不饱和脂肪酸含量增加的转基因鱼的制作方法

专利名称：不饱和脂肪酸含量增加的转基因鱼的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过导入脂肪酸去饱和酶基因不饱和脂肪酸含量增加的鱼，以及这些不饱和脂肪酸含量增加的鱼的生产方法。
背景技术：
现在正在大范围地研究，n-3高度不饱和脂肪酸(HUFA)，尤其是二十碳五烯酸(EPA，205n-3)，和二十二碳六烯酸(DHA，226n-3)在人的健康和发育中的优异效果(例如，参照非专利文献1，2，3，4，5)。在人中这些脂肪酸主要由海水鱼及它们的提取物的鱼油等接种，但是近年来，随着海洋中捕获的鱼数量减少，EPA和DHA的生产所必需的原料的稳定供给正受到威胁(例如，参照非专利文献6)。进而，据推测在2005年至2010年间，它们的供给成为危机(例如，参照非专利文献7)。现在认为通过养殖使鱼的生产量增加，潜在地使由捕获鱼获得的EPA和DHA的供给量的减少所产生的影响丧失。但是，鱼类的不饱和脂肪酸合成受鱼类具有的脂肪酸代谢酶的种类及其活性所左右，在淡水鱼中代谢成EPA和DHA的酶具有亚麻酸，而海水鱼中亚麻酸是其成长和通常的发达所必需的(例如，参照非专利文献8，9，10，11)，但是由于代谢成EPA和DHA的酶不具有亚麻酸，因此从食物中摄取亚麻酸。所谓青鱼的EPA和DHA是来源于浮游生物的EPA和DHA，这些鱼的养殖中需要高水平含有EPA和DHA的饲料(例如，参照非专利文献9，11)。因此，现在正在探索生产与海水鱼中所含同等程度或这种程度以上的EPA和DHA的生物技术的应用等针对在鱼的养殖场所，在成本方面不利的添加含有EPA和DHA的饲料的替代方法。
在关于这种替代方法的许多研究中，现已清楚了包括鱼在内的脊椎动物中EPA的合成，通过组合Δ6和Δ5不饱和化和链延伸反应，转化所摄食的α-亚麻酸(183n-3)而产生(例如，参照非专利文献12，13，14)。进而，现在还报道了按向225n-3，然后向245n-3的顺序通过延长链由EPA合成DHA，进而至246n-3的Δ6不饱和化，最后通过经β-氧化的过氧化物酶体，逆转化产生(例如，参照非专利文献12，15，16，17)，和海洋生物的通过经225n-3的Δ4不饱和化直接转化的DHA的1个步骤合成方法等(例如，参照非专利文献18)。
由于近年来的转基因技术的发达，可以制备含有有益于人的健康的外来蛋白质的动物(例如，参照非专利文献19)。这种技术还应用于水产养殖(例如，参照非专利文献20，21，22)，现渐已清楚了通过向卵母细胞的胚泡(例如，参照非专利文献23)，或者1细胞期胚胎的细胞质的显微注射，使用早期胚胎(例如，参照非专利文献25)或精子的电穿孔，逆转录病毒感染(例如，参照非专利文献27，28)和基因枪照射等(例如，参照非专利文献29)方法，可以产生转基因鱼。所有这些方法，在几种鱼种中，容易进行导入基因的传递，因此必须根据各个种类，选择适当的方法(例如，参照非专利文献22)，此外，在生长率，抗病性，对极限环境条件的适应性的改善方面，转基因技术的应用也可以根据鱼种来构建(例如，参照非专利文献21，30)。
但是，现在几乎没有进行以通过使用转基因技术改变鱼类的代谢途径作为目标的研究。作为这种研究，现已对为补偿鱼类中维生素C生物合成的缺乏而导入基因的可能性进行了报道(例如，参照非专利文献31)。该研究是关于维生素C的末端反应中作为催化剂作用的L-古洛糖酸-γ-内酯氧化酶(rGLO)基因的导入的研究，但是没有观察到维生素C的生成。此外，通过同时注入含有人葡萄糖输送蛋白质(hGluT)和兔己糖激酶II(rHK II)cDNA的构建体，尝试改善虹鳟鱼的碳水化合物的代谢，但是没有观察到与rHKII和hGluT1的功能相关的直接证据(例如，参照非专利文献32)。该实验中，为了改变脂肪酸生物合成途径，在斑马鱼中导入从yamamesalmon(马苏大麻哈鱼(Oncorhynchus masou))中分离的Δ6去饱和酶样基因。只不过报道了，由于认为该Δ6去饱和酶基因在一般的HUFA生物合成中处于反应速率决定阶段，因此作为最初的目标(例如，参照非专利文献33，34)。
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非专利文献34J.Biol.Chem.，274471-477，1999此外，作为关于使脂肪酸去饱和酶表达的基因的技术，现已提出了通过在动物中导入脂肪酸去饱和酶基因而转化该动物，使该脂肪酸去饱和酶基因在该动物中表达，前述动物中不饱和脂肪酸的含量增加的转化动物(例如，参照专利文献1)，和导入了编码使结合于脂质的脂肪酸的Δ9位不饱和的组囊藻(Anacystis)属来源的Δ9不饱和酶的基因的高等植物细胞的制备方法(例如，参照专利文献2)，和分离的动物来源的Δ5-脂肪酸脱氢酶及其能行使功能的部分(例如，参照专利文献3)，以及植物的种子中的十八碳四烯酸的产生方法(例如，参照专利文献4)等方法，前述植物的种子中的十八碳四烯酸的产生方法包括使植物的基因组中整合了按5’-3’的转录方向含有植物种子细胞中的功能启动子，编码Δ6-去饱和酶的DNA序列，和植物种子中功能的转录终止区域的第1种DNA构建体的植物生长的步骤，和使植物在Δ6去饱和酶表达的条件下生长的步骤。
非专利文献1特开2003-245070号公报非专利文献2特开平11-332408号公报非专利文献3特表平14-508932号公报非专利文献4特表平14-517255号公报发明内容以往，一般认为海产鱼用的混合饲料中需要使用含有EPA和DHA的鱼油，但是，本发明的问题在于通过改变鱼类的脂肪酸代谢途径，提供可以使更便宜且品质容易管理的植物性油脂或动物脂成为饲料，对在种苗生产场所的成本和劳动力的减轻作出具有巨大贡献，而且显示出高活力，处理抗性和低温抗性的鱼及其生产方法，还提供了作为功能性食品的高水平含有DHA的鱼类及其生产方法。
