病毒载体的制备方法

专利名称：病毒载体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种依赖于蛋白酶增殖的病毒载体的改良的制备方法。
背景技术：
许多病毒的结构蛋白质受到蛋白酶的加工之后方表现活性。为了以重组病毒的形式制备这种病毒载体，需要使病毒在这种蛋白酶的存在下增殖。例如负链RNA病毒的包膜中包含的F蛋白质就是一种这样的蛋白质，F蛋白质(F0)通过被由宿主来源的蛋白酶切割为F1和F2之后才显示出感染性。
负链RNA病毒仙台病毒(SeV)具有基因导入效率(感染性)高，搭载基因表达量高等特点，因此可期望其成为一种有效的基因导入用载体。此外，未发现其对人有病原性，而且也没有其基因整合到基因组等的遗传毒性，因此被认为具有较高的安全性(Lamb，R.A.&Kolakofsky，D.ParamyxoviridaeThe Virus And TheirReplication.P.1177-1204.In B.N.Fields，D.M.Knipe，and P.M.Howley(ed.)，FieldsVirology.Lippincott-Raven，Philadelphia，Pa(1996))。从这些方面考虑，仙台病毒作为“细胞质型基因导入载体”，作为与常规的载体不同的新型载体正处于研究和开发的阶段中。特别地，以人类的基因治疗为目的，正在尝试通过使病毒基因组的一部分基因从基因组中缺失来改变病毒，以获得具有高度安全性的病毒载体。
例如F基因缺失型SeV等基因缺失型仙台病毒的情况，为了可以高效价地回收，需要包装细胞以反式供给所缺失的蛋白，制得所述包装细胞是最重要的因素之一。迄今为止，已经开发了F基因缺失型SeV载体(SeV/ΔFLi，H.-O.et al.，J.Virol.74，6564-6569(2000))或M基因缺失型SeV载体(SeV/ΔMInoue，M.et al.，J.Virol.77，6419-6429(2003))等生产系统，制备了可以反式供给F蛋白质或M蛋白质的包装细胞。通过从基因组中缺失感染和融合必需的F基因，感染性粒子不会从感染细胞中释放出，由此载体被修饰成非传播型载体。通过从基因组中缺失粒子形成所必需的M基因，可以将从感染细胞中释放的粒子抑制到检测界线以下。尤其是，SeV/ΔF在导入细胞内其基因组可以自主复制，因此成为非传播型而仍然维持有高表达搭载基因的能力，该技术现已形成划时代的技术。
SeV尽管利用细胞中普遍存在的唾液酸作为其受体，但在其宿主动物(啮齿类等)的体内显示出范围非常狭窄的组织趋向性。例如，仅在小鼠的呼吸道或鸡受精卵的绒膜尿囊液中有效增殖。这种趋向性的限制依赖于F蛋白质的活化所必需的特异性蛋白酶的定位(Nagai，Y.Trends Microbial1，81-87(1993))，在受精卵的尿囊绒膜中血液凝集因子Xa(Gotoh，B.et al.EmboJ 9，4189-4195(1990))起作用，在小鼠呼吸道的上皮细胞中类胰蛋白酶Clara起作用(Kido，H，et al.J Boil Chem.267，13573-13579(1992))。对于这些蛋白酶，F蛋白(F0蛋白)的切割基序为Q-S-R。由于在大部分的细胞类型的培养系统中不表达活化F蛋白(切割F0蛋白的Q-S-R基序)的蛋白酶，为了在体外增加SeV，需要添加低浓度的胰蛋白酶以替代天然蛋白酶(7.5μg/ml)(Homma，M.&Ouchi，M.J Virol 12，1457-1465(1973))。
即使在制备F基因缺失型SeV载体(SeV/ΔF)时，同样也需要F蛋白的活化，需要在载体产生时添加胰蛋白酶，并且为了使胰蛋白酶起作用需要在无血清条件下培养。这种在无血清条件的胰蛋白酶存在下的培养对细胞来说是极为苛酷的条件，对于大部分细胞可以维持细胞的期间非常短，无法发挥作为包装细胞的功能。实际上可以作为包装细胞使用的细胞仅限于猴肾细胞LLC-MK2细胞或仓鼠肾细胞BHK-21细胞等数种细胞。也就是说，在无血清条件下的胰蛋白酶存在的培养条件下，只有极少数种类的细胞可以用作包装细胞使用。
非专利文献1Lamb，R.A.&Kolakofsky，D.ParamyxoviridaeThe Virus AndTheir Replication.P.1177-1204.In B.N.Fields，D.M.Knipe，andP.M.Howley(Ed.)，Fields Virology.Lippincott-Raven，Philadelphia，Pa(1996)非专利文献2Li，H.-O.et al.，J.Virol.74，6564-6569(2000)非专利文献3Inoue，M.et al.，J.Virol.77，6419-6429(2003)非专利文献4Nagai，Y.Trends Microbiol 1，81-87(1993)非专利文献5Gotoh，B.et al.Embo J 9，4189-4195(1990)非专利文献6Kido，H，et al.J Boil Chem.267，13573-13579(1992)非专利文献7Homma，M.&Ouchi，M.J Virol 12，1457-1465(1973)
发明的公开发明要解决的问题本发明提供了一种制备依赖于蛋白酶增殖的病毒的方法，该方法不依赖于所述蛋白酶，而是使用其它蛋白酶。本发明的方法可以有效制备病毒载体。
用于解决问题的方法如上所述，在病毒生产时需要蛋白酶的情况下，存在如下问题为了使该蛋白酶起作用，细胞的存活力就会下降，因此在病毒生产中可以使用的细胞被限于极少数种类。在生产病毒载体时，通过从病毒生产细胞(包装细胞)中出芽和被释放，来产生具有感染性的子代粒子。此时，可以预想到子代粒子中混入肌动蛋白等包装细胞来源的细胞质成分(和细胞膜成分)。实际上，一般认为在考虑对人类的基因治疗时，例如在需要大量给药病毒载体时，混入粒子中的细胞质成分(和细胞膜成分)，优选不是猴细胞来源或仓鼠细胞来源而是人细胞来源。但是，例如仙台病毒等情况，由于需要使用可以在上述这种“无血清条件下的胰蛋白酶存在下的培养条件”下生存的细胞，因此可以作为包装细胞利用的细胞种类仅限于极少数种类，难以应用于人类细胞。于是本发明人尝试开发了可以在大部分细胞中应用的培养条件的病毒制备的方法。
细胞的反式高尔基网(trans-Golgi network)、细胞表面和内含体中存在一种称为弗林蛋白酶(furin)的膜结合型丝氨酸内切蛋白酶。弗林蛋白酶的表达是比较普遍的，几乎在所有的组织细胞中表达，而且不仅参与细胞内蛋白，而且还参与膜蛋白和分泌蛋白的加工(Seidah，N.G&Chretien，M.BrainRes.845，45-62(1999)，Bergeron，F.et al.，J.Mol.Endocrinol.24，1-22(2000)，SteinerD.F.Curr.Opin.Chem..Boil.231-39(1998))。有的病毒的膜蛋白也受到弗林蛋白酶的加工，在副粘病毒科的病毒F蛋白质中，全脏器趋向性病毒或部分强毒株多具有弗林蛋白酶识别序列(Toyoda，T et al.，Virology157，242-247(1987))。例如，NDV的强毒株(Nagai，Y.Virology 72，494-5-8(1976))，麻疹病毒和腮腺炎病毒，或HRSV和HPIV-3(Nagai，Y.TrendsMicrobiol 1，81-87(1993))等都具有弗林蛋白酶识别序列。另一方面，典型的局部感染型SeV和HPIV-1则不具有弗林蛋白酶识别序列(病毒学，畑中正一编辑，东京，朝仓书店，1997.pp.247-248)。
本发明人认为，如果利用不取决于细胞种类而普遍表达的弗林蛋白酶的活性，就可以使与细胞株无关的方式制备病毒成为可能。也就是说，如果可以制备导入了插入有弗林蛋白酶识别序列的F基因的包装细胞，则不需要在培养基中添加用于使F蛋白质活化的胰蛋白酶，进而，也不需要造成无血清状态。由于在培养条件上没有限制，因此可以作为包装细胞使用的细胞的可选范围扩大了，尤其是可以利用人类细胞制备包装细胞。
同样的方法也可以应用于副粘病毒科以外的病毒载体的生产。例如，对于其它科的病毒，膜融合活性的表达以病毒前体糖蛋白质的经蛋白酶的切割加工为前提，例如人流感病毒A是具有局部感染型的序列(没有弗林蛋白酶识别序列)，而包括艾滋病毒在内的许多病毒则具有全脏器趋向性的序列(有弗林蛋白酶识别序列)。如此，对于许多病毒来说，由于病毒糖蛋白质前体的通过宿主蛋白酶的活化是控制病毒趋向性的重要因素，因此可以认为本发明的方法不限于副粘病毒，可以应用于多种制备病毒载体的包装细胞。
也就是说，本发明涉及一种制备依赖于蛋白酶增殖的病毒，而不依赖于所述蛋白酶的方法，更为具体的是涉及权利要求的各项中记载的发明。并且，本发明还涉及由权利要求的各项中记载的发明的一种或多种(或全部)所希望的组合构成的发明，尤其是涉及由引用同一独立权利要求项(与不包括于其它项中记载的发明的发明相关的权利要求)的权利要求项(从属权利要求)中记载的发明的1种或多种(或全部)所希望的组合构成的发明。各独立权利要求中记载的发明还指由这些从属权利要求的任意组合构成的发明。也就是说，本发明涉及，[1]一种制备依赖于通过蛋白酶对病毒蛋白质的切割而增殖的病毒的方法，该方法包括在(i)所述病毒蛋白质的由该蛋白酶识别的切割序列被改变为其它蛋白酶的切割序列的经修饰的病毒蛋白质，以及(ii)其它蛋白酶的存在下使该病毒产生的过程，产生的病毒含有被切割的所述经改变的蛋白质，不含有编码所述经改变的蛋白质的基因；[2]根据[1]中记载的方法，所制备的病毒携带有编码具有野生型切割序列的所述病毒蛋白质的基因；[3]根据[1]中记载的方法，所制备的病毒是缺失了编码所述病毒蛋白质的基因的非传播性病毒；[4]根据[1]至[3]任一项中记载的方法，所述其它蛋白酶是在生产病毒的细胞中内源性表达的蛋白酶；[5]根据[1]至[4]任一项中记载的方法，所述其它蛋白酶是弗林蛋白酶；[6]根据[1]至[5]任一项中记载的方法，所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg；[7]根据[1]至[5]任一项中记载的方法，所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Arg-Arg-Arg；[8]根据[1]至[7]任一项中记载的方法，所述病毒为负链RNA病毒；[9]根据[8]中记载的方法，所述负链RNA病毒为副粘病毒科病毒；[10]根据[8]中记载的方法，所述负链RNA病毒为仙台病毒；[11]一种载体，该载体编码经修饰的病毒蛋白质，在该经修饰的病毒蛋白质中，蛋白酶切割序列被改变为其它蛋白酶的切割序列，所述蛋白酶切割序列是其增殖依赖于该蛋白酶对病毒蛋白质的切割的病毒中病毒蛋白质的蛋白酶切割序列，其中，该载体是在该病毒的生产细胞中无法增殖的病毒载体或非病毒载体；[12]根据[11]中记载的载体，其为质粒；[13]根据[11]或[12]中记载的载体，其中所述经修饰的病毒蛋白质可以通过重组酶诱导表达；[14]根据[13]中记载的载体，其中所述重组酶为Cre或Flp；[15]根据[11]至[14]任一项中记载的载体，其中所述其它蛋白酶为在生产病毒的细胞中内源性表达的蛋白酶；[16]根据[11]至[15]任一项中记载的载体，其中所述其它蛋白酶是弗林蛋白酶；[17]根据[11]至[16]任一项中记载的载体，其中所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg；[18]根据[11]至[16]任一项中记载的载体，其中所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Arg-Arg-Arg；[19]根据[11]至[18]任一项中记载的载体，其中所述病毒蛋白质为负链RNA病毒的F蛋白质；[20]根据[19]中记载的载体，其中所述负链RNA病毒为副粘病毒科病毒；[21]根据[19]中记载的载体，其中所述负链RNA病毒为仙台病毒；[22]含有[11]至[21]任一项中记载的载体的哺乳动物细胞；[23]根据[22]中记载的细胞，其中所述细胞为用于生产依赖于蛋白酶对病毒蛋白质的切割而增殖的病毒的细胞；[24]根据[22]或[23]中记载的细胞，其中所述编码经修饰的病毒蛋白质的基因整合于该细胞的染色体中；[25]根据[22]至[24]任一项中记载的细胞，其为人类细胞；[26]一种依赖于通过蛋白酶对病毒蛋白质的切割而增殖的病毒的改变的病毒，其含有被改变为其它蛋白酶的切割序列的经修饰的蛋白质，但不含有编码所述经修饰的病毒蛋白质的基因；[27]根据[26]中记载的经修饰的病毒，其中所制备的病毒携带编码具有野生型切割序列的所述病毒蛋白质的基因；[28]根据[26]中记载的经修饰的病毒，所述病毒是缺失了编码所述病毒蛋白质的基因的非传播性病毒；[29]根据[26]至[28]任一项中记载的经修饰的病毒，其中所述其它蛋白酶是在生产病毒的细胞中内源性表达的蛋白酶；[30]根据[26]至[29]任一项中记载的经修饰的病毒，其中所述其它蛋白酶是弗林蛋白酶；[31]根据[26]至[30]任一项中记载的经修饰的病毒，其中所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg；[32]根据[26]至[30]任一项中记载的经修饰的病毒，其中所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Arg-Arg-Arg；[33]根据[26]至[32]任一项中记载的经修饰的病毒，其中所述病毒为负链RNA病毒；[34]根据[33]中记载的经修饰的病毒，所述负链RNA病毒为副粘病毒科病毒；[35]根据[33]中记载的经修饰的病毒，所述负链RNA病毒为仙台病毒。
所谓本发明中的病毒载体是指具有感染力的病毒粒子，用于在细胞中导入基因的载体。这里所称的“感染力”是指通过病毒载体与细胞的接触能够将载体中所含基因导入到细胞内部的能力。此外，本发明中的病毒载体中包括带有外来基因的载体，也包括不带有外来基因的载体。本发明的病毒的制备方法可以应用于具有传播能力的病毒载体的制备，以及没有传播能力的缺陷型载体的制备这两方面。这里所称的“具有传播能力”是指在病毒载体感染宿主细胞时，病毒在该细胞中复制，产生感染性病毒粒子。
所谓重组病毒是指以重组多核苷酸介导生成的病毒，或者这种病毒的扩增产物。所谓重组多核苷酸是指两端或一个末端不以与自然的状态相同的方式结合的多核苷酸。具体的是，重组多核苷酸是多核苷酸链的结合被人为改变(切割和/或结合)的多核苷酸。重组多核苷酸可以通过多核苷酸合成、核酸酶处理、连接酶处理等进行组合，通过公知的基因重组方法来构建。可以通过表达编码有通过基因操作构建的病毒载体的多核苷酸，并重建病毒，来生成重组病毒。
本发明中所称基因是指遗传物质，是指编码转录单位的核酸。基因可以是RNA，也可以是DNA。本发明中编码蛋白质的核酸称为该蛋白质的基因。此外，一般来说该基因也可以不编码蛋白质，例如基因也可以编码核酶或反义RNA等功能RNA。一般来说，基因可以是天然来源或人为设计的序列。此外，本发明中所谓“DNA”包括单链DNA和双链DNA。此外，所谓编码蛋白质是指正义或反义地(例如负链RNA病毒中)含有编码该蛋白质的氨基酸序列的ORF，以使得多核苷酸在适当条件下可以表达该蛋白质。
附图的简要说明

图1是仙台病毒F蛋白质的活化位点的序列的模式图。
图2是表示在F基因活化位点具有弗林蛋白酶识别序列(F(furin)R-Q-K-R)的F基因表达质粒的构建图解。
图3是表示在F基因活化位点具有弗林蛋白酶识别序列(F(5R)(R)-R-R-R-R)的F基因表达质粒的构建图解。
图4是表示pCAGGS(B型)和pCAGGS(BSX)的构建步骤的图。
图5是表示pCALNdLWE-zeo-NP(Z)的构建步骤的图。
图6是表示pCAGGS-P4C(-)的构建步骤的图。
图7是表示pCAGGS-L(TDK)的构建步骤的图。
图8是表示pCAGGS-F的构建步骤的图。
图9是表示pCAGGS-T7的构建步骤的图。
图10是表示pCAGGS-SeV和pCAGGS-SeV/ΔF-GFP的构建步骤的图。
图11是表示pCAGGS-SeV和pCAGGS-SeV/ΔF-GFP的构建步骤的图(续自图10)。
图12是表示pCAGGS-SeV的构建步骤的图(续自图11)。
图13是表示通过CIU测试研究HamRbz法中使基因组DNA的量变化时的SeV/ΔF-GFP的回收效率的结果的图。使用2μg或2μg以上的量时，回收效率几乎没有变化。
图14是表示对通过HamRbz法在回收SeV/ΔF-GFP时pCAGGS-F和pCAGGS-F5R的回收效率进行研究的结果的图。使用pCAGGS-F5R时回收效率大大提高。
图15是表示通过pCAGGS-T7法回收的传播型SeV(SeV(TDK)18+GFP)的HA测试的结果的照片。仅有用未稀释的BHK-21，BHK/T7，293T接种鸡卵时才检测到了HA活性。
图16是通过CIU测试研究pCAGGS-T7法中使基因组DNA的量变化时的SeV/ΔF-GFP的回收效率的结果的图。使用0.5μg-5μg的量，回收效率几乎没有变化，但是使用5μg时回收效率最好。
图17是通过CIU测试研究pCAGGS-T7法中使导入试剂变化时的SeV18+GFP/ΔF的回收效率的结果的图。使用磷酸钙时显示出与TransIT-LT-1时同等的或更高的回收效率。
图18是通过CIU测试研究pCAGGS-T7法中使细胞种类变化时的SeV/ΔF-GFP的回收效率的结果的图。从试验的所有细胞中回收到了病毒，回收效率依次为BHK/T7＞BHK-21＞293T＞LLC-MK2。(但是，使用BHK/T7时不添加pCAGGS-T7。)图19是表示通过利用F1抗体的Western-印迹法检测由克隆F5R2的包装细胞生产的F基因缺失型SeV载体的病毒粒子中的F蛋白质的结果的图。
图20是表示由克隆F5R2和克隆F5R2-F22的包装细胞生产的F基因缺失型SeV载体(SeV/ΔF-GFP)的随时间变化的感染性粒子生产量的图。
图21是表示通过利用F1抗体的Western-印迹法检测由克隆F5R2和克隆F5R2-F22的包装细胞生产的F基因缺失型SeV载体的病毒粒子中的F蛋白质的图。
用于实施本发明的最佳方式本发明提供了一种制备依赖于蛋白酶对病毒蛋白质的切割而增殖的病毒的方法，且该方法不依赖于所述蛋白酶。本发明的病毒的制备方法包括使用反式地供给(也就是说在所生产的病毒的基因组之外表达)经修饰的病毒蛋白质的细胞，在所述经修饰的病毒蛋白质中上述病毒蛋白质的上述蛋白酶的切割序列被改变为其它蛋白酶的切割序列；并在所述其它蛋白酶存在下产生病毒。例如，为了使依赖于宿主来源的蛋白酶增殖的病毒增殖，本来是需要将这种蛋白酶供给于病毒的。但是本发明的一个特征是，通过将作为该蛋白酶(姑且称为原来的蛋白酶)的底物的病毒蛋白质的切割序列改变成其它蛋白酶(称为第二种蛋白酶)的切割序列，用第二种蛋白酶产生病毒，而不需要该原来的蛋白酶。
也就是说，在通过在所述病毒蛋白质的由原来的蛋白酶识别的切割序列被改变为第二种蛋白酶的切割序列的经修饰的病毒蛋白质，以及第二种蛋白酶存在下产生病毒，具有第二种蛋白酶的切割序列的经修饰的病毒蛋白受到第二种蛋白酶的切割而被活化，从而使病毒得以增殖。这里，所生产的病毒自身不表达第二种蛋白酶。也就是说，所生产的病毒不保持编码第二种蛋白酶的基因。因此，该方法的特征之一在于，只要不反式地供给切割位点被改变的修饰型病毒蛋白质，那么即使有第二种蛋白酶，所生产的病毒无也法增殖。
本发明的方法需要以反式地向病毒供给其蛋白酶切割序列被取代为其它序列的病毒蛋白质的，但是无需改变所制备的病毒自身具有的病毒基因或病毒蛋白质。因此，所生产的病毒与原来的病毒的基因型也可以完全相同。此外，经修饰的病毒蛋白质与野生型病毒蛋白质只要蛋白酶切割位点不同就可以，因此可以将表型的变化控制到最小限度，可以认为对病毒的形成，增殖，基因表达等几乎没有影响。因此，本发明的方法通用性极高，可以认为该方法可以应用于依赖于蛋白酶增殖的多种病毒的制备。
