专利名称：发酵生产重组人血清白蛋白hsa的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中，特别涉及生产重组人血清白蛋白HSA的生物发酵方法的改进。
背景技术：
HSA是构成人血浆的主要成分，它用于治疗大出血、创伤、烧伤的药物准备。
最初，HSA主要来源于收集血液的分馏物。然而，这种生产过程存在经济上的不利条件及血源有限等问题。而且，血液自身也可能有问题，如血液中可能有人们所不期望的物质，如肝炎病毒，因此这种方法不可能成为工业化生产HSA的途径。
自上世纪九十年代以来，采用重组DNA技术可以将微生物和细胞的HSA基因与适合酵母菌转化载体重组，转化于酵母菌中，获得转基因菌株，可大规模地生产HAS，避免了使用人血浆生产白蛋白所带来的盲目性和危害性。US5631145介绍了一种将HSA表达质粒PMM042导入巴斯德毕赤酵母GTS115获得工程菌UHG42-3的方法，并详细介绍了利用该工程菌进行发酵生产HSA的方法，该方法发酵过程中保持发酵温度的恒定，其不足在于HSA产量较低，生产效率较低。
发明创造内容本发明的目的在于提供一种低生产成本、高产量的生产HSA的发酵方法，该方法不仅可以提高了宿主细胞的目的蛋白的表达量，同时减少了蛋白的着色程度，为工业化生产HSA提供了可能。
本发明的发酵生产重组人血清白蛋白HSA的方法，包括用酵母菌属或毕赤氏酵母属的酵母菌株经种子培养和发酵生产的步骤，其特征在于，所述发酵生产经过两个变温培养阶段，第一阶段为菌体生长期，温度控制在27-30℃，并监控发酵液中细胞浓度直至OD600数值为200时降温；第二阶段为HSA诱导期，温度控制在18-23℃，并加入诱导剂甲醇直至发酵结束。
上述方法中，所述第一阶段温度优选控制在28-30℃，第二阶段优选温度控制在18-21℃。
上述方法中，所述第一阶段还包括补料过程，第一阶段在批次发酵培养基中甘油消耗完时恒流或变流补加甘油。
上述方法中，所述发酵生产过程应监控发酵罐的溶氧值，第一阶段控制容氧量在饱和溶氧的50％左右，当溶氧值迅速升到100％时，开始流加补料甘油，补加速度以溶氧值控制，溶氧值控制在35-25％之间；第二阶段当溶氧值回升至100％时，开始加入诱导剂甲醇，持续恒速流加直至溶氧值下降至80％，然后增加甲醇流加速度使溶氧值控制在30％直至发酵过程结束。
上述方法中，所述发酵生产过程，应控制发酵液的pH值在5.5；当发酵液泡沫过大的时候加入泡敌消泡；所述发酵生产过程共需360小时。
上述方法中，所述第一阶段所用的批次培养基中加入微量元素Fe、Cu、Zn和Mn的硫酸盐。
上述方法中，所述酵母菌株为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株，优选巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10，菌种保藏号为CGMCC No.1360。
本发明在发酵过程中变温控制发酵过程以及补加特定的诱导剂，明显提高了宿主细胞的目的蛋白HSA的表达量，同时减少了蛋白的着色程度，为工业化生产HSA提供了可能。
具体实施例方式
本发明以提高HSA的生产量为目的，通过大量实验得到优化的发酵工艺。
发明人的大量实验表明，利用工程菌培养HSA的发酵过程可分为两个阶段，第一阶段在25-30℃下培养HSA生产菌体，用补料批次发酵法不断地往特定培养基中加入甘油(50％v/v)溶液作为碳源，根据溶氧值控制甘油的流量，流加过程中溶氧值应不低于30％，培养基中过高的甘油含量或过低的溶氧值可抑制HSA生产细胞的生长，因此，通过流加甘油和控制溶氧可以使生产细胞达到高浓度，此外，通过往培养基中加微量元素也可提高生产细胞浓度；第二阶段HSA的产生，当生产细胞达到适宜浓度，即OD600约为200时降低培养温度，在18-25℃下培养宿主，同时不断地往培养基中加入诱导剂，使生产细胞产生HSA，本发明的诱导剂为甲醇，同时作为维持生产细胞代谢的碳源，此阶段可继续流加甘油，也可停止加入甘油，以甲醇作为唯一碳原，流加速度仍以溶氧值控制，溶氧值不应低于30％。
