专利名称：一种角蛋白酶的产生菌及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种角蛋白酶的产生菌及其制备方法。
背景技术：
角蛋白(Keratin)以各种动物的毛发、羽毛、蹄角等作为主要形式大量存在于自然界中，是一种抗性很强的硬性蛋白。角蛋白分子通过胱氨酸的二硫键、氢键、盐键和其它交键作用形成高度交联的三维结构，非常稳定，不溶于水、盐、稀酸和稀碱，也不易为大多数蛋白质水解酶(如胰蛋白酶、酪蛋白酶、胃蛋白酶等)所降解。角蛋白酶(Keratinase)是一类能专一的降解天然角蛋白的酶类，可以显著提高角蛋白的消化性，有些角蛋白酶还同时对除角蛋白外的多种蛋白质有水解作用。
角蛋白酶能特异性地分解角蛋白的特性，使其在饲料工业、食品工业、皮革加工、洗涤剂行业、医药工业及环境治理等方面具有广阔的应用前景。在饲料工业中，角蛋白酶可将羽毛、猪毛等废弃物转化为高营养的饲料蛋白。角蛋白是禽类加工中产生的废弃物-羽毛中的主要组分，其粗蛋白含量高达80％以上，含各种氨基酸总量70％以上，并且富含多种动物所需要的必需氨基酸，是一种非常有应用前景的饲料蛋白源，但它以胱氨酸二硫键高度互连而成，不能被一般蛋白酶所降解，因此很难被动物吸收利用。高温蒸煮或化学处理虽可以改进蛋白质的消化性，但存在耗能大，产品的营养质量易被破坏，三废不易处理，环境污染严重等问题。利用角蛋白酶可有效地解决这一问题，它的优点在于更为经济，提高废弃角蛋白的利用率，同时产品营养价值好，而且无污染。我国的羽毛资源极其丰富，年产量数十万吨，但目前这部分优良的蛋白源未能得到有效利用，既造成了资源的浪费，又污染环境，而我国饲料蛋白资源严重匮乏，按照我国饲料工业发展规划，到2010年饲料蛋白的缺口将达到800万吨。因此，羽毛蛋白饲料资源的开发与利用有着及其重要的意义。另外，角蛋白酶还具有多种工业用途，如在食品工业中，可用来生产鱼露、肉胨等高营养食品，或作为肉类嫩化剂；在皮革加工业中，它可替代普通蛋白酶或与普通蛋白酶配合使用，提高处理效果和降低成本；在医药上，角蛋白酶有助于伤口愈合、去痂和上皮再生，是外科手术和皮肤烧伤、创伤的特效药等等。
角蛋白酶的研究工作已有几十年的历史，自然界中许多微生物均能分泌角蛋白酶，能特异性地分解角蛋白，使其降解为多肽和氨基酸。自1899年Ward报道了真菌马爪甲团囊菌(Onygena equina)能分解角蛋白以来，已先后发现30余种微生物具有降解角蛋白的能力，主要包括真菌中的皮肤癣菌和白假丝酵母(Candida albicans)，放线菌中的链霉菌(Streptomyces)和高温单胞菌属(Thermonspora)及细菌中的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽孢杆菌(Baccillus subtilis)等。目前用于发酵生产的菌种主要为弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。1990年，美国North carolina州立大学的Williams等分离得到生产角蛋白酶的高产菌地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PWD-1(ATCC 53757)，提取纯化该菌种产生的胞外角蛋白酶，并对其理化性质进行了详细的研究，该酶分子量约为33kD，酶在pH 5～12范围都很稳定，反应最适温度为50℃，比活性为5990U/mg，但该角蛋白酶不能降解未高温蒸煮过的羽毛，耐热性差，且会自我催化裂解(Applied Environ.Microbio.583271-3275，1992)。江西农业大学对弗氏链霉菌S-221进行了一系列的研究，他们用自行设计并改良的C2液体发酵培养基，发酵液的最后酶活达66.2ug/ml，该酶有效作用pH为7-10，在70℃下处理0.5小时，其酶活性只维持在70％左右(江西农业大学学报，19(4)60-65，1997)。角蛋白的微生物降解与利用的重大意义，越来越引起了人们的广泛兴趣。国外一些学者的研究工作，已涉及角蛋白酶高级结构、活性表达分子基础以及酶工程等分子生物学上的研究，主要集中在地衣形芽孢杆菌的角蛋白酶基因，已测出其编码序列而且已成功地克隆和表达。而国内对角蛋白酶的研究还基本停留在产角蛋白酶菌的分离、筛选、角蛋白酶的分离纯化及理化性质的研究，以及角蛋白酶的作用机制的初步研究。而且，研究的对象也极其有限，主要集中于对弗氏链霉菌的研究。在国内，对于细菌发酵生产角蛋白酶尚属空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种角蛋白酶的产生菌及其制备方法，用该菌产生的角蛋白酶酶活性好，具有很好的稳定性和热稳定性。