可以应用本发明的方法的病毒中，最优选下述病毒，其蛋白酶依赖性增殖不能用弗林蛋白酶互补，这样的病毒包括，例如副粘病毒科病毒，包括本来不具有弗林蛋白酶识别序列而显示出典型的局部感染性的仙台病毒(SeV)和人副流感病毒-1(HPIV-1)；还有新城疫病毒(NDV)和HPIV-2等弱毒株。此外，即使是本来具有弗林蛋白酶识别序列的、全脏器趋向性的病毒，或一部分强毒株的病毒，也同样地可以利用；本发明的方法还可以使用强毒株NDV和HPIV-2或HPIV-3，腮腺炎病毒，麻疹病毒，犬瘟热病毒(canine distemper virus)(CDV)，牛瘟麻疹病毒(rinderpest virus)(RPV)，人呼吸道合胞体病毒(HRSV)等。进而，即使是副粘病毒科之外的病毒载体，例如呼吸道肠道过滤性病毒(Reovirus)科的轮状病毒属的病毒，病毒粒子上的刺突蛋白VP4蛋白通过被胰蛋白酶切割而活化(AriasCF，JVirol.70(9)5832-9(1996)，Konno T et al.，Clin Infect Dis.16 Suppl2S92-7(1993))，因此，可以根据本发明使用改变的VP4蛋白质来制备轮状病毒，所述改变的VP4蛋白质中胰蛋白酶的切割序列被改变成弗林蛋白酶切割序列。此外，本方法还可以应用于多种病毒，包括例如具有局部感染性序列(无弗林蛋白酶识别序列)的人流感病毒A，或者具有全脏器趋向性的序列(有弗林蛋白酶识别序列)的艾滋病毒等(Nagai，Y.Trends Microbiol1，81-87(1993)，Nagai，Y.Microbiol Immunol.39，1-9(1995)，Klenk HD，Garten W.Trends Microbiol 2，39-43(1994)，Lamb，R.A.&Kolakofsky，D.ParamyxoviridaeThe Virus And TheirReplication.P.1177-1204.In B.N.Fields，D.M.Knipe，and P.M.Howley(ed.)，FieldsVirology.Lippincott-Raven，Philadelphia，Pa(1996)，病毒学，畑中正一编辑，东京，朝仓书店，247-248(1997))。例如，可以将所述弗林蛋白酶识别序列置换为更有效率的弗林蛋白酶识别序列，或置换成病毒生产细胞中表达的弗林蛋白酶之外的蛋白酶的识别序列。
本发明的方法在病毒生产细胞中难以充分供给病毒增殖所必需的蛋白酶的情况下特别有用。例如，该蛋白酶不在病毒生产细胞中内源性表达(或者只有非常微量的表达)，该蛋白酶对病毒生产细胞具有有害作用等。按照本发明的方法，原本需要上述蛋白酶的病毒，可以利用该细胞内源性表达的蛋白酶或对该细胞伤害性低的蛋白酶来制备。也就是说，把病毒蛋白质的蛋白酶切割位点改变成对细胞内源性表达的蛋白酶或对细胞有害性低的蛋白酶的切割位点，让这样经修饰的病毒蛋白质在细胞中表达。当使用这种细胞生产病毒时，由细胞供给的经修饰的病毒蛋白质被包入所形成的病毒中，并被第二种蛋白酶转变为活化型。如此，不需要原来的蛋白酶就可以生产病毒。
例如，本发明的方法优选应用于生产如下的病毒，该病毒的增殖需要病毒生产中经常使用的细胞LLC-MK2(ATCC CCL-7)，Vero(ATCC CCL-81)，BHK-21(ATCC CCL-10)，HEK293(ATCC CRL-1573)，HT1080(ATCCCCL-121)，Hela(ATCC CCL-2)，NIH3T3(ATCC CRL-1658)，3Y1(JCRB 0734)，COS-1(ATCC CRL-1650)，COS-7(ATCC CRL-1651)，CHO(ATCC CRL-9606)，CHO-K1(ATCC CCL 61)或它们的衍生株等中非内源性显著表达的蛋白酶。本发明尤其对病毒产生中使用的哺乳动物细胞显示有毒性的蛋白酶很有用。这样的蛋白酶包括例如胰蛋白酶。胰蛋白酶抑制细胞粘附，而且由于血清会使其失活，为了使胰蛋白酶在细胞外作用，必须使用不含血清的培养基。如此，在使用胰蛋白酶的培养条件下，细胞的存活力(生存和/或增殖等)就会降低。通过使用胰蛋白酶之外的蛋白酶作为第二种蛋白酶，可以避免由胰蛋白酶造成的细胞伤害。蛋白酶对细胞是否显示出毒性，可以通过测定在病毒产生时所必需的蛋白酶显示活性的条件下，细胞的存活力是否比没有该蛋白酶时降低来评估。细胞的存活力可以通过基于例如氧化还原色素刃天青被活细胞转化为荧光产物试卤灵的测试法(CellTiter-BlueTMCellViability Assay，Promega)来测定。或者，可以通过LDH(乳酸脱氢酶)活性测定，使用氧化还原色素Alamar Blue的Alama Blue荧光法，或者利用四唑化合物(MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5溴化四唑]和MTS[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑内盐])的被活细胞转换为甲产物的MTT法和MTS法等测定。
通过将这些病毒的病毒蛋白质的蛋白酶(即原来的蛋白酶)切割位点置换为病毒生产细胞内源性表达的蛋白酶或细胞毒性更低的蛋白酶等(即第二种蛋白酶)的切割序列，可以在不存在原来需要的蛋白酶的条件下制备病毒。对于第二种蛋白酶的切割序列没有特别的限制，但是优选使用例如上述哺乳动物细胞(LLC-MK2，Vero，BHK-21，HEK293，HT1080或它们的衍生株)等内源性表达的蛋白酶的切割序列。优选使用弗林蛋白酶切割的序列。由于弗林蛋白酶是普遍表达的，几乎在所有的组织和细胞中表达，通过取代为弗林蛋白酶切割序列可以有效生产病毒。作为弗林蛋白酶的切割序列的实例，可以例举有Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg(Xaa为任意的氨基酸)。具体可以列举有RTKR，RRRR，RHKR，RQR/KR，RHKR，RKRR等。例如，将原来具有被胰蛋白酶切割的切割序列(Xaa-Gln-Ser-Arg和Xaa-Gln-Gly-Arg)的病毒蛋白质的上述切割序列转变为弗林蛋白酶切割序列(Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg)，该蛋白质就会被弗林蛋白酶切割转变成为活化型。
除了弗林蛋白酶切割序列之外，切割序列还可以转变成所希望的蛋白酶的切割序列(WO01/20989)。特别地，转变为细胞中内源性表达的蛋白酶切割序列，或者对细胞毒性小的蛋白酶的切割序列。通过使用具有由这种蛋白酶切割的序列的病毒蛋白质基因，可以维持细胞的存活力，使病毒更有效地生产。包膜蛋白质的切割优选使用分泌到细胞外的蛋白酶和在膜表面表达的膜型蛋白酶等。此外，蛋白酶也可以存在于蛋白质从细胞中翻译到细胞表面分泌的输送途径上。
弗林蛋白酶之外的蛋白酶的切割序列可以使用例如特异于MMP(matrix metalloprotease，基质金属蛋白酶)和胶原蛋白酶的序列PLGMTS(序列号1)和PQGMTS(序列号2)的序列(特愿2002-129351)。此时，由MMP和胶原蛋白酶的切割发生于上述识别序列的第3个残基的C末端，例如已经确认，仙台病毒的F蛋白中F1蛋白的N末端上添加了MTS时仍具有F蛋白的活性。此外还发现其F蛋白中由胰蛋白酶所识别的R116被转变为I的SeV变异株被胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)或弹性蛋白酶(elastase)所活化(Tashiro M et al.，J Gen Virol.73(Pt 6)1575-9(1992)，Itoh M，Homma M.J GenVirol.69(Pt 11)2907-11(1988))；也可以利用这种序列。由于胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶在Y，F，W，L，I等疏水性氨基酸的C末端切割，因此可认为变异成为I以外的序列，即Y、F、W、L，也是可以的。
病毒生产细胞优选高表达第二种蛋白酶的。例如，还可以在病毒生产细胞中外源地表达切割经修饰的病毒蛋白质的第二种蛋白酶。通过高表达第二种蛋白酶，可以促进经修饰的病毒蛋白质的切割，进而提高病毒生产的效率。为此，向该细胞中导入编码第二种蛋白酶的表达载体。在第二种蛋白酶的表达中使用的启动子可以使用所希望的用于在哺乳动物细胞中表达基因的启动子。此外，还可以利用重组酶目的序列和诱导性启动子进行构建，使得第二种蛋白酶的表达可以被刺激诱导(下述)。
第二种蛋白酶的例子还有钙蛋白酶，泛素蛋白酶体系统，中性溶酶，MMP，丝氨酸蛋白酶，氨肽酶等。钙蛋白酶是通过与钙结合而活化的蛋白酶，作为其切割序列，可以使用α-肌动蛋白，肌钙蛋白，肌联蛋白等蛋白质的切割位点。作为钙蛋白酶的切割序列(Karlsson，J.O et al.(2000)CellBiol.Int.24，235-243)，可以使用例如Leu-Leu-Val-Tyr。
此外，也可以使用分解细胞外基质(excellular matrix；ECM)的MMP和其近缘基因家族的ADAM(一种解聚素(disintegrin)和金属蛋白酶)的切割序列。现在已知软骨蛋白聚糖(agrican，聚集蛋白聚糖)的分解所必需的ADAMTS(有血小板凝血酶敏感蛋白(thrombospondin)基序的ADAM)的聚集蛋白聚糖的切割序列(Tortorella，M.D.et al.(2000)J.Biol.Chem.275，18566-18573)。通过使用这些蛋白酶的识别序列，可以使用该蛋白酶制备病毒载体。
此外，ECM分解性丝氨酸蛋白酶包括，例如，组织蛋白酶G，弹性蛋白酶，纤溶酶，纤溶酶原活化因子(plasminogen activator；PA)，肿瘤胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶样中性蛋白酶，凝血酶等。纤溶酶通过对生物体内以非活性状态存在的纤溶酶原进行有限水解而产生。PA中存在与血液凝固相关的组织型PA(tPA)和与ECM分解相关的尿激酶型PA(uPA)(Blasi，F.andVerde，P.Semin.Cancer Bio.1117-126，1990)。uPA，tPA的切割序列是熟知的(Rijken，D.C.et al.(1982)J.Biol.Chem..257，2920-2925；Wallen，P etal.(1982)Biochim.Biophys.Acta 719，318-328；Tate，K.M.etal.(1987)Biochemistry 26，338-343)。一般使用的底物序列为VGR(Dooijewaard，G.，and Kluft，C.(1983)Adv.Exp.Med.Biol.156，115-120)和Substrate S-2288(Lle-Pro-Arg)(Matsuo，O.etal.(1983)Jpn.J.Physiol.33，1031-1037)。Butenas采用54种荧光底物，提供了对tPA显示高特异性的序列(Butenas，S.et al.(1997)Biochemistry36，2123-2131)；tPA显示出对FPR，VPR的高度的分解活性。因此，这些序列是特别优选使用的。纤溶酶可降解纤连蛋白，生腱蛋白，层粘连蛋白等。
此外，现在还知道了可分类于半胱氨酸蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶这两类的ECM分解酶。具体包括，例如，以层粘连蛋白、蛋白多糖、纤连蛋白、胶原和原胶原酶(通过分解而活化)等为底物的组织蛋白酶B(Sloane，B.F.，Semin.Cancer Biol.1137-152，1990)，以弹性蛋白，蛋白多糖，纤连蛋白，层粘连蛋白和弹性蛋白酶(活化)等为底物的组织蛋白酶L(Kane，S.E.，andGottesman，M.M.，Semin.Cancer Biol.1127-136，1990)，以及以层粘连蛋白，纤连蛋白，蛋白多糖及组织蛋白酶B和L(活化)作为底物的组织蛋白酶D(Rochefort，H.，Semin.Cancer Biol.1153-160，1990)等。
金属蛋白酶(metalloproteinase)是含有Zn等金属元素的金属酶，现已报道了caspase，氨肽酶，血管紧张肽I型转换酶，胶原酶等。作为分解ECM的金属蛋白酶，现已报道了16种或16种以上的基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases；MMP)。代表性的MMP，包括，例如，胶原酶-1、2、3(MMP-1、8、13)，白明胶酶A、B(MMP-2、9)，基质溶素(stromelysin)1、2、3(MMP-3、10、11)，间质溶素(matrilysin)(MMP-7)，和膜型金属蛋白酶(MT1-MMP和MT2-MMP)等。此外，ECM分解性的金属蛋白酶包括例如分解ECM构成蛋白质之类的氨肽酶N/CD13和氨肽酶B等。
其中，胶原酶(collagenase)(MMP-1、8、13)在特异性位点切割纤维性胶原I，II，III型胶原分子。白明胶酶(gelatinase)已知有白明胶酶A(MMP-2)和白明胶酶B(MMP-9)两种类型。白明胶酶也被称为IV型胶原酶，其分解基底膜的主要成分IV型胶原，但是也分解V型胶原和弹性蛋白。此外，现已知MMP-2在与MMP-1相同位点切割I型胶原。MMP-9不分解层粘连蛋白和纤连蛋白，但是MMP-2分解这些物质。基质溶素(stromelysin)(MMP-3，10)的底物范围宽，其分解蛋白多糖，III、IV、IX型胶原，层粘连蛋白，纤连蛋白等。间质溶素(matrilysin)(MMP-7)是不具有血液结合素区域的分子，底物特异性与MMP-3相同，尤其是对蛋白多糖和弹性蛋白的分解活性高。膜型基质金属酶(membrane-typeMMP；MT-MMP)(MT1，2，3，4，5，6-MMP)是具有跨膜结构的MMP。MT-MMP在前肽区域与活性位点之间具有插入序列(约10个氨基酸)。这种插入序列含有Arg-Xaa-Lys-Arg(Xaa为任意的氨基酸)，其在输送到细胞膜的过程中，在细胞内被加工切割而活化。作为MT-MMP，已知有MT1-MMP(MMP-14)，MT2-MMP(MMP-15)，MT3-MMP(MMP-16)、MT4-MMP(MMP-17)，MT5-MMP(MMP-23)，和MT6-MMP(MMP-25)等。例如，MT1-MMP降解I，II和III型胶原，MT3-MMP降解III型胶原。
MMP的切割底物多数是已知的。所有MMP都分解的底物序列，有PLGLWAR(序列号3)(Bickett，D.M.等，(1993)Anal.Biochem.212，58-64)，GPLGMRGL(序列号4)(Deng，S.J.等(2000)，J.BIOL.CHEM.275，31422-31427)，PQGLEAK(序列号5)(Beekman，B.等，(1996)FEBS Lett.390，221-225)，RPKPVEWREAK(序列号6)(Beekman，B.等，(1997)FEBS Lett.418，305-309)，和PLALWAR(序列号7)(Jacobsen，E.J等，(1999)，J.Med.Chem.42，1525-1536)。作为MMP2，9的分解底物有PLGMWS(序列号8)(Netzel-Arnett，S.等，(1991)Anal.Biochem.195，86-92)和PLGLG(序列号9)(Weingarten，H.等，(1985)Biochemistry 24，6730-6734)。
最近，通过噬菌体展示肽文库筛选，现已确认了对于MMP-9(Kridel，S.J.等，(2001)，J.Biol.Chem.276，20572-20578)，MMP-2(Chen，E.1.等，(2002)，J.Biol.Chem.277，4485-4491)，和MT1-MMP(Kridel，S.J等，J.Biol.Chem.In JBC Papers In Press，April 16，2002，ManuscriptM111574200)的分解底物序列。在这些论文中，特定的氨基酸序列根据3个MMP对其分解能力可被分为4组。组IV是被MT1-MMP特异性分解的序列，没有Arg的序列VFSIPL(序列号10)和IKYHS(序列号11)不可被MMP9、MMP2分解，而只可被MT-MMP分解。
例如，作为MMP9的切割序列，可以例举有Pro-XX-Hy(其中，X代表任意残基；Hy代表疏水性残基)，尤其优选Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr)。更具体的，可以例举Pro-Arg-(Ser/Thr)-Hy-(Ser/Thr)(切割发生在X和Hy残基之间)。Hy(疏水性残基)包括，例如，Leu，Val，Tyr，Ile，Phe，Trp，Met，但不限于此。或者，还鉴定了其它切割序列(例如，参见下列文献中的组I，II，IIIA，IIIB；如Kridel，S.J.等，(2001)，J.Biol.Chem.276，20572-20578所述)，可以使用这些序列中所希望的序列。此外，对于MMP2也可以是上述的Pro-X-X-Hy，此外，还包括(Ile/Leu)-X-X-Hy，Hy-Ser-X-Leu，和His-X-X-Hy等(参见例如以下文献的组I，II，III和IVChen，E.I等，(2002)J.Biol.Chem.227，4485-4491)等。MMP家族的切割序列，包括MMP-7，MMP-1，MMP-2，MMP-9，MMP-3，和MT1-MMP(MMP-14)等，可以通过例如参考天然底物蛋白的序列或者筛选肽文库之类手段来适当地选择(Turk，B.E等，Nature Biotech.19，661-667，(2001)；Woessner，J.F.and Napase，H，Matrix metalloprotelnases and TIMPs.(Oxford UniversityPress，Oxford，UK，2000)；Fernandez-Patron，C.等，Circ.Res.85906-911，1999；Nakamura，H.等，J.Biol.Chem.27538885-38890，2000；McQuibban，G.A.等，Science 2891202-1206，2000；Sasaki，T.等，J.Biol.Chem.2729237-9243，1997)。例如，切割位点的8个氨基酸P4-P3-P2-P1-P1’-P2’-P3’-P4’(于P1-P1’间被切割)的例子包括，但不限于对MMP-1，有VPMS-MRGG(序列号12)；对MMP-3有RPFS-MIMG(序列号13)；对MMP-7，有VPLS-LTMG(序列号14)；对MT1-MMP，有IPES-LRAG(序列号15)等。对MMP-8的此类序列包括，例如，PLAYWAR(序列号16)(Nezel-Amett，S.et al.，Anal.Biochem.19586，1991)。可以获得MMP的各种合成底物，并且还可以比较这些序列(参照，例如Merk Calbiochem目录的“各种MMP底物”一节)。
通过将病毒蛋白质的蛋白酶切割位点的序列取代为上述蛋白酶的切割位点，更换切割病毒蛋白质的蛋白酶。病毒蛋白质是否被第二种蛋白酶有效切割，可以通过在细胞中表达这种经修饰的病毒蛋白质，然后用Western印迹法来评估。此外，还可以通过检测被切割活化的病毒蛋白质的功能来确认(PCT/JP03/05528)。例如，如果是具有细胞膜融合作用的病毒蛋白质，将表达经修饰的病毒蛋白质的质粒载体转染细胞，在第二种蛋白酶存在下培养，而后检测合胞体形成。通过测定合胞体，可以确认经修饰的病毒蛋白质通过被第二种蛋白酶切割而被活化。
本发明中制备的病毒不编码病毒基因组中切割位点被修饰的蛋白质。该病毒包括具有编码病毒蛋白质的基因的病毒，所述病毒蛋白质具有切割序列被修饰前的原来的切割序列。也就是说，这种病毒含有经修饰的病毒蛋白质，但是该病毒的基因组中保持有编码具有野生型切割序列的病毒蛋白质的基因。因此，病毒(当其具有病毒增殖所必须的病毒基因时)依赖于切割野生型切割序列的蛋白酶而增殖。在制备带有具有野生型的切割序列的病毒基因的病毒时，除了在第二种蛋白酶存在下在病毒生产细胞中表达经修饰的病毒蛋白质之外，还可以在病毒生产细胞中添加或表达切割野生型切割序列的蛋白酶(即原来的蛋白酶)。通过使用经修饰的病毒蛋白质，可以预计增加的病毒生产量(参照实施例5)。
在本发明的另一种实施方式中，要制备的病毒是缺陷型病毒，其缺失了作为改变切割序列的对象的病毒基因。由于该病毒缺失了上述病毒基因，即使病毒感染目的细胞，也无法在该细胞中表达功能性的病毒蛋白质，(与有没有蛋白酶无关)也无法增殖。也就是说，这种病毒是非传播性的。本发明的方法特别地具有如下优点其可以使用包括人类细胞在内的各种细胞类型高效地制备一般难以高效价制备的、无传播能力的缺陷型载体。
在本发明的病毒制备中，如上所述反式(即从病毒基因组之外)地提供切割位点被改变为第二种蛋白酶切割序列的经修饰的病毒蛋白质。为此，优选另外构建表达经修饰的病毒蛋白质的载体，将其导入到病毒生产细胞中表达。用于表达经修饰的病毒蛋白质的载体可以使用所希望的载体，但是如果使用病毒载体，理所当然地，为了防止该载体与欲制备的病毒混杂，应使用在该病毒生产细胞中不增殖的病毒载体。此外，为了防止编码改变的蛋白质的基因被包入到制备的病毒中，应使用其它种类的病毒的载体，或者如果使用同种病毒的载体，则预先除去包入到病毒中所必须的信号序列。例如，优选使用增殖能力被失活的病毒载体、与要制备的病毒不同种类的非传播性病毒、或者非病毒载体。具体地，优选使用缺失复制能力的异种病毒载体和质粒载体。
