专利名称：检测李坏死环斑病毒的方法
技术领域：
本发明提供了一种通过免疫捕获反转录PCR技术检测李坏死环斑病毒的方法，属植物保护领域。
背景技术：
李坏死环斑病毒(PNRSV)为雀麦花叶病毒科等轴不稳环斑病毒属成员，可以通过机械摩擦、昆虫介体、芽接和嫁接等方式传播。植株感染李坏死环斑病毒后，整株带毒，终生危害。李坏死环斑病毒寄主范围广，能侵染双子叶植物中的21个科，引起许多植物产生坏死和环斑。李坏死环斑病毒侵染果树后引起产量和品质下降。据报道，感染李坏死环斑病毒的樱桃的萌芽率大大降低，再如，素有“花中皇后”的美称的月季历来受到各国人民的喜爱，具有很高的观赏价值和经济价值，但是一旦感染李坏死环斑病毒后，植株矮化，进入生殖生长阶段后几乎不开花或是开花过小以及畸形等，严重地降低了植株的商品性和观赏性。到目前为止，国际上尚无治疗病毒病害的特效药剂，因此对感染病毒病的植株进行病原检测和监测，对于识别病毒病害和防治其病害的传播具有重要的实际意义，是生产上对病毒病害进行综合治理的重要措施之一。
通常检测病毒的方法有指示植物法、电镜技术、酶联免疫吸附技术和分子生物学技术等。相比较而言，指示植物法虽然简单，但是检测周期长，最短也要10～20天，而且灵敏度非常低，有些植物体内含有病毒，还受到季节、环境以及病毒性质等方面的影响，因此已经很少用于病毒的检测。免疫电镜的出现极大的促进了电镜技术在病毒检测方面的应用，但是电子显微镜价格昂贵，制样技术复杂，不易掌握，不适合作为病毒检测的普通方法。目前应用最为广泛的检测病毒的方法是酶联免疫吸附法(ELISA)和分子生物学技术。较之指示植物法和电镜技术，ELISA方法检测周期较短，灵敏度高，可以检测到纳克(ng)级水平的病害，但是对于植株体内含量较低的病毒，往往会发生漏检的现象。分子生物学技术，特别是RT-PCR技术不但操作简单，而且特异性、灵敏度较ELISA方法高，可以检测到飞克(fg)级水平的病毒。李坏死环斑病毒多感染木本植物，植株体内病毒含量低，而且植物组织富含多糖和酚类，严重影响了普通RT-PCR的灵敏度和特异性，很容易发生漏检的情况。
发明内容
本发明克服了传统方法在检测植物上李坏死环斑病毒的不足，提供了一种灵敏、特异的检测李坏死环斑病毒的方法。
本发明的步骤是1.设计引物设计检测李坏死环斑病毒的引物
2.免疫捕获1)取100mg感病组织，加1mL研磨缓冲液充分研磨后将研磨液转入1.5mL灭菌离心管中，4000rpm离心4min，上清液即为病组织粗汁液；2)0.5mL PCR管中加入150μL以包被缓冲液稀释200倍的李坏死环斑病毒抗血清，37℃孵育3h或4℃过夜；3)弃PCR管中包被液，用PBST洗涤3次，加入150μL粗汁液，37℃下孵育3h或4℃过夜；4)用PBST洗涤PCR管3次，ddH2O洗涤1次，低速离心15sec，弃残余液体；3.RT-PCR1)在包被过的PCR管中加入下游引物PNRSV-R 1μL，9.5μL ddH2O，轻微振荡混匀后于70℃温育10min，之后迅速冰浴5min；2)反转录向上述PCR管中按以下体系加入试剂，充分振荡混匀，室温放置10min，42℃保温1hr，得到cDNA；
3)PCR取一新的PCR管，按下表体系加入各试剂
设置PCR程序为94℃4min，94℃1min、50℃～56℃1min、72℃2min，扩增30～38个循环，72℃延伸10min后4℃保存；4.电泳检测配制0.8％～2％的琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液环境中，150V稳压电泳90min，之后取出凝胶浸泡在0.5μg/mL溴化乙锭中染色10min，然后在紫外灯下观察并记录结果；5.结果分析根据电泳胶上扩增条带的有无及其大小判定所检测的植物中是否感染李坏死环斑病毒，即如果凝胶中存在483bp的核酸片段则说明样品中含有李坏死环斑病毒。
其中，所述的PCR循环可以为30～38个循环，也可以为31～34个循环；所述的PCR退火温度可以为50℃～56℃，也可以为51℃～54℃；所述的的琼脂糖浓度可以为0.8％～2％，也可以为0.9％～1.2％。
本发明的有益效果是将免疫学检测技术和分子生物学检测技术有机的结合起来，可应用于感病植株低浓度病毒的检测。一方面节省了普通RT-PCR中提取总RNA的烦琐步骤，降低了检测成本；另一方面由于抗体与抗原的特异性结合，提高了检测的特异性。同时可以直接从病毒汁液中捕获病毒粒子，起到浓缩和纯化病毒的作用，又利用PCR技术放大了检测的灵敏度，能有效的防止病毒漏检的情况。此外，利用免疫捕获PCR还可以避免双子叶植物中多糖和酚类对RT-PCR的干扰，降低漏检发生的几率。
图1是检测木本植物月季上的李坏死环斑病毒的电泳检测图。