本发明利用云南分布的微生物种类多及角蛋白质资源丰富的优势，筛选到产角蛋白酶的优良菌株，其粗酶液酶反应的最适pH为8.0左右，最适温度为60℃，具有很好的稳定性和热稳定性，在不同的pH条件下保温1h后，在pH6.4-10的范围内，酶活性均维持在80％以上。在70℃水浴中保温30min后，剩余酶活还有90％左右；保温120min后，酶活性依然维持在70％以上，经初步鉴定分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其保藏登记号为CGMCC No.1505。
该菌株的制备方法为1)菌株的分离和筛选从富含羽毛角蛋白的垃圾土壤、下水道淤泥、阴沟水中以及家禽活动点土壤采样，以羽毛角蛋白作为唯一氮源进行连续富集培养。取土样接入富集培养液并加入3-5根完整羽毛，于37℃，200r/min富集培养3-10天，待羽毛被分解，将其培养液转接富集培养液中，在同样条件下进行第二次富集培养。选取羽毛分解较好的培养液，按常规稀释后在初筛平板上进行平板涂布分离稀释，置于37℃恒温培养箱中培养1-2天，观看平板上菌落周围是否形成明显的透明圈。挑选大而明显的透明圈的菌落划线分离纯化2-3次；纯化后将其菌株接入液体发酵培养基摇瓶发酵，进一步初筛和复筛，最终分离筛选到分解利用羽毛角蛋白能力强、产角蛋白酶酶活高的菌株；2)该菌株接种到含有羽毛的液体发酵培养基中(未接种菌株的羽毛的液体发酵培养基作为对照)，将它们同时置于37℃，200r/min条件下发酵4天后，接种该菌株的液体发酵培养基中羽毛的羽小枝全部脱落，只剩羽梗，而对照液体发酵培养基中羽毛未分解。
分离筛选所用培养基为富集培养基(g/L)NH4Cl 0.5，NaCl 0.5，K2HPO40.3，KH2PO40.4，MgCl2·6H2O0.1，酵母膏0.1，羽毛粉10(接种时加入少量已灭菌的完整羽毛，pH7.5)。
筛选培养基A(g/L)NH4Cl 0.5，NaCl 0.5，K2HPO40.3，KH2PO40.4，MgCl2·6H2O 0.1，yeast extract 0.1，酪蛋白15，琼脂18-20(pH7.5)。
筛选培养基B(g/L)NaCl 10，peptone 10，yeast extract 5，Azokeratin10，琼脂18-20。
液体发酵培养基(g/L)NH4Cl 0.5，NaCl 0.5，K2HPO40.3，KH2PO40.4，MgCl2·6H2O 0.1，yeast extract 0.1，羽毛粉10(接种时加入少量已灭菌的完整羽毛，pH7.5)。
菌株的初步鉴定根据《常见细菌系统鉴定手册》以及《微生物学实验手册》对其进行形态特征、培养特征，生理生化测定等方面的初步鉴定。
菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌，具有荚膜和中生或次端生芽孢(见图2)。其能在20～60℃温度范围内生长，最适生长温度为37～50℃，生长pH是5～11，最适生长pH为7～8。能水解淀粉，能耐7％的NaCl生长，硝酸盐还原、接触酶实验、V.P实验、柠檬酸盐及丙酸盐利用、亚硝酸盐还原、明胶液化、酪素水解结果为阳性，甲基红实验、硫化氢实验、吲哚实验结果为阴性。该菌株经初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp)。
菌株的发酵将种子培养液接入装有50ml羽毛发酵培养基的250ml三角瓶中，置于迴转式恒温调速摇瓶柜中进行好氧发酵，转速为200r/min，37℃或50℃发酵3～4天。发酵液离心，取上清液，置于4℃保存。所用培养基为种子培养基(g/L)氯化钠10，蛋白胨10，酵母膏5，琼脂20发酵培养基(g/L)NH4Cl 0.5，NaCl 0.5，K2HPO40.3，KH2PO4O.4，MgCl2·6H2O0.1，yeast extract 0.1，羽毛粉10(接种时加入少量已灭菌的完整羽毛，pH7.5)。