更优选的用于表达经修饰的病毒蛋白质的载体包括例如质粒载体。用质粒转染细胞可以使用例如磷酸钙法(Graham，F.L.and Van Der Eb，J.，1973，Virology 52456；Wigler，M.and Silverstein，S.，1977，Cell 11223)，或者使用各种转染试剂的方法，或电穿孔法之类。对于磷酸钙法，按照例如Chen和Okayama(Chen and Okayama，H.，1987，Mol.Cell.boil.72745)所述方法，可以在2-4％CO2，沉淀混合液中的DNA浓度为20-30μg/ml的条件下，35℃下进行15-24小时。对于转染试剂，DEAE-葡聚糖(Sigma#D-9885M.W.5×105)，DOTMA(Roche)，Superfect(QIAGEN#301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Roche#1811169)，TransIT-LT1(Mirus，Product No.MIR 2300)之类。为了预防转染试剂与DNA的复合体在核内体中被分解，可以加入氯喹(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 803015)。此外，电穿孔法由于没有细胞选择性而通用性很高，可以通过优化脉冲电流的持续时间，脉冲的形状，电场(电极间的间隙，电压)的强度，缓冲液的导电率，DNA浓度，细胞密度进行应用。对于向细胞中导入DNA以重新构建载体，比较适宜使用转染试剂的方法，因为其操作简便而且便于使用大量细胞研究多种试样。优选的，可以使用Superfect Transfection Reagent(Qiagen，CatNo.301305)，Dosper Liposomal Transfection Reagent(Roche，Cat No.1811169)，TransIT-LT1(Mirus，Product No.MIR 2300)等，但是不限于此。
用于表达经修饰的蛋白质的启动子可以使用所希望的用于哺乳动物细胞表达的启动子，例如，可以使用巨细胞病毒(CMV)的启动子，鲁斯(氏)肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)(RSV)LTR启动子，胸苷激酶(TK)启动子，α-或β-肌动蛋白启动子，SV40早期基因启动子，EF1α启动子，SRα启动子，或者上述启动子的杂合启动子等((Kim DW et al.，1990，Use of the humanelongation factor 1 alpha promoter as a versatile and efficient expression system.Gene 91(2)217-23；Chapman BS et al.，1991，Effect of intron A from humancytomegalovirus(Towne)immediate-early gene on heterologous expression inmammalian cells，Nucleic Acids Res.143979-3986；Takebe Y et al.，1988，SRalpha promoteran efficient and versatile mammalian cDNA expression systemcomposed of the simian virus 40 early promoter and the R-U5 segment of humanT-cell leukemia virus type 1 long terminal repeat.Mol.Cell Biol.1466-472))。
用于表达经修饰的蛋白质的特别优选的启动子包括含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的启动子(称为CA启动子)。所谓CA启动子是指含有(i)巨细胞病毒(CMV)的IE(immediate early，立即早期)基因的增强子序列和(ii)鸡β-肌动蛋白启动子序列的杂合启动子。通过使用CA启动子表达经修饰的病毒蛋白质，可以生产高效价的病毒。作为CMV IE增强子，可以使用希望的CMV株的立即早期基因的增强子，例如，可以使用含有序列号17的核苷酸序列的DNA。
此外，作为鸡β-肌动蛋白启动子，可以使用含有鸡β-肌动蛋白基因的基因组DNA的转录起始位点和TATA盒(Ann.Rev.Biochem.50，349-383，1981)和CCAAT盒(Nud.Acids Res.8，127-142，1980)，并具有启动子活性的DNA片段。鸡β-肌动蛋白基因启动子的核苷酸序列已被例如T.A.Kost等人(Nucl.Acids Res.11，8287-8286，1983)报道。人们认为鸡β-肌动蛋白基因启动子的核苷酸序列中，从原来的β-肌动蛋白结构基因的翻译起始密码子(ATG)的上游-909位置的G(鸟嘌呤)起至-7位置的G(鸟嘌呤)的区域是内含子。由于该内含子有促进转录的活性，优选使用含有该内含子的至少一部分的基因组DNA片段。作为该鸡β-肌动蛋白启动子具体包括，例如，含有序列号18的核苷酸序列的DNA。内含子接纳序列(intron acceptorsequence)可以使用适当的其它基因的序列，例如，可以使用家兔β-球蛋白的剪切接纳序列。更具体地，可以使用位于家兔β-球蛋白的起始密码子的前方紧邻的第二个内含子的接纳位点。具体可以例举有含有序列号19中记载的核苷酸序列的DNA。本发明中的CA启动子优选是如下的DNA在CMV IE增强子序列的下游连接了含有一部分内含子的鸡β-肌动蛋白启动子，在其下游添加了希望的内含子接纳序列。其中，例如序列号20所示。为了表达蛋白质，可以以该序列的最后的ATG作为起始密码子，再添加经修饰的病毒蛋白质的编码序列。
CA启动子中使用的CMV增强子序列和鸡β-肌动蛋白基因启动子，根据分离株或分离个体的不同，其序列可能有多样性。此外，可以对这些序列进行轻微改变以添加或删除限制性酶识别位点或插入接头(Molecularcloninga laboratory manual.，3rd ed.，Joseph Sambrook，David W.Russell.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，2001)。也就是说，即使这些序列不是与序列号20所示序列完全相同的序列，只要具有同等或以上(例如70％或以上，优选80％或以上，90％或以上，或100％或以上)的启动子活性，就可以适当使用。作为CMV增强子序列和鸡β-肌动蛋白基因启动子序列的变异体，可以使用例如Genbank登录号AF334827，AY237157，AJ575208和X00182等中记载的序列。为了从这些序列中确定在CA启动子的构建中所必需的序列，可以与序列号17与18进行比对，选择匹配的区域。此外，可以从pCAGGS(Niwa，H.et al.(1991)Gene.108193-199，特开平3-168087)或pCALNdLw(Arai，T.et al.J.Virology 72，1998，p1115-1121)中切出DNA，用于CA启动子的构建。
上述CMV IE增强子序列和鸡β-肌动蛋白启动子的变异体包括这样的序列，其含有序列号17中记载的CMV IE增强子序列和序列号18中例示的鸡β-肌动蛋白启动子中取代，缺失，和/或插入了30％或30％以下，优选20％或20％以下，更优选15％或15％以下，更优选10％或10％以下，更优选5％或5％以下，更优选3％或3％以下的核苷酸，并且显示出同等启动子活性。这些序列显示出分别与序列号17中记载的核苷酸序列或序列号18中记载的核苷酸序列均具有高同源性。高同源性的核苷酸序列包括，例如，具有70％或以上，更优选75％或以上，更优选80％或以上，更优选85％或以上，更优选90％或以上，更优选93％或以上，更优选95％或以上，更优选96％或以上的同一性的核苷酸序列。核苷酸序列的同一性可以使用例如BLAST程序(Altschul，S.F.et al.，1990，J.Mol.Biol.215403-410)来确定。例如，在NCBI(National Center for Biothchnology Information)的BLAST的网页中将含有低复杂度(low complexity)的滤器(filter)完全置于OFF，用默认的参数进行检索(Altschul，S.F.et al.(1993)Nature Genet.3266-272；Madden，T.L.et al.(1996)Meth.Enzymol.266131-141；Altschul，S.F.et al.(1997)Nucleic AcidsRes.253389-3402；Zhang，J.& Madden，T.L.(1997)Genome Res.7649-656))。例如，使用比较两条序列的blast2sequence程序，可以进行两条序列的比对，以确定序列的同一性。缺口(Gap)与错配同样地处理，例如对于序列号17中记载的所有核苷酸序列或序列号18中记载的所有的核苷酸序列计算同一性的值。具体地，计算比对中的序列号17或18的总碱基数(包括缺口)中一致的碱基数的比例。从计算中排除比对中的序列号1或2的外侧的缺口。
此外，CMV增强子序列和鸡β-肌动蛋白启动子序列也可以通过杂交分别从CMV的基因组核酸和鸡基因组DNA中分离。本发明中使用的CMV增强子和鸡β-肌动蛋白启动子是在严紧条件下分别与序列号17中记载的核苷酸序列或序列号18中记载的核苷酸序列或其互补序列杂交的DNA，也可以是与其具有同等启动子活性的DNA。在杂交中，可以通过例如从包括序列号17中记载的核苷酸序列或序列号18中记载的核苷酸序列或它们的互补序列的核酸中制备探针，或者从作为杂交对象的DNA中制备探针，然后检测它们是否与其它DNA杂交来鉴定。严紧杂交条件是例如以下条件在5×SSC，7％(W/V)SDS，100μg/ml变性鲑精DNA，并含有5×Denhardt’s液(1×Denhardt’s溶液含有0.2％聚乙烯吡咯烷酮，0.2％牛血清白蛋白和0.2％Ficoll)的溶液中，于60℃，优选65℃，更优选68℃进行杂交，然后在2×SSC中，优选在1×SSC中，更优选在0.5×SSC中，更优选在0.1×SSC中，在与杂交相同的温度下，一边振荡一边清洗两小时。
在用于表达经修饰的病毒蛋白质的载体中，如果使用可以应答于特定刺激而诱导表达的表达系统，就可以在生产病毒时特异性地诱导经修饰的病毒蛋白质的表达。由于有时病毒蛋白质显示出对细胞的毒性，使用该诱导表达系统是有利的。为了达到该目的，可以使用例如采用大肠杆菌的四环素抗性操纵子的表达系统(Gossen，M.，et al.(1995)Science 2681766-1769；Tet Expression Systems and Cell LinesGuly 1996)CLONTECHniquesXI(3)2-5)，采用蜕皮素受体，RXR和蜕皮素受体应答序列的蜕皮素诱导表达系统(pVgRXR，pIND；Ecdysone-inducible Mammalian Expression Kit，Invitrogen公司)，或者采用Cre/loxP或FLP/FRT等序列特异的重组酶的表达系统。特别地，采用序列特异的重组酶的诱导表达系统容易与各种启动子组合使用，可以非常严格地控制表达的开/关，因此可应用于经修饰的病毒蛋白质的表达系统。
Cre是噬菌体P1具有的约38kDa的环化重组酶，特异性地在loxP位点间进行重组(Sauer B，Henderson N.1988.Site-specific DNA recombination inmammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1.Proc Natl AcadSci USA 855166-70；Sternberg N，Hamilton D.1981.Bacteriophage P1site-specific recombination.I.Recombination between loxP sites.J Mol Biol150467-86；Brian Sauer，Methods of Enzymology；1993，Vol.225，890-900；Nagy A.2000.Cre recombinasethe universal reagent for genome tailoring.Genesis 2699-109)。loxP是13bp的不对称的反向重复序列，具有8bp的间隔序列(ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT；下划线为反向重复；序列号21)。例如，使用Cre/loxP诱导型表达质粒pCALNdlw(Arai，T.et al.，J.Virology 72，1998，p1115-1121)，可以构建能被Cre诱导表达的载体。为了表达Cre，例如，按照齐藤等人的方法(Saito et al.，Nucl.Acids Res.233816-3821(1995)；Arai，T.et al.，J.Virol 72，1115-1121，(1998))，以例如moi(感染复数)＝3-5的腺病毒AxCANCre感染细胞。
FLP重组酶是源于酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的2微米质粒的约49kDa的翻转酶(flippase)重组酶，其以FLP重组酶目标(FRT)序列作为目标产生重组(Utomo AR，Nikitin AY，Lee WH.1999.Temporal，spatial，and cell type-specific control of Cre-mediated DNA recombination in transgenicmice.Nat Biotechnol 171091-6；Broach，J.R.，Guarascio，V.R.& Jayaram，M.(1982)Cell 29，227-34；Cox，M.M.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，4223-227；Vetter，D.，Andrews，B.J.，Roberts-Beatty，L.& Sadowski，P.D.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，7284-288；Abremski，K.& Hoess，R.(1984)J.Biol.Chem.259，1509-514；Stark，W.M.，Boocock，M.R.& Sherratt，D.J.(1992)Trends Genet.8，432-39；Kilby，N.J.，Snaith，M.R.& Murray，J.A.H.(1993)Trends Genet.9，413-21)。与loxP相同，FRT序列也是由13bp的重复序列构成，包含8bp的间隔序列(GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC；序列号22)(Andrews，B.J.et al.(1985).The FLP Recombinase of the 2 Micron Circle DNA of YeastInteraction with its Target Sequences.Cell 40，795-803)。此外，也可以利用上述loxP位点和FRT位点的变异序列进行目标特异的重组(Baszczynski，Christopher L.et al，美国专利申请20040003435)。
为了构建重组酶依赖性诱导表达的载体，将夹在重组酶靶序列间的DNA片段插入启动子与改变的病毒蛋白质编码序列之间。这种状态下，改变的病毒蛋白质受插入的DNA片段妨碍而不表达。但是，如果使重组酶作用，就能切出夹在目标序列间的DNA，使启动子得以表达重组酶。这样一来，通过重组酶，可以诱导由启动子启动的表达。优选预先设计使夹在重组酶的目标序列间的DNA中含有转录终止信号和/或终止密码子，以使重组酶不作用时，下游连接的基因的表达可以被确实地抑制。此外，可以预先在夹在重组酶的目标序列间的DNA中插入适当的标记基因。
经修饰的病毒蛋白质的表达载体，根据该载体的种类，使用转染或感染等适当的方法导入到哺乳动物细胞中使之表达。转染可以使用各种转染试剂。例如，优选使用DOTMA(Roche)，Superfect(QIAGEN#301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Roche#1811169)，TranslT-LT1(Mirus，Product No.MIR 2300)等阳离子脂质。经修饰的病毒蛋白质的表达载体既可以在病毒制备时一过性的导入，使之在病毒生产细胞中游离表达，也可以建立导入到病毒生产细胞的染色体中的稳定转化体。稳定地导入了经修饰的病毒蛋白质的表达载体的细胞可以作为辅助细胞用于制备病毒。这样的稳定转化体可以通过预先在载体中整合药物抗性标记基因并选择药物抗性株来获得。优选通过Western印迹分离高表达经修饰的病毒蛋白质的细胞克隆。此外，使这些细胞实际地生产病毒载体，以选择具有生产高效价病毒的能力的细胞。
对导入经修饰的病毒蛋白质的表达载体的细胞种类没有特别的限制，只要是病毒可以增殖的哺乳动物细胞。例如，可以使用小鼠，大鼠，猴，和人类来源的细胞株。具体地，可以例举有NIH3T3，3Y1，LLC-MK2，Vero，CV-1，HeLa，HEK293，COS-1，COS-7，CHO，CHO-K1，HT1080或者它们的衍生株。在制备用于向人类细胞导入基因的病毒载体时，优选使用人类细胞生产病毒。其原因是，如上所述，由病毒生产细胞释放的子代病毒粒子中，可能混入来源于病毒生产细胞的细胞质和细胞膜成分。因此如果使用人类细胞之外的细胞制备病毒时，这些成分在人体中会造成有害作用，或者还存在引起免疫反应的可能性。这些问题可以通过使用与病毒载体的给药对象同种的细胞来生产病毒来解决。
能够表达经修饰的病毒蛋白质的表达载体的细胞株，不仅可用于制备与该蛋白质同种来源的病毒，还可用于制备用该经修饰的病毒蛋白质假型化(pseudotype)的其它种类病毒。例如，通过在负链RNA病毒的经修饰的F蛋白质和HN蛋白质的存在下产生腺病毒，也可以构建被修饰的F蛋白质假型化(pseudotype)的腺病毒载体(Galarns，E.et al.，Hum.Gene Ther.12，811-821(2001))。进而，例如，该细胞可以用于经修饰的F蛋白质和HN蛋白质假型化逆转录病毒(Spiegel，M.et al.，J Virol.72(6)5296-5302(1998))。取决于制备的病毒，细胞中也可以进一步整合表达其它病毒蛋白质和/或病毒基因组RNA的载体。
具有经修饰的病毒蛋白质的病毒载体的制备，可以通过在各种病毒的制备过程中使用上述细胞(和切割该改变的病毒蛋白质的蛋白酶)来实施。具体地，在表达经修饰的病毒蛋白质的细胞中，在切割经修饰的病毒蛋白质的蛋白酶的存在下，转录病毒载体的基因组RNA。在需要反式提供病毒蛋白质以形成病毒粒子时，表达该病毒蛋白质。被转录的病毒基因组RNA与病毒蛋白质形成复合体，从而形成包入了经修饰的病毒蛋白质的病毒粒子。通过从细胞的培养上清或细胞中回收该病毒粒子，可以制备含有经修饰的病毒蛋白质的病毒载体。
本发明的方法可以应用于制备依赖于蛋白酶的所希望的病毒载体，下面以负链RNA病毒载体的制备方法为例进行更为详细地说明。所谓负链RNA病毒是含有负链(与有义编码病毒蛋白质的链互补的反义链)RNA作为基因组的病毒。负(minus)链RNA也称为负(negative)链RNA。负链RNA是优良的基因导入载体，因为其仅在宿主细胞的细胞质中进行转录复制，不具有DNA阶段，因此不发生向染色体的整合(integration)(Lamb，R.A.and Kolakofsky，D.，ParamyxoviridaeThe viruses and their replication.InFields BN，Knipe DM，Howley PM，(eds).Fields of virology.Vol.2.Lippincott-Raven PublishersPhiladelphia，1996，pp.1177-1204)。因此，不发生染色体异常所导致的癌变和恶化等安全方面的问题。负链RNA病毒的这种特征对将其载体化时的安全性方面大有贡献。在异种基因表达的结果中，即使连续多代传代负链RNA病毒中的仙台病毒(SeV)，也几乎没有发现基因的变异，显示出基因组的高稳定性，插入的异种基因在长时间内持续稳定地表达(Yu，D.et al.，Genes Cells 2，457-466(1997))。此外，由于其不具有衣壳结构蛋白质，因此在导入基因的大小或包装的灵活性(flexbility)等方面的性质上具有优点。如上所述，提示负链RNA病毒载体可成为用于人类的基因治疗的新型高效率转导载体。