具体实施例方式
实施例一以已知的感染了李坏死环斑病毒的月季叶片为材料，分别用本方法和普通RT-PCR方法对李坏死环斑病毒进行检测，以健康月季叶片为阴性对照，且设置阳性对照。
1.设计引物设计检测李坏死环斑病毒的引物
2.免疫捕获1)取100mg感病组织，加1mL研磨缓冲液充分研磨后将研磨液转入1.5mL灭菌离心管中，4000rpm离心4min，上清液即为病组织粗汁液；2)0.5mL PCR管中加入150μL以包被缓冲液稀释200倍的李坏死环斑病毒抗血清，37℃孵育3h或4℃过夜；3)弃PCR管中包被液，用PBST洗涤3次，加入150μL粗汁液，37℃下孵育3h或4℃过夜；4)用PBST洗涤PCR管3次，ddH2O洗涤1次，低速离心15sec，弃残余液体；3.RT-PCR1)在包被过的PCR管中加入下游引物PNRSV-R 1μL，9.5μL ddH2O，轻微振荡混匀后于70℃温育10min，之后迅速置冰浴5min；2)反转录向上述PCR管中按以下体系加入试剂，充分振荡混匀，室温放置10min，42℃保温1hr，得到cDNA；
3)PCR取一新的PCR管，按下表体系加入各试剂
设置PCR程序为94℃4min，94℃1min、50℃1min、72℃2min，扩增30个循环，72℃延伸10min后4℃保存；4.电泳检测配制0.8％的琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液环境中，150V稳压电泳90min，之后取出凝胶浸泡在0.5μg/mL溴化乙锭中染色10min，然后在紫外灯下观察并记录结果；5.结果分析用本方法检测李坏死环状病毒，在凝胶上存在483bp的核酸条带，条带清晰特异，与阳性对照的条带大小一致，说明本方法可以用于李坏死环斑病毒的检测；阴性对照中没有检测到任何核酸条带，说明阴性对照中不含李坏死环斑病毒。用普通的RT-PCR的方法检测发现有时可以检测到483bp的核酸条带，但是条带亮度微弱，有时则不能检测到核酸条带，结果稳定性和重复性较差。
实施例二以已知的感染了李坏死环斑病毒的月季叶片为材料，分别用本方法和普通RT-PCR方法对李坏死环斑病毒进行检测，以健康月季叶片为阴性对照，且设置阳性对照。
1.设计引物设计检测李坏死环斑病毒的引物
2.免疫捕获1)取100mg感病组织，加1mL研磨缓冲液充分研磨后将研磨液转入1.5mL灭菌离心管中，4000rpm离心4min，上清液即为病组织粗汁液；2)0.5mL PCR管中加入150μL以包被缓冲液稀释200倍的李坏死环斑病毒抗血清，37℃孵育3h或4℃过夜；3)弃PCR管中包被液，用PBST洗涤3次，加入150μL粗汁液，37℃下孵育3h或4℃过夜；4)用PBST洗涤PCR管3次，ddH2O洗涤1次，低速离心15sec，弃残余液体；3.RT-PCR1)在包被过的PCR管中加入下游引物PNRSV-R 1μL，9.5μL ddH2O，轻微振荡混匀后于70℃温育10min，之后迅速冰浴5min；2)反转录向上述PCR管中按以下体系加入试剂，充分振荡混匀，室温放置10min，42℃保温1hr，得到cDNA；
3)PCR取一新的PCR管，按下表体系加入各试剂
设置PCR程序为94℃4min，94℃1min、56℃1min、72℃2min，扩增38个循环，72℃延伸10min后4℃保存；4.电泳检测配制2％的琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液环境中，150V稳压电泳90min，之后取出凝胶浸泡在0.5μg/mL溴化乙锭中染色10min，然后在紫外灯下观察并记录结果；5.结果分析用本方法检测李坏死环状病毒，在凝胶上存在483bp的核酸条带，条带清晰特异，与阳性对照的条带大小一致，说明本方法可以用于PNRSV的检测；阴性对照中没有检测到任何核酸条带，说明阴性对照中不含PNRSV。用普通的RT-PCR的方法检测发现有时可以检测到483bp的核酸条带，但是条带亮度微弱，有时则不能检测到核酸条带，结果稳定性和重复性较差。
实施例三以已知的感染了李坏死环状病毒的月季叶片为材料，分别用本方法和普通RT-PCR方法对李坏死环斑病毒进行检测，以健康月季叶片为阴性对照，且设置阳性对照。
1.设计引物设计检测李坏死环斑病毒的引物
