血细胞抗原基因分型的方法和用于血细胞抗原基因分型的试剂盒的制作方法

专利名称：血细胞抗原基因分型的方法和用于血细胞抗原基因分型的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及血细胞抗原基因分型领域，更具体地涉及对红细胞(血型抗原)、血小板(血小板抗原)和白细胞(白细胞抗原)上的抗原进行基因分型。
本发明提供了一种血细胞抗原基因分型的方法和用于血细胞抗原基因分型的试剂盒，并提供了用于血细胞抗原基因分型的引物组和探针组。
背景技术：
在将来自供者的血液或者血液成分，例如红细胞、血小板和白细胞施用于另一人(或者更宽泛而言，施用于另一个哺乳动物个体)时，如果供者血液或者血液成分与受者血液不完全匹配，就有可能出现严重的不良反应。熟知的有输血反应(血液凝集)，其发生于例如将来自A型血供者的血液给予B型血的人的时候(血型抗原A和B属于ABO系统)。如果将猕猴血型D(RhD)阳性供者的血液给予RhD阴性患者，则很可能形成同种抗体。RhD抗体将导致RhD阳性红细胞迅速破坏并引起输血反应。此外，如果具有红细胞或血小板抗体的妇女怀孕，这些抗体可穿过胎盘并可破坏未出生的孩子的红细胞或血小板。这可引起严重的溶血，导致贫血、黄疸(出生后)，且如果治疗不当可能是致命的或者引起脑损伤。因此，为了避免输血反应，当前采用的输血原则是仅输注ABO和RhD相匹配的红细胞。为了避免育龄妇女产生同种抗体以及在妊娠期间出现可能的并发症，因此仅给她们输注ABO、RhD和K1相匹配的红细胞。将来也可能给育龄妇女输注Rhc和RhE相匹配的红细胞。
不过，也存在各种其他血型抗原(红细胞抗原)，且如果将不匹配的供者血液输给具有同种抗体的受者，这些抗原也会引起严重的问题。血小板特异性抗原分型对患者的诊断和治疗十分重要，因为可出现不同的同种免疫性血小板减少综合征。如果妇女产生了抗血小板抗原的抗体(绝大多数情况下是1型人血小板抗原(HPA)抗体)且大多数在妊娠期间产生，这些抗体可在未出生的孩子引起致命的血小板破坏，出血倾向增加。在一些病例，这可导致颅内出血。为预防出血，需要输注HPA-1a阴性血小板。
输注血小板通常不预先进行供者和受者的血小板抗原[人类人血小板抗原(HPA)]配型。输注不相配的血液或者血液成分可导致产生同种抗体，对于那些需要频繁或者反复输注红细胞或血小板(或白细胞)的患者来说尤其如此。如果形成了多种同种抗体，或者如果同种抗体针对的是高频率抗原，那么寻找相适合的红细胞或血小板就成了一个问题。根据已经发表的研究(Seltsam et al.，2003)，在具有针对高频率抗原的抗体的住院患者中，大约有1/3的患者的输血支持治疗是不令人满意的。
测试血型抗原和抗体的经典方法通过血细胞凝集试验进行表型分型。这一血清学测试技术简单便宜，不过其费用和难度在需要进行多重分析以进行完全配型时将会增加，并且其需要有大量的特异性抗血清。仅在荷兰，血液供者的总数便有500,000人之众，且估计每年增加大约60,000名供者。对于红细胞，存在至少29种血型抗原系统(各具有许多不同的等位基因)。此外，其还涉及对高频率抗原和低频率抗原进行分型。与临床相关的血细胞抗原系统大约有60种。因此，对所有的血液供者进行完全的表型分型是一种昂贵、繁重、耗时的工作，并且由于缺乏足够的分型试剂，这也是不可行的。
绝大多数血细胞抗原系统的分子基础是已知的。绝大多数血型抗原、血小板抗原和中性粒细胞抗原是双等位基因，并且是单核苷酸多态性(SNP)的结果。这些SNP可用于进行基因分型。科技文献中公开了数不清的用于对血型和血小板抗原进行基因分型的基于DNA的测试方法，其中包括PCR-RFLP、等位基因特异性PCR、作为单一或者多重分析的序列特异性PCR、实时定量PCR、单核苷酸染料终止子延伸方法以及高通量珠技术(综述见Reid，2003)。采用质谱分光光度计或者热测序仪(pyrosequencer)的半定量方法也可用于基因分型。
例如，Randen et al.(2003)最近公开了采用LightCycler技术进行解链曲线分析对人血小板抗原1、2、3、4、5和Gov(最近被称为HPA-15，Metcalfe et al.，2003)进行基因分型的方法。疾病最经常涉及双等位基因系统HPA-1至5和Gov(Berry et al.，2000)，这使得它们成为基因分型的重要靶位。LightCycler技术涉及使用对每一种上述血小板抗原具有特异性的引物对，通过PCR扩增供者DNA的有关片段。使用荧光杂交探针和解链曲线分析能够实现在同一毛细管同时检测血小板抗原的两个等位基因，其不需要进行以往基因分型方法所使用的繁重而费时的凝胶电泳。
不过，与所有其他的已知的血细胞抗原基因分型方法一样，LightCycler技术不能进行对血液供者进行完全基因分型这一任务量巨大的工作，这一工作需要的是适合进行高通量筛选的方法。对60,000名供者的两次不同的献血进行60种血型和血小板抗原的分型需要进行每年7百万次以上的分型测试，或者每周大约140,000次的分型测试。因此，为完成这一任务，十分需要一种快速可靠的高通量方法。
多重聚合酶链反应自二十世纪八十年代出现以来，聚合酶链反应(PCR)技术已经有了很大的进展。Chamberlain et al.(1988)披露了以多重PCR作为通用技术来扩增(基因组)DNA中的多基因座。其中，在一个反应混合物中加入的不是用于扩增一个基因座的一对引物，而是多个引物对。不过，扩增反应的复杂性限制了此类多重PCR的进展。反应成分和循环条件必须根据每一额外的引物对而加以调整。为克服这一问题，Shuber et al.(1995)引入了“嵌合”序列特异性引物。这些引物与模板DNA互补并在5′端含有一无关的20个核苷酸的标签(通用序列)。尽管这些引物被设计为使得它们的预期解链温度与其他引物类似并具有低于-10 kcal/mole的形成引物双链的AG计算值，但仍需调整这些引物的浓度以获得相似产率的PCR产物。为克服这一问题，同时也为了进一步降低引物二聚体的形成，Belgrade et al.(1996)仅使用了有限量的嵌合引物(2pmol)并在15个PCR循环后加入过量的通用引物。然后在较低的退火温度下再进行25个循环的热循环。Brownie et al.(1997)加入了最初即已经存在于PCR反应混合物中的通用引物。4个PCR循环后，将退火温度自60℃升高至74℃，并再进行35个PCR循环。此外，Heath et al.(2000)披露了巢式PCR，他们再第二个PCR中加入两种(互补的)通用引物，其中之一在5′端携带荧光标签。
迄今为止，多重PCR仅使用相对较少几组引物对进行等位基因特异性扩增。现有技术中既没有公开在对大量血细胞抗原进行基因分型的方法中使用多重PCR的可行性，也没有公开适合此类血细胞抗原基因分型的PCR条件和引物混合物的特点，也没有公开用于分析扩增产物以进行与临床有关的血细胞抗原基因型分型的实用、快速和可靠的方法。
DNA微阵列基因分型的通用领域已经有了一些采用微阵列技术的方法，其中之一是所谓的微测序方法(mini-sequencing method)，其包括微阵列上的或者是溶液中的等位基因特异性延伸物(Pastinen et al.，1997；Fan et al.，2000)。这种方法的一个困难之处在于出现非特异性引物延伸，因此需要进一步优化引物或者延伸方法本身(Pastinen et al.，2000；Lindroos et al.，2002)。此外，这种方法需要步骤繁多的酶性处理和纯化。