作为可以在本发明中使用的负链RNA病毒，特别地包括在基因组中具有单链负(negative)链[即负(minus)链]RNA的单链负链RNA病毒(也称为非分节型(non-segmented)负链RNA病毒)。作为这种病毒，包括属于副粘病毒科(Paramyxoviridae；包括副粘病毒属(Paramyxovirus)，麻疹病毒属(Morbillivirus)和腮腺炎病毒属(Rubulavirus)等)，弹状病毒科(Rhabdoviridae；包括水泡性病毒属(Vesiculovirus)，狂犬病毒属(Lyssavirus)和短暂热病毒属(Ephemerovirus)等)，纤丝病毒科(Filoviridae)，正粘病毒科(Orthomyxoviridae；包括流感病毒A，B，C，和索戈托样病毒(Thogoto-like viruses)等)，布尼亚病毒科(Bunyaviridae；包括布尼亚病毒属(Bunyavirus)，汉坦病毒属(Hantavirus)，内罗病毒(Nairovirus)和白蛉病毒属(Phlebovirus)等)，和沙粒病毒科(Arenaviridae)等科的病毒。
更具体的例子有仙台病毒(SeV)，人副流感病毒-1(HPIV-1)，人副流感病毒-3(HPIV-3)，海豹瘟热病毒(phocine distemper virus)(PDV)，犬瘟热病毒(canine distemper virus)(CDV)，海豚麻疹病毒(dolphinmolbillivirus)(DMV)，小反刍动物瘟疫病毒(peste-des-petits-ruminantsvirus)(PDPR)，麻疹病毒(measles virus)(MV)，牛瘟麻疹病毒(rinderpest virus)(RPV)，亨德拉病毒(Hendra virus)(Hendra)，立百病毒(Nipah)，人副流感病毒-2(HPIV-2)，猿副流感病毒5(SV5)，人副流感病毒-4a(HPIV-4a)，人副流感病毒-4b(HPIV-4b)，腮腺炎病毒(mumps virus)(Mumps)，新城疫病毒(Newcastle disease virus)(NDV)等。
本发明的病毒制备方法的主要对象是增殖所必需的蛋白酶为弗林蛋白酶之外的蛋白酶的病毒，但是对于例如原来的F蛋白质中含有弗林蛋白酶型切割序列的病毒，在制备因F蛋白质变异而切割位点变化的弱毒株时，也可以由病毒生产细胞反式提供弗林蛋白酶切割型F蛋白质。
改变负链RNA病毒的F蛋白质的切割位点时，优选如下设计切割序列，使得切割后的F1片段的N末端与野生型F蛋白质的F1片段的末端相同。此外，为了发生有效的切割反应而在切割位点插入接头时，希望设计成在切割后的F1片段的N末端上与野生型F1相比只添加的最少数的氨基酸。例如，设法使切割后的N末端与野生型F1相比添加的5个氨基酸或更少，优选4个氨基酸或更少，更优选3个氨基酸或更少(例如1，2或3个氨基酸)。可以使原来的F蛋白质的F2片段的C末端的氨基酸适当缺失，缺失的氨基酸例如可以与插入的氨基酸数相同，或者可以在0-10个氨基酸左右的范围内选择。只要不阻碍由蛋白酶进行的切割和膜融合的过程，F蛋白质就可以如此制备，使得在切割序列的下游直接连接F1的N末端，或者，也可以通过适当的间隔序列连接切割序列和F1片段。
表达经修饰的F蛋白质的载体可以使用所希望的载体系统，但是优选使用质粒载体。载体可以在病毒产生时转染到细胞中，或者也可以建立预先整合到细胞的染色体中的转化细胞。用于表达经修饰的F蛋白质的启动子，可以使用所希望的用于在哺乳动物细胞中表达的启动子，但是优选使用CA启动子。优选使用重组酶目标序列使得表达可以被重组酶特异性地诱导(参照实施例9)。
本发明中制备的病毒，更优选的是属于副粘病毒亚科(包括呼吸道病毒属，弹状病毒属和麻疹病毒属)的病毒或其衍生物，更优选的是属于呼吸道病毒属(genus respirovirus)(也称为副粘病毒属(Paramyxovirus))的病毒或其衍生物。衍生物中包括病毒基因以不损伤基于病毒的基因导入能力的方式被修饰的病毒。本发明可使用呼吸道病毒属病毒，包括例如人副流感病毒1型(HPIV-1)，人副流感病毒3型(HPIV-3)，牛副流感病毒3型(BPIV-3)，仙台病毒(Sendai virus也称为小鼠副流感病毒1型)和猴副流感病毒10型(SPIV-10)等。本发明中制备的病毒最优选的是仙台病毒。病毒可以是来源于天然株，野生株，变异株，实验室传代株，以及人工构建的毒株等的病毒。
特别地，已知仙台病毒对于啮齿类是有病原性的且可导致肺炎，但是对人是没有病原性。此外，根据以往的如下报道，也支持了即野生型仙台病毒经鼻给药于非人类灵长类中没有显示出严重的有害作用的观点(Hurwitz，J.L.et al.，Vaccine 15533-540，1997；Bitzer，M.et al.，J.Gene Med，.5543-553，2003；Slobod，K.S.et al.，Vaccine 223182-3186，2004)。仙台病毒的这些特征提示仙台病毒载体可以应用于人类的治疗中。
负链RNA病毒的基因组RNA与负链RNA病毒的病毒蛋白质一起形成核糖核蛋白(RNP)，通过该蛋白质表达基因组中的基因，这种RNA是具有复制后可形成子RNP的功能的RNA。一般而言，RNA病毒的基因组中，病毒基因作为反义序列在3’前导区域和5’尾随区域之间排列。各基因的ORF间存在转录终止序列(E序列)-插入序列(I序列)-转录起始序列(S序列)，因此编码各基因的ORF的RNA作为单独的顺反子被转录。基因组RNA反义地编码病毒蛋白质N(核壳体(或也称为核蛋白))，P(磷(phospho))和L(大)，它们是该RNA编码的基因群的表达和RNA自身的自主复制所必需的。基因组RNA还可以进一步编码包膜构成蛋白质，但是也可以构建缺失这些基因的缺失型载体。
例如，属于副粘病毒亚科的各种病毒中的各基因，一般如以下方式表示。一般N基因也表示为“NP”。此外，HN在没有神经氨酸酶时也表示为H。
呼吸道病毒属NP/C/V M F HN - L腮腺炎病毒属NP/VM F HN (SH) L麻疹病毒属 NP/C/V M F H - L例如，仙台病毒的各基因的核苷酸序列的数据库的登录号，对于N基因，参照M29343，M30202，M30203，M30204，M51331，M55565，M69046，X17218；对于P基因，参照M30202，M30203，M30204，M55565，M69046，X00583，X17007，X17008；对于M基因，参照D11446，K02742，M30202，M30203，M30204，M69046，U31956，X00584，X53056；对于F基因，参照D00152，D11446，D17334，D17335，M30202，M30203，M30204，M69046，X00152，X02131；对于HN基因，参照D26475，M12397，M30202，M30203，M30204，M69046，X00586，X02808，X56131；对于L基因，参照D00053，M30202，M30203，M30204，M69040，X00587，X58886。此外，其它病毒编码的病毒基因包括，例如，对于N基因，可以列举有CDV，AF014953；DMV，X75961；HPIV-1，D01070；HPIV-2，M55320；HPIV-3，D10025；Mapuera，X85128；Mumps，D86172；MV，K01711；NDV，AF064091；PDPR，X74443；PDV，X75717；RPV，X68311；5eV，X00087；SV5，M81442；和Tupaia，AF079780；对于P基因，可列举有CDV，X51869；DMV，Z47758；HPIV-1，M74081；HPIV-3，X04721；HPIV-4a，M55975；HPIV-4b，M55976；Mumps，D86173；MV，M89920；NDV，M20302；PDV，X75960；RPV，X68311；5eV，M30202；SV5，AF052755；和Tupaia，AF079780；对于C基因，可列举有CDV，AF014953；DMV，Z47758，HPIV-1，M74081；HPIV-3，D00047；MV，AB016162；RPV，X68311；5eV，AB005796；和Tupaia，AF079780；对于M基因，可列举有CDV，M12669；DMV Z30087；HPIV-1，S38067；HPIV-2，M62734；HPIV-3，D00130；HPIV-4a，D10241；HPIV-4b，D10242；Mumps，D86171；MV，AB012948；NDV，AF089819；PDPR，Z4797；PDV，X75717；RPV，M34018；5eV，U31956；和SV5，M32248；对于F基因，可列举有CDV，M21849；DMV，AJ224704；HPN-1，M22347；HPIV-2，M60182；HPIV-3，X05303，HPIV-4a，D49821；HPIV-4b，D49822；Mumps，D86169；MV，AB003178；NDV，AF048763；PDPR，Z37017；PDV，AJ224706；RPV，M21514；5eV，D17334；和SV5，AB021962；对于HN(H或G)基因，可列举有CDV，AF112189；DMV，AJ224705；HPIV-1，U709498；HPIV-2.D000865；HPIV-3，AB012132；HPIV-4A，M34033；HPIV-4B，AB006954；Mumps，X99040；MV，K01711；NDV，AF204872；PDPR，Z81358；PDV，Z36979；RPV，AF132934；5eV，U06433；和SV-5，S76876。但是，各病毒已知有多种毒株，由于毒株不同，也存在由上述例子之外的其它序列构成的基因。
一般而言，具有N，P和L基因的负链RNA病毒载体在细胞内自RNA基因组自主表达病毒基因，基因组RNA被复制。进而，在包膜构成蛋白质存在下形成感染性病毒粒子，然后释放到细胞外。如果在基因组中搭载编码感染性病毒粒子形成所必需的包膜构成蛋白质的基因，这种病毒载体可以自主增殖，形成具有传播能力的病毒载体。病毒载体从基因组中缺失任一种或所有包膜构成蛋白质基因，就可在感染细胞中形成不具有感染性的病毒粒子的缺失型病毒载体。
所谓包膜构成蛋白质是指成为病毒的包膜的成分的病毒蛋白质，包括露出于包膜表面，在对细胞的粘附或感染中起作用的刺突蛋白质和在形成包膜等中起作用的基质蛋白质。具体地，包膜构成蛋白质包括，例如F(融合)，HN(血凝素-神经氨酸酶)(或者H(血凝素))和M(基质)，根据病毒种类，具有H，M1和G等基因。刺突蛋白F基因缺失或HN(或H)基因缺失对使负链RNA病毒载体转变为非传染性是有效的，包膜的基质蛋白质M基因缺失对使感染细胞不能形成粒子是有效的(WO00/70055 WO00/70070和W003/025570；Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000)；Hasan，M.K.et al.，1997，J.General Virology 782813-2820)。此外，缺失了F，HN(或H)和M的至少两种基因的任意组合的载体可以保证具有更高的安全性。为了使基因缺损，可以通过导入变异(WO00/09700)使蛋白质的功能丧失，或者通过除去蛋白质的编码序列使基因缺失。例如，缺失了M和F两个基因的负链RNA病毒(ΔMΔF)将成为不具有传播性并且不能形成粒子的载体。ΔMΔF病毒在体内和体外都具有高水平的感染性和基因表达能力，该水平与野生型病毒同等。ΔMΔF病毒被认为有助于提高负链RNA病毒载体的安全性。使用共表达经修饰的F蛋白质和所缺失的蛋白质的哺乳动物细胞，可以构建缺失了包膜构成蛋白质基因的病毒。在某些细胞中进行感染时不需要HN蛋白质(Markwell，M.A.et al.，Proc.Natil.Acad.Sci.USA82(4)978-982(1985))，仅以F蛋白质就可实现感染。为了在该细胞中导入基因，在制备病毒载体时，可以仅提供经修饰的F蛋白质。
此外，制备缺失型病毒时，也可以使用与病毒基因组所缺失的包膜蛋白质不同种类的包膜蛋白质来制备假型化的病毒载体。例如，在重新构建病毒时，通过使作为骨骼病毒基因组原本编码的包膜蛋白质之外的包膜蛋白质在细胞中表达，可以制备具有所希望的包膜蛋白质的重组病毒。对于该蛋白质没有特别的限定。可以使用赋予细胞感染能力的所希望的蛋白质。例如，其它病毒的包膜蛋白质，例如水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus；VSV)的G蛋白质(VSV-G)。VSV-G蛋白质可以是来源于任意VSV株。例如，可以使用来源于印第安纳(Indiana)血清型株(J.Virology 39519-528(1981))的VSV-G蛋白质，但是不限于此。此外，本发明的载体可以含有其它病毒来源的包膜蛋白质的任意组合。例如，作为该蛋白质，来源于感染人细胞的病毒的包膜蛋白质是最佳的。作为该蛋白质，没有特别限定，但是可以列举有逆转录病毒的双嗜性包膜蛋白质。作为逆转录病毒的双嗜性包膜蛋白质，可以使用例如来源于小鼠白血病病毒(MuLV)4070A株的包膜蛋白质。此外，也可以使用来源于MuMLV 10A1的包膜蛋白质(例如pCL-10A1(Imgenex)(Nayiaux，R.K.et al.，J.Virol.705701-5705(1996))。此外，疱疹病毒科(Herpesviridae)的蛋白质包括例如单纯疱疹病毒的gB，gD，gH，gp85蛋白质，EB病毒的gp350，gp220蛋白质等。作为嗜肝DNA病毒(Hepadnavirus)科的蛋白质，可以例举有乙型肝炎病毒的S蛋白质等。该等蛋白质，也可以作为细胞外区域与F蛋白质或HN蛋白质的细胞内区域结合的融合蛋白质使用。如此，在本发明中，也可以制备含有来源于基因组来源的病毒之外的病毒的包膜蛋白质，例如VSV-G蛋白质的假型(pseudotype)病毒载体。如果设计成病毒的基因组RNA中基因组不编码该等包膜蛋白质，在病毒粒子感染细胞后，病毒载体就不会表达该等蛋白质。
此外，在改变了蛋白酶切割序列的经修饰的F蛋白质中，除了切割位点之外，还可以在其它位点增加改变。例如，通过缺失F蛋白质的细胞质区域，可以提高细胞融合能力(PCT/JP03/05528)。例如，使细胞质区域的一部分氨基酸缺失，使得细胞质区域具有0-28个，更优选1-27个，更优选4-27个氨基酸的F蛋白质，显示出显著高于野生型F蛋白质的细胞融合能力。所谓细胞质区域，就是膜蛋白质的细胞质侧的区域，F蛋白质中则是跨膜区域(TM)的C末端区域。例如，制备带有F蛋白质的病毒载体，其中该F蛋白质具有6-20个，优选10-16个，更优选13-15个氨基酸作为细胞质区域，就可以获得具有比使用野生型F蛋白质更高的细胞融合能力的载体。
此外，还可以构建带有两种刺突蛋白质的融合蛋白质的病毒。如果使起细胞融合作用的F蛋白质与被认为对细胞的粘附起作用的HN蛋白质(或H蛋白质)表达为融合蛋白质，就可以显示比在使它们分别表达的情况下更强的融合能力(PCT/JP03/05528)。上述融合蛋白质是两种蛋白质通过二者的细胞质区域部分结合的蛋白质。具体的是，融合蛋白质的N末端侧含有F蛋白质，C末端含有HN(或H)蛋白质。在使这两种蛋白质融合时，可以使两种全长蛋白质融合，但是也可以使缺失了F蛋白质的细胞质区域的一部分或全部的蛋白质与HN(或H)蛋白质融合。
此外，负链RNA病毒载体可以是缺失了附加基因的病毒载体。例如，通过敲除V基因，SeV的附加基因的一种，在不损伤培养细胞中的基因表达和复制的同时，SeV对小鼠等宿主的病原性显著减少(Kato，A.et al.，1997，J.Virol.717266-7272；Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16578-587；Curran，J.etal.，WO01/04272，EP1067179)。这种减毒化载体作为用于在体内和回体导入基因的无毒性的病毒载体特别有用。
负链RNA病毒载体的制备方法，具体包括以下步骤的方法(a)在下列物质的存在下在哺乳动物细胞中转录负链RNA病毒的基因组RNA或其互补链(i)F蛋白质的蛋白酶切割序列被改变为其它的蛋白酶切割序列的经修饰的病毒蛋白质，(ii)所述其它的蛋白酶，和(iii)构成含有负链RNA病毒的基因组RNA的RNP的蛋白质；以及(b)回收生成的病毒。其中，基因组RNA不编码该经修饰的病毒蛋白质。负链RNA病毒的基因组RNA或其互补链(反基因组(antigenome)RNA)，与负链RNA病毒的RNP的构成蛋白质共同形成RNP，表达基因组编码的病毒蛋白质的同时，使基因组RNA-反基因组(antigenome)RNA在细胞内扩增，形成病毒粒子。通过回收，可以获得病毒。
构成RNP的病毒蛋白质，是指与负链RNA病毒的基因组RNA形成复合体，并且是基因组RNA的复制和由基因组编码的基因的表达所必需的病毒蛋白质群，具体的是N(核壳体(或也称为核蛋白(NP)))，P(磷光体(phospho))和L(大)蛋白质。根据病毒种类，表示也有不同，但是对应的蛋白质对本领域技术人员而言是已知的(Anjeanette Robeft et al.，Virology 2471-6(1998))。可以使用与基因组相同的负链转录负链基因组，或者也可以用正链(反基因组(antigenome)，基因组RNA的互补链)转录负链基因组，来重建病毒RNP。为了提高载体的重建效率，优选生成正链。优选使RNA的末端尽量准确地与天然病毒基因组3’前导区域和5’尾随区域的末端相同。为此，可以通过预先在转录产物的5’端添加自我切割型核酶，通过核酶正确地切割出负链RNA病毒基因组的末端来实现(Inoue，K.et al.J.Virol.Methods 107，2003.229-236)。或者，在其它实施方式中，为了正确控制转录产物的5’端，利用噬菌体的RNA聚合酶识别序列作为转录起始位点，并在细胞内表达该RNA聚合酶。作为噬菌体的RNA聚合酶，可以使用例如大肠杆菌T3噬菌体和T7噬菌体和沙门氏菌SP6噬菌体等(Krieg，P.A.and Melton，D.A.1987.Invitro RNA synthesis with 5P6 RNA polymerase.Methods Enzymol.155397-15；Milligan，J.F.，Groebe，D.R.，Witherell，G.W.，and Uhlenbeck，O.C.1987.Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNAtemplates.Nucleic Acids Res.158783-798；Pokrovskaya，I.D.and Gurevich，V.V.1994.In vitro transcriptionPreparative RNA yields in analytical scalereactions.Anal.Biochem.220420-23)。噬菌体的RNA聚合酶的表达，可以使用例如表达该酶的痘苗病毒(Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126(1986))，或者也可以使之从质粒等非病毒载体中表达(参照实施例)。通过将RNA聚合酶基因整合到病毒生产细胞的染色体中，建立可以诱导表达噬菌体的RNA聚合酶的细胞株也是优选的。作为启动子，可以使用上述例示的哺乳动物细胞中表达基因的启动子，但是优选使用CA启动子。
为了控制转录产物的3’端，例如，可以使基因在转录产物的3’端编码自我切断型核酶，通过该核酶正确地切出3’端(Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820，1997～Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16578-587～Yu，D.et al.，1997，Genes Cells 2457-466)。核酶可以使用来源于丁型肝炎病毒的反基因组链(antigenomic strand)的自我切割核酶。
