专利名称：在芽孢杆菌细胞中生产透明质酸的方法
在芽孢杆菌细胞中生产透明质酸的方法
背景技术：
发明领域
本发明涉及在细菌细胞中生产透明质酸的方法。 相关技术的描述
透明质酸是由通过交替的(3-l，4-和P-l,3-糖苷键连接在一起的N-乙酰葡 糖胺(GlcNAc)和葡糖醛酸(GlcUA)的重复二糖单位组成的未^L酸化的 糖胺聚糖。已经鉴定透明质酸在体内的许多作用(参见，Laurent T. C. and Fi-aser J. R. E., 1992, FASEB J. 6: 2397-2404和 Toole B.P.， 1991， "Proteoglycans and hyaluronan in morphogenesis and differentiation." In: Cell Biology of the Extracellular Matrix, pp. 305-341, Hay E D.， ed., Plenum, New York)。透明质酸存在于透明软骨、滑膜关节液体和皮肤组织中，在真皮和 表皮中都存在。怀疑透明质酸在许多生理机能，例如粘附、发育、细胞运 动性、癌症、血管发生和伤口愈合中起作用。由于透明质酸独特的物理和 生物学特性，已经在眼睛和关节手术中使用它。也已经研究出供整形外科、 风湿病学和皮肤病学使用的透明质酸产物。
公鸡冠已经是透明质酸的常规来源。但是，利用含有生物合成透明质 酸的基因的重组微生物正作为 一种替换方式出现。
已经很好地确定芽孢杆菌(Bacilli)是生产天然和重组蛋白质的宿主细胞 系统。美国专利申请No.2002/0160489公开了包含酿脓链球菌(Streptococcus pyrogrnenes)类透明质酸合酶和UDP-葡糖脱氢酶基因中的一个或两个基因 的三个枯草芽孢杆菌菌林的构建。美国专利申请No.2003/0092118描述了利 用包含启动子控制下的来自类马链球菌(Streptococcus叫uisimilis )、化脓性 链球菌(Ptrepto")ccus pyogenes )、乳房链球菌(Streptococcus uberis )、 出血 败血性巴斯德(氏)菌(Pasteurella multocida )、 Sulfolobus solfactaricus、 炭疽 芽孑包杆菌pXOl ( Bacillus anthracis pXOl )、小球藻病毒(Chlorella vims )或 长嚢水云病毒(Ectocarpus siliculosus vims)的生产透明质酸的类透明质酸合酶基因的重组芽孢杆菌宿主细胞的用途。WO 03/054163公开了通过培养 包含含有类透明质酸合酶编码序列的核酸构建体的芽孢杆菌宿主细胞生产 透明质酸的方法，其中类透明质酸(hyaluronan)合酶编码序列可操作地与 类透明质酸合酶编码序列的外来启动子序列连接。
美国专利Nos.6,255,076和5,955,3 10描述了供在芽孢杆菌细胞中表达酶 所用的串联启动子，构建体和方法。其中也描述了利用cryIIIA稳定序列改 进芽孢杆菌中生产的情况。WO 03/095658公开了由amyL4199、短共有amyQ 和cryIIIA启动子序列组成的三if关启动子。
提供在芽孢杆菌菌抹中生产透明质酸的改进方法是本发明的目标。
发明概述
本发明涉及生产透明质酸的方法，包括(a)在有助于生产透明质酸 的培养基中培养芽孢杆菌宿主细胞，其中芽孢杆菌细胞包含含有三联启动 子的核酸构建体，三联启动子包含具有对应于SEQIDNO : 1的位置590的 突变的变体amyL启动子，"-35"区域具有TTGACA序列和，，-10"区域具有 TATA八T序列的共有启动子和cryIIIA启动子，其中三联启动子的每个启动 子序列可操作地与一个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列相连；和 (b)从培养基中分离透明质酸。在优选方式中，核酸构建体更进一步地包 含位于三联启动子下游， 一 个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列上 游的mRNA加工/稳定序列。
本发明也涉及包含含有三联启动子的核酸构建体的芽孢杆菌细胞，其 中三联启动子包含具有对应于SEQ ID NO : 1的位置5卯的突变的变体 amyL启动子，"-35"区域具有TTGACA序列和"-10"区域具有TATAAT序列 的共有启动子和cryIIIA启动子，其中三联启动子的每个启动子序列可操作 地与一个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列相连。在优选方式中， 核酸构建体更进一步地包含位于三联启动子下游， 一个或多个涉及透明质 酸生物合成的编码序列上游的mRNA加工/稳定序列。
本发明也涉及产生没有可选择标记的芽孢杆菌细胞突变体的方法，包 括删除芽孢杆菌细胞的可选择标记，其中芽孢杆菌细胞包含含有三联启动 子的核酸构建体，三联启动子包含具有对应于SEQIDNO : 1的位置590的 突变的变体amyL启动子，，，-35，，区域具有TTGACA序列和，，-10"区域具有 TATAAT序列的共有启动子和cryIIIA启动子，其中三联启动子的每个启动子序列可操作地与一个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列相连。
本发明也涉及获取芽孢杆菌宿主细胞的方法，包括将包含三联启动子
的核酸构建体引入芽孢杆菌细胞，其中三联启动子包含具有对应于SEQID NO: 1的位置5卯的突变的变体amyL启动子，"-35"区域具有TTGACA序 列和"-10"区域具有TATAAT序列的共有启动子和cryIIIA启动子，其中三联 启动子的每个启动子序列可操作地与一个或多个涉及透明质酸生物合成的
编码序列相连。
本发明更进一 步地涉及包含三联启动子的核酸构建体，其中三联启动 子包含具有对应于SEQ ID NO : 1的位置590的突变的变体amyL启动 子，，，-35'，区域具有TTGACA序列和"-10"区域具有TATAAT序列的共有启 动子和cryIIIA启动子，其中三联启动子的每个启动子序列可操作地与一个 或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列相连。
附图简述
图1显示pNBT28的限制性酶切图语。 图2显示pMRT038的限制性酶切图谱。 图3显示pNBT29的限制性酶切图谱。 图4显示pWWi001.的限制性酶切图语。 图5显示pWWi005的限制性酶切图语。 图6显示pNBT30的限制性酶切图镨。 图7显示pNBT31的限制性酶切图i普。 图8显示pNBT33的限制性酶切图i普。 图9显示pMDT006的限制性酶切图语。 图10显示pMDT007的限制性酶切图谙。 图11显示pNBT37的限制性酶切图语。 图2显示pNBT38的限制性酶切图谱。 图13显示pNBT39的限制性酶切图语。 图14显示pMRT040的限制性酶切图语。 图15显示pMRT044的限制性酶切图镨。 图16显示pMRT070的限制性酶切图i普。 图17显示pMRT075的限制性酶切图谱。 图18显示pNBT40的限制性酶切图语。图19显示pMRT077的限制性酶切图谱。
图20显示pTH012的限制性酶切图语。
图21显示pMB 1024-1的限制性酶切图i普。
图22显示pMB1242的限制性酶切图谱。
图23显示pTH029的限制性酶切图谱。
图24显示pTH026的限制性酶切图谗。
图25显示pT顧3的限制性酶切图语。
图26显示p丁H020的限制性酶切图语。
图27显示通过地衣芽孢杆菌TH15生产透明质酸。
发明详述
本发明涉及生产透明质酸的方法，包括(a)在有助于生产透明质酸
的培养基中培养芽孢杆菌细胞，其中芽孢杆菌细胞包含含有三联启动子的
核酸构建体，三联启动子包含具有对应于SEQIDNO: 1的位置590的突变 的变体amyL启动子，"-35"区域具有TTGACA序歹'j和"-10"区域具有TATAAT 序列的共有启动子和cryIIIA启动子，其中三联启动子的每个启动子序列可 操作地与一个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列相连；和(b)从培 养基中分离透明质酸。在本发明的方法中，核酸构建体优选更进一步地包 含位于三联启动子下游和一个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列上 游的mRNA加工Z稳定序列。
透明质酸
"透明质酸"在这里被定义为由通过交替的(3-l,4-和|3-1,3-糖苷键连接在 一起的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和葡糖醛酸(GlcUA)的重复二糖单位组 成的未硫酸化的糖胺聚糖。透明质酸又名类透明质酸(hyaluronan)、透明 质酸盐或HA,他们在这里可交换地使用。
在优选方式中，通过本发明的方法获取的透明质酸具有大约10,000-大 约10,000,000 Da的分子量。在更优选的方式中，通过本发明的方法获取的 透明质酸具有大约25，000-大约5,000,000 Da的分子量。在最优选的方式中， 通过本发明的方法获取的透明质酸具有大约50,000-大约3,000,000 Da的分 子量。
可以依照？文良的。卡。坐方法(Bitter and Muir, 1962， Anal Biochem. 4:330-334 )确定通过本发明的芽孢杆菌宿主细胞产生的透明质酸的水平。而 且，利用文献中的标准方法，例如Ueno et al.， 1988, Chem. Pharm. Bull. 36: 4971-4975; Wyatt, 1993, Anal. CWm. Acta 272: 1-40和Wyatt Technologies, 1999, "Light Scattering University DAWN Course Manual" and "DAWN EOS Manual", Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, California中描述的方 法可以确定透明质酸的平均分子量。
可以用本领域已知的修饰透明质酸的各种技术，例如美国专利 Nos.5,616,568、 5,652,347和5,874,417中描述的交联修饰通过本发明的方法 获取的透明质酸。而且，可以利用本领域已知的技术改变透明质酸的分子 量。
宿主细胞
本发明也涉及包含三联启动子的芽孢杆菌细胞，其中三联启动子包含 具有对应于SEQIDNO: 1的位置590的突变的变体amyL启动子，"-35"区 域具有TTG ACA序列和，，-10"区域具有TATAAT序列的共有启动子和cryIIIA 启动子，其中三联启动子的每个启动子序列可操作地与一个或多个涉及透 明质酸生物合成的编码序列相连。在优选方式中，核酸构建体更进一步地 包含位于三联启动子下游和一个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列 上游的mRNA加工/稳定序列。在另一个优选方式中，芽孢杆菌细胞没有外 来或异源的可选择标志基因。
本发明也涉及获取芽孢杆菌宿主细胞的方法，包括将含有三联启动子 的核酸构建体引入芽孢杆菌细胞，其中三联启动子包含具有对应于SEQID NO : 1的位置590的突变的变体amyL启动子，"-35"区域具有TTGACA序 列和"-10"区域具有TATAAT序列的共有启动子和cryIIIA启动子，其中三联 启动子的每个启动子序列可操作地与一个或多个涉及透明质酸生物合成的 编码序列相连。在优选方式中，核酸构建体更进一步地包含位于三联启动 子下游和一个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列上游的mRNA加工/
在本发明的方法中，芽孢杆菌宿主细胞可以是适合于重组生产透明质 酸的任何芽孢杆菌细胞。芽孢杆菌宿主细胞可以是野生型芽孢杆菌细胞或 其突变体。对实施本发明有用的芽孢杆菌细胞包括，但不局限于Bacillus agaraderhens、嗜碱芽孑包杆菌(Bacillus alkalophilus )、角罕淀粉芽孑包杆菌(Bacillusamyloliquefaciens )、短芽孑包杆菌(Bacillus brevis )、 环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌细胞("Bacillus clausii )、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans )、坚强芽孑包杆菌(Bacillus firmus )、杣烂芽孑包杆菌(Bacillus lautus )、 迟缓芽孑包杆菌(Bacillus lentus )、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis )、 巨 大芽孢杆菌(Bacillus magaterium )、 短小芽孑包杆菌(Bacillus pumilus )、 嗜 热月旨肪芽孑包杆菌(Bacillus stearothermophilus )、枯草芽孑包杆菌(Bacillus subdlis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis )细胞。在WO 98/22598 中描述了特别适合于重组表达的枯草芽孢杆菌细胞突变体。非包嚢
(encapsulating )芽孢杆菌细胞对本发明特别有用。
在优选方式中，芽孢杆菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens )、 克劳氏芽孑包冲干菌 (Bacillus clausii )、 迟纟爰芽孑包斥干菌
(Bacillus lentus )、 地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)或枯草斥干菌(Bacillus subtilis )纟田月包。在更^f尤选的方式 中，芽孢杆菌细胞是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens )纟田胞。在 另一个更优选的方式中，芽孢杆菌细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞Bacillus clausii )。在另一个更优选的方式中，芽孢杆菌细胞是迟緩芽孢杆菌细胞
(Bacillus lentus )。在另一个更优选的方式中，芽孢杆菌细胞是地衣芽孢杆 菌细胞(Bacillus licheniformis )。在另一个更优选的方式中，芽孢杆菌细胞 是枯草芽孢杆菌细胞(Bacillus subtilis )。在最优选方式中，芽孢杆菌宿主细 胞是枯草杆菌A164A5或枯草杆菌168A4(参见美国专利No.5，891，701 )。在 另一个最优选方式中，芽孢杆菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌SJ1904 (参见美 国专利No.5,733,753 )。
例如，可以通过原生质体转化(例如，参见Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115)、使用感受态细胞(例如，参见 Young and Spizizen， 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829， or Dubnau and Davi緒-Abelson， 1971， Journal of Molecular Biology 56: 209-221 )、通过电穿 孔(例如，参见Shigekawa and Dower， 1988, Biotechniques 6: 742-751 )、或 通过结合4乍用(例长口，参见Koehler and Thome, 1987， Journal of Bacteriology 169: 5271-5278 )，用本发明的核酸构建体转化芽孢杆菌宿主细胞。
核酸构建体
通过利用本领域众所周知的方法修饰一个或多个基因，将三联启动子
14或者三联启动子和mRNA加工/稳定序列可操作地连接到涉及透明质酸生物 合成的一个或多个基因上，将构建体插入载体中，并通过同源重组将载体 导入芽孢杆菌细胞的染色体或者将载体作为染色体外的自主复制元件，例 如质粒导入芽孢杆菌细胞来完成对包含可操作地与这一个或多个基因相连 的三联启动子，或三联启动子和mRNA加工/稳定序列的芽孢杆菌细胞的构 建。但是，应理解也可以利用本领域众所周知的方法在芽孢杆菌细胞内操 作这一个或多个基因。