另一种方法称为微阵列上的等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)。这种方法依赖于用于基因型测定的靶与短寡核苷酸探针的热稳定性(Hacia et al.，1996；Wang et al.，1998)。最初的发光寡核苷酸阵列出现于1991(Fodor et al.)。该方法已经用于确定新的SNP或者用于重复测序(resequencing)。其也用于基因分型(Evans et al.，2002)，这通过将衍生自患者样品的PCR扩增产物点样至阵列上并使阵列与等位基因特异性寡聚物接触，以分辨患者的等位基因。已经公开了很多变化形式，它们采用不同的工具，例如酶、纳米颗粒探针、人工核苷酸、热梯度、流通阵列(flow-through arrays)、阻断寡核苷酸，以提高敏感性或者特异性(Lu et al.，2002；Park et al.，2002；Prix et al.，2002；Kajiyama et al.，2003；Jobs et al.，2003；Van Beuningen et al.，2001；Iwasaki et al.，2002)。Wen et al.，2000对以寡核苷酸阵列分析TP53突变的敏感性和特异性与常规的DNA序列分析进行了比较。所使用的寡核苷酸阵列对每一SNP含有多个探针。为了将寡聚物固定于基质支持物，通常是玻片，探针可具有间隔物和胺基(Guoet al.，2001；Wen et al.，2003)。已经公开了多种微阵列格式，例如具有96-微阵列格局的玻片，每个阵列含有250个点，以提高通量(Huang et al.，2001)。已经公开了流通系统(Flow-through systems)以降低杂交时间并由此提高通量(Cheek et al.，2001；Van Beuningen et al.，2001)。
迄今为止，DNA微阵列方法尚未用于血细胞抗原基因分型，且现有技术中既没有公开在对大量血细胞抗原进行基因分型的方法中使用DNA微阵列的可行性，也没有公开适合此类血细胞抗原基因分型的寡核苷酸探针和微阵列格式的特点，也没有公开用于分析杂交结果以进行与临床有关的血细胞抗原基因型分型的实用、快速和可靠的方法。

发明内容
本发明的目的之一是提供可对大量血细胞抗原进行基因分型的实用、快速和可靠的方法和手段。
本发明的另一个目的是开发一种高通量技术，以使得能够就整个现有的供者群体和/或增加的供者群体，在20种且最终在大约60种血细胞抗原系统的数量级上对大量血细胞抗原进行基因分型，由此有助于选择正确的供者血液并提高输血的安全性。
本发明的另一个目的是实现基本上完全和可靠的基因分型，其至少覆盖大多数与临床有关的血细胞抗原系统，实现这一目的可仅使用简单的装置，将单一DNA样品在单一的反应管中进行一轮PCR反应，以同时扩增相关的DNA片段并以可检测的方式对其进行标记，并在短时间内完成，例如少于30小时，或者少于24小时，优选地少于6小时，且更优选地少于2小时，或者更加优选地少于1小时。
为达到上述目的，在一个方面，本发明通过提供了一种血细胞抗原基因分型的方法，其包括对来自一哺乳动物物种的个体的DNA进行多重聚合酶链反应(PCR)以便扩增并以可检测方式标记至少两种不同的血细胞抗原的基因座的含有所述血细胞抗原的核苷酸多态性位点的区域，并使用如此扩增并标记的DNA片段来确定每一所述血细胞抗原的基因型，所述多重PCR包括使用针对每一种待进行基因分型的血细胞抗原的至少一对血细胞抗原特异性嵌合引物以及至少一种以可检测方式标记的通用引物，其中所述至少一种通用引物具有不存在于所述哺乳动物物种的DNA中的独特序列，且其中每一嵌合引物对包括左侧嵌合引物和右侧嵌合引物，它们各自包括位于3′端的血细胞抗原特异性部分和位于5′端的通用部分，其中所述嵌合引物的通用部分的碱基序列对应于所述至少一种通用引物的碱基序列，且其中所述嵌合引物对的所述血细胞抗原特异性部分包含所述血细胞抗原的基因座的含有所述血细胞抗原的核苷酸多态性位点的区域。
在本发明的方法中，优选地使用一对以可检测方式标记的通用引物，所述通用引物具有不存在于所述哺乳动物物种的DNA中的独特序列，且优选地对于每一嵌合引物对，所述嵌合引物对的一个成员的通用部分的碱基序列对应于通用引物对的一个成员的碱基序列，且所述嵌合引物对的另一成员的通用部分的碱基序列对应于所述通用引物对的另一成员的碱基序列。
此外，在本发明中，特别优选地通过将多重PCR扩增的产物经变性后与存在于DNA阵列中或以任何其他形式存在例如载于珠上的血细胞抗原等位基因特异性寡核苷酸探针进行杂交，并分析杂交模式，以确定每一所述血细胞抗原的基因型。
在另一方面，本发明提供了用于通过在此所述的方法进行血细胞抗原基因分型的试剂盒，其包括针对每一种待进行基因分型的血细胞抗原的至少一对血细胞抗原特异性嵌合引物以及一对以可检测方式标记的通用引物，均如在此所定义者。
本发明还提供了一组用于多重PCR的血细胞抗原特异性嵌合引物对，以及一组用于血细胞抗原基因分型的血细胞抗原等位基因特异性寡核苷酸探针。


图1显示了在存在或不存在通用MAPH引物时的19种血型抗原的多重PCR结果。在最初的扩增循环过程中仅扩增到极少量的PCR产物(泳道2)，但足以在随后的循环中用作通用MAPH引物的模板。MAPH引物进行有效的扩增(泳道3)，因此几乎不需要调整引物浓度，且获得了相似产率的PCR产物。
图2显示了来自如本发明所述的19种血型抗原的多重PCR的、通过ABI毛细管测序仪获得的图式。
图3显示了6个供者样品的杂交扫描结果，其各自包括人血小板抗原1至5和Gov的6种PCR产物。一个样品的PCR产物与两个阵列杂交，也就是4个区(blocks)。原始的扫描图具有红色的点和黑色的背景。为了更好的观察，将其转变为反转灰阶图。
发明详述本发明提供了一种血细胞抗原基因分型的方法，其包括对来自一哺乳动物物种的个体的DNA进行多重聚合酶链反应(PCR)以便扩增并以可检测方式标记至少两种不同的血细胞抗原的基因座的含有所述血细胞抗原的核苷酸多态性位点的区域，并使用如此扩增和标记的DNA片段来确定每一种所述血细胞抗原的基因型，所述多重PCR包括使用针对每一种待进行基因分型的血细胞抗原的至少一对血细胞抗原特异性嵌合引物以及至少一种以可检测方式标记的通用引物，其中所述至少一种通用引物具有不存在于所述哺乳动物物种的DNA中的独特序列，且其中每一嵌合引物对包括左侧嵌合引物和右侧嵌合引物，它们各自包括位于3′端的血细胞抗原特异性部分和位于5′端的通用部分，其中所述嵌合引物的通用部分的碱基序列对应于所述至少一种通用引物的碱基序列，且其中所述嵌合引物对的所述血细胞抗原特异性部分包含所述血细胞抗原的基因座的区域，该区域含有所述血细胞抗原的核苷酸多态性位点。
更具体地，本发明提供了一种血细胞抗原基因分型的方法，其包括对来自一哺乳动物物种的个体的DNA进行多重聚合酶链反应(PCR)以便扩增并以可检测方式标记至少两种不同的血细胞抗原的基因座的区域，该区域含有所述血细胞抗原的核苷酸多态性位点，并使用如此扩增和标记的DNA片段来确定每一种所述血细胞抗原的基因型，所述多重PCR包括使用针对每一种待进行基因分型的血细胞抗原的至少一对血细胞抗原特异性嵌合引物和一对以可检测方式标记的通用引物，其中所述通用引物对包括正向通用引物和反向通用引物，所述通用引物各自具有不存在于所述哺乳动物物种的DNA中的独特序列，且其中每一嵌合引物对包括左侧嵌合引物和右侧嵌合引物，它们各自包括位于3′端的血细胞抗原特异性部分和位于5′端的通用部分，其中这些嵌合引物之一的通用部分的碱基序列对应于所述通用引物之一的碱基序列，且另一嵌合引物的通用部分的碱基序列对应于另一通用引物的碱基序列，且其中所述嵌合引物对的所述血细胞抗原特异性部分包含所述血细胞抗原的基因座的含有所述血细胞抗原的核苷酸多态性位点的区域。