病毒基因组可以编码所希望的外源基因。含有外源基因的重组病毒载体可以通过在病毒载体的基因组中插入外源基因获得(Yu，D.et al.，GenesCells 2457-466，1997；Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820，1997)。外源基因的插入位点，可以选择例如病毒基因组的非编码蛋白质区域的所希望的位点，例如可以在基因组RNA的3’前导区域和最接近于3’端的病毒蛋白质的ORF间，各病毒蛋白质ORF间，和/或最接近于5’端的病毒蛋白质的ORF与5’尾随区域间插入。此外，在缺失了M，F或HN基因等包膜构成蛋白质基因的基因组中，可以在其缺失区域插入编码外源基因的核酸。在副粘病毒中导入外源基因时，最好使要插入基因组中的片段的多核苷酸的链长为6的倍数(Kolakofski，D.et al.，J.Virol.72891-899，1998；Calain，P.and Roux，L.，J.Virol.674822-4830，1993；Calain，P.and Roux，L.，J.Virol.674822-4830，1993)。应当使插入的外源基因与病毒ORF间构成E-I-S序列(Tokusumi，T.et al.(2002)Virus Res 86(1-2)，33-8)。可以通过E-I-S序列介导将2个或2个以上的外源基因串联插入。
为了容易地插入外源基因，可以在编码基因组RNA的cDNA中设计用于插入外源基因的克隆位点。该位点可以是例如基因组的非编码蛋白质区域中的所希望的位置，具体地，可以在3’前导区域和最接近于3’端的病毒蛋白质的ORF间，各病毒蛋白质ORF间，和/或最接近于5’端的病毒蛋白质的ORF与5’尾随区域间插入。在缺失了包膜构成蛋白质基因的基因组中，可以在其缺失区域插入克隆位点。克隆位点可以是，例如，限制性酶的识别序列。
载体中搭载的外源基因的表达水平可以通过添加在该基因的上游(负链(negative链))的转录起始序列的种类来调节(WO01/18223)。此外，可以通过基因组上的外源基因的插入位置控制，越靠近负链的3’端插入时表达水平越高，越靠近5’端插入表达水平越低。这样，为了获得该基因的所希望的表达量，并且为了与前后的编码病毒蛋白质的基因的组合为最佳，可以适当调节外源基因的插入位置。
作为在基因组中插入编码核酸的外源基因时添加的S序列，可以使用例如负链RNA病毒的所希望的S序列，但是如果是仙台病毒，也可以优选使用3′-UCCCWVUUWC-5′(W＝A或C；V＝A，C，或G)(序列号23)的序列。尤其是，优选3′-UCCCAGUUUC-5′(序列号24)，3′-UCCCACUUAC-5′(序列号25)，和3′-UCCCACUUUC-5′(序列号26)。这些序列，如果以编码正链的DNA序列表示，分别是5′-AGGGTCAAAG-3′(序列号27)，5′-AGGGTGAATG-3′(序列号28)，和5′-AGGGTGAAAG-3′(序列号29)。作为仙台病毒载体的E序列，优选的是例如3′-AUUCUUUUU-5′(序列号30)或5′-TAAGAAAAA-3′(序列号31))。I序列可以是例如任意的3个碱基，具体可以使用3′-GAA-5′(以正链DNA表示为5′-CTT-3′)。
制备负链RNA病毒的具体方法包括例举一过性的进行病毒制备的方法。其中一种方法是用下面的载体共转染哺乳动物细胞(1)在哺乳动物启动子的控制下转录编码核酶与负链RNA病毒的基因组RNA或其互补链的DNA的载体；和(2)表达构成含有负链RNA病毒的基因组RNA的RNP的病毒蛋白质的载体。这时，使改变了蛋白酶切割序列的经修饰的蛋白质和该蛋白酶也同时存在。在构成RNP的病毒蛋白质的存在下，通过由哺乳动物启动子转录负链RNA病毒基因组RNA或反基因组RNA，形成功能性RNP，从而重建病毒。通过回收在细胞中生产的负链RNA病毒或其增殖产物，可以获得负链RNA病毒载体。
此外，在其它的方法中，用下面的载体一起共转染哺乳动物细胞在哺乳动物启动子的控制下，转录编码噬菌体RNA聚合酶的DNA的载体；含有编码连接在该RNA聚合酶的识别序列的下游的负链RNA病毒的基因组RNA或其互补链的DNA的载体；以及表达构成含有负链RNA病毒的基因组RNA的RNP的病毒蛋白质(N，L和P)的载体。在改变了蛋白酶切割序列的经修饰的蛋白质以及该蛋白酶的存在下进行转染。在构成RNP的病毒蛋白质的存在下，通过哺乳动物启动子表达负链RNA病毒基因组RNA或反基因组RNA，形成功能性RNP，从而重建病毒。通过回收在细胞中生产的负链RNA病毒或其增殖产物，可以获得负链RNA病毒载体。
转染中使用的载体优选例如质粒。既可以设法使各质粒分别表达一种蛋白质，也可以使一个质粒表达多个蛋白质。为此，可以使一个质粒中具有多个启动子，或者也可以通过利用IRES等使一个启动子生成多种蛋白质。上述借助转染的病毒生产方法的优点在于即使不使用特别的细胞也可以迅速制备病毒。启动子可以使用希望的哺乳动物细胞中表达基因所用的启动子，但是优选使用CA启动子。
为了表达噬菌体的RNA聚合酶，也可以使用病毒载体。已知有，例如，使用经紫外线(UV)照射处理20分钟灭活的表达T7RNA聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3(Fuerst，T.R.et al.，Proc.Nati.Acad.Sci.USA 838122-8126，1986，Kato，A.et al.，Genes Cells 1569-579，1996)制备负链RNA病毒的方法(WO00/70055，WO00/70070，和WO03/025570；Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000)；Hasan，M.K.et al.，1997，J.General Virology 782813-2820)。通过重复进行3次左右的适当稀释病毒溶液(培养上清)再扩增的操作，可以完全除去所得的负链RNA病毒溶液中可能含有的痘苗病毒。
本发明的病毒制备方法的其它方式中，病毒生产必需的蛋白质和/或RNA从病毒生产细胞的染色体表达。这种方法的一个例子是使用染色体中含有整合的表达经修饰的蛋白质的DNA的哺乳动物细胞株的方法。或者，还包括这样的方法，其使用哺乳动物细胞株，该细胞株的染色体中含有整合的表达经修饰的蛋白质的DNA，该DNA中由哺乳动物启动子转录病毒基因组RNA或其互补链，或者该DNA中整合了噬菌体来源的RNA聚合酶。通过从转化细胞的克隆中选择高表达量的细胞，可以制备具有生产效价更高的病毒的能力的细胞。因此，这些细胞可用于稳定地制备高效价的病毒。优选地，设计使得这些细胞株中，哺乳动物启动子在普通情况下不表达病毒基因组RNA和目的蛋白质，但是可以应答于刺激而诱导表达。通过使用上述loxP或FRT，可以使哺乳动物启动子诱导性地表达基因。在制备病毒时表达Cre重组酶和FLP重组酶，以诱导由哺乳动物启动子启动的表达。启动子可以使用希望的哺乳动物细胞中表达基因所用的启动子，但是优选使用CA启动子。在表达病毒基因组RNA和RNA聚合酶的细胞中，可以在该其染色体中再导入经修饰的F蛋白质基因。
在该细胞中，通过在构成含有负链RNA病毒的基因组RNA的RNP的病毒蛋白质(N，L和P)的存在下，使负链RNA病毒的基因组RNA或其互补链转录，诱导经修饰的F蛋白质的表达，可以进行负链RNA病毒的重建。RNP构成蛋白质可以编码它们的质粒载体转染来提供。
转染中使用的各质粒的量，在用核酶切出负链RNA病毒的基因组的方法(例如HamRbz法)中，可以使用0.1μg-2μg(更优选为0.3μg)的NP表达质粒，0.1μg-2μg(更优选为0.5μg)的P表达质粒，0.5μg-4.5μg(更优选为2.0μg)的L表达质粒，0.1μg-5μg(更优选为0.5μg)的改变的F表达质粒，0.5μg-5μg(更优选为5μg)的编码病毒基因组RNA(正链或负链)的质粒。例如，为了制备SeV，可以在转染中用以下的用量使用实施例中记载的各种质粒。
pCAGGS-NP0.1μg-2μg(更优选为0.3μg)pCAGGS-P 0.1μg-2μg(更优选为0.5μg)pCAGGS-L(TDK)0.5μg-4.5μg(更优选为2.0μg)pCAGGS-F5R 0.1μg-5μg(更优选为0.5μg)pCAGGS-SeV 0.5μg-5μg(更优选为5μg)(pCAGGS-SeV/ΔF-GFP)通过噬菌体的RNA聚合酶转录负链RNA病毒的基因组的方法中，可以使用0.1μg-2μg(更优选为0.5μg)的NP表达质粒，0.1μg-2μg(更优选为0.5μg)的P表达质粒，0.5μg-4.5μg(更优选为2.0μg)的L表达质粒，0.1μg-5μg(更优选为0.5μg)的改变的F表达质粒，0.5μg-5μg(更优选为5μg)的编码病毒基因组RNA(正链或负链)的质粒。例如，为了制备SeV，可以在转染中用以下的用量使用实施例中记载的各种质粒。
pCAGGS-NP0.1μg-2μg(更优选为0.5μg)pCAGGS-P 0.1μg-2μg(更优选为0.5μg)pCAGGS-L(TDK)0.5μg-4.5μg(更优选为2.0μg)pCAGGS-F5R 0.1μg-5μg(更优选为0.5μg)pCAGGS-SeV 0.5μg-5μg(更优选为5μg)(pCAGGS-SeV/ΔF-GFP)在编码病毒基因组的DNA中，在使F基因之外的包膜构成蛋白质的基因(例如HN基因和/或M基因等)缺失时，虽不能形成感染性病毒粒子，但是在宿主细胞中，通过另外在细胞中导入这些被缺失的基因或编码其它病毒的包膜蛋白质的基因等并使之表达，可以在宿主细胞中形成感染性病毒粒子(wO00/70055和WO00/70070；Hirata，T.et al.，2002，J.Virol.Methods，104125-133；Inoue，M.et al.，2003，J.Virol.776419-6429)。在病毒生产细胞中表达包膜构成蛋白质时，可以使用用于在哺乳动物细胞中表达基因的所希望的启动子，但是优选使用CA启动子。
转染后培养48-72小时左右后，回收细胞，重复进行3次冷冻融解来破碎细胞，然后用含有RNP的破碎物再次转染细胞，然后培养。或者，回收培养上清，添加到细胞的培养液中使之感染，进行培养。转染可以例如使之与lipofectamine或聚阳离子脂质体等一起形成复合体，然后导入细胞。具体地可以利用各种转染试剂。例如DOTMA(Roche)，Superfect(QIAGEN#301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Roche#1811169)，TransIT-LT1(Mirus，Product No.MIR 2300)等。为了防止在核内体中被分解，也可以添加氯喹(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA803015)。在导入了RNP的细胞中，进行RNP的病毒基因表达和RNP的复制过程，从而病毒扩增。回收的载体可以在-80℃保存。为了重建缺失了编码包膜构成蛋白质的基因的不具有传播能力的病毒，在转染中可以使用表达包膜构成蛋白质的细胞(辅助细胞)，或者可以与包膜构成蛋白质表达质粒共转染。此外，也可以通过在进行了转染的病毒生产细胞上用表达包膜构成蛋白质的细胞进行叠层培养，来扩增包膜构成蛋白质基因缺失型病毒(参照WO00/70055和WO00/70070)。
对于负链RNA病毒的制备，更详细的可以参照公知的方法。(Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820，1997，Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16578-587和Yu，D.et al.，1997，Genes Cells 2457-466；WO97/16539；WO97/16538；WO00/70055；WO00/70070；WO03/025570；Durbin，A.P.et al.，1997，Virology 235323-332；Whelan，S.P.et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 928388-8392；Schnell.M.J.et al.，1994，EMBO J.134195-4203；Radecke，F.et al.，1995，EMBO J.145773-5784；Lawson，N.D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 924477-4481；Garcin，D.et al.，1995，EMBO J.146087-6094；Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1569-579；Baron，M.D.andBarrett，T.，1997，J.Virol.711265-1271；Bridgen，A.and Elliott，R.M.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9315400-15404)。通过在这些方法中应用本发明的方法，可以从DNA以高效率重建包括副流感病毒，水泡性口炎病毒，狂犬病毒，麻疹病毒，牛瘟麻疹病毒，仙台病毒等的负链RNA病毒。
回收的病毒的效价，可以通过例如CIU测定(Cell Infecting Unit)测定或红血球凝集活性(HA)的测定来确定(WO00/70070；Kato，A.et al.，1996，GenesCells 1569-579；Yonemitsu，Y.& Kaneda，Y.，Hemaggulutinating virus ofJapan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells.Ed.by Baker AH.Molecular Biology of Vascular Diseases.Method in Molecular MedicineHumana Presspp.295-306，1999)。此外，对于搭载了GFP(绿色荧光蛋白质)等标记基因的载体，可以通过以标记为指标对感染细胞直接计数来定量效价(例如，作为GFP-CIU)。这样测定的效价，可以与CIU同等方式处理(WO00/70070)。
只要能重建出病毒，对重建中使用的宿主细胞没有特别的限定。例如，在仙台病毒载体等的重建中，可以使用猴来源的LLC-MK2细胞和CV-1细胞，仓鼠肾来源的BHK细胞等培养细胞，人源细胞等。尤其是，本发明的方法可以使用以往有困难的人细胞进行病毒的制备。此外，为了大量获得仙台病毒，使从上述宿主中获得的病毒载体感染含胚鸡卵，可以扩增病毒。现在已经开发了使用鸡卵的病毒载体的制备方法(中西等编(1993)《神经科学研究的前沿技术记录III，分子神经细胞生理学》，厚生社，大阪，pp.153-172)。具体地，例如，将受精卵置入培养器中，37-38℃培养，使胚发育。将病毒载体接种在尿囊腔，将卵培养数天(例如3天)使病毒载体增殖。培养期等条件可以根据使用的重组仙台病毒而变化。然后，回收含有病毒的绒膜尿囊液。从绒膜尿囊液中分离纯化仙台病毒载体可以按照常规方法进行(田代真人，《病毒实验规范操作》，永井，石浜监修，Medical View社，pp.68-73(1995))。
按照本说明书中记载的病毒制备方法，可以使负链RNA病毒载体以例如1×105CIU/ml或以上，优选1×106CIU/ml或以上，更优选5×106CIU/ml或以上，更优选1×107CIU/ml或以上，更优选5×107CIU/ml以上，更优选1×108CIU/ml或以上，优选5×108CIU/ml或以上的效价释放到病毒产生细胞的细胞外液中。病毒的效价可以通过本说明书和其它文献记载的方法测定(Kiyotani，K.et al.，Virology 177(1)，65-74(1990)；WO00/70070)。
通过本发明的方法制备的病毒载体可以纯化成基本纯。纯化方法可以通过包括过滤，离心分离，吸附和柱纯化等公知的纯化分离方法或它们的任意组合来进行。所谓“基本纯”是指含有病毒载体的溶液中该病毒的成分占主要比例。例如，对于基本上纯化的病毒载体组合物，可以根据下述确认溶液中所包含的所有蛋白质(但是作为载体(carrier)和稳定剂添加的蛋白质除外)中作为病毒载体的成分的所含蛋白质的比例占10％(重量/重量)或以上，优选占20％或以上，更优选50％或以上，优选70％(重量/重量)或以上，更优选80％(重量/重量)或以上，更优选90％(重量/重量)或以上。例如，对副粘病毒载体，具体的纯化方法可以例举使用纤维素硫酸酯，或交联多糖硫酸酯的方法(特公昭62-30752号公报，特公昭62-33879号公报和特公昭62-30753号公报)，以及使之吸附于含有岩藻糖硫酸的多糖和/或其分解物的方法(WO97/32010)等，但是不限于此。
在含有本发明的病毒载体的制备中，可以根据需要可以将载体与药学上可接受的所希望的承运体或介质组合。所谓“药学上可接受的承运体或介质”，可以与载体一起给药，其不显著抑制通过载体进行的基因导入的材料。作为这种承运体或介质，可以例举有，例如无菌水，氯化钠溶液，葡萄糖溶液，含有乳酸的Ringer溶液，培养液，血清，磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)等，通过将它们与载体适当组合而制剂化。此外，本发明的组合物也可以含有脂质体的膜稳定剂(例如，胆固醇等类固醇类)。此外，也可以含有抗氧化剂(例如生育酚或维生素E等)。进而，除此之外，还可以含有植物油，悬浮液，表面活性剂，稳定剂，杀生物剂等。此外可以添加保存剂和其它的添加剂。本发明的组合物可以是水溶液，胶囊，悬浮液，糖浆等形态。此外本发明的组合物也可以是溶液，冷冻干燥物或气雾剂形态的组合物。冷冻干燥物的情况，可以含有山梨醇，蔗糖，氨基酸和各种蛋白质等作为稳定剂。制备的病毒载体组合物可用作向包括人和非人哺乳动物在内的所希望的哺乳动物和动物细胞中导入基因的试剂和药物。特别地，通过本发明的方法制备的病毒载体优选被用于对人的基因治疗。
实施例以下，通过实施例对发明进行更详细的说明，但是并不限于这些实施例。并且，本说明书中引用的文献全部并入本文作为本说明书的一部分。
在F基因表达质粒中导入弗林蛋白酶识别序列为制备使用LLC-MK2以外的细胞，可以回收F基因缺失型SeV载体(SeV/ΔF)的包装细胞(尤其是利用人源细胞的包装细胞)，在包装细胞中表达的F蛋白质中导入弗林蛋白酶识别序列。导入的序列，使用基于识别弗林蛋白酶的共有序列R-(X)-R/K-R的序列(Chambers，T.J.et al.，Annu.Rev.Microbiol.44，649-688(1990))的比原来的F蛋白质的序列变异最少的R-Q-K-R的序列(F(furin))以及可预计切断效率更好的(R)-R-R-R-R的序列(F(5R))这两种序列(图1)。此外，F基因的表达可以利用Cre/loxP表达诱导系统。为了构建该系统，在与建立利用LLC-MK2的F蛋白的包装细胞(LLC-MK2/F7细胞)(Li，H.-O.et al.，J.Virology 74，6564-6569(2000)，WO00/70070)时相同，利用被设计成由Cre DNA重组酶诱导表达基因产物的质粒pCALNdLw(Arai，T.et al.，J.Virol.721115-1121(1988))。
首先，使用在具有Zeocin抗性基因的pCALNdLw中导入了F基因的质粒(pCALNdLw-ZeoF特愿2001-283451)，将弗林蛋白酶识别序列导入F基因(R-Q-K-RF(furin))。亚克隆的步骤概要示于图2中。以pCALNdLw-ZeoF作为模板，通过组合引物ploxF(5’-CATTTTGGCAAAGAATTGATTAATTCGAG-3’/序列号32)和pFfurinR(5’-TCACAGCACCCAAGAATCTCTTCTGGCGAGCACCGGCATTTTGTGTC-3’/序列号33)，使用Pfu Turbo(STRATAGENE，La Jolla，CA)进行PCR(步骤1)。此外，以相同的pCALNdLw-ZeoF作为模板，通过组合引物pFfurinF(5’-GACACAAAATGCCGGTGCTCGCCAGAAGAGATTCTTGGGTGCTGTGA-3’/序列号34)和pFXho2R(5’-GATCGTAATCACAGTCTCTCGAGAGTTGTACCATCTACCTAC-3’/序列号35)，进行PCR(步骤2)。通过在这时使用的pFfurinR和pFfurinF这两条引物中导入用于在弗林蛋白酶识别序列(这时是R-Q-K-R)中引入变异的序列。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳后，分别切出步骤1的1470bp的条带和步骤2的1190bp的条带，使用GENE CLEAN KIT(フナコシ，东京)回收(分别为片段(i)，片段(ii))。将分别稀释了10倍的纯化的片段(i)和片段(ii)各1μl混合，进而通过组合ploxF和pFXho2R的引物使用Pfu Turbo进行PCR(步骤3)。对5μlPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，结果检测出预计的2.6kbp的条带。于是，用Qiaquick PCR Extraction kit(QIAGEN，Bothell，WA)纯化出余下的PCR产物。然后用DraIII和MfeI连续进行限制性酶处理，经琼脂糖凝胶电泳分离后，切出约2.0kbp的条带(片段3)。另一方面，用DraIII和MfeI连续消化pCALNdLw-Zeo-F，通过琼脂糖凝胶电泳分离，切出约6kbp的条带，用GENE CLEAN KIT纯化(片段4)。通过连接片段3和4，构建出pCALNdLw-Zeo-F(furin)(也作pCALNdLw-Zeo-Ffurin)。