培养基通常是用于培养转化宿主，在已知条件下完成转化体的培养。培养基一般为合成的，最适宜的为液体培养基。例如，一个适宜的合成培养基由以下成分构成碳源，例如各种碳原，本发明中碳原为甘油与甲醇；氮源，例如尿素、氨盐、硝酸盐；微量营养素，如各种维生素、核苷酸，及无机盐，如Mg、Ca、Fe、Na、Mn、Co、和Cu盐。培养基的pH值可以是中性的、弱碱的和弱酸的，适宜的范围是5.0-6.0。
如果须提高HSA的生产量，第一阶段为菌体生长期，生长培养在28-30℃最佳，如果培养温度高于上述范围，菌体的生长和第二阶段HSA的生产受抑制。当菌体培养温度低于上述范围，由于培养过程是放热的，需要高成本和复杂操作控制温度，同时菌体生长速度减慢，达到适宜诱导的细胞浓度的时间延长，增加成本。第二阶段为诱导期，诱导剂为甲醇，诱导期温度在18-21℃最佳，诱导期随温度的升高HSA的表达量会降低，温度低于此范围，由于培养过程是放热的，依然需要高成本和复杂操作控制温度。HSA生产菌体的培养，例如本发明所用菌株在上述温度范围内进行与常规恒温30℃培养温度相比，HSA产量可以提高以2倍以上，且HSA色素含量降低。
本发明中第一阶段以甘油为唯一碳原，甘油的加入方式为连续流加，流加的速度可以为恒速，也可以变速流加，但培养基中甘油浓度应维持在5％以下，培养基中甘油浓度过高会抑制生产细胞的生长，第二阶段HSA的产生期，在此阶段加入诱导剂甲醇，加入方式为连续流加，流加的速度可以为恒速，也可以变速流加，但发酵液中甲醇的浓度应维持在3％以下，甲醇浓度过高会抑制生产细胞表达HSA，甲醇可作为此阶段唯一碳原，也可以与甘油混补。
本发明中培养基的pH值适宜的范围是5.0-6.0，由于生产细胞生长过程产生酸性代谢物，因此需补加碱，以维持pH值的稳定，本发明中补入的碱为氨水。
培养时间在1～1000小时之间，最好在20～360小时，静止培养或振荡培养，或通气搅拌状态下批次、半连续或连续培养，最好是准备种子的培养先于上述培养过程，种子培养可以用液体培养基(其成分如上述)，最好在30℃(对于酵母宿主)。
本发明中，所用工程菌可以为HSA75-10(菌种保藏号CGMCC NO.1360)、UHG42-3(US 5,631,145)、以及巴斯德毕赤氏酵母GTS115(US 5,707,828)。
所用种子培养基2％的细菌胨、1％的酵母抽提物、2％的甘油。
批次发酵培养基每L中含有甘油 50.0gH3PO4(85％)14.0mlCaSO4.2H2O 0.6gK2SO49.5gMgSO4.7H2O 7.8gKOH 2.6g0.2g/l生物素(Biotin)溶液 1.6mlYTB溶液 2ml(YTB溶液每升中含FeSO4.7H2O 65.0g，CuSO4.5H2O 6.0g，ZnSO4.7H2O20.0g，MnSO4.5H2O 3.0g，H2SO45.0ml)所用补料甘油或甲醇(甲醇作为诱导剂)，补加补料用量根据发酵过程中溶氧情况确定。
实施例一、10L发酵罐30℃恒温培养，对比例1)种子培养从冷冻管中取出1ml含生产细胞的菌液HSA75-10(菌种保藏号CGMCC NO.1360)，接入含200ml种子培养基的1000ml带挡板的摇瓶中，在30℃条件下，摇床培养24小时。培养24小时后，取全部培养液接入5L批次发酵培养基中。
2)发酵培养把200ml种子培养液接入含5L批次发酵培养基的10L发酵罐中，通气搅拌培养。主发酵在恒定30℃下进行。搅拌转速的低限与高限分别为200与1000rpm，主发酵溶氧控制在饱和溶氧的50％左右。当批次发酵培养基中的甘油消耗完，此时溶氧值迅速升至100％，即开始补料，补入补料甲醇，补加速度以溶氧值控制，溶氧值控制在35-25％之间，发酵过程中，pH控制在5.5，在发酵过程中泡沫过大时加入泡敌消泡，发酵培养360小时。
实施例一的方法与美国专利US5631145的方法近似，只是使用的不是同一菌株。
实施例二、10L发酵罐变温培养1)种子培养同实施例一。