用于解决问题的方法本发明为了制备不饱和脂肪酸含量增加的鱼，由于由外源基因编码的新的表型的导入中，外源基因向宿主个体的有效转录是一种重要的因素(Hacket，1993；Houdebine，2000)，作为最初阶段，选择使Δ6去饱和酶样基因的表达成为可能的适当的构建体。首先，选择具有2-3个月这样较短的世代时间，卵数量多，饲养简便等多种优点的硬骨斑马鱼(Teleosteanzebrafish)Daniorerio(Westerfield，1995；Gong，1999)作为模型鱼。在青鱂鱼(Oryziaslatipes)β-肌动蛋白启动子控制下将马苏大麻哈鱼(Oncorhynchus masou)来源的Δ6去饱和酶样cDNA导入到斑马鱼中时，主要在肌肉中表达，发现EPA和DHA的含量增加，确认了上述Δ6去饱和酶样基因确实是具有Δ6去饱和酶活性的基因，从而完成本发明。
也就是说，本发明涉及(1)导入脂肪酸去饱和酶基因，通过该脂肪酸去饱和酶基因的表达，不饱和脂肪酸含量增加的转基因鱼类，和(2)根据上述(1)记载的转基因鱼，其特征在于所述脂肪酸去饱和酶基因连结于青鱂鱼来源的β-肌动蛋白启动子的下游，和(3)根据上述(1)或(2)记载的转基因鱼，其特征在于所述脂肪酸去饱和酶基因连结于牛生长激素聚腺嘌呤化序列的上游，和(4)根据上述(1)-(3)任一项记载的转基因鱼，其特征在于所述脂肪酸去饱和酶基因是由以下(A)-(F)任一项的碱基序列构成的基因(A)编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质的碱基序列；(B)编码由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失，取代或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的并且具有脂肪酸去饱和酶活性的蛋白质的碱基序列；(C)编码与序列号2所示的氨基酸序列具有至少60％或60％以上的同源性的氨基酸序列构成的并且具有脂肪酸去饱和酶活性的蛋白质的碱基序列；(D)序列号1所示的碱基序列；(E)由在序列号1所示的碱基序列中缺失，取代或添加了1个或多个碱基的碱基序列构成的并且编码具有脂肪酸去饱和酶活性的蛋白质的碱基序列；(F)与序列号1所示的碱基序列在严紧条件下杂交并且编码具有脂肪酸去饱和酶活性的蛋白质的碱基序列；和(5)根据上述(1)-(4)任一项记载的转基因鱼，其特征在于所述不饱和脂肪酸是二十碳五烯酸(EPA)，和二十二碳六烯酸(DHA)，和(6)根据上述(1)-(5)任一项记载的转基因鱼，其特征在于其是养殖鱼。
发明的效果本发明不仅可以对种苗生产场所的成本和劳动力的减轻作出具有巨大贡献，而且可以生产显示出高活力，处理抗性和低温抗性的鱼苗，可以利用更便宜且品质容易管理的植物性油脂或动物油脂，而不使用含有EPA，DHA的鱼油作为养殖海产鱼用的配合饲料。此外，由于由本发明生产的鱼类含有比通常个体更多的DHA，通过使用封闭循环式陆地养殖系统还可以实现具有作为健康食品的附加价值的鱼类生产，进而，这种鱼类不仅在水产养殖中直接利用，而且作为在分子水平了解鱼类的脂肪酸代谢的机制时极为有用的研究工具，对这些领域贡献度极高。


图1是表示插入于在制作本发明的不饱和脂肪酸含量增加的鱼类时使用的表达载体中的脱氢酶基因构建物的概述的图。
图2是表示脱氢酶基因的瞬间表达结果的RT-PCR的图。
图3是表示F1世代的cDNA中脱氢酶基因在鳍，肝脏，肌肉中的表达结果的RT-PCR的图。
图4是表示通过使用从蓄积的鱼苗中提取的DNA模板的PCR分析，筛选生殖系统的传递物质的结果的代表例的RT-PCR的图。从通过DNA阳性FO和非转基因鱼个体的交配获得的约20尾两日龄的鱼苗中提取DNA。泳道1-6使用从转基因FO个体中获得的基因组DNA试样的PCR扩增产物。泳道C使用非转基因鱼的PCR扩增产物，泳道N不使用DNA模板的PCR扩增产物，泳道P扩增的pActD6质粒DNA(0.6pg)。
图5是表示不同的F1世代中导入基因表达的检测结果的RT-PCR的图。总RNA从尾鳍组织中提取。构建物后面的数字表示各个转基因系统。
图6是表示本发明的不饱和脂肪酸含量增加的鱼类中不饱和化生成物的含量的图。
具体实施例方式
作为本发明的转基因鱼类，如果是导入脂肪酸去饱和酶基因，通过该脂肪酸去饱和酶基因的表达，不饱和脂肪酸含量增加的转基因鱼类，没有特别的限制。作为上述脂肪酸去饱和酶基因，如果是动物来源，植物来源等来源，其来源没有特别的限定，但是可以最佳例举有Δ4脂肪酸去饱和酶基因，Δ5脂肪酸去饱和酶基因和Δ6脂肪酸去饱和酶基因等脂肪酸去饱和酶基因，它们可以单独使用或多个一起使用。这种Δ4脂肪酸去饱和酶基因，Δ5脂肪酸去饱和酶基因和Δ6脂肪酸去饱和酶基因是从脂肪酸的末端羧基的碳(デルタェンド)开始数，分别在第4，5，6位的碳形成不饱和结合的基因，作为这些脂肪酸去饱和酶基因，淡水鱼来源和浮游生物来源的基因由于不会对鱼类的正常发育和功能产生坏影响而优选，例如，可以具体例举有微细藻类来源的Δ4脂肪酸去饱和酶基因(Tonon，T.，Harvey，D.，Larson，T.R.，and Graham，I.A.Identification of a very long chain polyunsaturated fatty acid Δ4-desaturasefrom the microalga Pavlova lutheri.FEBS Lett.553，440-444(2003).)，大西洋产鲑鱼来源的Δ5脂肪酸去饱和酶基因(GenebankAF478472)和马苏大麻哈鱼(Oncorhynchus masou)来源的Δ6脂肪酸去饱和酶基因(GenebankAB074149，AB070444)。