"核酸构建体"在这里限定为分离自天然发生基因或已经经过修饰的包 含核酸片段的单链或双链的核酸分子，其中核酸片段以不存在于自然界的 方式组合和连接。当核酸构建体包含表达编码序列需要的全部控制序列时， 术语核酸构建体可能与术语表达盒同义。
"启动子"在这里限定为涉及结合RNA聚合酶启动基因转录的核苷酸序列。
"三联启动子"在这里限定为串联的三个启动子序列，其中每个启动子可 操作地与 一个编码序列或多个编码序列相连，并介导编码序列转录成 mRNA。
"操作性连接"在这里限定为其中控制序列，例如三联启动子恰当地位于 编码序列的相对位置使控制序列指导编码序列编码的透明质酸的生产的构型。
mRNA，并被翻译成涉及透明质酸生物合成的酶(或其他蛋白质)的核苷酸 序列。通常通过正好位于mRNA 5'端的开放阅读框上游的核糖体结合部位 和正好位于mRNA 3'端的开放阅读框下游的转录终止序列确定编码序列的 范围。编码序列可以包括，但是不限于基因组DNA、 cDNA、半合成的、 合成的核酸和重组的核酸。
用于分离或克隆编码多肽，例如编码酶的基因的技术为本领域熟知， 例如包括从基因组DNA分离、从cDNA制备或他们的组合。例如，通过利 用表达库的抗体筛选法检测克隆的具有共用结构特点的DNA片段或众所周 知的聚合酶链反应(PCR)可以完成从这种基因组DNA克隆基因。例如
参见Innis et al., 1990， PCR Protocols: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York。可以使用其他的核酸扩增过程，例如连接酶链反 应、连接活化转录和基于核酸序列的扩增。克隆过程涉及切割和分离包含多肽编码基因的目的核酸片段，将片段插入到载体分子中，以及将重组载 体整合到核苦酸序列的克隆可以在其中复制的芽孢杆菌细胞中。基因可以
是基因组、cDNA、 RNA、半合成来源，合成来源的基因或他们的任何组合。
可以用多种方式操作分离的编码涉及透明质酸生物合成的酶(或其他 蛋白质)的基因，为该酶(或其他蛋白质)的表达作准备。将基因序列插 入到构建体或载体之前对基因序列进行操作可能是合乎需要的或需要的， 这取决于表达载体或芽孢杆菌宿主细胞。利用克隆方法修饰核苦酸序列的 技术在本领域为大家所熟知。应理解也可以利用本领域众所周知的方法在 宿主细胞内操作基因序列。
许多酶与透明质酸的生物合成有关。在本发明的方法中， 一种或多种 涉及透明质酸生物合成的基因包括，但不限于编码类透明质酸合酶、UDP-葡萄糖6-脱氛酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、 6-磷酸葡萄糖异构酶、己糖激酶、葡糖磷酸变位酶、酰胺转移酶、变位酶和 乙酰转移酶的基因。类透明质酸合酶是生产透明质酸的关键酶。
"类透明质酸合酶"在这里被限定为通过添加GlcUA和GlcNAc糖前体 催化类透明质酸链延伸的合酶。链球菌的类透明质酸合酶，脊推动物的类 透明质酸合酶和病毒的类透明质酸合酶的氨基酸序列不同于巴斯德菌属 (Pasteurclla)的类透明质酸合酶，已经建议将他们分类为I组和II组类透明 质酸合酶，I组类透明质酸合酶包括链球菌的类透明质酸合酶(DeAngelis, 1999, Cell. Mol. Life Sci. 56: 670-682 )。为了在芽孢杆菌宿主细胞中生产类透 明质酸，可以使用真核来源的类透明质酸合酶，例如哺乳动物类透明质酸 合酶，但是这种类透明质酸合酶优选程度低。
类透明质酸合酶基因可以是任何能够在芽孢杆菌宿主细胞中表达的任 何类透明质酸合酶基因。基因可以是任何来源的基因。优选的类透明质酸 合酶基因包括I组或II组的任何基因，例如I组的来自类马链球菌、化脓性 链球菌、乳房链球菌、马链球菌兽疫亚种(Streptococcus叫ui subsp. Zooepidemicus )的类透明质酸合酶基因，或II组的Pasturella multocida的类 透明质酸合酶基因。
可以用这里公开的核苷酸序列或其子序列，以及其氨基酸序列或其片 段来设计核酸探针，以依照本领域众所周知的方法从不同属或种的菌抹中 鉴定和克隆编码涉及透明质酸生物合成的酶的DNA。特别地，在进行标准 的Southern印迹过程后，这种探针可用于与有价值的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和分离其中对应的基因。这种探针可以大大短于全长序 列，但是长度应该是至少14个、优选至少25个、更优选至少35个，最优 选至少70个核苷酸。也可以使用长些的一果针。DNA和RNA探针都可以使 用。为了检测对应的基因，典型地可以标记探针(例如用32P、 3H、 35S、 生物素或亲和素)。
因此，可以筛选从这种其他生物体制备的基因组DNA或cDNA库，以 选择与如上所述的探针杂交和编码透明质酸生物合成途径中的酶的DNA。
通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离方法可以从这种 其他生物体分离基因组DNA或其他DNA。来自库的DNA或分离的DNA 可以被转移和固定到硝酸纤维或其他适当的载体上。为了识别与这里公开 的核苦酸序列或其子序列同源的克隆或DNA,在Southern印迹中使用了载 体。对本发明来说，杂交指核酸序列在极低到很高的严谨条件下，与相当 于这里公开的核苷酸序列的标记的核酸探针其互补链或子序列杂交。可以 利用X线胶片检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
对长度为至少100个核苷酸的长探针来说，极低到很高的严谨条件被 定义为遵循标准Southern印迹程序，42。C在5XSSPE， 0.3% SDS， 200ug/ml 的剪切变性的鲑鱼精DNA,以及25% ， 3 5%或5 0%的曱酰胺中预杂交和杂 交最佳12-24小时，其中25%, 35%或50%曱酰胺分别代表极低和低严谨条 件，中等和中等-高严谨条件，以及高和很高的严谨条件。
对长度为至少100个核苷酸的长探针来说，最后优选在至少45°C (极 低严谨条件)，更优选至少50。C (低严谨条件)，更优选至少55r (中等严 谨条件)，更优选至少60°C (中等-高严谨条件)，甚至更优选至少65°C (高 严谨条件)，最优选至少70°C (很高的严谨条件)下，用2XSSC, 0.2% SDS 洗涤载体三次，每次15分钟。
对长度为大约15-70个核苷酸的短探针来说，严谨条件定义为遵循标准 Southern印迹程序，在低于计算的Tm大约5-10。C的条件下，在0.9MNaCl， 0.09M Tris-HCl， pH 7.6， 6mM EDTA, 0.5%NP-40， lXDenhardt' s溶液， 1mM焦磷酸钠，lmM磷酸二氢钠，0. ImM ATP和每毫升0.2mg酵母RNA 中预杂交，杂交，洗涤最佳12-24小时，其中Tm是参照Bolton和McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390 )计算 的。
对长度为大约15-70个核苷酸的短探针来说，在6XSCC， 0.1% SDS中洗涤载体一次，沖洗15分钟，再在低于计算的Tm5-1(TC的条件下利用 6XSSC洗涤两次，每次15分钟。
在优选方案中，类透明质酸合酶基因是I组的类透明质酸合酶基因。
在更优选的方案中，I组类透明质酸合酶基因选自由(a)编码的类透 明质酸合酶的氨基酸序列与SEQ ID NO: 3 ， SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7 具有最少70%，优选至少75%，更优选至少80%,更优选至少85%，更加 优选至少90%，最优选至少95%，或者甚至最优选至少97。/。的同一性的基 因；b)在低，中等，中等-高，或高严谨条件下与SEQIDNO: 2, SEQIDNO: 4 或SEQ ID NO: 6杂交的基因；和(c ) ( a )或(b )的互补链组成的群组。 对本发明来说，通过Clustal方法(Higgins, 1989， CABIOS 5: 151-153 )，利 用具冇同一性表和下列多重比对参数缺口计罚分(gap penalty) 10,间隙 长度计罚分(gap length penalty)10的LASERGENE MEGALIGN 软件 (DNASTAR, lnc.， Madison, WI)确定两个氨基酸序列之间的同一性程度。 成对地比对参数是Kt叩le二l，缺口罚分=3,窗口=5和对角线=5。
在最优选的方案中，I组类透明质酸合酶基因编码具有SEQIDNO: 3, SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的类透明质酸合酶或其具有 类透明质酸合酶活性的片段。
在另一个优选方案中，类透明质酸合酶基因是II组的类透明质酸合酶 基因。
在更优选的方案中，II组类透明质酸合酶基因选自由(a)编码的类透 明质酸合酶的氨基酸序列与SEQ ID NO: 9具有最少70%，优选至少75%， 更优选至少80%，更优选至少85%,更加优选至少卯％,最优选至少95%, 或者甚至最优选至少97%的同一性的基因；b)在低，中等，中等-高，或高 严谨条件下与SEQ ID NO: 8杂交的基因；和(c) (a)或(b)的互补链组 成的群组。
在最优选的方案中，II组类透明质酸合酶基因编码具有SEQ ID NO: 9 的氨基酸序列的类透明质酸合酶或其具有类透明质酸合酶活性的片段。
可用于本发明的其他类透明质酸合酶基因是来自炭疽芽孢杆菌、硫磺 矿辟d匕口十菌(Sulfolobus solfataricus )、 长嚢水云病毒(Ectocarpus siliculosus virus )和小球藻病毒1 ( Paramecium bursaria Chlorella virus ) ( PBCV - 1 )的 类透明质酸合酶基因。
在另一个更优选的方案中，类透明质酸合酶基因选自由(a)编码的类透明质酸合酶的氨基酸序列与SEQIDNO: 11, SEQIDNO: 13， SEQIDNO: 15或SEQ ID NO: 17具有最少70%,优选至少75%,更优选至少80%,更 优选至少85%，更加优选至少卯％，最优选至少95%，或者甚至最优选至 少97%的同一性的基因；b)在低，中等，中等-高，或高严谨条件下与SEQ ID NO: 10， SEQ ID NO: 12， SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 16杂交的基因； 和(c)(a)或(b)的互补链组成的群组。
在更优选的方案中，类透明质酸合酶基因编码具有SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13， SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的类透明 质酸合酶或其具有类透明质酸合酶活性的片段。
本发明的方法也包括核酸(nucleic)构建体，在构建体中通过由存在于构 建体中的内源基因，非内源基因，或者内源和非内源基因的组合编码类透 明质酸前体糖而将前体糖提供给宿主细胞。前体糖可以是D-葡糖醛酸或N-乙酰氨基葡萄糖。
在本发明的方法中，核酸构建体可以更进一步地包含编码涉及类透明 质酸前体糖生物合成的酶的一个或多个基因。换句话说，芽孢杆菌宿主细 胞可以更进一步地包含含有编码涉及前体糖生物合成的酶的一个或多个基 因的一个或多个第二核酸构建体。通过利用具有指导类透明质酸前体糖生 物合成路径中的步骤的 一 个或多个基因的构建体可以改进类透明质酸的生 产。短语"指导类透明质酸前体糖生物合成路径中的步骤"在这里指在N-乙 酰氨基葡萄糖或D-葡糖醛酸，或者N-乙酰氨基葡萄糖或D-葡糖醛酸前体糖 的形成中，该基因表达的酶是有活性的。 在供给前体糖的优选方法中，通过培养具有重组构建体的宿主细胞来 提供改进天然包含类透明质酸合酶基因的宿主细胞中类透明质酸的生产的 重组构建体，其中重组构建体具有可操作地与编码类透明质酸前体糖的生 物合成路径中的酶的一个或多个基因相连的三联启动子。在优选方法中， 宿主细胞也包含具有可操作地与类透明质酸合酶相连的三联启动子的重组 构建体。因此，本发明也涉及通过利用具有指导类透明质酸前体糖生物合 成路径中的步骤的 一个或多个基因的构建体改进类透明质酸生产的构建 体。核酸构建体中的这种基因可操作地与这里描述的三联启动子相连。
涉及生产透明质酸的前体糖的生物合成的基因包括，但不限于UDP-葡 萄糖6-脱氬酶基因、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷 酸化酶基因、6-磷酸葡萄糖异构酶基因、己糖激酶基因、葡糖磷酸变位酶基因、酰胺转移酶基因、变位酶基因和乙酰转移酶基因。
在包含类透明质酸合酶基因的细胞中，可以表达hasB、 hasC、 hasD或
其同系物中的任何一种，任何两种或更多种的组合以增加类透明质酸合酶 可用的前体并唐库。在Kunst, et al" Nature 390, 249-256, "The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis" (20 November 1997)
中描述了枯草芽孢杆菌基因组。在有些情况下，例如宿主细胞没有天然类 透明质酸合酶活性的情况下，构建体更进一步地包括hasA基因。
编码生物合成酶的基因可以是宿主细胞与生倶来的，但在其它情况下， 可以使用异源基因，或者天然和异源基因的组合。如果一个或多个基因包 括在构建体中，他们可能是天然操纵子中彼此有关的基因，例如包含hasA、 hasB、 hasC和hasD的类马链球菌的HAS操纵子的基因。在其他情况下， 利用没有包括操纵子所有组件的前体基因的某些组合也可能是想要的。在 其它情况下，利用一些宿主细胞天然基因和其他外源基因也可能是优选的。 选择取决于给定宿主细胞中可利用的糖库，在不干扰宿主细胞其他功能的 情况下细胞适应生产过剩的能力，以及细胞对天然基因和外源基因表达的 调节是否不同。
在 一 个实施例中这取决于细胞的代谢需求和生长条件，可利用的前体 糖库，因此通过表达编码UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶的基因，例如hasD 基因，芽孢杆菌gcaD基因或其同系物增加N-乙酰氨基葡萄糖的生产是合乎 需要的。换句话说，前体糖可以是D葡糖醛酸。在这样的一个方案中，基 因编码UDP-葡萄糖6-脱氢酶。这种基因包括芽孢杆菌tuaD基因，链球菌 的hasB基因或他们的同系物。另一个基因可以编码UDP葡萄糖焦磷酸化 酶，例如芽孢杆菌gtaB基因，链球菌的hasC基因或他们的同系物。
在本发明的方法中，UDP-葡萄糖6-脱氢酶基因可能是hasB基因或tuaD 基因，或他们的同系物。
在优选方案中，hasB基因选自由(a)编码氨基酸序列与SEQIDNO: 19， SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 23有最少70%，优选至少75%,更优选至少 80%，更优选至少85%，更加优选至少90%，最优选至少95%，或者甚至 最优选至少97%同一性的UDP-葡萄糖6-脱氢酶的基因；(b)在低，中等， 中等-高，或高严谨条件下与SEQ ID NO: 18 ， SEQ ID NO: 20或SEQ ID NO: 22杂交的基因；和(c) (a)或(b)的互补链组成的群组。
在更优选的方案中，hasB基因编码具有SEQIDNO: 19， SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 23的氨基酸序列的UDP-葡萄糖6-脱氢酶或其具有UDP-葡 萄糖6-脱氬酶活性的片段。
在另一个优选的方案中，tuaD基因选自由(a)编码氨基酸序列与SEQ ID NO: 25有最少70%，优选至少75%,更优选至少80%，更优选至少85%， 更加优选至少90%,最优选至少95%,或者甚至最优选至少97%同一性的 多肽的核苷酸序列；b)在低，中等，中等-高，或高严谨条件下与SEQ ID NO: 24杂交的核苷酸序列；和(c) (a)或(b)的互补链组成的群组。
在另一个更优选的方案中，tuaD基因编码具有SEQ ID NO: 25的氨基 酸序列的UDP-葡萄糖6-脱氬酶或其具有UDP-葡萄糖6-脱氬酶活性的片段。
在本发明的方法中，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因可能是hasC基因或 gtaB基因,或他们的同系物。