2.免疫捕获1)取100mg感病组织，加1mL研磨缓冲液充分研磨后将研磨液转入1.5mL灭菌离心管中，4000rpm离心4min，上清液即为病组织粗汁液；2)0.5mL PCR管中加入150μL以包被缓冲液稀释200倍的李坏死环斑病毒抗血清，37℃孵育3h或4℃过夜；3)弃PCR管中包被液，用PBST洗涤3次，加入150μL粗汁液，37℃下孵育3h或4℃过夜；4)用PBST洗涤PCR管3次，ddH2O洗涤1次，低速离心15sec，弃残余液体；3.RT-PCR1)在包被过的PCR管中加入下游引物PNRSV-R 1μL，9.5μL ddH2O，轻微振荡混匀后于70℃温育10min，之后迅速冰浴5min；2)反转录向上述PCR管中按以下体系加入试剂，充分振荡混匀，室温放置10min，42℃保温1hr，得到cDNA；
3)PCR取一新的PCR管，按下表体系加入各试剂
设置PCR程序为94℃4min，94℃1min、53℃1min、72℃2min，扩增32个循环，72℃延伸10min后4℃保存；4.电泳检测配制1％的琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液环境中，150V稳压电泳90min，之后取出凝胶浸泡在0.5μg/mL溴化乙锭中染色10min，然后在紫外灯下观察并记录结果；5.结果分析用本方法检测李坏死环状病毒，在凝胶上存在483bp的核酸条带，条带清晰特异，与阳性对照的条带大小一致，说明本方法可以用于PNRSV的检测；阴性对照中没有检测到任何核酸条带，说明阴性对照中不含PNRSV。用普通的RT-PCR的方法检测发现有时可以检测到483bp的核酸条带，但是条带亮度微弱，有时则不能检测到核酸条带，结果稳定性和重复性较差。
利用该方法在不同反应条件下对植物中李坏死环斑病毒进行检测。从实验结果看出，通过本方法均能从含有李坏死环斑病毒的植株中特异的扩增出483bp的核酸条带，而且阴性对照无非特异性结果发生。并且相比普通RT-PCR，本方法检测的灵敏度高，结果稳定性和重复性好，很少出现漏检的情况。因此该方法可以被应用于植物上发生的李坏死环斑病毒的检测。
权利要求
1.一种检测李坏死环斑病毒的方法，其步骤如下1)设计引物设计检测李坏死环斑病毒的引物
2)免疫捕获(a)取100mg感病组织，加1mL研磨缓冲液充分研磨后将研磨液转入1.5mL离心管中，4000rpm离心4min，上清液即为病组织粗汁液；(b)0.5mL PCR管中加入150μL以包被缓冲液稀释200倍的李坏死环斑病毒抗血清，37℃孵育3h或4℃过夜；(c)弃去包被液，用PBST洗涤3次，加入150μL粗汁液，37℃下孵育3h或4℃过夜；(d)用PBST洗涤PCR管3次，ddH2O洗涤1次，低速离心15sec，弃残余液体；3)RT-PCR(a)在包被过的PCR管中加入下游引物PNRSV-R1μL，9.5μL ddH2O，轻微振荡混匀后于70℃温育10min，之后迅速冰浴5min；(b)反转录向上述PCR管中按以下体系加入试剂，充分振荡混匀，室温放置10min，42℃保温1hr，得到cDNA；
(c)PCR取一新的PCR管，按下表体系加入各试剂
设置PCR程序为94℃4min，94℃1min、50℃～56℃1min、72℃2min，扩增30～38个循环，72℃延伸10min后4℃保存；4)电泳检测配制0.8％～2％的琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液环境中，150V稳压电泳90min，之后取出凝胶浸泡在0.5μg/mL溴化乙锭中染色10min，然后在紫外灯下观察并记录结果；5)结果分析根据电泳胶上扩增条带的有无及其大小判定所检测的植物中是否感染李坏死环斑病毒，即如果凝胶中存在483bp的核酸片段则说明样品中含有李坏死环斑病毒。
2.根据权利要求1所述的检测李坏死环斑病毒的方法，其特征是退火温度为51℃～54℃。
3.根据权利要求1所述的检测李坏死环斑病毒的方法，其特征是扩增31～34个循环。
4.根据权利要求1所述的检测李坏死环斑病毒的方法，其特征是配制的琼脂糖凝胶的浓度为0.9％～1.2％。
全文摘要
本发明提供了一种免疫捕获反转录PCR检测李坏死环斑病毒(PNRSV)的方法，属植物保护领域。其方案是，通过抗体特异捕获抗原、RT－PCR以及电泳检测等步骤，对植物中感染的李坏死环斑病毒进行扩增，并通过凝胶电泳进行分离和检测。该方法除了具有普通RT－PCR所具有的快速、特异的优点外，主要是实现了血清学与分子生物学技术的结合，先通过病毒抗体对抗原病毒的特异吸附，将植物中低浓度的病毒进行富集，再通过PCR进行扩增，从而使检测的灵敏度和特异性得到极大的提高，并降低了病毒的漏检率。
文档编号C12Q1/68GK1824800SQ20051004877
公开日2006年8月30日 申请日期2005年12月27日 优先权日2005年12月27日
发明者李凡, 陈精兰, 陈海如, 李正跃, 孙健, 王钰丽, 刘云龙, 范静华, 王扬, 姬广海, 孔宝华, 蔡红, 杨斌, 蒋小龙, 白松 申请人:云南农业大学