作为可以优选使用的Δ6脂肪酸去饱和酶基因，如果是以下任一种碱基序列构成的基因，没有特别的限制(A)编码序列号2所示的氨基酸序列(马苏大麻哈鱼(Oncorhynchus masou)来源的Δ6脂肪酸去饱和酶的氨基酸序列)的碱基序列；(B)编码由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失，取代或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的并且具有脂肪酸去饱和酶活性的蛋白质的碱基序列；(C)编码与序列号2所示的氨基酸序列具有至少60％或60％以上的同源性的氨基酸序列构成的并且具有脂肪酸去饱和酶活性的蛋白质的碱基序列；(D)序列号1所示的碱基序列(马苏大麻哈鱼(Oncorhynchus masou)来源的Δ6脂肪酸去饱和酶基因的碱基序列)；(E)由在序列号1所示的碱基序列中缺失，取代或添加了1个或多个碱基的碱基序列构成的并且编码具有脂肪酸去饱和酶活性的蛋白质的碱基序列；(F)与序列号1所示的碱基序列在严紧条件下杂交并且编码具有脂肪酸去饱和酶活性的蛋白质的碱基序列；其中所谓“编码具有脂肪酸去饱和酶活性的蛋白质的碱基序列”是指编码以某种形式与鱼类体内不饱和脂肪酸的生成相关的蛋白质的碱基序列，其具体的作用机制没有特别的限定。
上述所谓“缺失，取代或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列”是指缺失，取代或添加了例如1-20个，优选1-15个，更优选1-10个，更优选1-5个任一数量的氨基酸的氨基酸序列。此外，所谓“缺失，取代或添加了1个或多个碱基的碱基序列”是指缺失，取代或添加了例如1-20个，优选1-15个，更优选1-10个，更优选1-5个任一数量的碱基的碱基序列。
例如，这些由缺失，取代或添加了1个或多个碱基的碱基序列构成的DNA(变异DNA)还可以通过化学合成，基因工程方法，诱变等本领域已知的任意方法制备。具体的是，对于由序列号1所示碱基序列构成的DNA，通过使用使之与作为变异原的药剂接触作用的方法，照射紫外线的方法，基因工程方法等，在这些DNA中导入变异，可以获得变异DNA。基因工程方法的其中一种，定点诱变法是一种可以在特定位置导入特定变异的方法，因此是非常有用，可以按照Molecular CloningA Laboratory Mannual，2ndEd.，Cold Spring Harbor，NY.，1989以后称为“分子克隆第2版”，Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1-38，JohnWiley&Sons(1987-1997)等中记载的方法进行。通过使用适当的表达系使这种变异DNA表达，可以获得由缺失，取代或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质。
上述所谓“与序列号2所示的氨基酸序列具有至少60％或60％以上的同源性的氨基酸序列”如果是与序列号2所示的氨基酸序列的同源性在60％或60％以上，没有特别的限制，例如是指60％或60％以上，优选70％或70％以上，更优选80％或80％以上，更优选90％或90％以上，特别优选95％或95％以上，最优选98％或98％以上。
上述所谓“在严紧条件下杂交的碱基序列”是指通过使用DNA或RNA等核酸作为探针，采用克隆杂交法，噬菌斑杂交法，或Southern印迹杂交法等获得的碱基序列，具体的可举例有，通过使用固定了克隆或噬菌斑来源的DNA或该DNA的片段的过滤器，在0.7-1.0M的NaCl存在下，在65℃下进行杂交后，用0.1-2倍左右的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成为150mM氯化钠，15mM柠檬酸钠)，在65℃条件下清洗过滤器，可以鉴定的DNA。杂交可以按照分子克隆第2版等中记载的方法进行。
例如，作为可以在严紧条件下杂交的DNA，可以例举有与作为探针使用的DNA的碱基序列具有一定或一定以上的同源性的DNA，例如，可以最佳例举有具有60％或60％以上，优选70％或70％以上，更优选80％或80％以上，更优选90％或90％以上，特别优选95％或95％以上，最优选98％或98％以上的同源性的DNA。
本发明的基因的获得方法和制备方法没有特别的限定，可以通过根据本说明书中公开的序列号1或2所示的氨基酸序列或碱基序列信息制备适当的探针和引物，用它们筛选预计存在该基因的cDNA文库，分离目的基因，或按照常规方法通过化学合成来制备。
具体的是，通过按照常规方法从分离了本发明的基因的马苏大麻哈鱼(Oncorhynchus masou)中制备cDNA文库，接着，使用本发明的基因特有的适当的探针从该文库中选择所希望的克隆，可以获得本发明的基因。作为上述cDNA的起源可以例举有上述植物来源的各种细胞或组织，此外，从这些细胞或组织中分离总RNA，分离和纯化mRNA，获得cDNA和其克隆等可以按照任一种常规方法实施。从cDNA文库中筛选本发明的基因的方法，例如，可以例举有，分子克隆第2版中记载的方法等本领域技术人员常用的方法。
此外，作为由上述(B)-(F)任一所示的碱基序列构成的本发明的变异基因或相同基因，可以通过以下方式分离利用具有序列号1所示的碱基序列或其一部分的DNA片段，在适当的条件下从其它生物体等中筛选该DNA的同系物。此外，还可以通过前述变异DNA的制备方法来制备。
接着，作为由鱼体内表达的脂肪酸去饱和酶生成的不饱和脂肪酸，根据所使用的脂肪酸去饱和酶的种类和脂肪酸基质的种类而不同，可以最佳例举有二十碳五烯酸(EPA)，和二十二碳六烯酸(DHA)，除DHA(226n-3)和EPA(205n-3)之外，可以列举LNA(183n-3)，OTA(184n-3)，ETA(204n-3)，DPA(225n-3)，TPA(245n-3)，THA(246n-3)，亚油酸(182n-6)，γ-亚麻酸(183n-6)，二十碳三烯酸(203n-6)，花生油烯酸(204n-6)，二十二碳五烯酸(225n-6)等。