在优选方案中，hasC基因选自由(a )编码氨基酸序列与SEQ ID NO: 27-SHQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 31有最少70%,优选至少75%，更优选至少 80%，更优选至少85%,更加优选至少90%,最优选至少95%,或者甚至 最优选至少97%同一性的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因；(b)在低，中等， 中等-高，或高严谨条件下与SEQ ID NO: 26， SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 30杂交的基因；和(c) (a)或(b)的互补链组成的群组。
在另一个更优选的方案中，hasC基因编码具有SEQ ID NO: 27， SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 3 1的氨基酸序列的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶或其具有 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶活性的片段。
在另一个优选的方案中，gtaB基因选自由(a)编码氨基酸序列与SEQ ID NO: 33有最少70%,优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%， 更加优选至少90%,最优选至少95%,或者甚至最优选至少97%同一性的 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因；b)在低，中等，中等-高，或高严谨条件 下与SEQ ID NO: 32杂交的基因；和(c) (a)或(b)的互补链组成的群组。
在另一个更优选的方案中，gtaB基因编码具有SEQ ID NO: 33的氨基 酸序列的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶或其具有UDP-葡萄糖焦磷酸化酶活性的 片段。
在本发明的方法中，UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因可能是hasD或 gca[〕基因，或他们的同系物。
在优选方案中，hasD基因选自由(a )编码氨基酸序列与SEQ ID NO: 35 有最少70%,优选至少75°/。，更优选至少80%，更优选至少85%,更加优选至少90%，最优选至少95%，或者甚至最优选至少97%同一性的UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶的基因；(b)在低，中等，中等-高，或高严谨条件 下与SEQIDNO: 34杂交的基因；和(c) (a)或(b)的互补链组成的群组。
在另一个更优选的方案中，hasD基因编码具有SEQ ID NO: 35的氨基 酸序列的UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶或其具有UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷 酸化酶活性的片段。
在优选的方案中，gcaD基因选自由(a)编码氨基酸序列与SEQ ID NO: 37有最少70%，优选至少75%，更优选至少80%,更优选至少85%，更加 优选至少90%，最优选至少95°/。，或者甚至最优选至少97%同 一性的UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶的基因；(b)在低，中等，中等-高，或高严谨条件 下与SEQ ID NO: 36杂交的基因；和(c)(a)或(b)的互补链组成的群组。
在另一个更优选的方案中，gcaD基因编码具有SEQ ID NO: 37的氨基 酸序列的UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶或其具有UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷 酸化酶活性的片段。在本发明的方法中，6-磷酸葡萄糖异构酶基因可能是hasE或其同系物。
在优选方案中，hasE基因选自由(a)编码氨基酸序列与SEQ ID NO: 39 有最少70%，优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%,更加优 选至少90%，最优选至少95%,或者甚至最优选至少97%同一性的6-磷酸 葡萄糖的基因；(b)在低，中等，中等-高，或高严谨条件下与SEQIDNO.-SS 杂交的基因；和(c) (a)或(b)的互补链组成的群组。
在另一个更优选的方案中，hasE基因编码具有SEQ ID NO: 39的氨基 酸序列的6-磷酸葡萄糖或其具有6-磷酸葡萄糖异构酶活性的片段。
本发明也涉及包含编码类透明质酸合酶操纵子的分离的多核苦酸的核 酸构建体，其中操纵子包含类透明质酸合酶基因和UDP-葡萄糖6-脱氢酶基 因，以及任选地地从由UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因，UDP-N-乙酰葡糖胺焦 磷酸化酶基因和6-磷酸葡萄糖异构酶基因组成的群组选择出来的 一 个或多 个基因。
可以模仿类马链球菌的操纵子(WO 03/054163 )或化脓性链球菌的操 纵子(Crater and van de Rijn， 1995， J. Biol. Chem. 270: 18452-18458 )构建" 人工操纵子"。这种人工操纵子包含hasA、 hasB、 hasC和hasD，或他们的 同系物，可选地，包括的成分可以少于存在于类马链球菌操纵子中的全部 补足物(full complements人工操纵子也可以同时包含6-磷酸葡萄糖异构酶基因(hasE)，以及从由己糖激酶基因、葡糖磷酸变位酶基因、酰胺转移
酶基因、变位酶基因和乙酰转移酶基因组成的群组选择出来的一个或多个
基因。在SEQ ID NO : 40中发现了编码类马链球菌类透明质酸合酶操纵子 大部分的多核苷酸。这一序列包括分别是枯草芽孢杆菌tuaD基因(SEQ ID NO: 24 )和gtaB基因(SEQ ID NO: 32 )同系物的hasB ( SEQ ID NO: 18 ) 和hasC ( SEQ ID NO: 26 )，这和化脓性链球菌(Streptococcus equisimilis)的 gcaD基因的同系物(SEQ ID NO : 36 )已经被命名为hasD ( SEQ ID NO : 34 ) 的情况一样。枯草芽孢杆菌gcaD基因编码参与N乙酰氨基葡萄糖合成的 UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶，N-乙酰氨基葡萄糖是类透明质酸的双组分 中的一种。类马链球菌的gcaD、 hasD同系物由类马链球菌排列在类透明质 酸合酶操纵子上。多核苷酸也包含has A基因的一部分(SEQ ID NO : 2的最 后U56bp )。
在优选方案中，核酸构建体包含从由hasA、 hasB、 tuaD、 hasC、 gtaB、 hasD 、 gcaD和hasE组成的群组中选择出来的一个或多个基因。 在另一个优选方案中，核酸构建体包含hasA。
在另一个优选方案中，核酸构建体包含hasA和hasB或tuaD。在另一 个优选方案中，核酸构建体包含hasA和hasC或gtaB。在另一个优选方案 中，核酸构建体包含hasA和hasB或gcaD。在另 一个优选方案中，核酸构 建体包含hasA和hasE。在另一个优选方案中，每一个如上所述的核酸构建 体都不包含hasA。
在另一个优选方案中，核酸构建体包含hasA、 hasB或tuaD,以及hasC 或gtaB。在另一个优选方案中，核酸构建体包含hasA、 hasB或tuaD，以及 hasD或gcaD。在另一个优选方案中，核酸构建体包含hasA、 hasB或tuaD, 以及hasE。在另一个优选方案中，核酸构建体包含hasA、 hasC或gtaB，以 及hasD或gcaD。在另 一个优选方案中，核酸构建体包含hasA、hasC或gtaB， 以及hasE。在另一个优选方案中，每一个如上所述的核酸构建体都不包含 hasA。
在另一个优选方案中，核酸构建体包含hasA、 hasB或tuaD, hasC或 gcaD，以及hasl)。在另一个优选方案中，核酸构建体包含hasA、 hasB、 hasD 或gcaD，以及hasE。在另一个优选方案中，核酸构建体包含hasA、 hasC 或gtaD， hasD或gcaD，以及hasE。在另一个优选方案中，核酸构建体包 含hasA、 hasB或tuaD, hasC或gtaD，以及hasE。在另 一个优选方案中，
23每一个如上所述的核酸构建体都不包含hasA。
基于以上所述的优选方案，可以用记录的基因的其他同系物替换记录
的基因。
在本发明的方法中，核酸构建体包含可操作地与三联启动子连接的涉 及类透明质酸生物合成的一个或多个基因，其中三联启动子包含具有对应
于SEQ ID NO : 1的位置590的突变的变体amyL启动子，"-35"区域具有 TTGACA序列和"-10"区域具有TATAAT序列的共有启动子和cryIIIA启动 子，三联启动子的每个启动子序列可操作地与一个或多个涉及透明质酸生 物合成的编码序列相连。三联启动子的启动子顺序可以是任何次序。
在本发明的方法中，可以从任何细菌来源中获得三联启动子成分。在 优选方案中，从革兰氏阳性细菌，例如芽孢杆菌菌林，例如嗜碱芽孢杆菌
(Bacillus alkalophilus )、角罕淀4分芽孑包才干菌(Bacillus amyloliquefaciens )、 4豆 芽孑包杆菌(Bacillus brevis )、环状芽孑包杆菌(Bacillus circulans )、克劳氏芽 孢杆菌细胞(Bacillus clausii )、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans )、坚强芽 孢杆菌(Bacillus firmus)、杣烂芽孢杆菌(Bacillus lautus )、迟緩芽孢杆菌
(Bacillus lentus )、地衣芽孑包杆菌(Bacillus licheniformis )、 巨大芽孢杆菌
(Bacillus magaterium )、 4豆小芽孑包4干菌(Bacillus pumilus )、 p耆热月旨肪芽孑包 杆菌(Bacillus stearothermophilus )、枯草芽孑包杆菌(Bacillus subtilis)或苏 云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis );或链霉菌菌抹，例如变铅青链霉菌
(Streptomyces lividans )或Streptomyces murinus;或革兰氏阴性纟田菌，例如 大肠杆菌或假单胞菌中获得启动子序列。
供本发明的方法使用的适当的amyL启动子的实例是地衣芽孢杆菌a-淀粉酶基因的启动子(amyL)。供本发明的方法使用的适当的cryIIIA启动 子的实例是苏芸金芽孢杆菌亚种tenebrionis cryIIIA基因的启动子。
在本发明的方法中可以依照美国专利Nos. 5,698,415和6,100,063获取 具有对应于SEQ ID NO : 1的位置5卯的突变的变体amyL启动子，其中突 变是将位置590的T转换为A以产生SEQ ID NO : 1 。美国专利No. 5,698,415 要求保护来源于地衣芽孢杆菌amyL启动子的启动子变异体。参考上述专利 的权利要求1可知，这种启动子变异体是该权利要求中给出的序列的片段， 其中N2-N9具有序列ATGTATCA。通过将想要的突变掺入到覆盖amyL启 动子区域的长PCR引物，28902 (美国专利No. 6,100,063 )中来构建这种启 动子变异体。另一个PCR引物，LWN3216 (美国专利No.6，100，063 )从跨越AmyL信号肽编码区域的Pstl位点向上游阅读。这些引物允许PCR扩增 来源于亲代amyL启动子的变体amyL启动子片段。
在本发明中，亲代amyL启动子是(a)具有与SEQ ID NO : 1有最少 70。/。同一性的核苦酸序列的多核芬酸；或(b)具有至少在低严谨条件下与 SEQ ID NO: 1或其互补链杂交的核苷酸序列的多核苷酸。
在第一个方案中，亲代amyL启动子包含与SEQ ID NO: 1具有最少 70%,优选至少75%,更优选至少80%，更优选至少85%，更加优选至少 90%,最优选至少95%,或者甚至最优选至少97%同一性程度的核普酸序 列(在下文中指"同源amyL启动子")。
优选地，亲代amyL启动子包含SEQ ID NO : 1的核苷酸序列或其具有 启动子活性的片段。在优选实施例中，亲代amyL启动子包含SEQ ID NO : 1 的核苷酸序列。在另一个优选实施例中，亲代amyL启动子由SEQ ID NO : 1 的核苦酸序列组成。
在第二个方案中，亲代amyL启动子是在低严谨条件下，优选中等严谨 条件下，更优选中等-高严谨条件下，更加优选高严谨条件下和最优选很高 的严谨条件下与SEQ ID NO : 1或它的互补链杂交的核苷酸序列(J. Sambrook， E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York )。在这里限定了这种严谨条 件。
依照本领域众所周知的方法，可以用SEQ ID NO: 1的核苦酸序列或其 片段来鉴定和克隆来自不同的属或种的菌抹的同源amyL启动子。
本发明中，分离的变体amyL启动子包含与SEQ ID NO: 1具有最少 70%,优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%，更加优选至少 90%,最优选至少95%，或者甚至最优选至少97%同一性程度的核苷酸序 列。
对本发明来i兌，通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur and Lipman, 1983， Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 726-730 ),利用具有 同一性表和下列多重比对参数缺口计罚分10，间隙长度计罚分10的 LASERGENE MEGALIGNTm軟件(DNASTAR， Inc., Madison, WI)确定两 个核苷酸序列之间的同 一性程度。成对地比对参数是Ktuple=3，缺口罚分 =3和窗口=20。
通过定位诱变可以完成"共有"启动子的构建，产生更完美地符合确定的枯草芽孢杆菌营养(vegetative)"aA型"启动子的"-10"和"-35"区的共有序列的 启动子。"-35"区域的共有序列是TTGACA， "-10"区域的共有序列是 TATAAT 。可以从能够在芽孢杆菌宿主细胞中起作用的任何启动子中获得共
有序列。
在优选方案中，"共有"启动子是从由大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉 菌琼脂糖酶基因(dagA)、迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprH)、地衣芽 孢杆菌碱性蛋白酶基因(枯草芽孢杆菌蛋白酶Carlsberg基因)、枯草芽孢杆 菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌a-淀粉酶基因(amyE)、地衣 芽孢杆菌a-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因 (amyM)、解淀粉芽孢杆菌ot-淀粉酶基因(amyQ )、地衣芽孢杆菌青霉素 酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xy旧基因、苏云金芽孢杆菌亚种 tenebri()nis ( Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis ) cryIIIA基因 (SEQ ID NO : 41 )或其部分，或者原核生物的f3-内酰胺酶基因获得的启动子中得到 的。还可以从spol细菌噬菌体启动子中获得"共有"启动子。