本发明包括一系列特定的步骤，这些步骤组合起来能够实现上述的目的。该系列步骤包括自用于进行本发明的基因分型分析的样品中分离DNA，随后进行本发明的关键方面之一，即对携带造成血细胞抗原差别的单核苷酸多态性(SNP)的基因片段进行多重PCR。该多重PCR使用不同引物的混合物，这些引物包括两对或两对以上嵌合引物，此外还包括一种标记的通用引物或一对标记的通用引物。然后将如此扩增并标记的DNA片段变性(例如通过加热)，并在能够使得相匹配的序列发生杂交的条件下与一组探针相接触，优选地是存在于微阵列中的探针，所述微阵列包括众多等位基因特异性探针。下一步，测定微阵列中每一个点上的标记片段的存在情况，最后对测定的信号进行解析以对样品进行分型。探针也可以其他形式存在，例如可以是固定于珠(玻璃珠、聚乙烯珠等)上的探针，或者是附着于适当容器的壁上的探针等。不过阵列格式是最为优选的实施方式。
物种本发明不仅可以进行人类血细胞抗原基因分型，也可以对所有具有血细胞抗原系统的动物进行血细胞抗原基因分型。就实用性目的而言，基因分型涉及哺乳动物的血细胞抗原，包括例如牲畜和宠物、野生动物以及大体上所有具有经济价值、情感价值或者野生动物保护价值的动物。不过，最优选地，本发明涉及对人类进行血细胞抗原基因分型。
血细胞抗原可通过本发明的方法进行基因分型的血细胞抗原包括典型的血型抗原，例如Kidd、Duffy、Kell和猕猴血型。ABO血型抗原系统也可采用本发明进行基因分型，不过由于其具有极其的重要性，可能必须进行已有的且已经公认的血清学测试。可使用本发明进行基因分型的其他血型抗原包括导致以下血型系统发生基因沉默的抗原变体和/或基因变体MNS、猕猴血型(Rh)、Kell、Kidd、Duffy、Colton、Diego、Dombrock、Lutheran、Lewis、Cartwright、Landsteiner Wiener(LW)、Cromer、Knops、Kx、Indian、Gerbich、Hh、Chido/Rodgers、GIL、I、JMH、OK、P-related、RAPH-MER2、Scianna、Xg、YT等。
除了血型抗原，本发明的方法也可用于血小板和白细胞(特别是中性粒细胞)抗原进行基因分型。与临床关联最为密切的血小板抗原(至少是在西方世界)包括HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5和Gov(或HPA-15)。可使用本发明进行基因分型的其他血小板抗原包括例如人血小板抗原6至14和16，虽然认为这些抗原不是很重要。可使用本发明的方法进行基因分型的典型的人中性粒细胞(Human Neutrophil Antigens)的实例包括HNA-1、4和5，其他抗原，例如HNA-2和3，一旦其分子基础得以阐明即可进行基因分型。
可以设想，即便仅仅对很小量的血细胞抗原进行基因分型，依然可以采用本发明。出于某些目的，可能仅对红细胞抗原、或仅对血小板抗原、或仅对与某一特别情况有关的一组选定的抗原进行基因分型即可。采用本发明进行基因分型的血细胞抗原的最小数量是两种血细胞抗原，例如血细胞抗原RhD和RHD基因变体RhDψ，或者血细胞抗原JK1/2(Jka/Jkb)和血细胞抗原FY1/2(Fya/Fyb)。对更大量的血细胞抗原进行基因分型显然是优选的，例如3、4、5种，且特别是6种或者更多。不过，在大多数情况下，优选地进行至少覆盖绝大多数与临床相关的血细胞抗原的差不多完全的基因分型。最为优选地，本发明包括特异于HPA-1至5和HPA-15的至少6种不同的嵌合引物对，以及特异于红细胞抗原的至少10或11或12种嵌合引物对，例如特异于各种Kidd、Duffy、Kell和猕猴血型抗原。
DNA
进行多重PCR的DNA通常是待进行血细胞抗原基因分型的个体的基因组DNA。
供者DNA可来自任何合适的来源，例如来自EDTA、肝素或柠檬酸盐处理的血液样品或白细胞层(buffy coats)，这可采用本领域人员已知的分离方法和手段，例如商品化的Qiagen Blood DNA提取试剂盒，采用盐析方法，例如使用Miller et al.(1988)的标准方案，或者采用RocheMagnapure。
通用引物本发明的方法使用携带可检测标记物的至少一种通用引物，优选地是携带可检测标记物的一对通用引物。通用引物的序列对应于嵌合引物5’端的通用部分的序列。可以仅使用一种通用引物。在这种情况下，所有嵌合引物在其5’端均具有相同的碱基序列，即嵌合引物5’端的通用部分对应于该单一通用引物的序列。不过，在实践中发现使用两种不同的通用引物(即一对通用引物)是优选的。在这种情况下，每对嵌合引物含有一具有对应于所述通用引物之一的通用部分的引物，以及一具有对应于另一通用引物的通用部分的引物。
重要的是，通用引物不与待基因分型的DNA发生杂交。假定待基因分型的DNA是人基因组DNA，通用引物(以及嵌合引物的相应部分)不应该杂交于人基因组DNA，且因此应该具有不存在于所述DNA中的独特序列。优选地，通用引物的序列明显不同于存在于人基因组中的任何序列。此外，特别优选的是，通用引物被设计为使得其Tm值与嵌合引物中特异于血细胞抗原的部分的Tm值相似。优选地，通用引物的Tm值在50至70℃之间，更优选地在56至68℃之间。此外，通用引物的长度优选地为12至30个碱基，更优选地为15至25个，或者更加优选地为16至20个碱基。
使用White et al.，2002公开的通用引物获得了非常好结果，其中序列ggccgcgggaattcgatt(SEQ ID NO1，正向MAPH)的Tm为67.55℃，而gccgcgaattcactagtg(SEQ ID NO2，反向MAPH)的Tm为57.94℃。
可检测标记物通用引物携带可检测标记物。标记物可以是任何适合于具体目的的标记物，例如放射性原子或基团、酶例如催化其底物发生可测定的转化的酶、染料、荧光物质、化学发光物质、生物素等。最为优选地，标记物是荧光团，本领域人员已知多种这样的荧光团。其中的实例是Cy3、Cy5、荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、罗丹明、Hex、Tet、Fam等。
最优选地，本发明使用荧光团Cy5，这是一种Sulfoindocyanine染料(Mujumdar et al.，1993)。
通常，特别是如果标记物是连接于寡核苷酸的一种基团，其应该连接于通用引物的寡核苷酸序列的5’端。
由于通用引物是标记的，因此尽管嵌合引物没有标记，本发明仍然在扩增的同时实现了非常高效的标记，同时可以使用未经事先标记的各种嵌合引物。
嵌合引物本发明所用的嵌合引物在其5’端具有通用部分且在其3’端具有血细胞抗原特异性部分。通用部分的寡核苷酸序列对应于通用引物的序列，在此对其不需要进一步阐述。
至于嵌合引物的血细胞抗原特异性部分，最优选的是这些部分具有相似的Tm值，无论是与混合物中的其他嵌合引物的血细胞抗原特异性部分相比，还是与所用的通用引物相比，均是如此。因此，优选的是嵌合引物的血细胞抗原特异性部分的Tm值在50至70℃之间，更优选地在55至65℃之间，且最优选地在56至62℃之间。此外，嵌合引物的血细胞抗原特异性部分的长度优选地为12至35个碱基，更优选地为15至30个，或者更加优选地为16至25个碱基。
此外，所选定的嵌合引物的血细胞抗原特异性部分优选地使得PCR扩增产生的寡核苷酸产物的长度为50至800、优选地80至500、最优选地100至400或300个核苷酸。产物的长度为100至200个核苷酸应该是理想的。
用于设计合适的嵌合引物的血细胞抗原特异性部分的各种软件产品是已知的。基于公众能够获得的编码血细胞抗原的基因的DNA序列，可使用软件Primer3(http://www.broad.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3www.cgi)来设计引物。可使用CELERA数据库来核实任何非特异性的基因组DNA结合，并可使用Oligo6软件(Medprobe)来核实任何引物二聚体的形成。优选地选择AG计算值低于-10kcal/mole的引物。