作为本发明的不饱和脂肪酸含量增加的鱼类，如果是通过导入的脂肪酸去饱和酶基因表达其体内的不饱和脂肪酸含量增加的鱼类即可，可以是本来具有脂肪酸去饱和酶基因的鱼类，或者也可以是完全没有脂肪酸去饱和酶基因的鱼类，但是优选作为养殖对象的鱼类，肌肉组织等可食用部分中不饱和脂肪酸含量选择性上升的鱼类，和直至子代中都稳定表达脂肪酸去饱和酶基因的鱼类，作为鱼的种类，优选硬骨鱼类，在硬骨鱼类中，优选属于鲤科(Cyprinidae)，丽鱼科(Cichlidae)，鲑科(Salmonidae)，胡子鲇科(Clariidae)，鲇科(Siluridae)，鮠科(Ictaluridae)的属的鱼类。具体的是五条鰤(Seriola quinqueradiata)，真鲷(Pagrus major)，比目鱼(Paralichthys olivaceus)，河豚(Takifugu rubripes)，黄条鰤(Seriolaaureovittata)，虎虾(日本对虾，Penaeus japonicus)，虹鳟鱼(Oncorhyncusmykiss)，高体鰤(Seriola dumerili)，纵带鲹(Pseudocaranx dentex)，七带石斑鱼(Epinephelusseptemfasciatus)，金槐鱼(Thunnus thynnus)等养殖鱼，此外可以最佳例举有鲤(例如Cyprinus carpio)，斑马鱼(Danino rerio)，非洲鲶鱼(Clarias gariepinus)，罗非鱼(Oreochronis niloticus)，鲑鱼(Salmo Salar)，青鱂鱼(Oryzias latipes)等。
在构建将脂肪酸去饱和酶基因导入鱼类中的表达载体时，优选制备脂肪酸去饱和酶基因连结于在鱼类细胞中有效表达的启动子的下游的表达载体。作为这种启动子，可以例举有β-肌动蛋白启动子，脂肪细胞P2(aP2)启动子，Mylz2(Danio rerio myosin light polypeptide 2skeletal muscle mylz2)启动子，UCP启动子，SV40启动子，巨细胞病毒启动子，EF1α启动子，硫组氨酸甲基内金属盐(metallothionein)启动子，热激启动子等，这其中在表达效率方面优选β-肌动蛋白启动子，Mylz2启动子。此外，为了使mRNA稳定，优选在脂肪酸去饱和酶基因的下游连结牛生长激素聚腺嘌呤化序列等聚腺嘌呤化序列。此外，根据需要还可以使用具有使基因的表达增强的功能的内含子序列和增强子序列，指导转录终止的终止子序列。构建的表达载体向鱼类的导入，可以通过向卵母细胞或受精卵的显微注射法，病毒载体感染法，基因枪法，电穿孔法进行。
本发明的转基因鱼类方便起见还包括导入了脂肪酸去饱和酶基因的鱼成体，其后代，以及鱼受精卵细胞，鱼胚细胞等。
以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明，但是本发明的技术范围不限定于这些例示。
实施例1斑马鱼的饲养和食物使用AB株的斑马鱼(walker et al.，1999)，对Westerfield(1995)的摘要进行几处修正，使鱼产卵，饲养。在40立升的水槽中，以明14小时，暗10小时的光周期，28±1℃下饲养亲代鱼(broodstock)。每隔一天用otohime(商品名Nisshin公司制)和Artemia(Salt Creek公司制)无节幼体分别给鱼喂食。为了可以一天进行两次显微注射，在4个水槽中分别装入雌性12只和雄性8只。将这些水槽，分成两组，使1组在10:30am产卵，另一组在14:00pm产卵。
实施例2Δ6去饱和酶cDNA的克隆用两条基于GenBank数据库(AB070444)的变性引物，通过PCR从马苏大麻哈鱼(Oncorhynchus masou)的肝脏中分离Δ6去饱和酶样cDNA。这两条变性引物，正向和反向分别是(5’-TACTCCATGGTTCAGCAAATGAATTGAACA-3’)和(5’-TCGTCCATGGCCATTCACTGCTGACAAGGA-3’)，为了容易进行表达载体的克隆，两天引物各含有NcoI位点(下线部位)。在下述条件下进行PCR扩增。94℃下3分钟，接着94℃下30秒，62℃下30秒，进行30个循环，72℃下1.5分钟。然后，将1680bp的PCR扩增产物亚克隆到pGEM-TEasy载体(Promega公司制)中。
实施例3导入基因表达的构建使用8.5kb的质粒pArD6(图1)是导入基因表达。也就是说，用XhoI处理pRc/RSV(Invitrogen公司制)，然后将取出的牛生长激素(BGH poly(A))序列连接于pBluescriptSK(+/-)(Clontech公司制)。通过PCR用pOBA-109修饰3.7kb的青鱂鱼β-肌动蛋白启动子(mβ-肌动蛋白)(Takagi et al.，1994)，提供用于向含有BGH poly(A))的pBluescriptSK(+/-)的连结的EcoRI位点。实施例2中获得的1477kb的马苏大麻哈鱼(O.masou)的Δ6去饱和酶样基因(D6D)，作为两条基于GenBank数据库(AB070444)的寡核苷酸引物，使用含有SalI识别位点(下线部分)的正向引物SalI-desF3(5’-TTGTCGACGGTCTGAGTGGAGCAGAGAGAA-3’；序列号5)和反向引物-des-OmaR(5’-ATCCAGGAAATGTCCTCTCTGTTCGCA-3’；序列号6)，在94℃下3分钟，接着94℃下30秒，62℃下30秒，进行30个循环，72℃下1.5分钟的条件下进行PCR扩增。然后，将PCR扩增产物克隆到pGEM-TEasy载体(Promega公司制)中，用SalI处理，获得Δ6去饱和酶样基因片段，将其插入青鱂鱼β-肌动蛋白启动子(mβ-肌动蛋白)和BGH poly(A)序列之间，制备成pActD6构建体。