在更优选的方案中，"共有"启动子是从解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶基因 (amyQ)中获得的。在最优选的方案中，共有启动子是包含在SEQ ID NO : 42或SEQ ID NO : 43的核苦酸1-185中的"共有"amyQ启动子。在另 一个最 优选的方案中，共有启动子是包含在SEQ ID NO : 42或SEQ ID NO : 43的 核苷酸86- 185中的短"共有"amyQ启动子。SEQ ID NO : 42的"共有"amyQ 启动子包含含有野生型amyQ启动子(SEQ ID NO 44)核苷酸序列的下列 突变在-35区域(相对于转录起始位点)中的位置135和136分别出现的 T—A和T—C,和SEQ ID NO : 44的-10区域的位置156的A—T变化。SEQ ID NO : 43的"共有"amyQ启动子更进一步地在位置116,即-35区域上游大 约20个碱基处，包含T—A变化(SEQ ID NO : 43 ),其中变化对启动子功 能显然没有不利影响，因为能很好地从关键的-10和-35区域除去它。
在优选方案中，三联启动子包含具有对应于SEQ ID NO : 1的位置590 的突变的变体amyL启动子。在另一个优选方案中，三联启动子包含SEQ ID NO : l的变体amyL启动子。在另一个优选方案中，三联启动子包含"-35" 区域具有序列TTGACA和"-lO"区域具有TATAAT的共有amyQ启动子。在 另一个优选方案中，三联启动子包含"-35"区域具有序列TTGACA和"-10" 区域具有TATAAT的短共有amyQ启动子。在另一个优选方案中，三联启 动子包含cryllIA启动子或其部分(Agaisse and Lereclus， 1994， MolecularMicrobiology 13: 97-107 )。
在更优选的方案中，三联启动子包含具有对应于SEQIDNO: 1的位置 590的突变的变体amyL启动子，"-35，，区域具有序列TTGACA和"-10"区域 具有TATAAT的短共有amyQ启动子和cryIIIA启动子。
在另一个更优选的方案中，三联启动子包含以上述5'到3'次序排列的具 有对应于SEQ1DN0 : 1的位置5卯的突变的变体amyL启动子，"-35"区域 具有序列TTGACA和"-10"区域具有TATAAT的短共有amyQ启动子和 cryIIIA启动子。
在最优选的方案中，三联启动子包含SEQ IDNO : 1的变体amyL启动 子，"-35"区域具有序列TTGACA和"-10"区域具有TATAAT的短共有amyQ 启动子和SEQ ID NO : 41的crylIIA启动子。
在另一个最优选的方案中，三联启动子包含以上述5'到3'次序排列的 SP:Q ID NO : 1的变体amyL启动子，"-35"区域具有序列TTGACA和"-10" 区域具有TATAAT的短共有amyQ启动子和SEQ ID NO : 41的cryIIIA启动 子。
"mRNA加工/稳定序列"在这里限定为位于三联启动子的 一个或多个启 动子序列下游，位于一个或多个编码序列上游的序列，其中三联启动子序 列中的每一个都可操作地连接到一个或多个编码序列上，因此可以处理从
一个或多个启动子序列合成的全部mRNAs以产生在转录产物5'端有稳定序 列的mRNA转录产物。在mRNA转录产物5'端存在这种稳定序列会增加 mRNA转录产物的半衰期(Agaisse and Lereclus, 1994, supra, Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology ]77: 3465-3471 )。 mRNA加工/稳定序列与细菌16S 核醣体RNA的3'端互补。在优选方案中，mRNA加工/稳定序列产生在转录 产物5端具有稳定序列的大小基本均一的转录产物。在另一个优选方案中， mRNA加工/稳定序列位于整个三联启动子下游和 一个或多个编码序列上 游。在另一个优选方案中，mRNA加工/稳定序列位于三联启动子的cryIIIA 启动子下游和一个或多个编码序列上游。
mRNA加工/稳定序列优选位于三联启动子下游和一个或多个涉及透明 质酸生物合成的编码序列的上游。但是，mRNA加工/稳定序列可以位于三 联启动子中任何启动子序列的下游和一个或多个涉及透明质酸生物合成的 编码序列的上游。而且，mRNA加工/稳定序列可以位于三联启动子的每一 个启动子序列的下游和一个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列的上游。mRNA处理稳定序列或序列可能与三联启动子的一个或多个启动子序 列异源和/或彼此异源。
在优选方案中，mRNA加工/稳定序列是WO 94/25612和上文的Agaisse 和Lereclus， ]994中公开的苏云金芽孢杆菌cryIIIA mRNA加工/稳定序列或 其保留mRNA处理/稳定功能的部分。在另一个更优选的方案中，mRNA力口 工/稳定序列是上文Hue等，1995中公开的枯草芽孢杆菌SP82的mRNA加 工/稳定序列或其保留mRNA处理/稳定功能的部分。
当cryIIIA启动子和其mRNA加工/稳定序列被用于本发明的方法时， 可以使用包含WO 94/25612和上文Agaisse和Lereclus， 1994中公开的序列， 通过SEQ ID NO : 41的核苷酸-635到-22描绘的DNA片段或者其保留启动 子和mRNA处理/稳定功能的部分。当cryIIIA mRNA加工/稳定序列被包含 在核芬酸-551到-22中时，用核苷酸-635到-552来描绘cryIIIA启动子。在 优选方案中，cryIIIA mRNA加工/稳定序列包含在含有核苷酸-568到-22的 片段中。在另 一个优选方案中，cryIIIA mRNA加工/稳定序列包含在含有核 芬酸-367到-21的片段中。而且，可以利用本领域众所周知的方法制备仅包 含cryIIIA启动子和/或仅包含cryIIIA mRNA加工/稳定序列的DNA片段， 以构建各种三联启动子和mRNA加工Z稳定序列组合。
在优选方式中，cryIIIA启动子和它的mRNA加工/稳定序列优选方文置在 组成三联启动子的其他启动子序列的下游和一个或多个编码序列的上游。
在更优选方案中，三联启动子包含具有对应于SEQ ID NO : 1的位置 590的突变的变体amyL启动子，其中启动子序列是任何次序的"-35"区域具 有序列TTGACA和"-10"区域具有TATAAT的短共有amyQ启动子和cryIIIA 启动子，以及cryIIIA mRNA加工/稳定序列。
在另一个更优选方案中，三联启动子包含SEQ ID NO : 1的变体amyL 启动子，其中启动子序列是任何次序的"-35"区域具有序列TTGACA和"-10" 区域具有TATAAT的短共有amyQ启动子和SEQ ID NO : 41的cryIIIA启动 子，以及cryUIA mRNA加工/稳定序列。
在最优选的方案中，三联启动子包含以上述5'到3'次序排列的具有对应 于SEQ ID NO: 1的位置590的突变的变体amyL启动子，"-35"区域具有序 列TTGACA和"-IO"区域具有TATAAT的短共有amyQ启动子，cryIIIA启动 子和cryIIIAmRNA加工/稳定序列。
在另一个最优选的方案中，三联启动子包含以上述5'到3'次序排列的
28SEQ ID NO : 1的变体amyL启动子，，，-35"区域具有序列TTGACA和"-10" 区域具有TATAAT的短共有amyQ启动子，SEQ ID NO : 41的cryIIIA启动 子和cryIIIA mRNA加工/稳定序列。
通过将一个或多个编码序列可操作地连接到一个或多个附加的控制序 列上，可以更进一步地操作涉及透明质酸生物合成的一个或多个编码序列， 其中控制序列指导编码序列在与控制序列相适合的情形下在芽孢杆菌细胞 中表达。应理解表达包括涉及多肽生产的任何步骤，包括但不限于转录、 转录后修饰、翻译、翻译后修饰和移位。利用克隆方法修饰核苷酸序列的
术语"控制序列"在这里限定为包括表达编码序列必需的或对编码序列 表达有利的所有组件。每个控制序列可以是一个或多个编码序列的天然控 制序列或者与 一 个或多个编码序列异源。除较早描述的三联启动子之外， 这种控制序列包括，但不局限于引导序列，信号序列和转录终止子。可以 用连接子来提供控制序列，这样可以插入特异的限制性内切位点，便于将 控制序列与编码区连接。
控制序列也可以是适当的被芽孢杆菌细胞识别后能终止转录的转录终 止序列。终止序列可操作地与编码多肽的多核苷酸的3'末端相连。在选择的 芽孢杆菌细胞中有功能的任何终止子都可以用于本发明。
控制序列也可以是适当的引导序列，引导序列是对芽孢杆菌细胞进行 的翻译很重要的mRNA非翻译区。引导序列可操作地与编码多肽的多核苷 酸的5'末端相连。在选择的芽孢杆菌细胞中有功能的任何可1导序列都可以用 于本发明。
控制序列也可以是编码与转移表达的多肽，例如将表达的多肽转移到 细胞膜的多肽的氨基末端连接的氨基酸序列的信号肽编码区。信号肽编码 区可以是多肽与生倶来的或者是从外来来源中获得的。编码序列的5'端可以 固有地包含在翻译阅读框中天然地与编码移位多肽的编码区的片段连接的 信号肽编码区。或者，编码序列的5'端可以包含与编码移位多肽的编码序列 的部分异源的信号肽编码区。当编码序列通常不包含信号肽编码区时，可 能需要外来的信号肽编码区。或者，为了使多肽的移位相对于通常与编码 序列有关的天然信号肽编码区有所增强，可以用外来的信号肽编码区简单 地替换天然的信号肽编码区。能够指导表达的多肽移位的任何信号肽编码 区都可以用于本发明。芽孢杆菌细胞可以包含至少两个不同核酸构建体的 一个或多个拷贝， 其中按照上文的描述构建每个构建体。
核酸构建体可以更进一步地包含一个或多个允许容易选择转化细胞的 可选择标记。可选择标记是其产物提供生物杀伤剂抗性，重金属抗性和营 养缺陷原养型等等的基因。细菌的可选择标记的实例有来自枯草芽孢杆菌 或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者是赋予抗生素抗性，例如氨苄青霉素、卡
那霉素、红霉素、氯霉素或四环素抗性的标记。而且，可以通过如wo
91/09129中描述的共转化完成选择，在共转化中可选择标记位于分离的载体上。
本发明的特殊优点是可以产生不含外来可选择标记的芽孢杆菌细胞， 也就是说，在将核酸构建体导入芽孢杆菌细胞之后，可以从芽孢杆菌细胞 上删除可选择标记基因以产生没有标记的细胞。因为调节和环境方面的原 因，除去可选择标记基因产生没有这种标记的芽孢杆菌细胞可能是优选的。
可以用基因缺失或取代技术完全去除可选择标记基因。例如利用构 建的包含ffl比连的(contiguous)侧接可选4奪标记基因的5'和3'区的质粒，通 过同源重组可以完成可选择标记基因的缺失。可以在允许质粒定居在细胞 中的许可温度条件下，将与第二可选择标记相联系的溫度敏感质粒，例如 pH194上连续的5'和3'区引入芽孢杆菌细胞。然后将细胞转入非许可温度以 选择质粒在一个同源侧接区被整合到染色体中的细胞。质粒整合的选择受 第二可选择标记的影响。在整合以后，通过将细胞改变到许可温度培养几 代，不进行选择可以促进第二同源侧接区的重组事件。将细胞接种到平皿 获取单个集落，检查丧失两个可选择标记的集落(例如，参见Perego, 1993, In A.L. Sonneshein， J.A. Hoch, and R. Losick, editors, Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Chapter 42, American Society of Microbiology, Washington, D.C.， 1993 )。也可以使用本领域众所周知的其他方法。
表达载体
在本发明的方法中，可以利用包含涉及透明质酸生物合成的一个或多 个基因，三联启动子，或者也同时包含mRNA加工/稳定序列，转录和翻译 终止信号的重组表达载体来进行重组生产。可以将如上所述的各种核酸和 控制序列连接在一起产生包含一个或多个方便的限制性内切位点的重组表 达载体，其中限制性内切位点允许在该位点插入或替换多核苷酸。或者，通过将一个或多个涉及透明质酸生物合成的基因或包含一个或多个基因的 核酸构建体插入到适当的表达载体中可以表达一个或多个涉及透明质酸生 物合成的基因。在构建表达载体的过程中， 一个或多个涉及透明质酸生物 合成的基因位于载体中，这样一个编码序列或多个编码序列可操作地与三
联启动子，或者三联启动子和mRNA加工/稳定序列，以及其他任何适当的 表达控制序列和可能的移位控制序列连接。
重组体表达载体可以是能方便地经受重组DNA过程和能使涉及透明质 酸生物合成的一个或多个基因在导入芽孢杆菌细胞中时表达的任何载体。 典型地，载体的选择取决于载体与载体被插入其中的芽孢杆菌细胞的相容 性。载体可以是线性质粒或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即 作为染色体外实体存在的载体，例如质粒，染色体外元件，微型染色体或 人工染色体，这种载体的复制不依赖染色体复制。载体可以包含任何保证 自我复制的工具。换句话说，载体可以是被引入芽孢杆菌细胞时，能被整 合到染色体中并和已经整合它的染色体一起复制的载体。载体系统可以是 单个载体或质粒或两个或多个载体或质粒，或转座子。
"导入"指将包含涉及透明质酸生物合成的一个或多个基因的载体引入 到芽孢杆菌细胞中，以便以染色体整合体或自我复制的染色体外载体来维 持该载体。因为一个或多个编码序列或基因更有可能稳定地维持在细胞中， 因此通常认为整合是一个优点。通过同源重组，非同源重组或转位可以将 载体整合到染色体中。
将表达载体导入芽孢杆菌细胞可以受原生质体转化，使用感受态细胞， 电穿孔或这里描述的结合作用的影响。
为了进行整合作用，载体可以依靠载体的任何成分以通过同源重组将 载体稳定整合到基因组中。载体可以包含指导通过同源重组整合到芽孢杆 菌细胞基因组的附加多核苷酸序列。附加多核苷酸序列使载体能够在染色 体的精确位置整合到芽孢杆菌细胞基因组中。为了增加在精确位置整合的 可能性，整合成分应优选包含足够量的核酸，例如100-10,000个碱基对， 优选400-10,000个石咸基对，最优选800-10,000个石威基对，其中核酸与对应 的目标序列高度同源以增强同源重组的概率。整合成分可以是与芽孢杆菌 细胞基因组中的目标序列同源的任何多核苷酸序列。而且，整合成分可以 是非编码或编码序列。
为了自主复制，载体可以更进一步地包含使载体能够在正讨论的芽孢杆菌细胞中自主复制的复制起点。复制的细菌起点的实例有允许在大肠杆
菌中复制的质粒pBR322、 pUC19、 pACYC177和pACYC184的复制起点和 允许在芽孢杆菌属中复制的pUB110、 pE194、 pTA1060和pAM(31。复制起 点可以是具有使它在芽孢杆菌细胞中的功能变得对温度敏感的突变的复制 起点(例^口， 参见Ehrich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1433 )。
用来连接如上所述的组件以构建重组表达载体的过程为本领域熟练技 术人员所熟知(例如，参见Sambrook et al.， 1989,上文)。
生产
在本发明的方法中，使用本领域已知的方法在适合于生产透明质酸的 营养培养基中培养芽孢杆菌属宿主细胞。例如可以在适当的培养基，以 及允许表达涉及透明质酸合成的酶和分离透明质酸的条件下，在实验室或 工业发酵罐中通过摇瓶培养，小规模或大规模发酵(连续不断的发酵、分 批发酵、分级-分批发酵或固态发酵)培养细胞。使用本领域已知的方法， 在包含碳源，氮源和无机盐的合适的营养培养基中进行培养。可以直接从
培养基中回收分泌的透明质酸。
可以利用本领域众所周知的方法分离产生的透明质酸。例如，通过包
括但不限于离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀的常规程序可以从 营养培养基中分离透明质酸。然后通过本领域已知的多种方法，包括但不 限于色谱法(例如离子交换、亲合、疏水性、色谱聚焦和排阻色谱(size exclusion)),电泳方法(例如，准备的等电聚焦)、有差别的可溶性(differential solubility)(例^口，石克酉交4妄;;冗;;定)或4由4是(侈寸^口，参见Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 )可以更进一 步地纯化分离的透明质酸。
因为重组芽孢杆菌细胞的类透明质酸直接表达到培养基中，因此利用 简单的处理就可以从培养基中分离出类透明质酸。首先，采用物理方法从
培养基中除去芽孢杆菌细胞和细胞碎片。可以先稀释培养基，如果需要， 以降低培养基的粘性。从培养基中除去细胞的许多方法，例如离心或微量 过滤，本领域熟练技术人员已经已知。如果愿意，接下来可以过滤剩余的 上清液，例如通过超滤以浓缩类透明质酸和从类透明质酸中除去小分子污 染物。在除去细胞和细胞碎片后，通过已知的机制可以完成从培养基简单