酶活测定方法和粗酶酶学性质1、酶活测定方法(见Lin，x，LeeC.-G.，casal e，E.S.，andshih，J.C.H.1992.Purification and characterization of keratinase froma feather-degrading Bacillus licheniformisstrain..Appl.Environ.Microbin.583271-3275)。
(1)测定步骤如下①20mg偶氮角蛋白(Azokeratin)溶于3.2mL磷酸缓冲液(pH8.0)，震荡混匀，在50℃水浴中预先保温2min；②加入适当稀释倍数的酶液0.8mL，在50℃水浴中精确保温15min；
③加入10％三氯乙酸0.8mL，使酶反应终止；④离心(10000r/min，6min)并在450nm下测吸光值；⑤反应时对照液先加10％三氯乙酸0.8ml，再加酶液0.8mL；酶活定义为每ml酶液反应15分钟后OD值增加0.01为1U。
(2)偶氮角蛋白预处理方法(见Tomarelli，R.M.，Charney J.，andHarding M.L.，The use of azoalbumin as a substrate in the colormetricdetermination of peptic and tryptic activity.J.Lab，Clin，Med.，34，428-433)溶液A50g角蛋白溶于1L蒸馏水再与10％碳酸氢钠溶液100mL混匀；溶液B0.025mol磺胺酸溶于200mL蒸馏水后加入5mL5.0N氢氧化钠溶液，然后加入0.025mol亚硝酸钠混匀；加入0.05molHCl(10mL 5.0N盐酸溶液)搅拌2min；再加入0.05molNaOH(10mL5.0N氢氧化钠溶液)搅拌5sec；再与溶液A混匀，最后将混合液透析过夜后，置于烘箱中烘干(不高于60℃)即可。
2、粗酶酶学性质(1)酶反应的最适温度与最适pH值使偶氮角蛋白在pH8.0的缓冲液中，在不同温度下(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃)进行酶促反应，测其酶活，所得结果如图3。结果表明其酶反应在温度为50-70℃范围内酶活性变化不大，最适温度为60℃。配制不同pH值(4.4、5.6、6.4、7.2、7.6、8.0、8.6、9.0、10、11)的磷酸缓冲液，底物偶氮角蛋白在不同的pH缓冲液中，60℃下进行酶促反应，测其酶活，所得结果如图4。结果表明在角蛋白酶的pH为6.4-10范围内，酶活性变化不大，最适pH为8.0。
(2)角蛋白酶的pH稳定性试验将不同pH值(4.4、5.6、6.4、7.2、7.6、8.0、8.6、9.0、10、11)的缓冲液配制的酶液分别置于60℃水浴中保温60min后，测其酶活，所得结果如图5。结果表明该角蛋白酶具有较好pH稳定性，在pH6.4-8.0范围内处理1h后酶活性均维持在的80％以上。
(3)角蛋白酶的热稳定性试验将酶液置于70℃的水浴中分别保温10min、30min、50min、70min、90min、120min，所得结果如图6。结果表明该酶具有较好的耐热性，在70℃下处理30min，其剩余酶活还有90％左右；处理120min后，酶活性依旧维持在70％以上。
本发明筛选到产角蛋白酶的优良菌株，该菌株所产角蛋白酶粗酶液酶反应的最适pH为7.5-8.0左右，最适温度为50-60℃，具有很好的稳定性和热稳定性，在不同的pH条件下保温1h后，在pH6.4-10的范围内，酶活性均维持在80％以上。在70℃水浴中保温30min后，剩余酶活还有90％左右；保温120min后，酶活性依然维持在70％以上。相比较而言，比已报道的角蛋白酶有更好的耐热特性和pH稳定性。
图1A和图1B是本发明的菌株对羽毛的分解试验图。
图2是本发明的菌株芽孢染色图。
图3是本发明的酶反应的最适温度曲线图。
图4是本发明的酶反应的最适pH曲线图。
图5是本发明的pH对酶稳定性的影响曲线图。
图6是本发明的酶的热稳定性曲线图。
本发明的微生物保藏日期为2005年10月23日，保藏单位简称CGMCC，保藏编号CGMCC No.1505。
具体实施例方式