2)发酵培养把200ml种子培养液接入含5L批次发酵培养基的10L发酵罐中，通气搅拌培养，通气量为0.5-0.8WWM。发酵第一阶段为菌体生长期，分别于30℃、29℃、28℃、27℃下进行培养，搅拌转速的低限与高限分别为200与1000rpm，该阶段通过溶氧电极监控溶氧量，控制溶养量在饱和溶氧的50％左右，当溶氧值迅速升到100％时，说明批次发酵培养基中的甘油消耗完，此时开始补料过程，流加补料甘油，补加速度以溶氧值控制，溶氧值控制在35-25％之间，同时检测发酵液中细胞浓度，取发酵液用分光光度计在600纳米下测吸光值即OD600值(如果发酵液的细胞浓度超过仪器测定范围，则精密稀释发酵液后再用仪器测定)，当得到的发酵液的OD600值约为200时降低培养温度，同时停止补加甘油；第二阶段诱导期分别在18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃进行(与第一阶段温度的组合实验序号见表1所列)，当发酵罐的温度降低至设定温度时，监控溶氧值，当溶氧值回升至100％时，开始流加诱导剂甲醇(浓度100％)，起始流速5ml/h，持续恒速流加直至溶氧值下降至80％，然后增加甲醇流加速度，通过调节流加甲醇的速度，使溶氧值控制在30％，直至发酵过程结束。在整个发酵培养过程中，发酵液的pH控制在5.5，当发酵液泡沫过大的时候加入泡敌消泡，总发酵培养360小时。
实施例三、2000L发酵罐恒温培养，对比例1)一级种子培养从甘油管中取1ml含生产细胞的菌液HSA75-10(CGMCC NO.1360)，接入有200ml种子培养基的1000ml的带挡板的摇瓶中，在30℃条件下，摇床培养24小时。
2)二级种子培养一级种子培养液接种到含有5L批次培养基的10L发酵罐，在30℃条件下，搅拌培养24小时，溶氧控制在饱和溶氧的50％左右，在种子培养过程中，不控制培养液的pH。
3)主发酵二级种子培养液5L接种到含有1000L批次发酵培养基的2000L发酵罐中，通气搅拌培养。主发酵在恒定30℃下进行。通过调节搅拌转速，溶氧控制在饱和溶氧的50～30％。当批次发酵培养基中的甘油消耗完，即开始补料过程，补入补料甲醇，补加速度以溶氧值控制，溶氧值控制在35-25％之间，发酵的pH控制在5.85，在发酵液泡沫过大时加入泡敌消泡，发酵培养360小时。
实施例三的方法与美国专利US5631145近似，只是使用的不是同一菌株。
实施例四、2000L发酵罐变温培养1)一级种子培养同实施例三中步骤1)。
2)二级种子培养同实施例三中步骤2)。
3)主发酵二级种子培养液5L接种到含有1000L批次发酵培养基的2000L发酵罐中，通气搅拌培养。通气搅拌培养，通气量为0.5-0.8WWM。发酵第一阶段为菌体生长期，分别于30℃、29℃、28℃、27℃下进行培养，搅拌转速的低限与高限分别为200与1000rpm，该阶段通过溶氧电极监控溶氧量，控制容氧量在饱和溶氧的50％左右，当溶氧值迅速升到100％时，说明批次发酵培养基中的甘油消耗完，此时开始补料过程，流加补料甘油，补加速度以溶氧值控制，溶氧值控制在35-25％之间，同时检测发酵液中细胞浓度，每隔4小时取发酵液10ml用分光光度计在600纳米下测吸光值即OD600值(如果发酵液的细胞浓度超过仪器测定范围，则精密稀释发酵液后再用仪器测定)，当得到的发酵液的OD600值约为200时降低培养温度，同时停止补加甘油；第二阶段诱导期分别在18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃进行(与第一阶段温度的组合实验序号见表1所列)，当发酵罐的温度降低至设定温度时，监控溶氧值，当溶氧值回升至100％时，开始流加诱导剂甲醇(浓度100％)，起始流速1000ml/h，持续恒速流加直至溶氧值下降至80％，然后增加甲醇流加速度，通过调节流加甲醇的速度，使溶氧值控制在30％，直至发酵过程结束。在整个发酵培养过程中，发酵液的pH控制在5.5，当发酵液泡沫过大的时候加入泡敌消泡，总发酵培养360小时。
表1
发酵液的测样1、细胞浓度的测量取实施例每一个培养温度和诱导温度对应的发酵液作为测试样品。用分光光度计测量，样品用蒸馏水稀释到其在用分光光度计的读数在0.3～0.5之间后，稀释样品在600nm测吸光度，测定值与稀释倍数的乘积作为发酵液样品的OD600数值。按公式OD600/4.2来计算得到每一个样品的细胞干重。