实施例4显微注射用DNA的制备以30μg/ml的浓度将实施例3中所得的环状DNA稀释于0.1M的KCl/0.125％的四甲基罗丹明葡聚糖中。用超MC离心分离过滤机0.22μm(MILLIPORE公司制)，4℃下以5000rpm在微量离心机中将DNA溶液旋转5分钟，除去混合的颗粒。将3-4μL的DNA移入到清洁的盖玻片上，为了防止蒸发用数滴矿物油覆盖。
实施例5显微注射板的制备为了制备显微注射板，将模子置于90nm陪替氏培养皿上，将约30ml的热的3％琼脂糖(用蒸馏水调制)注入板中。在室温下凝固琼脂糖后，除去模子，显微注射的针贯穿时制备用于支撑胚胎的12个沟。用塑料制盖板覆盖使用的板，于4℃保存直至使用。
实施例6显微注射针的配置用微细的玻璃的显微注射毛细管，以micropipette plur(Narishige(ナリシゲ)公司制)(图2A)制备显微注射针。显微注射针的尖端约5-8μm。针固定在支架上，从注射器，向右传递到显微操纵器，通向氟树脂制管，在针中填充矿物油。
实施例7显微注射的设置显微注射使用由立体化学显微镜，显微注射过程中使用由控制实施例6中制备的显微注射针的显微操纵器，DNA负荷用的附属于显微操纵器的磁性架台(Narishige(ナリツゲ)公司制)，塑料制双制动器(twistopper)，氟树脂制管(Narishige(ナリシデ)公司制)和显微注射板构成的系统进行。将安装了针支架的DNA负荷用显微操纵器安装在固定于金属面上的磁性架台上，用3ml矿物油填充注射器，直接安装于双制动器(twistopper)上，该双制动器(twistopper)固定在安装于显微注射针支架上的1mm的氟树脂制管的约40cm的部分上。
实施例8卵的回收和显微注射显微注射的当天，在进行照明操作至少15分钟前，将实施例1的3尾雄性和2尾磁性斑马鱼从水槽中转移到3L的饲养槽中。产卵约15分钟后将卵回收于陪替氏培养皿中。用移液管将1细胞器胚胎转移到实施例5制备的显微注射板的沟中。胚盘需要面向显微注射板。用实施例7的纤维注射系统进行将实施例4获得的DNA溶液显微注射到显微注射板上的1细胞器胚胎的细胞质中。于28±1℃下保存注入了DNA的胚胎。在受精5-6小时后除去非受精卵和变形的卵。第二天除去死亡或变形的胚胎，将健康的胚胎重新转移到新的陪替氏培养皿中。
实施例9RNA分离和半定量的RT-PCR为了分离mRNA，受精8小时后取出20个胚胎的试样，定量转录水平。用ISOGEN(Nippon Gene公司制)按照制造者的说明分离总RNA。用2U/μg RQ 1Rnase-free Dnase(Promega公司制)，在37℃下分解微量的DNA30分钟。苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀后，溶解于经二乙基焦磷酰胺(DEPC)处理的水中。用Ready-to-Go You-Prime First-Strand Beads(Amersham PharmaciaBiotech公司制)从2-3μg总RNA中按照制造者的说明合成单链cDNA。在该反应中，使用dT3RACE-VECT引物(5’-GTAATACGAATAACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGG(T)7-3’；序列号7)。
为了定量外源去饱和酶基因的转录水平，进行半定量的RT-PCR。以2μlcDNA作为模板，使用20μl的10×Ex Taq缓冲液，200μM的dNTP，0.125U的Ex Taq聚合酶(Takara公司制)在下述条件下进行PCR分析。94℃下3分钟，接着94℃下30秒，62℃下30秒，进行24个循环，72℃下1.5分钟。使用Omar(5’-AGGACTGGCTCACCATGCAGTTGAGT-3’；序列号8)作为脱氢酶用的正向引物，使用前述des-Omar(序列号4)作为反向引物。分析β-肌动蛋白基因表达作为等量的RNA负荷的内部标准。使用(5’-ACTACCTCATGAAGATCCTG-3’；序列号9)作为β-肌动蛋白基因的正向引物，使用(5’-TTGCTGATCCACATCTGCTG-3’；序列号10)作为反向引物。用0.7％琼脂糖对2μl反应液进行电泳，然后分离，用溴化乙锭染色，用紫外线照射摄影。为了制备稳定的系统使用显示最强表达的构建体。
用FO中使用的方法分析F1和F2的去饱和酶基因表达。从一尾DNA阳性的鱼的鳍，肝脏，肌肉中提取总RNA，鉴定了F1中外源基因的表达。从至少20尾2日龄的鱼苗和至少10尾成年鱼的肌肉和肝脏中提取F2世代的总RNA。
实施例10DNA分离和PCR扩增以从尾鳍组织中提取的DNA为模板通过PCR进行转基因个体的鉴定。从DNA阳性FO和非转基因鱼交配生产的2日龄的保存的鱼苗提取DNA，鉴定生殖系传递物质。使用DNA分离试剂盒(Puregene制)按照制造者的说明进行基因组DNA的分离。PCR反应和使用的引物与RT-PCR中使用的方法相同。
实施例11稳定株的制备将DNA阳性FO饲养至成年鱼。使成熟的FO与非转基因斑马鱼交配，为了筛选传递生殖系的鱼，累积通过交配获得的至少20尾2日龄的鱼苗。接着，用生殖系阳性的FO制备出F1和F2世代。F1和F2的制备和筛选过程与FO中使用的方法相同。
实施例12脂肪酸分析从含有马苏大麻哈鱼(Oncorhynchus masou)来源的Δ6去饱和酶基因的非转基因鱼和转基因鱼中提取总脂肪酸。非转基因鱼和转基因鱼，在同一水槽中饲养，从所有的鱼中提取总脂肪酸。用装备有氢框架离子化感知器和毛细管柱30m×0.32mm×0.25μm(Supelco公司制)的气相色谱(Shimadzu 14BShimadzu公司制)分离提取的脂肪酸，用文献(引用文献)记载的方法从脂肪酸中制备脂肪乙酯(FAME)。通过上述气相色谱的测定，通过将保持时间与适当的FAME标准(Supelco公司制)比较鉴定脂肪乙酯峰。