32沉淀类透明质酸。可以用盐、乙醇或者盐和乙醇的组合从滤液中沉淀类透 明质酸。 一旦还原成沉淀，通过物理手段可以很容易地从溶液中分离类透 明质酸。换句话说，通过使用本领域已知的蒸发技术，例如喷雾干燥可以 从滤出溶液干燥或浓缩类透明质酸。依照这里描述的修饰的。卡唑方法可以 确定由本发明的芽孢杆菌属宿主细胞产生的透明质酸的水平。
在本发明的方法中，当在相同的生产条件下培养时，芽孢杆菌细胞相 对于仅包含可操作地与涉及透明质酸生物合成的一个或多个编码序列相连 的三联启动子的一个启动子序列的芽孢杆菌细胞优选产生至少25%以上、
更优选产生至少50%以上、更优选产生至少75%以上、更优选产生至少100% 以上、甚至更优选产生至少200%以上、最优选产生至少300%以上、甚至 最优选产生至少400%以上的透明质酸。
缺失/破坏
或其他不受欢迎的基因。在这种方法中，利用已经构建的包含连续的侧接 可选择标记基因的5'和3'区的质粒，通过同源重组可以完成可选择标记基因 的删除。例如，可以在允许质粒定居在细胞中的许可温度条件下，将与第 二可选择标记相联系的温度敏感质粒，例如pE194上连续的5'和3'区引入 芽孢杆菌细胞。然后将细胞转入非许可温度以选择质粒在一个同源侧接区 被整合到染色体中那些细胞。整合质粒的选择受第二可选择标记的影响。 在整合以后，通过将细胞改变到许可温度培养几代，不进行选择可以促进 第二同源侧接区的重组事件。将细胞接种到平皿以获取单个集落，检查丧 失两个可选择标记的集落(例如，参见Perego， 1993, InA丄.Sonneshein, J.A. Hoch， and R. Losick, editors, Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Chapter 42， American Society of Microbiology, Washington, D.C., 1993 )。
将包含缺陷基因5'和3'区，但缺乏可选择标记基因的核酸片段引入突变 细胞进行同源重组，随后在反选择培养基上进行选择也可以除去可选择标 记基因。通过同源重组，包含可选择标记基因的缺陷基因被缺乏可选择标 记的核酸片段替换。也可以使用本领域已知的其他方法。
如上所述的方法还可以用于删除或破坏不想要的基因。美国专利 No.5,891,701公开了删除包含spoIIAC、 aprE、 nprE和amyE的几个基因的 技术。通过上述方法也可以除去其他不想要的生物化合物，例如cypX (登记 号BG12580 )和/或yvmC (登记号BG14121 )合成的红颜料。
在优选方式中，芽孢杆菌宿主细胞没有标记外来或异源的可选择标记。 在另一个优选方案中，芽孢杆菌属宿主细胞不产生cypX和yvmC合成的任
4可红颜津+。
下列实施例更进一步地描述了本发明，不应认为实施例是限制本发明
的范围。
实施例
引物和寡核苷酸
依月 、厂家的i兌明在Applied Biosystems Model 394 Synthesizer (Applied Biosystems， Inc., Foster City, CA )上合成全部引物和寡核苷酸。
实施例1 :构建在amyL位点包含Pll启动子/amyL表达盒的地衣芽 孢杆菌MaTa2
通过标准基因替换方法，在地衣芽孢杆菌SJ1904 (美国专利 No.5,733,753 ) amyL基因(基本上和登记号M13256 一致，Gray et al.， 1986, J. Bacteriol. 166: 635，除在位置474用C代替T，在位置523用G代替C， 在位置524用C代替G，以及在位置768-770用AAA代替TTT之外)的上 游插入Pll启动子(Prsh。rt"*t"amyQ/Prcryl Astab，美国专利No.6，255,076 )。因为 使质粒负载位于功能启动子下游的amyL编码区的片段存在困难，因此按照 如下所述的两个步骤完成构建。首先，用缺乏RBS的复合(composite)启 动子替换amyL启动子和amyL核糖体结合部位(RBS )(防止amyL表达)。 然后进行第二次基因替换再导入RBS，从而产生有功能的表达盒。
通过电穿孔将基于pE194的温度敏感质粒pMRT064.1( WO 03/054163 ) 引入地衣芽孢杆菌菌抹SJ1904 (Xue et al., 1999， Journal of Microbiological Methods 34: 183-191 )。在28°C孵育24-48小时后，将细胞接种到每毫升补 充有lug红霉素和25ug林可霉素的胰蛋白胨血琼脂培养基(TBAB)-琼 脂平板上。TBAB琼脂平板由每升33g胰蛋白胨血琼脂培养基组成。分离红 霉素抗性转化体，并在存在红霉素(5ug/ml)的条件下在50。C的非许可温度培养转化体。在这个温度，pE194复制起点是非活性的。细胞仅通过将质
粒整合到细菌染色体的amyL位点才能在存在红霉素的条件下生长。为了促 进导致用Pll启动子替换内源amyL启动子和随后丧失RBS的质粒丧失或 "looping out",在30。C的许可温度，在Luria-Bertani ( LB )培养基生长整合 体几代，不进行选择。LB培养基由每升10g胰蛋白胨，5g酵母抽提物和 5gNaCl组成。在这个温度，pE194复制起点是有活性的，能促进从基因组 切除质粒(Molecular Biological Methods for Bacillus, edited by C.R. Harwood and S.M. Cutting,9卯，John Wiley and Sons Ltd.)。然后将细胞接种到非选择 性LB琼脂平板上(每升LB培养基加15g Bacto琼脂)，通过下列标准鉴定 包含想要的启动子替换和丧失基于pE194的复制子的集落(1 )在包含 0.5。/。淀粉-a;oire( Sigma Chemical Co., St. Louis, MO )，加TBAB盖层的TBAB 平皿上不能形成晕圈表明pii启动子存在，amyL RBS丧失；和(2)红霉 素敏感性表明基于pE194的复制子丧失。选择出一个满足这三个标准的转 化体，将其命名为地衣芽孢杆菌SJ1904::pMRT064.1。
按照如下步骤恢复上述菌才朱中的amyLRBS。用Pad消化质粒pNBT23
(pDG268MCSAneo-Prshort "共有"謡yQ/Pr—nA/crylIIAstab/SAV ,美国专利No. 6,255,076 )，用T4 DNA聚合酶I ( Roche Applied Science, Indianapolis, IN ) 使末端变钝，然后用Sail进行消化。用Ecll36U和Sail消化质粒pUC19
(Yanisch-Perron et al., 1985， Gene 33: 103-119 )。利用44 mM Tris Base, 44 mM硼酸，0.5 mMEDTA (0.5XTBE)緩冲液，在0.8%琼脂糖凝胶上分辨 消化物，依照厂家的说明利用QIAquick DNA抽提试剂盒(QIAGEN Inc., Valencia, CA)从凝胶中纯化来自pUC19的大些的载体片段(大约2661bp) 和来自pNBT23的较小的crylIIAstab/aprH 5 '片段(大约1069bp)。依照厂 家的i兑明，利用T4 DNA连4娄酵(Roche Applied Science; Indianapolis, IN ) 将两个纯化的片段连接在一起，连接的混合物被转化到大肠杆菌SURE⑧感 受态细月包中(Stratagene, Inc., La Jolla， CA )。在每毫升补充有100ug氨苄青 霉素的2X酵母-胰蛋白胨(2XYT)琼脂平板上选择转化体。2XYT平板由 每升16g胰蛋白胨，10g酵母抽提物，5gNaCl和5g Bacto琼脂组成。依 照厂家的说明,利用Bio Robot 9600 ( QIAGEN Inc., Valencia, CA )从几个转 化体中纯化质粒DNA,用EcoRI力口 Sail消化质粒DNA，再利用0.5XTBE 緩冲液，在0.8%琼脂糖凝胶上进行分析。通过存在大约1071 bp的EcoRI/Sall crylIIAstab/aprH5'片段鉴定出正确质粒，并将其命名为pNBT28 (图1 )。依照Horton et al.， 1989, Gene 77: 61-8的方法，通过重叠延伸拼接法 (SOE)构建质粒pMRT038。分别利用如下所示的引物对733-45-1和 733-45-2，以及733-68-1和733-70-1 PCR扩增来自质粒pDN1981 (美国专 利No.5,698,415 )的amyL启动子区和5'编码序列。在由pDN1981 DNA lng, 每种引物0.4uM, dATP、 dCTP、 dGTP和dTTP各200uM，具有2.5mM MgCl2 的1XPCR Buffer II ( Applied Biosystems， Inc., Foster City, CA )和2.5单位 AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA )组 成的50ul反应中进行PCR扩增。在RoboCycler 40热循环仪(Stratagene, Inc., La Jolla， CA )中进行反应，反应程序为95。C10分钟，1个循环；95°C1分 钟，5(TC1分钟，25循环；72。Cl分钟，25个循环；和72。C7分钟，1个循 环。用0.5XTBE緩沖液，在0.8%琼脂糖凝胶上目测检验PCR产物。amyl 启动子区和5'编码序列的预期片段分别是大约600和500bp。利用引物 733-45-1和733-70-1扩增最后的SOE片段。利用TA-TOPO克隆试剂盒 (Stratagene,Inc., La Jolla， CA )将最后的SOE片段克隆到pCR2.1中。在每 毫升补充有100ug氨千青霉素的2XYT琼脂平板上选择转化体，并在37。C 將育16小时。利用M13正反向引物(Invitrogen, Inc, Carlsbad， CA )，通过 DNA测序验证携带正确质粒的转化体。质粒被命名为pMRT038 (图2 )。
引物733-45-1 :
5'-GTCCTTCTTGGTACCTGGAAGCAGAGC-3' ( SEQ ID NO : 45 )
733-70-1 : 5'-GGTGTTCTCTAGAGCGGCCGCGGTTGCGGTCAGC-3' ( SEQ ID NO : 48 )
用BglII消化质粒pNBT28，用Klenow片段使末端变钝，然后用Sacl 进行消化。用EcoRl消化质粒pMRT03 8,用Klenow片段使末端变钝，然 后用Sacl进行消化。利用0.5XTBE緩沖液，在0.8%琼脂糖凝胶上分辨消化 物，依照厂家的说明利用QIAquick DNA抽提试剂盒从凝胶中纯化来自
733-45-2 : 5，-
SEQ ID NO : 46 ) 引物733-68-1 :
CCACATTGAA-3' ( SEQ ID NO : 47 )
引pNBT28的大些的载体片段(大约3253bp)和来自pMRT038的较小片段(大 约593bp )。利用T4 DNA连接酶将两个纯化的片段连接在一起，连接的混 合物被转化到大肠杆菌SURE⑧感受态细胞中。在每毫升补充有100ug氨节 青霉素的2XYT琼脂平板上选择转化体。依照厂家的说明，利用QIAGEN Bio Robot 9600从几个转化体中纯化质粒DNA,用EcoRI加HindIII消化质粒 DNA后，再利用0.5XTBE緩沖液，在0.8%琼脂糖凝胶上进行分析。通过 存在大约]168bp的EcoRI/Hindm片段鉴定出正确质粒，并将其命名为 pNBT29 (图3 )。
用EcoRI和HindIII消化质粒pNBT29和pCJ791 ( WO 03/054163 )。 利 用0.5XTBE緩冲液，在0.8%琼脂糖凝胶上分辨消化物，依照厂家的说明利 用QIAquick DNA抽提试剂盒从凝胶中纯化来自pCJ791的大些的载体片段 (大约4340bp)和来自pNBT29的较小片段(大约1168bp)。利用T4 DNA 连接酶将两个纯化的片段连接在一起，连接的混合物被转化到枯草芽孢杆 菌1 68A4( WO 03/054163 )中。依照厂家的说明，利用tip-20柱子(QIAGEN ]nc.， Valencia, CA )从几个转化体中纯化质粒DNA,用EcoRI加HindIII消 化质粒DNA后，再利用0.5XTBE緩冲液，在0.8%琼脂糖凝胶上进行分析。 通过存在大约1168bp的EcoRI/Hindlll片段鉴定出正确质粒，并将其命名为 pWWi001.1 (图4 )。
为了恢复地衣芽孢杆菌菌抹SJl卯4::pMRT064.1中的amyL RBS，通过 电穿孔将质粒pWWi001.1引入该菌林中，然后按照实施例1的描述将其整 合并从染色体中切除。通过amyL表达的恢复鉴定出想要的克隆，其中通过 在包含0.5%淀粉-azure加TBAB盖层的TBAB平板上生长菌抹来测定amyL 的表达。产生淀粉酶的菌抹在集落或碎片周围形成清晰的暈圈。
实施例2 :构建在天然amyL位点包含P12启动子/amyL表达盒的地 衣芽孢杆菌MaTa3
用填充了 Klenow片段的HindIII消化质粒pMRT064.1，然后用Sfil进 行消化。用Sfil和Ec]136H消化质粒pNBT23 (美国专利No.6,255,076 )。利 用0.5XTBE緩冲液，在0.8。/。琼脂糖凝胶上分辨消化物，依照厂家的说明利 用QIAquick DNA抽提试剂盒从凝胶中纯化来自pMRT064.1的大些的载体 片段(大约4892bp )和来自pNBT23的较小片段(大约728bp )。利用T4 DNA 连接酶将两个纯化的片段连接在一起，连接的混合物被转化到枯草芽孢杆菌168A4中。依照厂家的说明，利用QIAGEN tip-20柱子从几个转化体中 纯化质粒DNA，用EcoRI加HindIII消化质粒DNA后，再利用0.5XTBE緩
冲液，在0.8。/。琼脂糖凝胶上进行分析。通过限制性内切酶和/或PCR分析 验证正确的质粒，并将其命名为pWWi005 (图5 )。
通过电穿孔将质粒pWWi005引入地衣芽孢杆菌MaTa2中，然后按照实 施例1的描述将其整合并从染色体中切除，其中用P12启动子(Prsh。,r,共有 ,,ai，iyQ/Pr ylllA/cryIIIAstab，美国专利No.6，255，076 )替换Pll启动子产生地衣 芽孢杆菌菌林MaTa3。利用下文显示的引物961197和94-935，通过PCR 分析鉴定想要的克隆。在由200ng地衣芽孢杆菌MaTa3染色体DNA (按照 Pitcher et al., 1989, Letters in Applied Microbiology 8: 151-156的描述分离)， 每种引物0.4uM, dATP、 dCTP、 dGTP和dTTP各200uM,具有2.5mM MgCl2 的X PCR Buffer II和2.5单位AmpliTaq Gold DNA聚合酶组成的50ul反 应中进行PCR扩增。在RoboCycler 40热循环仪中进行反应，反应程序为 95。C10分钟，1个循环；95。Cl分钟，50。C1分钟，25循环；72。Cl分钟， 25个循环；和72。C7分钟，1个循环。利用0.5XTBE緩沖液，在2%琼脂糖 凝胶上目测检验PCR产物。预期片段是大约230bp。
引物961197 :
49 )
引物94-935 :
5'画GGCGTTACAATTCAAAGA-3' ( SEQ ID NO : 50 )
实施例3 :构建在天然amyL位点包含P17启动子/amyL表达盒的地 衣芽孢杆菌MDT217
利用如下所示的引物，从地衣芽孢杆菌SJ1904(美国专利No.5,733,753 ) 的染色体DNA PCR扩增amyL4199启动子(PramyL419y ，美国专利 No.6,100,063 ),此后被命名为P6启动子)，其中引物分别整合了 Sfil位点 和Sad位点。
引物950872 :
NO : 51 )
引物991151 :5'-GAGCTCCTTTCAATGTGATACATATGA-3' ( SEQ ID NO : 52 )
在由50ng地衣芽孢杆菌SJ1904染色体DNA U姿照上文Pitcher et al.， 1989的描述获取)，950872和991151引物各0.4 uM, dATP、 dCTP、 dGTP 和dTTP各200 uM,具有2.5 mM MgCl2的IX PCR Buffer II和2.5单位 AmpliTaq Gold DNA聚合酶组成的50ul反应中进行一式三份的PCR扩增。 在RoboCycler40热循环仪中进行反应，反应程序为95。C9分钟，1个循环； 95"C]分钟，55。Cl分钟，30循环;72。Cl分钟，30个循环;和72°C5分钟， 1个循环。用0.5XTBE緩沖液，在0.8%琼脂糖凝胶上目测检验PCR产物。 预期片段是大约600bp。