优选的嵌合引物列表包括以下引物HPA1-left gccgcgaattcactagtgcttcaggtcacagcgaggt SEQ ID NO3HPA1-right ggccgcgggaattcgattgctccaatgtacggggtaaa SEQ ID NO4HPA2-left gccgcgaattcactagtgtgaaaggcaatgagctgaag SEQ ID NO5HPA2-right ggccgcgggaattcgattagccagactgagcttctcca SEQ ID NO6HPA3-left gccgcgaattcactagtggcctgaccactcctttgc SEQ ID NO7HPA3-right ggccgcgggaattcgattggaagatctgtctgcgatcc SEQ ID NO8HPA4-left gccgcgaattcactagtgatccgcaggttactggtgag SEQ ID NO9HPA4-right ggccgcgggaattcgattccatgaaggatgatctgtgg SEQ ID NO10HPA5-left gccgcgaattcactagtgtccaaatgcaagttaaattaccag SEQ ID NO11HPA5-right ggccgcgggaattcgattacagacgtgctcttggtaggtSEQ ID NO12HPA15-left gccgcgaattcactagtgtgtatcagttcttggttttgtgatgSEQ ID NO13HPA15-rightggccgcgggaattcgattaaaaccagtagccacccaag SEQ ID NO14JI1/2-left gccgcgaattcactagtggtctttcagccccatttgag SEQ ID NO15JK1/2-rightggccgcgggaattcgattgttgaaaccccagagtccaa SEQ ID NO16
FY1/2-left gccgcgaattcactagtggaattcttcctatggtgtgaatgaSEQ ID NO17FY1/2-right ggccgcgggaattcgattaagaagggcagtgcagagtcSEQ ID NO18GATAbox-leftgccgcgaattcactagtgggccctcattagtccttgg SEQ ID NO19GATAbox-right ggccgcgggaattcgattgaaatgaggggcatagggata SEQ ID NO20Fyx-leftgccgcgaattcactagtgtcatgcttttcagacctctcttc SEQ ID NO175Fyx-right ggccgcgggaattcgattcaagacgggcaccacaat SEQ ID NO176KEL1/2-left gccgcgaattcactagtgaagggaaatggccatactgaSEQ ID NO21KEL1/2-rightggccgcgggaattcgattagctgtgtaagagccgatccSEQ ID NO22KEL3/4-left gccgcgaattcactagtggcctcagaaactggaacagcSEQ ID NO23KEL3/4-rightggccgcgggaattcgattagcaaggtgcaagaacactct SEQ ID NO24KEL6/7-left gccgcgaattcactagtggcagcaccaaccctatgttcSEQ ID NO177KEL6/7-rightggccgcgggaattcgatttcaggcacaggtgagcttc SEQ ID NO178RHCEex2for gccgcgaattcactagtgcgtctgcttccccctcc SEQ ID NO25RHex2revggccgcgggaattcgattctgaacagtgtgatgaccacc SEQ ID NO26RHDex3-left gccgcgaattcactagtgtcctggctctccctctct SEQ ID NO179RHCEex3-right ggccgcgggaattcgatttttttcaaaaccccggaag SEQ ID NO180RHCEex5-leftgccgcgaattcactagtgggatgttctggccaagtg SEQ ID NO27RHex5revggccgcgggaattcgattggctgtcaccacactgactgSEQ ID NO28RHDψ-left ggccgcgggaattcgattgtagtgagctggcccatca SEQ ID NO29RHDψ-right gccgcgaattcactagtgtgtctagtttcttaccggcaagt SEQ ID NO30RHD-leftB gccgcgaattcactagtgttataataacacttgtccacagggSEQ ID NO31RHD-rightC ggccgcgggaattcgattcggctccgacggtatcSEQ ID NO32BigC-left gccgcgaattcactagtgggccaccaccatttgaa SEQ ID NO33BigC-right intron2 ggccgcgggaattcgattccatgaacatgccacttcacSEQ ID NO34RhDVI-left(fw) ggccgcgggaattcgattctttgaattaagcacttcacaga SEQ ID NO181RhDVI-right(rev)gccgcgaattcactagtggccagaatcacactcctgctSEQ ID NO182MN-left gccgcgaattcactagtgtgagggaatttgtcttttgca SEQ ID NO35
MN-right ggccgcgggaattcgattcagaggcaagaattcctcca.SEQ ID NO36Ss-leftgccgcgaattcactagtgtttttctttgcacatgtctttSEQ ID NO183Ss-right ggccgcgggaattcgatttctttgtctttacaatttcgtgtg SEQ ID NO184U-left gccgcgaattcactagtgcgctgatgttatctgtcttatttttc SEQ ID NO37U-rightggccgcgggaattcgattgatcgttccaataataccagcc SEQ ID NO38DO-leftggccgcgggaattcgatttgatccctccctatgagctg SEQ ID NO185DO-right gccgcgaattcactagtgttatatgtgctcaggttcccagt SEQ ID NO186JO-leftgccgcgaattcactagtgcctggcttaaccaaggaaaa SEQ ID NO39JO-right ggccgcgggaattcgatttcatactgctgtggagtcctgSEQ ID NO40Colton-leftgccgcgaattcactagtggccacgaccctctttgtct SEQ ID NO187Colton-right ggccgcgggaattcgatttacatgagggcacggaagat SEQ ID NO188Diego-left gccgcgaattcactagtgacttattcacgggcatccag SEQ ID NO189Diego-rightggccgcgggaattcgattaagctccacgttcctgaaga SEQ ID NO190Wr-leftgccgcgaattcactagtgggcttcaaggtgtccaactc SEQ ID NO636Wr-right ggccgcgggaattcgattaggatgaagaccagcagagc SEQ ID NO637Yt-leftggccgcgggaattcgattccttcgtgcctgtggtagat SEQ ID NO638Yt-right gccgcgaattcactagtgttctgggacttctgggaatg SEQ ID NO639Lu-leftgccgcgaattcactagtgggacccagagagagagagactg SEQ ID NO640Lu-right ggccgcgggaattcgattgggagtccagctggtatgg SEQ ID NO641。