实施例菌株的分离和筛选1)从云南宜良、建水、玉溪等地屠宰场、养殖场附近富含羽毛角蛋白的垃圾土壤、下水道淤泥、阴沟水中以及家禽活动点土壤采样，以羽毛角蛋白作为唯一氮源进行连续富集培养。取土样5g接入50mL富集培养液并加入3-5根已灭菌的完整羽毛，富集培养基由(g/L)NH4Cl0.5，NaCl0.5，K2HPO40.3，KH2PO40.4，MgCl2·6H2O 0.1，酵母膏0.1，羽毛粉10组成，于37℃，200r/min富集培养3-10天，待羽毛被分解，将其培养液转接50mL富集培养液中，在同样条件下进行第二次富集培养。
2)选用上述羽毛分解较好的培养液，按常规稀释梯度(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5)稀释后在筛选平板上进行平板涂布分离稀释，置于37℃恒温培养箱中培养1-2天，观看平板上菌落周围是否形成明显的透明圈。挑选大而明显的透明圈的菌落划线分离纯化2-3次，最终分离筛选到分解利用羽毛角蛋白能力强、产角蛋白酶酶活高的菌株。这里所用筛选培养基为筛选培养基A(g/L)NH4Cl 0.5，NaCl 0.5，K2HPO40.3，KH2PO40.4，MgCl2·6H2O 0.1，yeast extract 0.1，酪蛋白15，琼脂18-20(pH7.5)；筛选培养基B(g/L)NaCl 10，peptone 10，yeast extract 5，Azokerat in 10，琼脂18-20，先用筛选培养基A，再用筛选培养基B，筛选两次。
将该菌株接种到含有羽毛的液体发酵培养基中(未接种菌株的羽毛的液体发酵培养基作为对照)，将它们同时置于37℃，200r/min条件下发酵4天后，接种该菌株的液体发酵培养基中羽毛的羽小枝全部脱落，只剩羽梗，而对照液体发酵培养基中羽毛未分解，结果见附图1。图1A中羽毛未分解；而图1B中羽毛的羽小枝全部脱落，只剩羽梗。液体发酵培养基(g/L)NH4Cl0.5，NaCl 0.5，K2HPO40.3，KH2PO40.4，MgCl2·6H2O 0.1，yeast extract 0.1，羽毛粉10(接种时加入少量3-5根已灭菌的完整羽毛，pH7.5)。
权利要求
1.一种角蛋白酶的产生菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，其保藏登记号为CGMCC No.1505。
2.权利要求1所述的角蛋白酶的产生菌的制备方法，其特征在于菌株的分离和筛选是1)从富含羽毛角蛋白的垃圾土壤、下水道淤泥、阴沟水中以及家禽活动点土壤采样，以羽毛角蛋白作为唯一氮源进行连续富集培养，即取土样接入富集培养液并加入3-5根完整羽毛，于37℃，200r/min富集培养3-10天，待羽毛被分解，将其培养液转接富集培养液中，在同样条件下进行第二次富集培养；选取羽毛分解较好的培养液，按常规稀释后在初筛平板上进行平板涂布分离稀释，置于37℃恒温培养箱中培养1-2天；挑选大而明显的透明圈的菌落划线分离纯化2-3次，纯化后将其菌株接入液体发酵培养基摇瓶发酵，进一步初筛和复筛，最终分离筛选到分解利用羽毛角蛋白能力强、产角蛋白酶酶活高的菌株；2)把该菌株接种到含有羽毛的液体发酵培养基中，将它们同时置于37℃，200r/min条件下发酵4天后，观察接种该菌株后的液体发酵培养基中羽毛脱落情况。
全文摘要
本发明是一种角蛋白酶的产生菌及其制备方法。其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其保藏登记号为CGMCC No.1505。本发明筛选到产角蛋白酶的优良菌株，该菌株所产角蛋白酶粗酶液酶反应的最适pH为7.5－8.0左右，最适温度为50－60℃，具有很好的稳定性和热稳定性，在不同的pH条件下保温1h后，在pH6.4－10的范围内，酶活性均维持在80％以上。在70℃水浴中保温30min后，剩余酶活还有90％左右；保温120min后，酶活性依然维持在70％以上。相比较而言，比已报道的角蛋白酶有更好的耐热特性和pH稳定性。
文档编号C12R1/125GK1800358SQ20051004877
公开日2006年7月12日 申请日期2005年12月27日 优先权日2005年12月27日
发明者黄遵锡, 钟巧芳, 许波 申请人:云南师范大学