利用TA-TOPO克隆试剂盒将600bp的PCR片段克隆到pCR2.中，并 依照厂家的说明将其转化到大肠杆菌OneShotTM感受态细胞中(Stratagene, Inc.， La Jolla, CA)。 37。C在每毫升补充有100ug氨千青霉素的2XYT琼脂平 板上生长16小时后，选择出转化体。依照厂家的说明，利用QIAGEN Bio Robot 9600从这些转化体中纯化质粒DNA，用EcoRI消化质粒DNA后， 再利用0.5XTBE緩沖液，在0.8%琼脂糖凝胶上进行分析。发现质粒具有正 确的片段(大约3913bp和640bp)。利用M13 (-20)正向引物和M13反向 引物(Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA )，通过DNA测序确认插入DNA的DNA 序列。具有正确克隆序列的质粒被命名为pNBT30 (图6)。
用Sfil和Sacl消化质粒pNBTll ( pDG268MCSAneo-PrcryIIIA /SAV,美 国专利No.6,255,076 )和pNBT30。利用0.5XTBE緩沖液，在0.8%琼脂糖 凝胶上分辨消化物，依照厂家的说明利用QIAquickDNA抽提试剂盒从凝胶 中纯化来自pNBTl]的大些的载体片段(大约7931bp)和来自pNBT30的 较小片段(大约611bp)。利用T4 DNA连接酶将两个纯化的片段连接在一 起，连接的混合物被转化到大肠杆菌SURE⑧感受态细胞中。在每毫升补充 有100ug氨千青霉素的2XYT琼脂平板上选择转化体。依照厂家的说明， 利用QIAGEN Bio Robot 9600从这些转化体中纯化质粒DNA,用Ncol消化 质粒DNA后，再利用0.5XTBE緩沖液，在0.8%琼脂糖凝胶上进行分析。发 现质粒具有正确的片段(大约6802 bp和1741 bp ),并将其命名为pNBT31 (图7)。
PraniyL4i99/PrSh。rt"wamyQ/cryniAstab复合启动子(P16)的构建如下。用 I)raIII和Ecl13611消化质粒pNBT31 。利用Sfil消化质粒pNBT24 (pI)G268MCSAneo-Prshort'.共有长crylIIAstab/SAV ， 美国专利No.6,255,076 )，利用T4DNA聚合酶I使末端变钝，然后用DraIII进行消化。利 用0.5XTBE缓沖液，在0.8%琼脂糖凝胶上分辨消化物，依照厂家的说明利 用QIAquick DNA抽提试剂盒从凝胶中纯化来自pNBT31的大些的载体片段 和来自pNBT24的较小启动子片段(大约U00bp)。利用T4 DNA连接酶将 两个纯化的片段连接在一起，依照厂家的说明将连接的混合物转化到大肠 杆菌SURE⑧感受态细胞中。在每毫升补充有100ug氨千青霉素的2XYT琼 脂平板上选择转化体。依照厂家的说明，利用QIAGEN Bio Robot 9600从几 个转化体中纯化质粒DNA，用SfiI加SacI消化质粒DNA后，再利用0.5XTBE 緩冲液，在0.8。/。琼脂糖凝胶上进行分析。通过存在大约1400bp的Sfil/Sacl 片段鉴定出正确质粒，并将其命名为pNBT33 (图8 )。
用Avail和Ecll36H消化质粒pNBT33。用Notl消化质粒pMRT074( WO 03/054163 )，利用T4DNA聚合酶使末端变钝，然后用Avail进行消化。利 用0.5XTI犯緩冲液，在0.8%琼脂糖凝胶上分辨消化物，依照厂家的说明利 用QIAquick DNA抽提试剂盒从凝胶中纯化来自pMRT074的大些的栽体片 段(大约4433bp)和来自pNBT30的较小片段(大约1157bp)。利用T4 DNA 连接酶将两个纯化的片段连接在一起，将连接的混合物转化到枯草芽孢杆 菌168A4中。在28。C孵育24-48小时后，在每毫升补充有lug红霉素和25ug 林可霉素的TBAB-琼脂平板上选择转化体。依照厂家的说明，利用QIAGEN tip-20柱子从几个转化体中分离质粒DNA，通过用BamHI力口 HindIII消化质 粒进行验证。产生的质粒被命名为pMDT006 (图9)。
通过电穿孔将质粒pMDT006引入地衣芽孢杆菌MaTa3。分离红霉素抗 药性转化体，按照实施例1的描述整合质粒并从染色体中切除质粒，其中 导致用P16启动子替换P12串联启动子产生地衣芽孢杆菌菌抹MDT216。 地衣芽孢杆菌MDT216基本上是地衣芽孢杆菌MDT206的利福平敏感型式 (参见实施例6)。利用引物94-935和94-919 (上述的)，通过PCR分析鉴 定想要的克隆。
用Sfil和EcoRI消化质粒pWWi005 (实施例2 )以除去位于amyL基因 上游的DNA序列。用T4DNA聚合酶使末端钝化，在0.8%琼脂糖凝胶上利 用0.5XTBE缓冲液分辨片段。依照厂家的说明利用QIAquick DNA抽提试 剂盒从凝胶中纯化大些的载体片段(大约5069bp)。利用T4DNA连接酶将 纯化的片段连接在一起，将连接的混合物转化到枯草芽孢杆菌168A4中。 在28。C孵育24-48小时后，在每毫升补充有lug红霉素和25ug林可霉素的
40TBAB-琼脂平板上选择转化体。依照厂家的说明，利用QIAGENtip-20柱子 从几个转化体中分离质粒DNA，通过用BamHI加HindIII消化质粒进行验 证。产生的质粒被命名为pMDT007 (图10)。
通过电穿孔将质粒pMDT007 1入地衣芽孢杆菌MDT216。分离红霉素 抗药性转化体，按照实施例1的描述整合质粒并从染色体中切除质粒，导 致P16启动子转换成PramyL4l99/Prsh。rt"M"amyQ/PrcryII1A/cryIIIAstab三联的串联启 动子(P17)产生地衣芽孢杆菌菌林MDT217。利用如上所述的引物94-935 和94-919，通过PCR分析鉴定想要的克隆。
实施例4 :地衣芽孢杆菌MDT217的C-组件蛋白酶被删除的衍生物--地衣芽孢杆菌MDT220的构建
通过按照如下所述的方法删除地衣芽孢杆菌MDT217 (实施例3)的 C-组件(component)蛋白酶基因构建地衣芽孢杆菌MDT220，地衣芽孢杆 菌M[〕T220是包含在P17三联串联启动子控制下的amyL基因(登记号 M13256 )的C-组件阴性菌抹。
利用SOE ( Horton et al.， 1989，上文)，通过PCR构建编码地衣芽孢杆菌 C-组件蛋白酶的基因被删除的型式(美国专利No.5,459,064，登记no.D 10060, Kakudo et al.，992, J. Biol. Chem. 267: 23782 )。利用显示如下的扩增5'C-组 件片段的？ 1物991173 (插入5'EcoRI限制性内切位点)和引物991174 ，以 及扩增3'C-组件片段的引物991175和991176(插入3'HindIII限制性内切位 点)，通过PCR扩增C-组件基因的5'和3'区。
引物991173 :
5'-GAATTCGACGGCTTCCCGTGCGCC-3' ( SEQ ID NO : 53 ) 引物991174 :
5'-GCAAGCGAGCACGGATTGTAAGTACAAGTTAGATA-3' ( SEQ ID NO : 54 )
引物991175 :
5'-AACTTGTACTTACAATCCGTGCTCGCTTGCCGTAC-3' ( SEQ ID NO : 55 )
引物991176 :
5'-AAGCTTCCATTCAAACCTGGTGAGGAAG匿3' ( SEQ ID NO : 56 ) 在由50ng地衣芽孢杆菌SJ1904染色体DNA (按照上文Pitcher et al.，1989的描述获取)，扩增5'C-组件片段的991173和991174引物对或扩增3' C-组件片段的引物对991175和991176中的每种引物各0.4 uM， dATP、 dCTP、 dGTP和dTTP各200 uM,具有2.5 mM MgCl2的IX PCR Buffer II 和2.5单位AmpliTaq GoldTMDNA聚合酶组成的30ul反应中进行一式三份的 PCR扩增。在RoboCycler 40热循环仪中进行反应，反应程序为95 °C 9分钟， 1个循环;95。Cl分钟,52。Cl分钟，72。Cl分钟，3个循环;95。Cl分钟， 55°C1分钟，72"C1分钟，27个循环；和72°C5分钟，1个循环。用0.5XTBE 缓冲液，在0.8%琼脂糖凝胶上目测检验PCR产物。预期片段的大小是大 约2卯bp。
依照Horton et al., 1989的描述，利用引物对991173和991176 产生最后的SOE片段，并利用TA-TOPO克隆试剂盒将片段克隆到pCR2.1 中。在37。C孵育16小时之后，在每毫升补充有100ug氨苄青霉素的2XYT 琼脂平板上选择转化体。依照广家的说明，利用QIAGENtip-20柱子从几个 转化体中分离质粒DNA，利用M13 (-20)正向引物和M]3反向引物通过 DNA测序进行验证。包含SOE片段的质粒被命名为(图11 )。
用EcoRI和HindIII消化质粒pCJ791 ( WO 03/054163 )和pNBT37。 利 用0.5XTBE緩冲液，在0.8%琼脂糖凝胶上分辨消化物，依照厂家的说明利 用QIAquick DNA抽提试剂盒从凝胶中纯化来自pCJ791的大些的载体片段 (大约4340bp )和来自pNBT37的较小的C-组件删除片段(大约580bp )。 利用T4 DNA连接酶将两个纯化的片段连接在一起，将连接的混合物转化 到枯草芽孢杆菌168A4中。在28。C孵育24-48小时后，在每毫升补充有lug 红霉素和25ug林可霉素的TBAB-琼脂平板上选择转化体。依照厂家的说明， 利用QIAGEN tip-20柱子从几个转化体中分离质粒DNA，通过用EcoRI加 HindIII消化和琼脂糖凝胶电泳进行验证。鉴定出产生大小为大约4340bp和 大约580bp的预期片段的质粒，并将其命名为pNBT38 (图12 )。
通过电穿孔将质粒pNBT38引入地衣芽孢杆菌MDT217。分离红霉素抗 药性转化体，按照实施例1的描述整合质粒并从染色体中切除质粒。依照 上文Pitcher etal.， 1989的描述从几个转化体中分离染色体DNA，利用如上 所述的引物991173和991176通过PCR分析染色体DNA以鉴定C-组件删 除菌林。鉴定出产生大约580bp的预期大小的PCR片段的几个转化体，大 约580bp的PCR片段证实C-组件基因部分缺失。选择一个这样的转化体， 并将其命名为MDT220。实施例5 :构建质粒pTH012
利用下列引物，通过PCR从芽孢杆菌JP170的染色体DNA扩增编码芽 孢杆菌JP170碱性蛋白酶的基因(WO 98/56927和美国专利No. 5891701， 登记号AR069954 )。
引物992843 :
5'-CGAGCTCGATGTGTTATAAATTGAGAGGAG-3' (SEQ ID NO : 57) 引物961252 :
5，-GCGGCCGCGTCATAAACGTTGCAATCGTGCTC-3' (SEQ ID NO :
58)
在由50ng芽孢杆菌JP170染色体DNA(按照上文Pitcher et al., 1989的 描述获取)，引物992843和961252各0.4 uM, dATP、 dCTP、 dGTP和dTTP 各200 uM,具有2.5 mM MgCl2的IX PCR Buffer II和2.5单位Ampl汀aq Gold DNA聚合酶组成的50ul反应中进行一式三份的PCR扩增。在 RoboCycler 40热循环仪中进行反应，反应程序为95°C9分钟，1个循环； 95t:i分钟，55。Cl分钟，30循环；72。Cl分钟，30个循环；和72°C5分钟， 1个循环。用0.5XTBE緩冲液，在0.8%琼脂糖凝胶上目测检验PCR产物。 预期片段是大约2163bp。
利用TA-T()PO克隆试剂盒将2163bp的PCR片段克隆到pCR2.1中， 并依照厂家的说明将其转化到大肠杆菌OneShot 感受态细胞中。37°C在每 毫升补充有100ug氨苄青霉素的2XYT琼脂平板上生长16小时之后进行转 化体选择。依照广家的说明，利用QIAGENBio Robot 9600从几个转化体中 纯化质粒DNA，用Sm力口 Notl消化质粒DNA后，再利用0.5XTBE纟爰冲液， 在0.8%琼脂糖凝胶上进行分析。鉴定具有正确大小插入物的质粒，利用 M13 (-20)正向引物和M13反向引物及下面的内在引物通过DNA测序确 认插入物的DNA序列。鉴定具有正确序列的质粒，并将其命名为pNBT39 (图13 )。
引物992843 :
5'-CGAGCTCGATGTGTTATAAATTGAGAGGAG-3' ( SEQ ID NO : 59 ) 引物961021 :
5,-GTCGAATATGATGGGGATG-3' ( SEQ ID NO : 60 ) 引物960898 :
5，-GGACAAGGACAGATTGTAGCAGTTGCTGATACTGG-3' ( SEQ IDNO : 61 )
引物961048 :
5，-GCGATTACAGTTGGGGCAACCG-3' ( SEQ ID NO : 62 )
引物961222 :
5'-GGTAGCACGACGGCATCACTAAC-3' ( SEQ ID NO : 63 ) 按照如下步骤构建质粒pMRT077 (图19)。分别利用显示如下的引物
对733-45-1和733-45-7，以及引物对757-19-1和733-45-6通过SOE将amyL
基因的上游区和3'区融合。 引物733-45-1 :
5，画GTCCTTCTTGGTACCTGGAAGCAGAGC-3' ( SEQ ID NO : 64 ) 引物733-45-7 :
65 )
引 物
CATGGGATCCGCGG CCGCACAAGGGAAGGC-3' ( SEQ ID NO : 66 ) 引物733-45-6 :
5，-CAATTCATCCTCTAGAGTCTCAGG-3' ( SEQ ID NO : 67 ) 在由lngpDN1981DNA(美国专利No. 5，698，415 )，每个引物各0.4 uM， dATP、 dCTI)、 dGTP和dTTP各200 uM,具有2.5 mM MgCl2的1X PCR Buffer II和2.5单位AmpliTaq Gold DNA聚合酶组成的50ul反应中进行PCR扩 增。在RoboCycler 40热循环仪中进行反应，反应程序为95°C10分钟，1 个循环；95°C1分钟，50°C1分钟，25循环；72°C1分钟，25个循环；和 72。C7分钟，1个循环。利用0.5XTBE缓冲液，通过在0.8%琼脂糖凝胶上 的电泳目测检验PCR产物。预期片段分别是大约600和500bp。利用引物 733-45-1和733-45-6扩增最后的片段。利用TA-TOPO克隆试剂盒将最后的 片段克隆到pCR2.1载体中。在每毫升补充有100ug氨苄青霉素的2XYT琼 脂平板上选择转化体，并在37。C孵育16小时。利用M13正反向引物通过 DNA测序验证携带正确质粒的转化体。该质粒被命名为pMRT040(图14)。 用Kpnl/Xbal消化质粒pM謂40,并用Klenow片段补平(filled in)，然 后依照厂家的说明利用QIAquick DNA抽提试剂盒从0.8%琼脂糖-0.5XTBE 凝胶中分离大约1000bp的片段。将该片段克隆到用EcoRV消化的pShV3
44(WO 03/054163 )中,并依照厂家的说明将其转化到大肠杆菌XLlBlue细 胞中(Stratagene， Inc., La Jolla， CA )。在每毫升补充有lOOug氨千青霉素的 2XYT琼脂平板上选择转化体，并在37。C孵育16小时。依照厂家的说明， 利用QIAGEN tip-20柱子从几个转化体中分离质粒DNA，通过用SacI/SphI 的限制性分析在利用0.5XTBE緩冲液的0.8。/。的琼脂糖凝胶上验证质粒 DNA。产生的质粒^皮命名为pMRT044 (图15 )。
用 Sacl力。Hindlll消化质粒pMRT044和 pNBT3
(pDG268MCSAneo-Prc,.yI Astab/SAV ，美国专利No. 6,255,076 )。利用 0.5XTBE緩冲液，在0.8%琼脂糖凝胶上分辨消化物，依照厂家的说明利用 Ql Aquick DNA抽提试剂盒从凝胶中纯化来自pMRT044的大些的载体片段