接着，在pCALNdLw-ZeoF上的F基因中导入更有效切断的弗林蛋白酶识别序列(R)-R-R-R-R(F(5R))。亚克隆的步骤概要示于图3中。以如上制备的pCALNdLw-Zeo-F(furin)作为模板，通过组合引物ploxF和pF5R-R(5’-TCACAGCACCGAAGAATCTCCTCCGGCGACGACCGGCATTTTGTGTCGTATC-3’/序列号36)，进行PCR(步骤5)。此外，以相同的pCALNdLw-Zeo-F(furin)作为模板，通过组合引物pF5R-F(5′-GATACGACACAAAATGCCGGTCGTCGCCGGAGGAGATTCTTCGGTGCTGTGA-3′/序列号37)和R5437(5’-GACACAAAATGCCGGTGCTCGCCAGAAGAGATTCTTGGGTGCTGTGA-3’/序列号38)，进行PCR(步骤6)。通过在这时使用的两条引物pF5R-R和pF5R-F中导入用于在弗林蛋白酶识别序列(这时是(R)-R-R-R-R)引入变异的序列。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳分离后，分别切出步骤5的1470bp的条带和步骤6的200bp的条带，用Qiaquick PCR Extraction kit纯化(分别为片段5，片段6。将分别稀释了50倍的纯化的片段5和片段6各1μl混合，进而通过组合ploxF和R5437的引物使用Pfu Turbo进行PCR(步骤7)。对5μlPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离后，染色，确认了约1.6kbp的条带。于是，用Qiaquick PCR Purification kit纯化剩余物，然后用ClaI和FseI消化，经琼脂糖凝胶电泳分离后，切出约1kbp的条带，用Qiaquick PCRPurification kit纯化(片段7)。另一方面，用ClaI和FseI消化pCALNdLw-Zeo-F(furin)，经琼脂糖凝胶电泳分离后，切出约8kbp的条带，用Qiaquick PCR Purification kit纯化(片段8)。通过连接片段7和8，构建出pCALNdLw-Zeo-F(5R)(也记载为pCALNdLw-Zeo-F5R)。用XhoI消化pCALNdLw-Zeo-F5R，纯化后进行连接，选择不含有XhoI片段(含有Zeocin抗性基因)者，获得pCAGGS-F5R。
其它质粒的构建·pCAGGS(B型)的构建(图4)用XhoI消化pCALNdLw(Arai，T.et al.J.Virology 72，1998，p1115-1121)，用Qiaquick PCR Purification kit纯化，进行连接。选择除去XhoI片段者，所得产物为pCAGGS(B型)。用SalI消化pCAGGS(B型)，用Pfu DNA聚合酶平末端化，用Qiaquick PCR Purification kit纯化，进行连接。选择SalI位点被破坏者，作为pCAGGS(BSX)。
·pCAGGS-NP的构建(图5)用SpeI和EcoT22I消化pCALNdLw，经琼脂糖凝胶电泳分离。切出2651bp片段和3674bp片段，用Qiaquick gel Extraction kit纯化。进而用XhoI消化2651bp片段，经琼脂糖凝胶电泳分离后，纯化出1761bp的条带。以pcDNA3.1/Zeo(+)为模板，使用引物5’-TCTCGAGTCGCTCGGTACGATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCAC-3’(序列号39)和引物5’-AATGCATGATCAGTAAATTACAATGAACATCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTGCACGCAGTTG-3’(序列号40)通过PCR扩增出Zeocin抗性基因，用XhoI和EcoT22I消化，用琼脂糖凝胶电泳分离，切出438bp的片段，用Qiaquick Gel Extraction kit纯化。通过连接含有这种Zeocin抗性基因的条带和上述3674bp和1761bp这3种片段，获得pCALNdLw-Zeo。通过用SawI消化pCALNdLw-Zeo，插入EcoRI接头(STRATAGENE)，获得pCALNdLWE-Zeo。用NotI和EcoRI消化导入了多克隆位点的仙台病毒cDNA(特开2002-272465)(以下称为pSeV(TDK))，用琼脂糖凝胶电泳分离，切出1669bp的条带，用Qiaquick Gel Extraction kit纯化。在经NotI和EcoRI消化的pGEM 11 Zf(+)(Promega)中插入含有这种NP基因的片段，制成pGEM-NP(Z)PCR14-3。使用5’-CCGGAATTCAACAAATGGCCGGGTTGTTGAGCACCTTCGA-3’(序列号41)和5’-CCGGAATTCCTAGATTCCTCCTATCCCAGCTACTGCTGCTCG-3’(序列号42)通过PCR扩增，EcoRI消化后，导入pCALNdLWE-Zeo的EcoRI位点，获得pCALNdLWE-Zeo-NP(Z)。接着，用XhoI消化pCALNdLWE-Zeo-NP(Z)，进行连接，构建除去了XhoI片段的质粒，以其作为pCAGGS-NP。
·pCAGGS-P4C(-)的构建(图6)用XhoI消化pCALNdLw-HygroM(Inoue，M.et al.J.Virology 77，2003，p6419-6429)，用Qiaquick PCR Purification kit纯化后，切出含有潮霉素抗性基因的1679bp的条带，用Qiaquick Gel Extraction kit纯化。用XhoI消化pCALNdLw，切出经琼脂糖凝胶电泳分离后4864bp的条带，用Qiaquick GelExtraction kit纯化。用这两条带进行连接，构建pCALNdLw-Hygro。通过用SwaI消化该pCALNdLw-Hygro，插入NheI接头(STRATAGENE)，获得pCALNdLWN-Hygro。以4C(-)SeV cDNA(Kurotani，Kato，Nagai，et al Genesto Cells 3，1998，p111-124)为模板，使用5’-CTAGCTAGCCCACCATGGATCAAGATGCCTTCATTCTAAAAGAAGATTCT-3’(序列号43)和5’-CTAGCTAGCCTAGTTGGTCAGTGACTCTATGTCCTCTTCTACGAGTTCCA-3’(序列号44)，通过KOD-PLUS DNA聚合酶(ToYoBo)进行PCR。使用geneclean kit纯化，用NheI消化PCR产物，用gene clean kit纯化。将其导入到pCALNdLWN-Hygro的NheI位点，获得pCALNdLWN-hygro-P(Z)k4C(-)。用XhoI对其消化，用Qiaquick PCR Purification kit纯化后，进行连接，选择除去了XhoI(潮霉素抗性基因区域)片段者，获得pCAGGS-P4C(-)。
·pCAGGS-L(TDK)的构建(图7)用FseI和SacI消化pSeV(TDK)，经琼脂糖凝胶电泳分离后，切出6732bp的条带，用Qiaquick gel Extraction kit纯化。使用Pfu DNA聚合酶和dNTP，使之在72℃反应10分钟而平末端化。用Qiaquick PCR Purificationkit纯化后，导入到pCAGGS(BSX)的SwaI位点中，获得pCAGGS-L(TDK)。
·pCAGGS-F的构建(图8)用XhoI消化pCALNdLw/F(Li，H.-O.et al.J.Virology 74，2000，p6564-6569)后，进行连接，选择除去XhoI(新霉素抗性基因区域)片段者，获得pCAGGS-F。
·pCAGGS-T7的构建(图9)用BamHI消化pTF7-3(ATCC No.67202)后，经琼脂糖凝胶电泳分离后，回收含有T7RNA聚合酶基因的2.65kbp片段，插入到pMW219(Nippon gene)的BamHI位点，获得pMW219-T7。用SacI消化该pMW219-T7后，用DNABlunting kit(TaKaRa)平端化，导入EcoRI接头(STRATAGENE)，获得pMW219-T7-EcoRI。用EcoRI消化该pMW219-T7-EcoRI，纯化含有T7RNA聚合酶的EcoRI片段，通过导入到上述的pCALNdLWE的EcoRI位点中，获得pCALNdLWE-T7。
·pCAGGS-SeV和pCAGGS-SeV/ΔF-GFP的构建(图10-12)用NotI和KpnI消化pSeV(TDK)，经琼脂糖凝胶电泳分离后，切出2995bp的条带，用Qiaquick Gel Extraction kit纯化。将MlinkerF55’-GGCCGCGTCGACATCGATGCTAGCCTCGAGCCGCGGTAC-3’(序列号45)，MlinkerR 5’-CGCGGCTCGAGGCTAGCATCGATGTCGACGC-3′(序列号46)各2μg(μl)与21μl H2O混合，使之在95℃下培养5分钟，85℃下培养15分钟，65℃下培养15分钟，37℃下培养15分钟，25℃下培养15分钟，4℃下培养。连接这种混合液与pSeV(TDK)Not I-Kpn I纯化液，获得pSeV/Linker。以该SeV/Linker作为模板，使用pGEM-F55’-CTTAACTATGCGGCATCAGAGC-3’(序列号47)和pGEM-R15’-GCCGATTCATTAATGCAGCTGG-3’(序列号48)，采用KOD-Plus(TOYOBO)进行PCR，使用Qiaquick PCR Purification kit纯化。以这种纯化液作为模板，使用RibLF1 5’-CTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCACCAAACAAGAG-3’(序列号49)和pGEM-R1 5’-GCCGATTCATTAATGCAGCTGG-3’(序列号48)，采用KOD-Plus(ToYoBo)进行PCR，使用Qiaquick PCR Purification kit纯化。以这种纯化液作为模板，使用RibLF2 5’-GATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTC-3’(序列号50)和pGEM-R1 5’-GCCGATTCATTAATGCAGCTGG-3’(序列号48)，采用KOD-Plus(TOYOBO)进行PCR，使用Qiaquick PCR Purification kit纯化。进而，以该纯化液为模板，使用RibLF3 5’-GCGGGCCCTCTCTTGTTTGGTCTGATGAGTCCGTGAGGAC-3’(序列号51)和pGEM-R1 5’-GCCGATTCATTAATGCAGCTGG-3’(序列号48)，采用KOD-Plus(TOYOBO)进行PCR，使用Qiaquick PCR Purification kit纯化。将纯化的PCR产物导入到pCAGGS(BSX)的SwaI位点中，形成pCAGGS-SeV(m)。接着，用NotI和SalI消化pSeV 18+b(+)/ΔF-EGFP(Li，H.-O.et al.J.Virology 74，2000，p6564-6569)，经琼脂糖凝胶电泳分离后，切出1972bp的条带，用Qiaquick Gel Extraction kit纯化，用NotI和SalI消化，与纯化的pCAGGS-SeV(m)连接，获得pCAGGS-SeV(m)A。pSeV(+)18/ΔF用NheI和KpnI消化，然后用琼脂糖凝胶电泳分离，切出3325bp的条带，用QiaquickGel Extraction kit纯化，用NotI和SalI消化。所得片段与pCAGGS-SeV(m)连接，获得pCAGGS-SeV(m)AC。
用SalI和NheI消化pSeV 18+b(+)(Li，H.-O.et al.J.Virology 74，2000，p6564-6569)，用Qiaquick PCR Purification kit纯化。然后，导入LITMUS38(NEW ENGLAND BioLabs)的SalI-NheI位点，得到Litmus38/SeV SalI-NheI。用SalI和NheI消化Litmus38/SeV SalI-NheI，经琼脂糖凝胶电泳分离后，切出9886bp的条带，用Qiaquick Gel Extraction kit纯化，通过导入到pCAGGS-SeV(m)AC的SalI-NheI位点，获得pCAGGS-SeV。
用SalI和NheI消化pSeV/ΔF-EGFP(Li，H.-O.et al.J.Virology 74，2000，p6564-6569)，用Qiaquick PCR Purification kit纯化。然后，导入LITMUS38(NEW ENGLAND BioLabs)的SalI-Nhe位点，获得Litmus38/SeV SalI-NheIΔF-GFP。用SalI和NheI消化Litmus38/SeV SalI-NheIΔF-GFP，经琼脂糖凝胶电泳分离后，切出8392bp的条带，用Qiaquick Gel Extraction kit纯化，通过导入到pCAGGS-SeV(m)AC的SalI-NheI位点，获得pCAGGS-SeV/ΔF-GFP。
·pGEM-IRES-Luci的构建将由用BamHI消化pMAMneo-Luci(Clontech)获得的荧光素酶片段导入到PTM1(Nature，348，1，November，1990，91-92)的BamHI的位点中，获得pGEM-IRES-Luci。
表达T7RNA聚合酶的BHK-21(以下为BHK/T7)的建立使用哺乳动物转染试剂盒(mammalian transfection kit)(Stratagene)或SuperFect(Qiagen)以上述构建的pCALNdLWE-T7进行对BHK-21细胞的转染。在含有400μg/ml的G418的D-MEM中，37℃，5％CO2下培养2周，由单一的细胞获得增殖的药物抗性克隆。以Moi＝4用表达Cre DNA重组酶的重组腺病毒(AxCANCre)感染所得的药物抗性克隆，24小时后，用PBS清洗细胞一次后，回收细胞，通过使用抗-T7RNA聚合酶兔多克隆抗体的western印迹分析确认T7RNA聚合酶的表达。
对于可确认表达的克隆，使用SuperFect以pGEM-IRES-Luci进行转染。24小时后回收细胞，通过使用双荧光素酶报告系统(Promega)试剂盒的MiniLumat LB9506(EG&G BERTHOLD)测定荧光素酶的活性，确认T7RNA聚合酶的活性。
F缺失型SeV载体的回收通过使用转录添加了锤头核酶的仙台病毒的载体的病毒载体的制备方法(以下称为HamRbz法)，回收F基因缺失型SeV。在转染人胎儿肾来源的293T细胞的前一天，以1×106细胞/孔/2ml加入了10％FBS的D-MEM培养基接种于6孔板中。转染按以下述方式进行。在30μl Opti-MEM中混合15μlTransIT-LT1(Mirus)，室温下培养10-15分钟。这期间制备DNA溶液。在20μl Opti-MEM中分别溶解0.3μg pCAGGS-NP，0.5μg pCAGGS-P4C(-)，2μgpCAGGS-L(TDK)，0.5μg pCAGGS-F5R，0.5-5μg pCAGGS-SeV/ΔF-GFP。10-15分钟后，混合TransIT-LT1溶液和DNA溶液，室温下静置15分钟。这期间除去细胞的培养基，轻柔地以1ml/孔添加新的加入了10％FBS的D-MEM培养基。15分钟后，在DNA-TransIT-LT1混合物中加入500μlOpti-MEM(GIBCO)，将其全部添加到细胞中，然后培养。37℃，5％CO2下培养72小时后，除去培养液，用以1×106细胞/ml悬浮于含有7.5μg/ml胰蛋白酶(不含血清)的MEM(以下称为Try-MEM)中的LLC-MK2/F7/A细胞(诱导F蛋白表达的细胞记载为LLC-MK2/F7/A；H.-O.et al.，J.Virology74.6564-6569(2000)，WO00/70070)以1ml/孔覆层，37℃，5％CO2下培养。自此24小时后，回收1ml培养液，加入1ml新的Try-MEM，37℃，5％CO2下培养。48小时后回收1ml培养液，加入1ml新的Try-MEM，37℃，5％CO2下培养。72小时后回收1ml培养液，在回收的培养液中加入133μl7.5％BSA(最终浓度1％BSA)，于-80℃保存直至测定CIU。
如下所述，通过对GFP表达细胞的计数实施CIU的测定(GFP-CIU)。CIU测试的2-3天前在12孔板上接种LLC-MK2细胞。两天前时，以1.5×105细胞/孔的比例，以1ml/孔加入了10％FBS的MEM培养基接种，在三天前时，以8.0×104细胞/孔的比例，以1ml/孔加入了10％FBS的MEM培养基接种。在CIU测试当天用不含血清的MEM清洗一次后，用MEM培养基制备覆层后第24，48，72小时回收的培养液的1/10稀释系列，37℃感染1小时后，用MEM培养基清洗一次，添加1ml MEM培养基。37℃培养2天后，用荧光显微镜观察细胞，对适度稀释的孔的GFP阳性细胞计数。其结果是，覆层后72小时后，回收了1×105-1×107GFP-CIU/ml的病毒载体(图13)。
F基因的供给在导入弗林蛋白酶识别序列的F(以下称F5R)时与野生型F(以下称F)时的生产能力的比较通过pCAGGS供给F蛋白质时，进行使用野生型的F基因的情况与导入弗林蛋白酶识别序列的F5R的情况下的重建效率的比较。在转染293T细胞前一天，以1×106细胞/孔/2ml加入了10％FBS的D-MEM培养基接种于6孔板中。转染转染按以下述方式进行。在30μl Opti-MEM中混合15μlTransIT-LT1(Mirus)，室温下培养10-15分钟。这期间制备DNA溶液。在20μl Opti-MEM中分别溶解固定量的0.3μg pCAGGS-NP，0.5μgpCAGGS-P4C(-)，2μg pCAGGS-L，2μg pCAGGS-SeV/ΔF-GFP；和变化量0.1μg，0.3μg，0.5μg，0.7μg，0.9μg的pCAGGS-F或pCAGGS-F5R。10-15分钟后，混合TransIT-LT1溶液和DNA溶液，室温下静置15分钟。这期间除去细胞的培养基，轻柔地以1ml/孔添加新的加入了10％FBS的D-MEM。15分钟后，在DNA-TransIT-LT1混合物中加入500μlOpti-MEM(GIBCO)，将其全部添加到细胞中，然后培养。37℃，5％CO2下培养72小时后，除去培养液，以1ml/孔使以1×106细胞/ml悬浮于含有7.5μg/ml胰蛋白酶(不含血清)的MEM(以下称为Try-MEM)中的LLC-MK2/F7/A细胞(诱导F表达的细胞记载为LLC-MK2/F7/A；H.-O.et al.，J.Virology 74.6564-6569(2000)，WO00/70070)覆层，37℃，5％CO2下培养。自此24小时后，回收1ml培养液，加入1ml新的Try-MEM，37℃，5％CO2下培养。48小时后回收1ml培养液，加入1ml新的Try-MEM，37℃，5％CO2下培养。72小时后回收1ml培养液，在回收的培养液中加入133μl 7.5％BSA(最终浓度1％BSA)，于-80℃保存直至测定CIU。回收所有的试样后进行CIU测试。其结果是，pCAGGS-F为0.7μg时的重建效率最好，覆层后第24，48，72小时分别含有0CIU/ml，7.9×102CIU/ml，3.3×104CIU/ml的病毒载体。另一方面，使用pCAGGS-F5R时远比pCAGGS-F时的重建效率好，覆层后第72小时时前者可以获得比后者高373倍的病毒载体(图14)。