实施例13稳定系统的制备结果受精8小时后，用由从注入瞬间的外源基因表达的胚胎中提取的RNA合成的cDNA分析外源基因的瞬间表达。显示瞬间表达的结果示于图2。此外，从DNA阳性的鱼的鳍，肝脏，肌肉中提取总RNA，鉴定了F1中外源基因表达的结果示于图3。图3中，还记载了除了使用Mylz2启动子代替青鱂鱼来源的β-肌动蛋白启动子之外其它均相同的条件下进行的结果。如图3中可见，可以使用青鱂鱼β-肌动蛋白启动子和Mylz2启动子中的任一种启动子，在鳍中和肌肉中发现了外来基因的表达。
使用马苏大麻哈鱼(Oncorhynchus masou)去饱和酶基因特异的引物从由鳍提取的基因组DNA中通过PCR扩增筛选除转基因个体。为了筛选传递生殖系的鱼，使DNA阳性鱼与非转基因鱼交配，结果示于表1和图4中。如表1所示，400个注入DNA的胚胎中形成109尾成年鱼，这其中有4尾在胚细胞中带有pActD6基因构建体。使用这些鱼制备出F1和F2世代。外源基因的向F1世代的传递率，如表2所示，在4.2％至44.1％间变化。根据这些结果，确认了转基因FO鱼是嵌合体。使用通过RT-PCR分析的具有更高mRNA转录水平的F1转基因株，制备F2世代。F1鱼的代表性的外源基因的表达示于图5中。导入基因的向F2世代的传递通过孟德尔的分离方式进行。这些结果证实各F1的转基因系统的所有的二倍体细胞含有转基因。



实施例14转基因鱼中的脂肪酸组成从非转基因和转基因两种鱼的全身制备脂肪乙酯(FAME)，用气相色谱(GC)分析。转基因鱼的n-3脂肪酸构成组成示于表3中。在表达马苏大麻哈鱼(Oncorhynchus masou)去饱和酶基因的转基因鱼中的EPA和DHA的生产是对应的非转基因鱼的1.4±0.1倍(1.86±0.03mg/g对1.32±0.05mg/g)和2.1±0.2倍(4.62±0.22mg/g对2.22±0.08mg/g)(p＜0.05＝。但是，转基因系统间的EPA和DHA的生产量存在相当高比例的差异。在可食用部分中EPA和DHA的生产量分别为所有鱼中的75％和78％。


表3所示的结果是3次实验的平均值±标准偏差(SD)。用SD＝0.0表示SD＜0.005。括弧内的数值表示各脂肪酸在所有脂肪酸内的比率。在同一水槽中饲养非转基因鱼和转基因鱼。用GC分析定量的脂肪酸甲酯从所有的鱼中提取所有脂肪酸。构建物后面的数字表示各个转基因株。
为了确认导入的基因是Δ6去饱和酶还是Δ5去饱和酶，计算不饱和化基质以外的脂肪酸。如图所示，转基因鱼的Δ6和Δ5不饱和化生成物比非转基因鱼高(p＜0.05)。表示导入基因的Δ6不饱和化脂肪酸生成物的更高值是由外源Δ6脱氢酶产生的。
序列表<110>独立行政法人科学技术振兴机构(Japan Science and Technology Agency)<120>不饱和脂肪酸含量增加的转基因鱼<130>2005C2529<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1692<212>DNA<213>马苏大麻哈鱼<400>1tgtcattcga tattttcagc aaatgaattg aacaacacat tttgttgtac aacgctgtct 60ggaaaacatc tcccttccct ctggcagaag aatcgcagtg tgtttcagtt ggacagactg120gacagagtgc agccgacaca gcgacggtgt gagtggagca gagagaaccg aggatggggg180gcggaggtca gcagacggag tcaagcgagc cggccaaggg tgacggggtt gggcccgatg240gagggcgagg tggcagtgca gtctacacct gggaagaggt ccagaagcac tgccacagaa300gcgaccagtg gttggtcatc gacaggaagg tctataatat tacccagtgg gcgaagagac360acccaggggg catcagggtc atcagtcact ttgctggaga agatgccacg gaagcatttg420tcgcattcca tctcgaaccg aattttgtca ggaagtttct gaagccgttg ctgattggag480agctggcacc gacagagccc agccaggacc aggggaaaaa tgcagtactg gtgcaggact540
tccaggccct gcgtgaccgt gtggagagtg agggtctcct ccgtgcccgc cccctcttct 600tcagcctcta cctgggccac atcctgctac tagaggccct ggctttgggc ctgctctggg 660tctgggggac cagctggagc ctcacactgc tctgttccct catgctggcc acgtctcagg 720cccaggctgg ctggctgcag catgactacg gccacctgtc agtctgcaag aaatctggct 780ggaaccacaa actgcacaag tttgtcattg gacacctaaa gggtgcctct gctaactggt 840ggaaccatcg tcacttccag caccacgcta agcccaacgt gtttagtaaa gatcctgata 900tcaactcact gcatgtcttc gtcctgggag acaaacagcc tgtagagtat ggtataaaga 960agttgaagta catgccctac