(大约7500bp )和来自pNBT3的较小的cryIIIA的稳定片段(大约540bp )。 利用T4 DNA聚合酶将两个纯化的片段连接惯转化一起，依照厂家的说明 将连接的混合物用于转化大肠杆菌XLlBlue细胞。在每毫升补充有lOOug 氨苄青霉素的2XYT琼脂平板上选择转化体，并在37。C孵育16小时。依照 广家的说明，利用QIAGEN tip-20柱子从几个转化体中分离质粒DNA，通 过用Sacl/Hind川的限制性分析在利用0.5XTBE緩沖液的0.8%的琼脂糖凝 胶上验证质粒DNA。产生的质粒被命名为pMRT070 (图16)。
用EcoRI/Hindlll消化质粒pMRT074 ( WO 03/054163 )和pMR丁070。 依照厂家的说明，利用0.5XTBE緩冲液和QIAquick DNA纯化试剂盒从0.8% 琼脂糖凝胶中分离来自pMRT074的大约3500bp的片段和来自pMRT070的 大约1100bp的片段，连接分离的片段，并将他们转化到枯草芽孢杆菌168A4 感受态细胞中。在每毫升补充有lug红霉素和25ug林可霉素的TBAB-琼脂 平板上选择转化体，并在30。C孵育24-48小时。依照厂家的说明，利用 QIAGEN tip-20柱子从几个转化体中分离质粒DNA，通过用EcoRI/Hindlll 的限制性分析在0.8%的琼脂糖凝胶上利用0.5XTBE緩沖液验证质粒DNA。 产生的质粒被命名为pMRT075 (图17)。
用Sacl力。Notl消化质粒pMRT075和pNBT40 (图18 )。质粒pNBT40 基本上是包含编码来自解淀粉芽孢杆菌的中性蛋白酶的基因(叩r [BamP]) 的pCR2.卜TOPO栽体(Vasantha et al.， 1984， J. Bacteriol. 159: 811， accession no. K02497 )。依照厂家的说明，利用0.5XTBE緩冲液和QIAquick DNA纯 化试剂盒从0.8%琼脂糖凝胶中分离来自pMRT075的大约5500bp的片段和 来自pNBT40的大约1600bp的片段，连接分离的片段，并将他们转化到枯草芽孢杆菌168A4感受态细胞中。在每毫升补充有1%的脱脂乳，lug红霉
素和lug林可霉素的TBAB-琼脂平板上选择转化体，并在30。C孵育24-48 小时。获取在TBAB-琼脂脱脂乳平皿上产生清晰区带的转化体，产生的质 粒被命名为pMRT077 (图19 )。
用Sacl加Notl消化质粒pNBT39和pMRT077。利用0.5XTBE緩沖液， 在0.8%琼脂糖凝胶上分辨消化物，依照厂家的说明利用QIAquick DNA抽 提试剂盒从凝胶中纯化来自pMRT077的大些的载体片段(大约5400bp)和 来自pNBT39的较小的JP170蛋白酶片段(大约2163bp)。利用T4DNA连 接酶将两个纯化的片段连接在一起，将连接的混合物转化到枯草芽孢杆菌 ]68A4感受态细胞中。依照厂家的说明，利用QIAGENtip-20柱子从几个转 化体中纯化质粒DNA，用Sacl力口 Notl消化质粒DNA后，再利用0.5XTBE 緩冲液，在0.8%琼脂糖凝胶上进行分析。通过存在大约2163的SfiI/Notl JP170片段鉴定出正确质粒，并将其命名为pTH012 (图20)。
实施例 6:在amyL位点包含一个拷贝的P17启动子/sc hasA/tuaD/gtaB表达盒的地衣芽孢杆菌菌抹TH15的构建
质粒pMB748包含融合到地衣芽孢杆菌amyL基因的amyL信号序列上 的来自芽孢杆菌属I633 (WO 99/64619 )的甘露聚糖酶基因的成熟部分。利 用显示如下的引物对80501D1B11和172965，以质粒pMB748作为模板 l)NA，通过删除甘露聚糖酶基因的3'部分构建该基因的截短型式。在由50ng pMB748 DNA，引物80501D1B11和172965各0.4 uM, dATP、 dCTP、 dGTP 和dTTP各200 uM,具有2.5 mM MgCl2的50X PCR Buffer II和2.5单位 AmpliTaq Gold DNA聚合酶组成的50ul反应中进行PCR扩增。在 RoboCycler 40热循环4义中完成反应，反应程序为95。C9分钟，1个循环； 95"C]分钟，55°C1分钟，30循环;72°C1分钟，30个循环;和72°C5分钟， 1个循环。用0.5XTBE緩冲液，在0.8%琼脂糖凝胶上目测检验大约900bp 的PCR产物。
引物80501dlbl1 :
(SEQ ID NO : 68 ) 引物172965 :AAG-3' ( SEQ ID NO : 69 )
PCR片段被克隆到用SacII和NotI消化的质粒pMOL944( WO 99/64619 )
中。依照厂家的说明，利用QIAquick DNA纯化试剂盒从0.8%琼脂糖 -0.5XTBE凝胶中分离质粒载体片段和amyL/甘露聚糖酶PCR片段，连接分 离的片段，并将他们转化到枯草芽孢杆菌菌抹PL2306 (美国专利 No.6,677,147 )中，在每毫升补充有lOug卡那霉素的TBAB平皿上选4奪卡 那霉素抗性菌抹。依照厂家的说明，利用QIAprep Spin Miniprep试剂盒 (QIAGEN Inc., Valencia, CA )从几个转化体纯化质粒。通过限制性内切酶 消化分析质粒。鉴定包含正确插入物的质粒，并将其命名为pMB1024-l (图 21 )。
枯草芽孢杆菌MDT206的构建如下。通过电穿孔将质粒pMDT006 (实 施例3)引入地衣芽孢杆菌MaTa4。分离红霉素抗性转化体，按照实施例l 的描述整合质粒并从染色体中切除质粒，导致用P16启动子替换P11启动 子产生地衣芽孢杆菌菌抹MDT206。利用引物94-935 (上述的)和下列引 物，通过PCR分析鉴定想要的克隆。
引物94-919 :
5-GGAAGTACAAAAATAAGC-3' ( SEQ ID NO : 70 )
按照如下步骤从地衣芽孢杆菌菌抹MDT206 PCR扩增和克隆cryIIIA mRNA处理稳定序列和amyL信号序列。在由50ng地衣芽孢杆菌MDT206 染色体DNA (按照上文Pitcher et al., 1989的描述获取)，226370和219916 引物各0.4 uM， dATP、 dCTP、 dGTP和dTTP各200 uM，具有2.5 mM MgCl2 的IX PCR Buffer II和2.5单位AmpliTaq Gold DNA聚合酶组成的50ul反 应中进行PCR扩增。在RoboCycler 40热循环仪中进行反应，反应程序为 95。C9分钟，1个循环；95。Cl分钟，55。Cl分钟，30循环；72。Cl分钟， 30个循环；和72。C5分钟，1个循环。用0.5XTBE緩冲液，在0.8%琼脂 糖凝胶上目测检验大约650bp的PCR产物。
引物226370 :
(SEQ ID NO : 71 ) 引物219916 :
5，-TGCCGCGGCTGCAGAATGAGGCAG-3' ( SEQ ID NO : 72 )
用Xmal和Pstl消化质粒pMB 1024-1和crylIIA/amyL信号序列的PCR片段。依照厂家的说明，利用QIAquick DNA纯化试剂盒从0.8%琼脂糖 -0.5XTBE凝胶中分离来自pMB1024-l的大些的载体片段(大约5500bp ) 和amyL信号序列的PCR片段(大约650bp )，连接分离的片段，并将他们 转化到枯草芽孢杆菌菌抹MOL2023中，在每毫升补充有10ug卡那霉素的 TBAB平皿上选择卡那霉素抗性。该菌抹基本上是具有来自质粒pE194 (Horin()uchi and Weisblum， 1982, J. Bacteriol. 150 : 804 - 814 )的红霉素抗性 基因的枯草芽孢杆菌A164A10,其中质粒pE194被插入ydhT基因(编码甘 露糖内-1,4-p-甘露糖苷酶)中。枯草芽孢杆菌A164A10源自于枯草芽孢杆 菌A164A5 (美国专利No.5,891,701 )，而且在下列基因spoIIAC、 aprE、 nprE、 amyE、 srfAC、 wprA、 bpr、 vpr、 mpr和epr中有缺失。依月 、厂家的 说明，利用QIAprcp Spin Miniprep试剂盒从几个转化体纯化质粒，并通过 限制性内切酶消化进行分析。鉴定出包含正确插入物的质粒，并将其命名 为pMB1242 (图22 )。
利用显示如下的引物993634和引物733-68-1 (实施例1 ),通过PCR 从pMB1242扩增RBS和甘露聚糖酶基因。
引物993634 :
5'-GTT八ACTTGAAAAACGGTGCTTAATC-3' ( SEQ ID NO : 73 ) 在由50ngpMB1242,引物993634和733-68-1各0.4uM， dATP、 dCTP、 dGTP和dTTI)各200 uM，具有2.5 mM MgCl2的50X PCR Buffer II和2,5 单位AmpliTaq Gold DNA聚合酶组成的50ul反应中进行一式三份的PCR 扩增。在RoboCycler 40热循环仪中A进行反应，反应程序为95°C9分钟， 1个循环；95。Cl分钟，55。Cl分钟，30循环；72。Cl分钟，30个循环；和 72"C5分钟，1个循环。利用0.5XTBE緩冲液，在0.8%琼脂糖凝胶上目测 检验PCR产物。预期片段是大约1052 bp。
利用TA-TOPO克隆试剂盒将1052bp的PCR片段克隆到pCR2.1中， 并依照厂家的说明将其转化到大肠杆菌OneShot 感受态细胞中。37°C在每 毫升补充有100ug氨苄青霉素的2XYT琼脂平板上生长16小时之后进行转 化体选择。依照厂家的说明，利用QIAGEN Bio Robot 9600从这些转化体中 纯化质粒DNA,用Sfil加Notl消化质粒DNA。鉴定质粒，利用M13 (-20 ) 正向和M13反向引物通过DNA测序确i^插入物的DNA序列。鉴定具有正 确序列的质粒，并将其命名为pTH029 (图23 )。接下来，按照下列步骤将甘露聚糖酶基因作为Sacl/Hpal片段克隆到 pNBT18 ( pDG268MCSAneo-长crylIIAstab/SAV,美国专利No.6,255,076 ) 中替换aprH编码区。用Sacl加Hpal消化质粒pTH029。用Sacl加Hpal消 化质粒pNBT18。利用0.5XTBE緩沖液，在0.8%琼脂糖凝胶上分辨消化物， 依照厂家的说明利用QIAquick DNA抽提试剂盒从凝胶中纯化来自pNBT18 的大些的载体片段(大约7330bp)和来自pTH029的较小的甘露聚糖酶基 因片段(大约1010bp)。利用T4DNA连接酶将两个纯化的片段连接在一起， 依照厂家的说明将连接的混合物转化到大肠杆菌OneShot 感受态细胞中。 37i:在每毫升补充有100ug氨千青霉素的2XYT琼脂平板上生长16小时之 后进行转化体选择。依照厂家的说明，利用QIAGEN自动机从这些转化体 纯化质粒DNA。通过存在大约1095bp的Sfil/Notl甘露聚糖酶基因片段鉴 定出正确的质粒，并将其命名为pTH026 (图24 )。
然后，按照如下步骤将甘露聚糖酶基因和来自pTH026的aprH基因终 止子作为SacI/Notl片段插入pTH012中替换JP170蛋白酶基因。用Sacl和 Not消化质粒pTH012和pTH026。利用0.5XTBE緩冲液，在0.8%琼脂糖 凝胶上分辨消化物，依照厂家的说明利用QIAquick DNA抽提试剂盒从凝胶 中纯化来自pTH012的大些的载体片段(大约5359bp )和来自pTH026的较 小的甘露聚糖酶基因片段(大约1095bp)。利用T4DNA连接酶将两个纯化 的片段连接在一起，将连接的混合物转化到枯草芽孢杆菌168A4中。依照 厂家的说明，利用QIAGEN tip-20柱子从几个转化体中纯化质粒DNA，用 Sacl力。Notl消化质粒DNA后，再利用0.5XTBE緩沖液，在0.8%琼脂糖凝 胶上进行分析。通过存在大约1095的Sfil/Notl甘露聚糖酶基因片段(该片 段携带有amyL RBS， amyL信号序列-甘露聚糖酶编码序列融合物和aprH 终止子，在下文中被称为"甘露聚糖酶基因")鉴定出正确的质粒。产生的质 粒被命名为pTH013 (图25 )。
构建质粒pTH020，将包含类马链球菌类透明质酸合酶基因(hasA)的 人工透明质酸(HA)操纵子引入在P17三联启动子控制下的地衣芽孢杆菌 MDT220的染色体中。按照如下步骤将来自pHA3 ( WO 03/054163 )的 crylIIAstab/hasA/tuaD/gtaB人工操纵子作为SacI/Notl片段插入质粒pTH013 中替换甘露聚糖酶基因。用Sacl和Notl消化质粒pTH013和pHA3。利用 ().5XTBE緩冲液，在0.8。/。琼脂糖凝胶上分辨消化物，依照厂家的说明利用QIAquick DNA抽提试剂盒从凝胶中纯化来自pTH013的大些的载体片段 (大约5400bp )和来自pHA3的较小的crylIIAstab/hasA/tuaD/gtaB人工操纵 子片段(大约3800bp)。利用T4DNA连接酶将两个纯化的片段连接在一起， 将连接的混合物转化到枯草芽孢杆菌168A4中。依照厂家的说明，利用 QIAGENtip-20柱子从几个转化体中纯化质粒DNA，用SacI加NotI消化质 粒DNA后，再利用0.5XTBE緩冲液，在0.8%琼脂糖凝胶上进行分析。通 过限制性内切酶消化和/或PCR分析鉴定正确的质粒。产生的质粒被命名为 p'ITI020 (图26 )。
通过电穿孔将质粒pTH020引入地衣芽孢杆菌MDT220。分离红霉素抗 性转化体，按照实施例1的描述整合质粒并从染色体中切除质粒。从几个 转化体分离染色体DNA(上文，Pitcher etal., 1989 )，并通过PCR进行分析。 利用引物992463和992468 ( hasA基因)、引物992464和992472 (tuaD基 因)，以及引物992471和992477 ( gtaB基因)完成PCR核对。在I-IA操纵 子被整合到染色体之后，鉴定最后的菌抹是蛋白酶阴性和红霉素敏感菌抹， 利用相同的引物再次确认存在的操纵子。选择一个这样的转化体，并将其 命名为地衣芽孢杆菌TH15 。
实施例7 :地衣芽孢杆菌TH15的发酵
在两升的发酵罐(Applikon, Inc., Holland)中评估地衣芽孢杆菌THl5 生产透明质酸(HA)的情况，pH控制在7.0土0.2，培养基由每升6.5gKH2P04、 4.5gNa2HP04、 3.0g(NH4)2SO4、 2.0g柠檬酸钠、3.0g MgS04.7H20、 15g蔗 糖、0.5g CaCl2.2H20、 6.0ml微量金属溶液(组成见下文)和3.0ml消泡 剂组成。补料(feed)由20% (w/w)蔗糖组成。微量金属溶液由每升lOOg 柠檬酸、20gFeSO4'7H2O、 5gMnS04.H20、 2g CuS04'5H20和2g ZnCl2组成。 在48小时发酵期间，温度控制在37°C。最大气流和搅动速度分别是1.5 vvm 和1300 rpm。
显示在图27中的结果表明了 p17三联启动子在地衣芽孢杆菌TH15中 驱动hasA/tuaD/gtaB操纵子表达产生HA的能力。
本发明在这里描述和要求保护的内容并不限于这里公开的特定方案的 范围，因为这些方案只是用于解释说明本发明的几个方面。规定任何等效方案都在本发明的范围内。实际上，在上述内容的基础上，这里显示和描 述的方案之外的本发明的各种修饰对本领域熟练技术人员来说是很明显 的。这种修饰也在附加的权利要求的范围内。在发生矛盾时，本发明中包 含定义的公开内容将起调控作用。
权利要求
1. 生产透明质酸的方法，包括(a)在有助于生产透明质酸的培养基中培养芽孢杆菌细胞，其中芽孢杆菌细胞包含含有三联启动子的核酸构建体，三联启动子包含具有对应于SEQ ID NO1的位置590的突变的变体amyL启动子，”-35”区域具有TTGACA序列和”-10”区域具有TATAAT序列的共有启动子和cryIIIA启动子，其中三联启动子的每个启动子序列可操作地与一个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列相连；和(b)从培养基中分离透明质酸。
2. 权利要求l的方法，其中变体amyL启动子是SEQIDNO: 1。
3. 权利要求l的方法，其中共有启动子是从任何细菌启动子获得的。
4. 权利要求1的方法，其中共有启动子是从芽孢杆菌启动子获得的。