2、HSA的产量的测量取实施例每一个培养温度和诱导温度对应的发酵液作为测试样品。样品15000rpm离心5分钟后取出，用HPLC检测，并定义30℃下HSA的产量为100％，其它样品的产量为与30℃下HAS产量的相对值。
3、HSA着色程度的评价取每一实施例每一个培养温度和诱导温度对应的发酵液作为测试样品。样品15000rpm离心5分钟后取出，用紫外分光光度计测A350/A280的比值评价着色程度，其中A350/A280的吸光值仅检测了发酵结束前的样品(359小时以后)。
用上述测试方法，对实施例一和实施例二中组合条件下的发酵液进行测试，结果见表2表2
用上述测试方法，对实施例三和实施例四中组合条件下的发酵液进行测试，结果见表3。
表3
通过表2和表3的数据可以看出，采用本发明变温发酵培养的方法得到的发酵液(标号1至24)，产物HAS的产量明显高于同样恒温培养条件下的结果，一般是恒温培养结果的两至三倍；色度降低也非常明显，除24号样外，色度值均降低至0.1以下。和美国专利文献US5631145介绍的同样方法测定得到的数值相比，HAS常量也明显以倍数提高。
权利要求
1.一种发酵生产重组人血清白蛋白HSA的方法，包括用酵母菌属或毕赤氏酵母属的酵母菌株经种子培养和发酵生产的步骤，其特征在于，所述发酵生产经过两个变温培养阶段，第一阶段为菌体生长期，温度控制在27-30℃，并监控发酵液中细胞浓度直至OD600数值为200时降温；第二阶段为HSA诱导期，温度控制在18-23℃，并加入诱导剂甲醇直至发酵结束。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一阶段温度控制在28-30℃，第二阶段温度控制在18-21℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一阶段还包括补料过程，在第一阶段所用批次发酵培养基中甘油消耗完时以恒流或变流的方式补加甘油。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述发酵生产过程监控发酵罐的溶氧值，第一阶段控制溶氧量在饱和溶氧的50％左右，当溶氧值迅速升到100％时，开始流加补料甘油，补加速度以溶氧值控制，溶氧值控制在35-25％之间；第二阶段当溶氧值回升至100％时，开始加入诱导剂甲醇，持续恒速流加直至溶氧值下降至80％，然后增加甲醇流加速度使溶氧值控制在30％直至发酵过程结束。
5.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述发酵生产过程，控制发酵液的pH值在5.5。
6.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述发酵生产过程，当发酵液泡沫过大的时候加入泡敌消泡。
7.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述发酵生产过程共360小时。
8.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述第一阶段所用的批次培养基中加入微量元素Fe、Cu、Zn和Mn的硫酸盐。
9.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述酵母菌株为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述酵母菌株为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10，菌种保藏号为CGMCC No.1360。
全文摘要
本发明公开了一种变温发酵生产重组人血清白蛋白HSA的方法，包括用酵母菌属或毕赤氏酵母属的酵母菌株经种子培养和发酵生产的步骤，所述发酵生产经过两个培养阶段，第一阶段为HSA生产期，温度控制在27－30℃，并监控发酵液中细胞浓度直至OD
文档编号C12R1/84GK1854306SQ20051006817
公开日2006年11月1日 申请日期2005年4月29日 优先权日2005年4月29日
发明者邓建慧, 任乐民, 仓基勇, 史建红, 贾茜, 高健 申请人:华北制药集团新药研究开发有限责任公司