最优选的是具有SEQ ID NO3至40的嵌合引物。
上述软件产品能够使得本领域人员设计用于其他血细胞抗原的其他引物。本发明包括使用一组具有相同的血细胞抗原特异性部分但具有不同的通用部分的相似的嵌合引物。
引物的比例为了实现本发明的目的，且特别是尽可能避免出现引物二聚体，重要的是仅使用最小比例的嵌合引物，而扩增主要是归因于通用引物的延伸。在实践中，所使用的通用引物的摩尔量优选地是每一嵌合引物的摩尔量的至少10倍、更优选地是至少40倍。每一扩增反应优选地使用5nM的每一嵌合引物，且每一嵌合引物对0.2μM的各种通用引物。对于每微升反应体积，每一嵌合引物的量优选地为5 femtomol(5*10-15mol)，而对于每一嵌合引物对使用大约0.2pmol(0.2*10-12mol)的各种通用引物。
多重PCR条件本发明的方法采用的多重PCR使用通用引物和嵌合引物的混合物，这些引物在反应开始时就存在。本发明所用的PCR并不区分其中仅有嵌合引物被延伸的单独的第一部分和其中仅有通用引物被延伸的第二部分。本发明在后面的PCR循环中使用的退火温度或引物延伸温度与最初的几个PCR循环中使用的退火温度或引物延伸温度相同。本发明人发现，改变反应条件以便将嵌合引物延伸转变为通用引物延伸的作法是不必要的。
多重PCR优选地使用耐热DNA聚合酶，例如Taq DNA聚合酶。也可使用其他的耐热DNA聚合酶，甚至可使用不耐热DNA聚合酶，不过这可能需要反复添加新鲜的DNA聚合酶。合适的DNA聚合酶可通过商业途径获得，例如作为多重PCR试剂盒的一个成分，如Qiagen多重试剂。此类试剂盒也含有其他必要的成分，例如所需的各种dNTP以及合适的缓冲系统。
进行PCR热循环的装置也是商品化的，例如MWG AG BiotechPrimusHT热循环仪。
本发明的扩增通常以热处理激活DNA聚合酶开始，例如95℃，15分钟。随后开始热循环，每个循环包括热变性步骤、退火步骤(以便通过杂交将引物结合于模板)和引物延伸或者延长步骤。在本发明中，热变性步骤的加热温度优选地为90至98℃，更优选地为大约94或95℃，且持续时间为15至60秒(允许短些或者特别是更长些)，更优选地为大约30秒。此外，在本发明中，退火步骤的加热温度优选地为54至60℃，更优选地为大约57℃，且持续时间为60至120秒(允许短些或者特别是更长些)，更优选地为大约90秒。此外，在本发明中，引物延伸步骤的加热温度优选地为68至76℃，更优选地为大约72℃，且持续时间为60至120秒(允许短些或者特别是更长些)，更优选地为大约90秒。最终在引物延伸步骤的温度处理更长的时间，例如10分钟，可结束热循环。
根据可利用的时间和对精度的要求，可任意选择循环总数。总共30个循环应该就足够了，不过优选40或45或50个循环或者更多。
基因分型多重PCR产生的是标记的扩增产物的混合物，其中理想地的情况是各产物基本上包括不同血细胞抗原的基因座的区域，该区域含有所述血细胞抗原的核苷酸多态性位点。在绝大多数现在已知的血细胞抗原的多态性中，核苷酸多态性是单核苷酸多态性(SNP)，但本发明也包括多态性位点覆盖一个以上核苷酸的情况。
已有多种用于分析标记的扩增产物混合物中存在的SNP的策略，包括产物测序，但大多数不适合进行快速、可靠的高通量基因分型。因此本发明优选地使用将多重PCR产物与含有血细胞抗原等位基因特异性寡核苷酸探针的DNA阵列相接触这一特殊的步骤。所述接触是在将扩增的寡核苷酸产物变性后进行的，例如通过加热，且进行接触的条件适合于这些产物与阵列中相应的探针发生杂交。在与探针接触前对扩增产物进行纯化并不是必要的，因此通常可以将其省略。
探针探针是包括核苷酸多态性位点的寡核苷酸。由此，它们具有等位基因特异性。虽然它们的长度可以是自8或10个核苷酸直至数百个核苷酸不等，但本发明使用的探针的长度优选地为15至40个核苷酸，更优选地为l6或17至29或30个核苷酸。优选地，所有探针具有相似的Tm值，特别是在55至75℃的范围内，更优选地在60至70℃的范围内，或特别优选地在60至65℃的范围内。
尽管原则上针对每一血细胞抗原的每一等位基因可以仅使用一种探针，但本发明针对每一血细胞抗原的每一等位基因使用数种探针，由此增加该方法的可靠性。根据本发明，针对每一血细胞抗原的每一等位基因，所述阵列含有至少两种、优选地至少5种不同的有义探针和至少两种、优选地至少5种反义探针，它们各自覆盖核苷酸多态性位点，但覆盖的是不同的位置。优选地，这些位置位于或者靠近所述寡聚物的中心。
正如前面谈及引物的血细胞抗原特异性部分时所述，可用于设计合适的血细胞抗原等位基因特异性探针的各种软件产品是已知的(特别是Primer3软件产品)。
优选的探针列表包括如下探针(SNP被突出显示)HPA1-allele aHPA-1aa tacaggccctgcctctgggSEQ ID NO4lHPA-1ab aggccctgcctctgggct SEQ ID NO42HPA-1ac ccctgcctctgggctcaccSEQ ID NO43HPA-1ad tgcctctgggctcacctcgSEQ ID NO44HPA-1ae ctctgggctcacctcgctgSEQ ID NO45HPA-1aa CRcagcgaggtgagcccagagSEQ ID NO46HPA-1ab CRcgaggtgagcccagaggcaSEQ ID NO47HPA-1ac CRggtgagcccagaggcagggSEQ ID NO48HPA-1ad CRagcccagaggcagggcct SEQ ID NO49HPA-1ae CRcccagaggcagggcctgtaSEQ ID NO50HPA1-allele bHPA-1ba tacaggccctgcctccgggSEQ ID NO51HPA-1bb aggccctgcctccgggct SEQ ID NO52HPA-1bc ccctgcctccgggctcac SEQ ID NO53HPA-1bd ctgcctccgggctcacct SEQ ID NO54