5. 权利要求1的方法，其中共有启动子是从由大肠杆菌/oc操纵子、天蓝 色链霉菌琼脂糖酶基因(&gA)、迟緩芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(，rH)、 地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(枯草杆菌蛋白酶Carlsberg基因)、枯草芽孢 杆菌果聚糖蔗糖酶基因"flcB)、枯草芽孢杆菌a-淀粉酶基因(am少E)、地 衣芽孢杆菌oc-淀粉酶基因("w.VL)、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(aw少M)、解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶 基因(戸nP )、枯草芽孢杆菌j^/A和xy/B基因、苏云金芽孢杆菌亚种tenebrionis cry〃/A基因或其部分，或者原核生物的P-内酰胺酶基因获得的启动子中得到 的。
6. 权利要求l的方法，其中共有启动子是从解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶基 因(，Q)中获得的。
7. 权利要求6的方法，其中共有amyQ启动子具有SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 43的核芬酸序列。
8. 权利要求7的方法，其中共有amyQ启动子具有SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 43的核苷酸86-185的核苦酸序列。
9. 权利要求1的方法，其中cr_y///A启动子是从苏云金芽孢杆菌亚种 tenebrionis获4寻的。
10. 权利要求l的方法，其中核酸构建体更进一步地包含位于三联启 动子下游和 一 个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列上游的mRN A加工/稳定序列。
11. 权利要求10的方法，其中mRNA加工/稳定序列是crylIIAmRNA加工/稳定序列。
12. 权利要求10的方法，其中mRNA加工/稳定序列是SP82 mRNA加工/稳定序列。
13. 权利要求l的方法，其中芽孢杆菌细胞包含一个或多个拷贝的核酸构建体。
14. 权利要求l的方法，其中芽孢杆菌细胞包含一个拷贝的核酸构建体。
15. 权利要求l的方法，其中核酸构建体更进一步地包含可选择的标记基因。
16. 权利要求l的方法，其中芽孢杆菌细胞不包含外来的可选择标记基因。
17. 权利要求l的方法，其中涉及透明质酸生物合成的一个或多个编 码序列选自由类透明质酸合酶、UDP-葡萄糖6-脱氢酶、UDP-葡萄糖焦磷酸 化酶、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、己糖激酶、 葡糖磷酸变位酶、酰胺转移酶、变位酶和乙酰转移酶基因组成的群组。
18. 权利要求l的方法，其中核酸构建体包含在芽孢杆菌细胞的染色 体中。
19. 权利要求l的方法，其中核酸构建体包含在染色体外元件中。
20. 权利要求l的方法，其中芽孢杆菌属宿主细胞是嗜碱芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌细胞、凝 结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟緩芽孢杆菌、地衣芽孢杆 菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或 苏云金杆菌细胞。
21. 权利要求l的方法，其中芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌细胞。
22. 权利要求l的方法，其中芽孢杆菌细胞是地衣芽孢杆菌细胞。
23. 包含核酸构建体的芽孢杆菌细胞，其中核酸构建体含有(a)包 含具有对应于SEQ ID NO : 1的位置5卯的突变的变体aw^L启动子，"-35"区 域具有TTGACA序列和，，-10"区域具有TATAAT序列的共有启动子和"丁///八 启动子的三联启动子，其中三联启动子的每个启动子序列可操作地与一个 或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列相连，和任选地(b)位于三联启动子下游和一个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列的上游的mRNA加工/稳定序列。
24. 权利要求23的芽孢杆菌细胞，其中变体amyL启动子是SEQIDNO:1。
25. 权利要求23的芽孢杆菌细胞，其中共有启动子是从任何细菌启动 子获得的。
26. 权利要求23的芽孢杆菌细胞，其中共有启动子是从芽孢杆菌属启动子获得的。
27. 权利要求23的芽孢杆菌细胞，其中共有启动子是从由大肠杆菌lac 操纵子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、迟緩芽孢杆菌碱性蛋白酶基 因(aprH )、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(枯草杆菌蛋白酶Carlsberg基因)、 枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌a-淀粉酶基因(amyE)、地衣芽孢杆菌a-淀粉酶基因(amyL )、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽 糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶基因(amyQ )、地衣芽孢 杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xy旧基因、苏云金杆菌亚 种tenebrionisci'yniA基因或其部分，或者原核生物的(3-内酰胺酶基因获得的 启动子中得到的。
28. 权利要求23的芽孢杆菌细胞，其中共有启动子是从解淀粉芽孢杆 菌a-淀粉酶基因(am少Q)中获得的。
29. 权利要求28的芽孢杆菌细胞，其中共有a/7^Q启动子具有SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 43的核苦酸序列。
30. 权利要求29的芽孢杆菌细胞，其中共有am少Q启动子具有SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 43的核苦酸86-185的核苷酸序列。
31. 权利要求23的方法，其中co^/A启动子是从苏云金杆菌亚种 tenebrionisl^寻的。
32. 权利要求23的芽孢杆菌细胞，其中核酸构建体更进一步地包含位 于三联启动子下游和一个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列上游的 mRNA加工/稳定序列。
33. 权利要求32的芽孢杆菌细胞，其中mRNA加工/稳定序列是crylIIA mRNA加工/稳定序列。
34. 权利要求32的芽孢杆菌细胞，其中mRNA加工/稳定序列是SP82 mRNA加工/稳定序列。
35. 权利要求23的芽孢杆菌细胞，其中芽孢杆菌细胞包含一个或多个拷贝的核酸构建体。
36. 权利要求23的芽孢杆菌细胞，其中芽孢杆菌细胞包含一个拷贝的核酸构建体。
37. 权利要求23的芽孢杆菌细胞，其中核酸构建体更进一步地包含可 选择的标记基因。
38. 权利要求23的芽孢杆菌细胞，其中芽孢杆菌细胞不包含外来的可选择标记基因。
39. 权利要求23的芽孢杆菌细胞，其中涉及透明质酸生物合成的一个 或多个编码序列选自由类透明质酸合酶、UDP-葡萄糖6-脱氢酶、UDP-葡萄 糖焦磷酸化酶、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、己 糖激酶、葡糖磷酸变位酶、酰胺转移酶、变位酶和乙酰转移酶基因组成的群组。
40. 权利要求23的芽孢杆菌细胞，其中核酸构建体包含在芽孢杆菌细 胞的染色体中。
41. 权利要求23的芽孢杆菌细胞，其中核酸构建体包含在染色体外元件中。
42. 权利要求23的芽孢杆菌细胞，其中芽孢杆菌属宿主细胞是嗜碱芽 孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌 细胞、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、杣烂芽孢杆菌、迟緩芽孢杆菌、地 衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽 孢杆菌或苏云金杆菌细胞。
43. 权利要求23的芽孢杆菌细胞，其中芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌 细胞。
44. 权利要求23的芽孢杆菌细胞，其中芽孢杆菌细胞是地衣芽孢杆菌细胞。
45. 产生没有可选择标记的芽孢杆菌细胞突变体的方法，包括删除芽 孢杆菌细胞的可选择标记基因，其中芽孢杆菌细胞包含含有三联启动子的 核酸构建体，三联启动子包含具有对应于SEQIDNO: l的位置5卯的突变的 变体c,myL启动子，"-35"区域具有TTGACA序列和"-l0"区域具有TATAAT序 列的共有启动子和co;/〃A启动子，其中三联启动子的每个启动子序列可操 作地与一个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列相连。
46. 权利要求45的方法，其中变体amyL启动子是SEQIDNO: 1。
47. 权利要求45的方法，其中共有启动子是从任何细菌启动子获得的。
48. 权利要求45的方法，其中共有启动子是从芽孢杆菌启动子获得的。
49. 权利要求45的方法，其中共有启动子是从由大肠杆菌/ac操纵子、 天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(^gA )、迟緩芽孢杆菌碱性蛋白酶基因()、 地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(枯草杆菌蛋白酶Carlsberg基因)、枯草芽孢 杆菌果聚糖蔗糖酶基因(McB)、枯草芽孢杆菌(x-淀粉酶基因(flmj'E)、地 衣芽孢杆菌a-淀粉酶基因(am_yL)、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因("/w.vM)、解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶基因(awyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶 基因(pewP)、枯草芽孢杆菌矽/A和;^/B基因、苏云金杆菌亚种tenebrionis cryIIIA基因或其部分，或者原核生物的(3-内酰胺酶基因获得的启动子中得到 的。
50. 权利要求45的方法，其中共有启动子是从解淀粉芽孢杆菌oc-淀粉 酶基因(amyQ)中获得的。
51. 权利要求50的方法，其中共有awyQ启动子具有SEQ ID NO: 42或 SEQ ID NO: 43的核苦酸序列。
52. 权利要求51的方法，其中共有tw^Q启动子具有SEQ ID NO: 42或 SEQ ID NO: 43的核芬酸86-185的核苷酸序列。
53. 权利要求45的方法，其中c,'v〃/A启动子从苏云金杆菌亚种
54. 权利要求45的方法，其中核酸构建体更进一步地包含位于三联启 动子下游和 一 个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列上游的mRNA加工/稳定序列。
55. 权利要求54的方法，其中mRNA加工/稳定序列是co^/AmRNA加工/稳定序列。
56. 权利要求54的方法，其中mRNA加工/稳定序列是SP82 mRNA加工/稳定序列。
57. 权利要求45的方法，其中芽孢杆菌细胞包含一个或多个拷贝的核酸构建体。
58. 权利要求45的方法，其中芽孢杆菌细胞包含一个拷贝的核酸构建体。
59. 权利要求45的方法，其中核酸构建体更进一步地包含可选择的标记基因。
60. 权利要求45的方法，其中芽孢杆菌细胞不包含外来的可选择标记基因。
61. 权利要求45的方法，其中涉及透明质酸生物合成的一个或多个编 码序列是从由类透明质酸合酶、UDP-葡萄糖6-脱氢酶、UDP-葡萄糖焦磷酸 化酶、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、己糖激酶、 葡糖磷酸变位酶、酰胺转移酶、变位酶和乙酰转移酶基因组成的群组中选 择出来的。
62. 权利要求45的方法，其中核酸构建体包含在芽孢杆菌细胞的染色体中。
63. 权利要求45的方法，其中核酸构建体包含在染色体外元件中。
64. 权利要求45的方法，其中芽孢杆菌属宿主细胞是嗜碱芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌细胞、凝 结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟緩芽孢杆菌、地衣芽孢杆 菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或 苏云金杆菌细胞。
65. 权利要求45的方法，其中芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌细胞。
66. 权利要求45的方法，其中芽孢杆菌细胞是地衣芽孢杆菌细胞。
67. 通过权利要求45的方法获取的没有可选择标记的芽孢杆菌细胞突变体。
68. 获取芽孢杆菌属宿主细胞的方法，包括将包含三联启动子的核酸 构建体引入芽孢杆菌细胞，其中三联启动子包含具有对应于SEQ ID NO : 1 的位置590的突变的变体amyL启动子，"-35"区域具有TTGACA序列和"-10" 区域具有TATAAT序列的共有启动子和co;/Z/A启动子，其中三联启动子的每 个启动子序列可操作地与一个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列相 连。
69. 权利要求68的方法，其中核酸构建体更进一步地包含位于三联启 动子下游和 一 个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列上游的mRNA加
70. 权利要求69的方法，其中mRNA加工/稳定序列是crylIIAmRNA加工/稳定序列。
71. 权利要求69的方法，其中mRNA加工/稳定序列是SP82 mRNA加工/稳定序列。
72. 包含三联启动子的核酸构建体，其中三联启动子包含具有对应于 SEQ ID NO : 1的位置590的突变的变体am^L启动子，"-35'，区域具有 TTGACA序列和"-10"区域具有TATAAT序列的共有启动子和^少///八启动子， 其中三联启动子的每个启动子序列可操作地与一个或多个涉及透明质酸生 物合成的编码序列相连。
73. 权利要求72的核酸构建体，其中核酸构建体更进一步地包含位于 三联启动子下游和一个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列上游的 mRNA加工/稳定序列。
74. 权利要求73的核酸构建体，其中mRNA加工/稳定序列是c/^〃/A mRNA加工/稳定序列。
75. 权利要求73的核酸构建体，其中mRNA加工/稳定序列是SP82 mRNA加工/稳定序列。
全文摘要
本发明涉及生产透明质酸的方法，包括(a)在有助于生产透明质酸的培养基中培养芽孢杆菌宿主细胞，其中芽孢杆菌细胞包含含有三联启动子的核酸构建体，三联启动子包含具有对应于SEQ ID NO1的位置590的突变的变体amyL启动子，“-35”区域具有TTGACA序列和“-10”区域具有TATAAT序列的共有启动子和cryIIIA启动子，其中三联启动子的每个启动子序列可操作地与一个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列相连；和(b)从培养基中分离透明质酸。本发明也涉及包含核酸构建体的芽孢杆菌细胞，其中核酸构建体包含(i)含有具有对应于SEQ ID NO1的位置590的突变的变体amyL启动子，“-35”区域具有TTGACA序列和“-10”区域具有TATAAT序列的共有启动子和cryIIIA启动子的三联启动子，其中三联启动子的每个启动子序列可操作地与该个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列相连。
文档编号C12P19/26GK101426925SQ200580017663
公开日2009年5月6日 申请日期2005年3月31日 优先权日2004年3月31日
发明者威廉·威德纳, 玛丽亚·唐, 艾伦·斯洛马, 迈克尔·托马斯 申请人:诺维信生物聚合物公司