传播型SeV载体的制备通过使用pCAGGS-T7，经T7RNA聚合酶使SeV基因组转录的病毒载体制备方法(以下称为pCAGGS-T7)进行传播型SeV的回收。转染前一天，将各细胞接种于6孔板中(293T细胞1×106细胞/孔/2ml加入了10％FBS的D-MEM，LLC-MK2细胞5.0×105细胞/孔/2ml加入了10％FBS的D-MEM，BHK-21细胞2.5×105细胞/孔/2ml加入了10％FBS的D-MEM，BHK/T7细胞2.5×105细胞/孔/2ml加入了10％FBS的D-MEM)。转染按以下述方式进行。在30μl Opti-MEM中混合15μl TransIT-LI1(Mirus)，室温下培养10-15分钟。这期间制备DNA溶液。在20μl Opti-MEM中分别溶解0.5μgpCAGGS-T7，0.5μg pCAGGS-NP，0.5μg pCAGGS-P4C(-)，2μgpCAGGS-L(TDK)，5μg pSeV(TDK)18+GFP。10-15分钟后，混合TransIT-LT1溶液和DNA溶液，室温下静置15分钟。这期间除去细胞的培养基，轻柔地以1ml/孔添加新的加入了10％FBS的D-MEM培养基。15分钟后，在DNA-TransIT-LT1混合物中加入500μl Opti-MEM(GIBCO)，将其全部添加到细胞中，然后培养。37℃，5％CO2下培养3天。此时，对GFP阳性细胞计数的结果是293T细胞246个，LLC-MK2细胞16个，BHK-21细胞288个，BHK/T7细胞405个。然后，除去培养液，在细胞中添加1ml PBS(-)，用细胞刮刀刮下细胞并回收到eppendorf管中。冷冻融解1次后，将未稀释的细胞悬浮液和100μl经PBS稀释10倍，100倍，1000倍的细胞悬浮液分别接种于10天的鸡卵中。孵卵机中35℃下培养3天。然后，回收绒膜尿囊液，进行HA测试。其结果是，在接种了未稀释的293T细胞，BHK-21细胞，BHK/T7细胞悬浮液的鸡卵中可确认病毒的增殖(图15)。
F缺失型SeV载体的制备在转染293T细胞的前一天，以1×106细胞/孔/2ml加入了10％FBS的D-MEM培养基接种于6孔板中。转染按以下述方式进行。在30μl Opti-MEM中混合15μl TransIT-LY1(Mirus)，室温下培养10-15分钟。这期间制备DNA溶液。在20μl Opti-MEM中分别溶解0.5μg pCAGGS-T7，0.5μg pCAGGS-NP，0.5μg pCAGGS-P4C(-)，2μg pCAGGS-L(TDK)，0.5μg pCAGGS-F5R，0.5-5μgSeV/ΔF-GFP(WO00/70070)。10-15分钟后，混合TransIT-LT1溶液和DNA溶液，室温下静置15分钟。这期间除去细胞的培养基，轻柔地以1ml/孔添加新的加入了10％FBS的D-MEM。15分钟后，在DNA-TransIT-LT1混合物中加入500μlOpti-MEM(GIBCO)，将其全部添加到细胞中，然后培养。37℃，5％CO2下培养72小时后，除去培养液，用以1×106细胞/ml悬浮于Try-MEM中的LLC-MK2/F7/A细胞以1ml/孔覆层，37℃，5％CO2下培养。自此24小时后，回收1ml培养液，加入1ml新的Try-MEM，37℃，5％CO2下培养。48小时后回收1ml培养液，加入1ml新的Try-MEM，37℃，5％CO2下培养。72小时后回收1ml培养液，在回收的培养液中加入133μl7.5％BSA(最终浓度1％BSA)，于-80℃保存直至测定CIU。
如下所述，通过对GFP表达细胞的计数实施CIU的测定(GFP-CIU)。CIU测试的2-3天前在12孔板上接种LLC-MK2细胞。两天前时，以1.5×105细胞/孔的比例，以1ml/孔加入了10％FBS的MEM培养基接种，在三天前时，以8.0×104细胞/孔的比例，以1ml/孔加入了10％FBS的MEM培养基接种。在CIU测试当天用不含血清的MEM清洗一次后，用MEM培养基制备覆层后第24，48，72小时回收的培养液的1/10稀释系列，37℃感染1小时后，用MEM培养基清洗一次，添加1ml MEM培养基。37℃培养2天后，用荧光显微镜观察细胞，对适度稀释的孔的GFP阳性细胞计数。其结果是，覆层后72小时后，回收了1×106-1×107GFP-CIU/ml的病毒载体(图16)。
这种pCAGGS-T7法，在使用293T细胞作为质粒的导入细胞时，通过磷酸钙法也可以成功回收SeV18+GFP/ΔF。其效率与TransIT-LT1等同(图17)。
pCAGGS-T7法的细胞种类的研究为了研究这种pCAGGS-T7法在293T之外的细胞中是否也可以回收仙台病毒载体，尝试在LLC-MK2，BHK-21，BHK/T7或293T细胞系中是否也可以回收。在转染前将各种细胞接种于6孔板中(LLC-MK2细胞5×105细胞/孔，BHK-21细胞2.5×105细胞/孔，BHK/T7细胞2.5×105细胞/孔，293T细胞1×106细胞/孔)。转染按以下述方式进行。在30μl Opti-MEM中混合15μl TransIT-LT1(Mirus)，室温下培养10-15分钟。这期间制备DNA溶液。在20μl Opti-MEM中分别溶解0.5μg pCAGGS-T7，0.5μgpCAGGS-NP，0.5μg pCAGGS-P4C(-)，2μg pCAGGS-L(TDK)，0.5μgpCAGGS-F5R，2μg SeV/ΔF-GFP(但是，使用BHK/T7细胞时不添加pCAGGS-T7)。10-15分钟后，混合TransIT-LT1溶液和DNA溶液，室温下静置15分钟。这期间除去细胞的培养基，轻柔地以1ml/孔添加新的加入了10％FBS的D-MEM。15分钟后，在DNA-TransIT-LT1混合物中加入500μlOpti-MEM(GIBCO)，将其全部添加到细胞中，然后培养。37℃，5％CO2下培养72小时后，除去培养液，用以1×106细胞/ml悬浮于Try-MEM中的LLC-MK2/F7/A细胞以1ml/孔覆层，37℃，5％CO2下培养。自此24小时后，回收1ml培养液，加入1ml新的Try-MEM，37℃，5％CO2下培养。48小时后回收1ml培养液，加入1ml新的Try-MEM，37℃，5％CO2下培养。72小时后回收1ml培养液，在回收的培养液中加入133μl 7.5％BSA(最终浓度1％BSA)，于-80℃保存直至测定CIU。以n＝3进行。其结果是，从检测的所有细胞种类中回收载体。载体的回收效率的顺序为BHK/T7细胞＞BHK-21细胞＞293T细胞＞LLC-MK2细胞(图18)。此外，由于BHK/T7细胞株中没有被pCAGGS-T7转染，表明T7表达株中可以使用CA启动子，可以回收F缺失型SeV/ΔF-GFP。
可诱导表达含有弗林蛋白酶识别序列的F蛋白的包装细胞的克隆对于人细胞HeLa细胞，尝试制备包装细胞。转染中可以使用LipofectAMINE PLUS试剂(Invitrogen，Groningen，Netherlands)按照标准操作规范中记载的方法进行。也就是用以下的方法进行。以2×105细胞/皿将HeLa细胞接种于6孔板中，在含有10％FBS的D-MEM中培养24小时。将1.5μg pCALNdLw-Zeo-F(furin)或pCALNdLw-Zeo-F(5R)稀释于不含FBS和抗生素的D-MEM中(总量为94μL)，搅拌后添加6μL LipofectAMINE PLUS试剂，再次搅拌，于室温下放置15分钟。放置后，添加预先用不含FBS和抗生素的D-MEM稀释的4μl LipofectAMINE PLUS试剂(总体积为100μl)，室温放置15分钟，放置后，添加1mL不含FBS和抗生素的D-MEM后，在经PBS清洗一次的HeLa细胞中添加该转染混合液。37℃，5％CO2下在培养箱中培养3小时后，不除去转染混合液，添加1mL含有20％FBS的D-MEM，培养24小时。培养后，用胰蛋白酶剥离，在96孔板中以约5细胞/孔或25细胞/孔的比例稀释，在含有500μg/mL的Zeocin(Gibco-BRL，Rockville，MD)并加入了10％FBS的D-MEM中，培养约2周。在6孔板中扩大培养从单一的细胞扩增的克隆。对这样制备的克隆进行分析。
对于所得克隆，用Western印迹法半定量分析F蛋白的表达量。将个克隆接种于6孔板中，在几乎融合的状态下，按Saito等人的方法(Saito et al.，Nucl.Acids Res.233816-3821(1995)；Arai，T.et al.，J.Virol 72，1115-1121，(1998))，以moi＝5用经含有5％FBS的MEM稀释的表达Cre DNA重组酶的重组腺病毒(AxCANCre)感染。32℃培养2天后，除去培养上清，用PBS清洗一次，用细胞刮刀刮下并回收细胞。平均每一泳道施加该样品量的1/10，进行SDS-PAGE后，通过进行利用抗F抗体(γ236Segawa，H.et al.，J.Biochem.123，1064-1072(1998))的Western印迹法，半定量分析细胞内的F蛋白质。按以下方法进行western印迹法。将从6孔板的1孔中回收的细胞于-80℃保存后，用100μL稀释1x的SDS-PAGE用的试样缓冲液(Red Loading BufferPack；New England Biolabs，Beverly，MA)，98℃加热10分钟。离心后，在SDS-PAGE凝胶(Multigel 10/20；Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd，Tokyo，Japan)中载入10μL上清。以15mA泳动2.5小时后，通过半干法以100mA经1小时的转移到PVDF膜(Immobilon PVDF transfer membrane；Millipore，Bedford，MA)上。将转移膜于4℃放置于封闭溶液(Block Ace；Snow BrandMilk Products Co.，Ltd，Sapporo，Japan)中1小时以上后，将其浸于含有10％BlockAce并以1/1000体积添加了抗F抗体的第一抗体溶液中，于4℃放置过夜。用含有0.05％Tween20的TBS(TBST)清洗3次，再用TBS清洗3次后，浸于含有10％Block Ace并以1/5000体积添加了结合HRP的抗小鼠IgG+IgM抗体(Goat F(ab′)2Anti-Mouse IgG+IgM，HRP；BioSource Int.，Camarillo，CA)的第二抗体溶液中，室温下振荡1小时。用TBST清洗3次，TBS清洗3次后，通过化学发光法(ECL Western印迹检测试剂；Amershampharmacia biotech，Uppsala，Sweden)检测。所得的克隆中，作为F蛋白的表达量比较多的克隆，对于导入了pCALNdLw-Zeo-F(furin)或pCALNdLw-Zeo-F(5R)的基因的细胞，分别获得了31个克隆和23个克隆。
对于这些克隆，研究了F基因缺失型SeV(SeV/ΔF)的病毒实际的生产能力。首先，作为简便的方法，以搭载了GFP基因的SeV/ΔF(SeV/ΔF-GFP)感染，研究其GFP荧光的幅度。具体的是，将各克隆的细胞接种于6孔板中，37℃下培养。通过上述方法(AxCANCre感染)诱导F蛋白的表达后，转移到32℃下，感染1天后以Moi＝0.1用搭载了GFP基因的SeV/ΔF(SeV/ΔF-GFP)进行感染，随时间变化在荧光显微镜下观察GFP荧光的扩展。对于导入了pCALNdLw-Zeo-F(furin)或pCALNdLw-Zeo-F(5R)基因的克隆，观察到GFP荧光的扩展的分别是8个克隆和12个克隆。对于这些克隆，研究它们的实际病毒生产能力。以moi＝0.5感染SeV/ΔF-GFP后，在10％FBS存在下或不存在FBS下于32℃培养，感染3天后研究培养上清中的病毒载体。所有的克隆中获得了存在10％FBS情况下比不存在FBS情况下高10-20倍效价的载体。尤其是，克隆F5R2的情况中生产能力高，在10％FBS存在下回收3×106CIU/ml的SeV/ΔF-GFP。确认了即使在使用以往无法作为包装细胞使用的HeLa细胞的情况下也可以生产SeV/ΔF，在不添加胰蛋白酶且有血清存在下成功生产了SeV/ΔF。
载体生产能力的提高虽然克隆F5R2的载体生产能力较高(3×106CIU/ml)，但是为了应用于实际的载体生产中，需要进一步提高生产能力。对于F5R2中生产的SeV载体(SeV/ΔF-GFP)，通过western-印迹法研究了F蛋白的切割程度。这时，利用了抗F1抗体。抗F1抗体是新制备的多克隆抗体，其是从用F1蛋白质的3种合成肽1-8(FFGAVIGT+Cys/序列号52)，27-39(EAREAKRDIALIK/序列号53)和285-297(CGTGRRPISQDRS/序列号54)的混合物免疫的兔血清中制备的抗体。抗F1抗体可以检测F0和F1。以与实施例9相同的方法进行F蛋白的表达诱导和载体生产。此外，对于Western-印迹法，可以利用抗F1的多克隆抗体作为第一抗体，抗兔IgG抗体(anti-rabbit IgG(Goat)H+L conj.；ICN P.，Aurola，OH)作为第二抗体。F5R2中生产的SeV载体(SeV/ΔF-GFP)中F蛋白的检测结果示于图19。发现活化的F蛋白质F1的比例较小。
为了获得具有更高病毒生产能力的改变的F蛋白质表达细胞，实施F5R2的细胞再克隆，选择F1的切割频率提高的细胞。获得了32个克隆，通过仔细研究载体的生产能力发现，克隆F5R2-F22显示出最高的生产能力。以MOI＝0.5感染SeV/ΔF-GFP后，在10％FBS存在下于32℃培养，研究培养上清中的SeV/ΔF-GFP的效价随时间变化的结果示于图20中。再克隆的F5R2-F22显示出比亲代细胞F5R2高10倍以上的生产能力，在感染第3天可以生产8×107CIU/ml的SeV/ΔF-GFP。对于这种细胞(克隆F5R2-F22)，通过利用抗F1抗体的Western-印迹法研究了生产的SeV载体(SeV/ΔF-GFP)中的F蛋白的切割程度。表明了对F1的切割程度比F5R2细胞高(图21)。我们认为这有益于生产能力(＝感染性病毒粒子的生成)的提高。我们认为作为进一步提高生产能力的方法，例如，在细胞中导入人弗林蛋白酶基因或具有类似活性的蛋白质的基因，可以使弗林蛋白酶样活性提高。由于生产的SeV载体(SeV/ΔF-GFP)中的F蛋白质量比较多，因此预计通过促进F0蛋白的切割，提高活性型F蛋白(F1蛋白)的比率，可以进一步提高生产能力。
工业上利用的可能性根据本发明的方法，在不使用病毒增殖原来需要的蛋白酶，也可以制备该病毒。通过使用病毒生产细胞内源性表达的蛋白酶所识别的切割序列或通过使用对细胞极少产生有害作用的蛋白酶的切割序列，可以扩大用于病毒制备的细胞的选择范围，提高病毒制备效率。本发明的方法作为包括基因治疗用载体在内的所希望的基因导入载体的制备方法是有用的。
序列表<110>株式会社载体研究所(DNAVEC RESEARCH INC.)<120>病毒载体的制备方法<130>D3-A0401P<140>
<141>
<150>JP 2004-014654<151>2004-01-22<160>54<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的实例<400>1Pro Leu Gly Met Thr Ser1 5<210>2<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的实例<400>2Pro Gln Gly Met Thr Ser1 5<210>3<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的实例<400>3Pro Leu Gly Leu Trp Ala Arg1 5<210>4<211>8<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的实例<400>4Gly Pro Leu Gly Met Arg Gly Leu1 5<210>5
<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的实例<400>5Pro Gln Gly Leu Glu Ala Lys1 5<210>6<211>11<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的实例<400>6Arg Pro Lys Pro Val Glu Trp Arg Glu Ala Lys1 5 10<210>7<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>PLALWAR<400>7Pro Leu Ala Leu Trp Ala Arg1 5<210>8<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的实例<400>8Pro Leu Gly Met Trp Ser1 5<210>9<211>5<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的实例<400>9Pro Leu Gly Leu Gly1 5<210>10<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的实例
<400>10Val Phe Ser Ile Pro Leu1 5<210>11<211>5<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的实例<400>11Ile Lys Tyr His Ser1 5<210>12<211>8<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的实例<400>12Val Pro Met Ser Met Arg Gly Gly1 5<210>13<211>8<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的实例<400>13Arg Pro Phe Ser Met Ile Met Gly1 5<210>14<211>8<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的实例<400>14Val Pro Leu Ser Leu Thr Met Gly1 5<210>15<211>8<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的实例<400>15Ile Pro Glu Ser Leu Arg Ala Gly1 5