catcaccaac accagtactt cttcctcgtt ggacctccac1020tcatcgttcc agtgtttttc aacatccaga tattccggac catgttttca caacgagact1080gggtggatct ggcgtgggcg atgactttct accttcgctt cttctgctgt tactatccct1140tctttggttt ctttggctca gtagcattga tcagcttcgt caggtttttg gaaagccact1200ggtttgtatg ggtgacccag atgagtcacc ttccgatgga gatggatcac gagagacacc1260aggactggct caccatgcag ttgagtgcta cttgcaacat tgaacagtca accttcaacg1320actggttcag tggacacctc aactttcaga ttgaacacca tctgtttcct accatgcccc1380gtcataacta ccacctggta gctcctctgg ttcgtgcttt gtgtgagaaa catggagttc1440cctaccaggt caagactttg cagaaaggca tgactgatgt tgtcaggtca ctgaagaagt1500caggggatct gtggctggat gcgtatctcc ataaataaat cccttcctga ctctggacgg1560gatttaatcc atcgcagatt aacgacctgc gaacagagag gacatttcct ggatgttttt1620
gatgataatg atcgctgcaa acattattgt gatataattg ttttaatcct tgtcagcagt1680gaatggggat cc1692<210>2<211>454<212>PRT<213>马苏大麻哈鱼<400>2Met Gly Gly Gly Gly Gln Gln Thr Glu Ser Ser Glu Pro Ala Lys Gly1 510 15Asp Gly Val Gly Pro Asp Gly Gly Arg Gly Gly Ser Ala Val Tyr Thr20 2530Trp Glu Glu Val Gln Lys His Cys His Arg Ser Asp Gln Trp Leu Val35 40 45Ile Asp Arg Lys Val Tyr Asn Ile Thr Gln Trp Ala Lys Arg His Pro50 5560Gly Gly Ile Arg Val Ile Ser His Phe Ala Gly Glu Asp Ala Thr Glu65 70 75 80Ala Phe Val Ala Phe His Leu Glu Pro Asn Phe Val Arg Lys Phe Leu85 90 95
Lys Pro Leu Leu Ile Gly Glu Leu Ala Pro Thr Glu Pro Ser Gln Asp100 105 110Gln Gly Lys Asn Ala Val Leu Val Gln Asp Phe Gln Ala Leu Arg Asp115 120 125Arg Val Glu Ser Glu Gly Leu Leu Arg Ala Arg Pro Leu Phe Phe Ser130 135 140Leu Tyr Leu Gly His Ile Leu Leu Leu Glu Ala Leu Ala Leu Gly Leu145 150 155 160Leu Trp Val Trp Gly Thr Ser Trp Ser Leu Thr Leu Leu Cys Ser Leu165 170 175Met Leu Ala Thr Ser Gln Ala Gln Ala Gly Trp Leu Gln His Asp Tyr180 185 190Gly His Leu Ser Val Cys Lys Lys Ser Gly Trp Asn His Lys Leu His195 200 205Lys Phe Val Ile Gly His Leu Lys Gly Ala Ser Ala Asn Trp Trp Asn210 215 220His Arg His Phe Gln His His Ala Lys Pro Asn Val Phe Ser Lys Asp225 230 235 240
Pro Asp Ile Asn Ser Leu His Val Phe Val Leu Gly Asp Lys Gln Pro245 250 255Val Glu Tyr Gly Ile Lys Lys Leu Lys Tyr Met Pro Tyr His His Gln260 265 270His Gln Tyr Phe Phe Leu Val Gly Pro Pro Leu Ile Val Pro Val Phe275 280 285Phe Asn Ile Gln Ile Phe Arg Thr Met Phe Ser Gln Arg Asp Trp Val290 295 300Asp Leu Ala Trp Ala Met Thr Phe Tyr Leu Arg Phe Phe Cys Cys Tyr305 310315 320Tyr Pro Phe Phe Gly Phe Phe Gly Ser Val Ala Leu Ile Ser Phe Val325 330 335Arg Phe Leu Glu Ser His Trp Phe Val Trp Val Thr Gln Met Ser His340 345 350Leu Pro Met Glu Met Asp His Glu Arg His Gln Asp Trp Leu Thr Met355 360 365Gln Leu Ser Ala Thr Cys Asn Ile Glu Gln Ser Thr Phe Asn Asp Trp370 375 380