HPA-1bcctccgggctcacctcgct SEQ ID NO55HPA-1ba CR agcgaggtgagcccggag SEQ ID NO56HPA-1bb CR aggtgagcccggaggcag SEQ ID NO57HPA-1bc CR gtgagcccggaggcaggg SEQ ID NO58HPA-1bd CR agcccggaggcagggcct SEQ ID NO59HPA-1be CR cccggaggcagggcctgtaSEQ ID NO60HPA2-allele aHPA-2aactgacgcccacacccaag SEQ ID NO61HPA-2abctcctgacgcccacaccc SEQ ID NO62HPA-2acggctcctgacgcccacac SEQ ID NO63HPA-2adagggctcctgacgcccac SEQ ID NO64HPA-2aeccagggctcctgacgccc SEQ ID NO65HPA-2aa CR cttgggtgtgggcgtcag SEQ ID NO66HPA-2ab CR gggtgtgggcgtcaggag SEQ ID NO67HPA-2ac CR gtgtgggcgtcaggagcc SEQ ID NO68HPA-2ad CR gtgggcgtcaggagccct SEQ ID NO69HPA-2ac CR gggcgtcaggagccctgg SEQ ID NO70HPA2-allele bHPA-2bacctgatgcccacacccaagSEQ ID NO71HPA-2bbctcctgatgcccacacccaSEQ ID NO72HPA-2bcggctcctgatgcccacaccSEQ ID NO73HPA-2bdagggctcctgatgcccacaSEQ ID NO74HPA-2beccagggctcctgatgccc SEQ ID NO75HPA-2ba CR cttgggtgtgggcatcaggSEQ ID NO76HPA-2bb CR tgggtgtgggcatcaggagSEQ ID NO77HPA-2bc CR ggtgtgggcatcaggagcc SEQ ID NO78HPA-2bd CR tgtgggcatcaggagccctSEQ ID NO79HPA-2be CR gggcatcaggagccctgg SEQ ID NO80HPA3-allele aHPA-3aaccatccccagcccctccc SEQ ID NO81HPA-3abgcccatccccagcccctc SEQ ID NO82HPA-3acctgcccatccccagcccc SEQ ID NO83HPA-3ad1 gctgcccatccccagccc SEQ ID NO84HPA-3adggctgcccatccccagcc SEQ ID NO85HPA-3ad2 gggctgcccatccccagc SEQ ID NO86HPA-3aeggggctgcccatcccca SEQ ID NO87HPA-3aa CR gggaggggctggggatgg SEQ ID NO88HPA-3ab CR gaggggctggggatgggc SEQ ID NO；89HPA-3ac CR ggggctggggatgggcag SEQ ID NO90HPA-3ad1 CRgggctggggatgggcagc SEQ ID NO91
HPA-3ad CR ggctggggatgggcagcc SEQ ID NO92HPA-3ad2 CRgctggggatgggcagccc SEQ ID NO93HPA-3ae CR tggggatgggcagccccSEQ ID NO94HPA3-allele bHPA-3baccagccccagcccctccSEQ ID NO95HPA-3bbgcccagccccagcccctSEQ ID NO96HPA-3bcctgcccagccccagcccSEQ ID NO97HPA-3bd1 gctgcccagccccagccSEQ ID NO98HPA-3bdggctgcccagccccagcSEQ ID NO99HPA-3bd2 gggctgcccagccccagSEQ ID NO100HPA-3beggggctgcccagccccaSEQ ID NO101HPA-3ba CR gaggggctggggctgg SEQ ID NO102HPA-3bb CR aggggctggggctgggcSEQ ID NO103HPA-3bc CR gggctggggctgggcagSEQ ID NO104HPA-3bd1 CRggctggggctgggcagcSEQ ID NO105HPA-33bd CRgctggggctgggcagccSEQ ID NO106HPA-3bd2 CRctggggctgggcagcccSEQ ID NO107HPA-3be CR tggggctgggcagccccSEQ ID NO108HPA4-allele aHPA-4aagccacccagatgcgaaag SEQ ID NO109HPA-4abcacccagatgcgaaagct SEQ ID NO110HPA-4accccagatgcgaaagctca SEQ ID NO111HPA-4adcagatgcgaaagctcacc SEQ ID NO112HPA-4aegatgcgaaagctcaccag SEQ ID NO113HPA-4aa CR ctggtgagctttcgcatc SEQ ID NO114HPA-4ab CR ggtgagctttcgcatctg SEQ ID NO115HPA-4ac CR tgagctttcgcatctggg SEQ ID NO116HPA-4ad CR agctttcgcatctgggtg SEQ ID NO117HPA-4ac CR ctttcgcatctgggtggc SEQ ID NO118HPA4-allele bHPA-4bagccacccagatgcaaaag SEQ ID NO119HPA-4bbccacccagatgcaaaagct SEQ ID NO120HPA-4bcacccagatgcaaaagctcac SEQ ID NO121HPA-4bdcagatgcaaaagctcacca SEQ ID NO122HPA-4begatgcaaaagctcaccagtaaSEQ ID NO123HPA-4ba CR ttactggtgagcttttgcatcSEQ ID NO124HPA-4bb CR tggtgagcttttgcatctg SEQ ID NO125HPA-4bc CR gtgagcttttgcatctgggt SEQ ID NO126HPA-4bd CR agcttttgcatctgggtgg SEQ ID NO127HPA-4be CR cttttgcatctgggtggc SEQ ID NO128
HPA5-allele aHPA-5aagagtctacctgtttactatcaaagagg SEQ ID NO129HPA-5abagtctacctgtttactatcaaagaggta SEQ ID NO130HPA-5acgtctacctgtttactatcaaagaggtaa SEQ ID NO131HPA-5adctacctgtttactatcaaagaggtaaaa SEQ ID NO132HPA-5aeacctgtttactatcaaagaggtaaaaa SEQ ID NO133HPA-5aa CR tttttacctctttgatagtaaacaggt SEQ ID NO134HPA-5ab CR ttttacctctttgatagtaaacaggtag SEQ ID NO135HPA-5ac CR ttacctctttgatagtaaacaggtagac SEQ ID NO136HPA-5ad CR tacctctttgatagtaaacaggtagact SEQ ID NO137HPA-5ae CR cctctttgatagtaaacaggtagactc SEQ ID NO138HPA5-allele bHPA-5bagagtctacctgtttactatcaaaaagg SEQ ID NO139HPA-5bbagtctacctgtttactatcaaaaaggta SEQ ID NO140HPA-5bcgtctacctgtttactatcaaaaaggtaa SEQ ID NO141HPA-5adctacctgtttactatcaaaaaggtaaaa SEQ ID NO142HPA-5beacctgtttactatcaaaaaggtaaaaa SEQ ID NO143HPA-5ba