<210>16<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>蛋白酶的切割序列的实例<400>16Pro Leu Ala Tyr Trp Ala Arg1 5<210>17<211>367<212>DNA<213>巨细胞病毒<400>17actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca120ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt180caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg240ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag300tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt360accatgg 367<210>18<211>1248<212>DNA<213>Gallus gallus<400>18tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 60ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg120ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg180cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc240ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg gagtcgctgc gacgctgcct300tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg ccccggctct gactgaccgc360gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct ccgggctgta attagcgctt420ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa agccttgagg ggctccggga480gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gggtgcgtgc gtgtgtgtgt gcgtggggag540cgccgcgtgc ggctccgcgc tgcccggcgg ctgtgagcgc tgcgggcgcg gcgcggggct600ttgtgcgctc cgcagtgtgc gcgaggggag cgcggccggg ggcggtgccc cgcggtgcgg660ggggggctgc gaggggaaca aaggctgcgt gcggggtgtg tgcgtggggg ggtgagcagg720gggtgtgggc gcgtcggtcg ggctgcaacc ccccctgcac ccccctcccc gagttgctga780gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt ggcgcggggc tcgccgtgcc840gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg gggccgcctc gggccgggga900gggctcgggg gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc ggctgtcgag gcgcggcgag960ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg cagggacttc ctttgtccca 1020aatctgtgcg gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc ccctctagcg ggcgcggggc 1080gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag ggccttcgtg cgtcgccgcg 1140ccgccgtccc cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg cggggggacg gctgccttcg 1200ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg accggcgg1248<210>19<211>95<212>DNA<213>Oryctolagus cuniculus<400>19cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg 60ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattc95<210>20<211>1744<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>CA启动子的实例<400>20actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca120ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt180caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg240ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag300tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt360accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca420cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg480gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg540agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg600cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcggggag tcgctgcgac660gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac720tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt780agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc840tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg900tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg960cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1020ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 1080gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag 1140ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1200ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1260ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1320cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1380tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1440gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1500cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1560gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1620gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1680tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattcgg cttgatcgaa gcttgcccac 1740catg1744<210>21<211>34<212>DNA<213>噬菌体P1<400>21ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat 34<210>22<211>34<212>DNA<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>22gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc 34<210>23<211>10<212>RNA<213>人工的<220>
<223>仙台病毒(Sendai virus)S序列的实例(w＝a或c；v＝a或c或g)<400>23ucccwvuuwc10<210>24<211>10<212>RNA<213>人工的
<220>
<223>仙台病毒S序列的实例<400>24ucccaguuuc10<210>25<211>10<212>RNA<213>人工的<220>
<223>仙台病毒S序列的实例<400>25ucccacuuac10<210>26<211>10<212>RNA<213>人工的<220>
<223>仙台病毒S序列的实例<400>26ucccacuuuc10<210>27<211>10<212>DNA<213>人工的<220>
<223>仙台病毒S序列的实例<400>27agggtcaaag10<210>28<211>10<212>DNA<213>人工的<220>
<223>仙台病毒S序列的实例<400>28agggtgaatg10<210>29<211>10<212>DNA<213>人工的<220>
<223>仙台病毒S序列的实例<400>29agggtgaaag10<210>30<211>9<212>RNA
<213>人工的<220>
<223>仙台病毒E序列的实例<400>30auucuuuuu9<210>31<211>9<212>DNA<213>人工的<220>
<223>仙台病毒E序列的实例<400>31taagaaaaa9<210>32<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>32cattttggca aagaattgat taattcgag 29<210>33<211>47<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>33tcacagcacc caagaatctc ttctggcgag caccggcatt ttgtgtc 47<210>34<211>47<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>34gacacaaaat gccggtgctc gccagaagag attcttgggt gctgtga 47<210>35<211>42<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>35gatcgtaatc acagtctctc gagagttgta ccatctacct ac42<210>36<211>52
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>36tcacagcacc gaagaatctc ctccggcgac gaccggcatt ttgtgtcgta tc 52<210>37<211>52<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>37gatacgacac aaaatgccgg tcgtcgccgg aggagattct tcggtgctgt ga 52<210>38<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>38aaatcctgga gtgtctttag agc 23<210>39<211>54<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>39tctcgagtcg ctcggtacga tggccaagtt gaccagtgcc gttccggtgc tcac 54<210>40<211>85<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>40aatgcatgat cagtaaatta caatgaacat cgaaccccag agtcccgctc agtcctgctc 60ctcggccacg aagtgcacgc agttg 85<210>41<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>41ccggaattca acaaatggcc gggttgttga gcaccttcga 40
<210>42<211>42<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>42ccggaattcc tagattcctc ctatcccagc tactgctgct cg42<210>43<211>50<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>43ctagctagcc caccatggat caagatgcct tcattctaaa agaagattct50<210>44<211>50<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>44ctagctagcc tagttggtca gtgactctat gtcctcttct acgagttcca50<210>45<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>45ggccgcgtcg acatcgatgc tagcctcgag ccgcggtac39<210>46<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>46cgcggctcga ggctagcatc gatgtcgacg c31<210>47<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>47cttaactatg cggcatcaga gc 22
<210>48<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>48gccgattcat taatgcagct gg 22<210>49<211>37<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>49ctataggaaa ggaattccta tagtcaccaa acaagag 37<210>50<211>38<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>50gatgagtccg tgaggacgaa actataggaa aggaattc 38<210>51<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>51gcgggccctc tcttgtttgg tctgatgagt ccgtgaggac 40<210>52<211>9<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>52Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr Cys1 5<210>53<211>13<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>53
Glu Ala Arg Glu Ala Lys Arg Asp Ile Ala Leu Ile Lys1 5 10<210>54<211>13<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>54Cys Gly Thr Gly Arg Arg Pro Ile Ser Gln Asp Arg Ser1 5 10
权利要求
1.一种制备依赖于蛋白酶对病毒蛋白质的切割而增殖的病毒的方法，该方法包括在如下物质存在的情况下产生该病毒的步骤(i)经修饰的病毒蛋白质，其中该病毒蛋白质的该蛋白酶切割序列被改变为其它蛋白酶的切割序列，和(ii)所述其它蛋白酶，其中所产生的病毒含有被切割的所述经修饰的病毒蛋白质，不含有编码所述经修饰的病毒蛋白质的基因。
2.根据权利要求1中记载的方法，其中所制备的病毒保持有编码具有野生型切割序列的所述病毒蛋白质的基因。
3.根据权利要求1中记载的方法，其中所制备的病毒是缺失了编码所述病毒蛋白质的基因的非传播性病毒。
4.根据权利要求1中记载的方法，其中所述其它蛋白酶是在生产病毒的细胞中内源性表达的蛋白酶。
5.根据权利要求1中记载的方法，其中所述其它蛋白酶是弗林蛋白酶。
6.根据权利要求1中记载的方法，其中所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg。
7.根据权利要求1中记载的方法，其中所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Arg-Arg-Arg。
8.根据权利要求1中记载的方法，其中所述病毒为负链RNA病毒。
9.根据权利要求8中记载的方法，其中所述负链RNA病毒为副粘病毒科病毒。
10.根据权利要求8中记载的方法，其中所述负链RNA病毒为仙台病毒。
11.一种载体，该载体编码经修饰的病毒蛋白质，在该经修饰的病毒蛋白质中，蛋白酶切割序列被改变为其它蛋白酶的切割序列，所述蛋白酶切割序列是其增殖依赖于该蛋白酶对病毒蛋白质的切割的病毒中病毒蛋白质的蛋白酶切割序列，其中，该载体是在该病毒的生产细胞中无法增殖的病毒载体或非病毒载体。
12.根据权利要求11中记载的载体，其为质粒。
13.根据权利要求11中记载的载体，其中所述经修饰的病毒蛋白质可以通过重组酶诱导表达。
14.根据权利要求13中记载的载体，其中所述重组酶为Cre或Flp。
15.根据权利要求11中记载的载体，其中所述其它蛋白酶为在生产病毒的细胞中内源性表达的蛋白酶。
16.根据权利要求11中记载的载体，其中所述其它蛋白酶是弗林蛋白酶。
17.根据权利要求11中记载的载体，其中所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg。
18.根据权利要求11中记载的载体，其中所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Arg-Arg-Arg。
19.根据权利要求11中记载的载体，其中所述病毒蛋白质为负链RNA病毒的F蛋白质。
20.根据权利要求19中记载的载体，其中所述负链RNA病毒为副粘病毒科病毒。
21.根据权利要求19中记载的载体，其中所述负链RNA病毒为仙台病毒。
22.含有权利要求11中记载的载体的哺乳动物细胞。
23.根据权利要求22中记载的细胞，其中所述细胞为生产依赖于蛋白酶对病毒蛋白质的切割而增殖的病毒。
24.根据权利要求22中记载的细胞，其中所述编码经修饰的病毒蛋白质的基因整合于该细胞的染色体中。
25.根据权利要求22中记载的细胞，其为人类细胞。
26.一种经修饰的病毒，是依赖于蛋白酶对病毒蛋白质的切割而增殖的病毒的经修饰的病毒，其中含有该病毒蛋白质的由该蛋白酶识别的切割序列被改变为其它蛋白酶的切割序列的经修饰的蛋白质，且不含有编码所述经修饰的病毒蛋白质的基因。
27.根据权利要求26中记载的经修饰的病毒，所制备的病毒保持有编码具有野生型切割序列的所述病毒蛋白质的基因。
28.根据权利要求26中记载的经修饰的病毒，所述病毒是缺失了编码所述病毒蛋白质的基因的非传播性病毒。
29.根据权利要求26中记载的经修饰的病毒，所述其它蛋白酶是在生产病毒的细胞中内源性表达的蛋白酶。
30.根据权利要求26中记载的经修饰的病毒，所述其它蛋白酶是弗林蛋白酶。
31.根据权利要求26中记载的经修饰的病毒，所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg。
32.根据权利要求26中记载的经修饰的病毒，所述其它蛋白酶的切割序列包括Arg-Arg-Arg-Arg。
33.根据权利要求26中记载的经修饰的病毒，所述病毒为负链RNA病毒。
34.根据权利要求33中记载的经修饰的病毒，所述负链RNA病毒为副粘病毒科病毒。
35.根据权利要求33中记载的经修饰的病毒，所述负链RNA病毒为仙台病毒。
全文摘要
本发明提供一种制备依赖于蛋白酶对病毒蛋白质的切割而增殖的病毒的方法，而该方法不依赖于所述蛋白酶。本发明的病毒的制备方法，其特征在于在蛋白酶的切割序列被修饰为其它蛋白酶的切割序列的病毒蛋白质的存在下生产病毒。通过将蛋白酶的切割序列取代为病毒产生细胞内源性表达的蛋白酶的切割序列，可以有效地产生病毒载体。通过本发明中的方法，可以使用较广范围的细胞制造高效价的病毒。
文档编号C12N15/64GK1934257SQ20058000918
公开日2007年3月21日 申请日期2005年1月20日 优先权日2004年1月22日
发明者井上诚, 伴浩志, 饭田章博, 长谷川护 申请人:株式会社载体研究所