Phe Ser Gly His Leu Asn Phe Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr385 390 395 400Met Pro Arg His Asn Tyr His Leu Val Ala Pro Leu Val Arg Ala Leu405 410 415Cys Glu Lys His Gly Val Pro Tyr Gln Val Lys Thr Leu Gln Lys Gly420 425 430Met Thr Asp Val Val Arg Ser Leu Lys Lys Ser Gly Asp Leu Trp Leu435 440 445Asp Ala Tyr Leu His Lys450<210>3<211>30<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>正向引物<400>3tactccatgg ttcagcaaat gaattgaaca30<210>4<211>30<212>DNA<213>人工系列
<220>
<223>反向引物<400>4tcgtccatgg ccattcactg ctgacaagga30<2l0>5<211>30<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>正向引物<400>5ttgtcgacgg tctgagtgga gcagagagaa30<210>6<211>27<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>反向引物<400>6atccaggaaa tgtcctctct gttcgca 27<210>7<211>48<212>DNA<213>人工系列
<220>
<223>d T3 RACE-VECT引物<400>7gtaatacgaa taactatagg gcacgcgtgg tcgacggccc gggctggt48<210>8<211>26<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于脱氢酶的正向引物<400>8aggactggct caccatgcag ttgagt26<210>9<211>20<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>β-肌动蛋白正向引物<400>9actacctcat gaagatcctg 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工系列
<220>
<223>β-肌动蛋白反向引物<400>10ttgctgatcc acatctgctg20
权利要求
1.导入脂肪酸去饱和酶基因，通过该脂肪酸去饱和酶基因的表达，不饱和脂肪酸含量增加的转基因鱼。
2.权利要求1记载的转基因鱼，其特征在于所述脂肪酸去饱和酶基因连结于青鱂鱼来源的β-肌动蛋白启动子的下游。
3.权利要求1或2记载的转基因鱼，其特征在于所述脂肪酸去饱和酶基因连结于牛生长激素聚腺嘌呤化序列的上游。
4.根据权利要求1-3任一项记载的转基因鱼，其特征在于所述脂肪酸去饱和酶基因是由以下(A)-(F)任一项的碱基序列构成的基因(A)编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质的碱基序列；(B)编码由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失，取代或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的并且具有脂肪酸去饱和酶活性的蛋白质的碱基序列；(C)编码与序列号2所示的氨基酸序列具有至少60％或60％以上的同源性的氨基酸序列构成的并且具有脂肪酸去饱和酶活性的蛋白质的碱基序列；(D)序列号1所示的碱基序列；(E)由在序列号1所示的碱基序列中缺失，取代或添加了1个或多个碱基的碱基序列构成的并且编码具有脂肪酸去饱和酶活性的蛋白质的碱基序列；(F)与序列号1所示的碱基序列在严紧条件下杂交并且编码具有脂肪酸去饱和酶活性的蛋白质的碱基序列。
5.根据权利要求1-4任一项记载的转基因鱼，其特征在于所述不饱和脂肪酸是二十碳五烯酸(EPA)，和二十二碳六烯酸(DHA)。
6.根据权利要求1-5任一项记载的转基因鱼，其特征在于其是养殖鱼。
全文摘要
本发明设法可以利用更便宜且品质容易管理的植物性油脂，而不使用含有EPA，DHA的鱼油作为养殖海产鱼用的配合饲料，不仅可以在种苗生产场所，对成本和劳动力的减轻作出具有巨大贡献，而且可以生产显示出高活力，处理抗性和低温抗性的鱼苗。通过导入脂肪酸去饱和酶基因，表达该脂肪酸去饱和酶基因的不饱和脂肪酸含量增加的鱼类，该脂肪酸去饱和酶基因选自于Δ4脂肪酸去饱和酶基因，Δ5脂肪酸去饱和酶基因和Δ6脂肪酸去饱和酶基因中的一种或两种，它们优选淡水鱼来源的脂肪酸去饱和酶基因，所述淡水鱼来源的脂肪酸去饱和酶基因优选可促进通过青鱂鱼来源的β－肌动蛋白启动子的表达的基因。
文档编号C12N15/53GK1988796SQ200580009559
公开日2007年6月27日 申请日期2005年3月28日 优先权日2004年3月31日
发明者吉崎悟朗, 竹内俊郎, 佐藤秀一, 奇龙维斯旺纳特, 阿利穆丁 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构