CR tttttacctttttgatagtaaacaggt SEQ ID NO144HPA-5bb CR ttttacctttttgatagtaaaacaggtag SEQ ID NO145HPA-5bc CR ttacctttttgatagtaaacaggtagac SEQ ID NO146HPA-5bd CR tacctttttgatagtaaacaggtagact SEQ ID NO147HPA-5be CR cctttttgatagtaaacaggtagactc SEQ ID NO148HPA15-allele aGov-aa ttattatcttgacttcagttacaggattt SEQ ID NO149Gov-ab tcttgacttcagttacaggatttaccSEQ ID NO150Gov-ac tgacttcagttacaggatttaccaa SEQ ID NO151Gov-ad cttcagttacaggatttaccaagaatSEQ ID NO152Gov-ac cagttacaggatttaccaagaatttgSEQ ID NO153Gov-aa CR caaattcttggtaaatcctgtaactgSEQ ID NO154Gov-ab CR attcttggtaaatcctgtaactgaagSEQ ID NO155Gov-ac CR tggtaaatcctgtaactgaagtcaa SEQ ID NO156Gov-ad CR ggtaaatcctgtaactgaagtcaagaSEQ ID NO157Gov-ae CR aaatcctgtaactgaagtcaagataataa SEQ ID NO158HPA15-allele bGov-ba tatcttgacttcagttccaggatt SEQ ID NO159Gow-bb cttgacttcagttccaggatttac SEQ ID NO160Gov-bc gacttcagttccaggatttacca SEQ ID NO161Gov-bd ttcagttccaggatttaccaagSEQ ID NO162Gov-be cagttccaggatttaccaagaatt SEQ ID NO163Gov-ba CR aattcttggtaaatcctggaactg SEQ ID NO164
Gov-bb CRcttggtaaatcctggaactgaa SEQ ID NO165Gov-bc CRggtaaatcctggaactgaagtca SEQ ID NO166Gov-bd CRgtaaatcctggaactgaagtcaag SEQ ID NO167Gov-bc CRaatcctggaactgaagtcaagata.SEQ ID NO168Colton-a-alleleCo.a.1 aacaaccagacggcggtSEQ ID NO191Co.a.2 accagacggcggtccagSEQ ID NO192Co.a.3 cagacggcggtccaggaSEQ ID NO193Co.a.4 gacggcggtccaggacaa SEQ ID NO194Co.a.5 cggcggtccaggacaacSEQ ID NO195Co.a.1.crgttgtcctggaccgccgt SEQ ID NO196Co.a.2.crtcctggaccgccgtctgSEQ ID NO197Co.a.3.crctggaccgccgtctggtSEQ ID NO198Co.a.4.crggaccgccgtctggttgSEQ ID NO199Co.a.5.craccgccgtctggttgttSEQ ID NO200Colton-b-alleleCo.b.1 ggaacaaccagacggtggt SEQ ID NO201Co.b.2 acaaccagacggtggtccag SEQ ID NO202Co.b.3 accagacggtggtccagga SEQ ID NO203Co.b.4 gacggtggtccaggacaacg SEQ ID NO204Co.b.5 cggtggtccaggacaacg SEQ ID NO205Co.b.1.crcgttgtcctggaccaccgt SEQ ID NO206Co.b.2.crttgtcctggaccaccgtctg SEQ ID NO207Co.b.3.crctggaccaccgtctggttgt SEQ ID NO208Co.b.4.crggaccaccgtctggttgttc SEQ ID NO209Co.b.5.craccaccgtctggttgttcc SEQ ID NO210Diego-a-alleleDi.a.1 gtgaagtccacgccggcSEQ ID NO211Di.a.2 gaagtccacgccggcctSEQ ID NO212Di.a.3 agtccacgccggcctccSEQ ID NO213Di.a.4 tccacgccggcctccctSEQ ID NO214Di.a.5 acgccggcctccctggcc SEQ ID NO215Di.a.1.crgccagggaggccggcgtSEQ ID NO216Di.a.2.cragggaggccggcgtggaSEQ ID NO217Di.a.3.crggaggccggcgtggactSEQ ID NO218Di.a.4.craggccggcgtggacttcSEQ ID NO219Di.a.5.crggccggcgtggacttcaSEQ ID NO220Diego-b-alleleDi.b.1 ggtgaagtccacgctggc SEQ ID NO221Di.b.2 gtgaagtccacgctggcct SEQ ID NO222
Di.b.3 tgaagtccacgctggcctcc SEQ ID NO223Di.b.4 gaagtccacgctggcctccct SEQ ID NO224Di.b.5 acgctggcctccctggcccSEQ ID NO225Di.b.1.crggccagggaggccagcgt SEQ ID NO226Di.b.2.crcagggaggccagcgtgga SEQ ID NO227Di.b.3.cragggaggccagcgtggactSEQ ID NO228Di.b.4.crggaggccagcgtggacttcSEQ ID NO229Di.b.5.crggccagcgtggacttcaccSEQ ID NO230Diego Wr-a-alleleWr.a.1 tgggcttgcgttccaagt SEQ ID NO231Wr.a.2 ggcttgcgttccaagtttcSEQ ID NO232Wr.a.3 ttgcgttccaagtttcccaSEQ ID NO233Wr.a.4 cgttccaagtttcccatctSEQ ID NO234Wr.a.5 tccaagtttcccatctggaSEQ ID NO235Wr.a.1 CRtccagatgggaaacttggaSEQ ID NO236Wr.a.2 CRagatgggaaacttggaacgSEQ ID NO237Wr.a.3 CRtgggaaacttggaacgcaaSEQ ID NO238Wr.a.4 CRgaaacttggaacgcaagccSEQ ID NO239Wr.a.5 CRacttggaacgcaagccca SEQ ID NO240Diego Wr-b-allele2Wr.b.1 gggcttgcgttccgagtt SEQ ID NO241Wr.b.2 gcttgcgttccgagtttc SEQ ID NO242Wr.b.3 ttgcgttccgagtttccc SEQ ID NO243Wr.b.4 cgttccgagtttcccatc SEQ ID NO244Wr.b.5 tccgagtttcccatctgg SEQ ID NO245Wr.b.1 CRccagatgggaaactcgga SEQ ID NO246Wr.b.2 CRgatgggaaactcggaacg SEQ ID NO247Wr.b.3 CRgggaaactcggaacgcaa SEQ ID NO248Wr.b.4 CRgaaactcggaacgcaagc SEQ ID NO249Wr.b.5 CRaactcggaacgcaagccc SEQ ID NO250Dombrock-a-alleleDo.a.1 taccacccaagaggaaactSEQ ID NO251Do.a.2 ccacccaagaggaaactggSEQ ID NO252Do.a.3 acccaagaggaaactggttg SEQ ID NO253Do.a.4 caagaggaaactggttgcaSEQ ID NO254Do.a.5 aggaaactggttgcagttga SEQ ID NO255Do a 6 crctcaactgcaaccagtttcc SEQ ID NO256Do a 7 crcaactgcaaccagtttcctc SEQ ID NO257Do a 8 crtgcaaccagtttcctcttgg SEQ ID NO258Do a 9 craccagtttcctcttgggtgg SEQ ID NO259
Do a 10 crcagtttcctcttgggtggta SEQ ID NO260Dombrock-b-alleleDo.b.1taccacccaagaggagact SEQ ID NO261Do.b.2ccacccaagaggagactgg SEQ ID NO262Do.b.3acccaagaggagactggttg SEQ ID NO263Do.b.4caagaggagactggttgca SEQ ID NO264Do.b.5aggagactggttgcagttga SEQ ID NO265Do b 6 cr ctcaactgcaaccagtctcc SEQ ID NO266Do b 7 cr caactgcaaccagtctcctc SEQ ID NO267Do b 8 cr tgcaaccagtctcctcttgg SEQ ID NO268Do b 9 cr accagtctcctcttgggtgg SEQ ID NO269Do b 10 crcagtctcctcttgggtggt SEQ ID NO270Dombrock-Joseph(a) positive alleleJo.a.pos. 1 ccccagaacatgactaccac SEQ ID NO271Jo.a.pos.2ccagaacatgactaccacacaSEQ ID NO272Jo.a.pos.3agaacatgactaccacacacgc SEQ ID NO273Jo.a.pos.4catgactaccacacacgctgtSEQ ID NO274Jo.a.pos.5actaccacacacgctgtgg SEQ ID NO275Jo.a.pos.1.cr gccacagcgtgtgtggtagt SEQ ID NO276Jo.a.pos.2.cr acagcgtgtgtggtagtcatgSEQ ID NO277Jo.a.pos.3.cr agcgtgtgtggtagtcatgttSEQ ID NO278Jo.a.pos.4.cr cgtgtgtggtagtcatgttctg SEQ ID NO279Jo.a.pos.5.cr gtggtagtcatgttctgggg SEQ ID NO280Dombrock-Joscph(a)negative alleleJo.a.neg.1ctaccccagaacatgactatcac SEQ ID NO281Jo.a.neg.2cccagaacatgactatcacaca SEQ ID NO282Jo.a.neg.3cagaacatgactatcacacacgc SEQ ID NO283Jo.a.neg.4catgactatcacacacgctgtg SEQ ID NO284Jo.a.neg.5actatcacacacgctgtggc SEQ ID NO285Jo.a.neg.1.cr aatagccacagcgtgtgtgatagt SEQ ID NO286Jo.a.ncg.2.cr cacagcgtgtgtgatagtcatg SEQ ID NO287Jo.a.neg.3.cr cagcgtgtgtgatagtcatgtt SEQ ID NO288Jo.a.neg.4.cr cgtgtgtgatagtcatgttctgg SEQ ID NO289Jo.a.neg.5.cr gtgatagtcatgttctggggtag SEQ ID NO290Duffy-a-alleleFy.A.1ccagatggagactatggtgccSEQ ID NO291Fy.A.2atggagactatggtgccaac SEQ ID NO292Fy.A.3ggagactatggtgccaacctgSEQ ID NO293Fy.A.4gactatggtgccaacctgga SEQ ID NO294Fy.A.5tatggtgccaacctggaag SEQ ID NO295
Fy.A.1.cr cttccaggttggcaccataSEQ ID NO296Fy.A.2.cr tccaggttggcaccatagtc SEQ ID NO297Fy.A.3.cr aggttggcaccatagtctcc SEQ ID NO298Fy.A.4.cr gttggcaccatagtctccat SEQ ID NO299Fy.A.5.cr gcaccatagtctccatctgg SEQ ID NO300Duffy-b-alleleFy.B.1cccagatggagactatgatgcc SEQ ID NO301Fy.B.2gatggagactatgatgccaac SEQ ID NO302Fy.B.3tggagactatgatgccaacctg SEQ ID NO303Fy.B.4gactatgatgccaacctggaa SEQ ID NO304Fy.B.5tatgatgccaacctggaagc SEQ ID NO305Fy.B.1.cr gcttccaggttggcatcata SEQ ID NO306Fy.B.2.cr ttccaggttggcatcatagtc SEQ ID NO307Fy.B.3.cr caggttggcatcatagtctcc SEQ ID NO308Fy.B.4.cr gttggcatcatagtctccatc SEQ ID NO309Fy.B.5.cr gcatcatagtctccatctggg SEQ ID NO310Duffy GATAbox-normal-alleleFy.GATA.normal.1 agtccttggctcttatcttg SEQ ID NO311Fy.GATA.normal.2 agtccttggctcttatcttgga SEQ ID NO312Fy.GATA.normal.3 cttggctcttatcttggaagc SEQ ID NO313Fy.GATA.normal.4 gctcttatcttggaagcacagg SEQ ID NO314Fy.GATA.normal.5 cttatcttggaagcacaggcgc SEQ ID NO315Fy.GATA.normal.1.cr gcctgtgcttccaagataag SEQ ID NO316Fy.GATA.normal.2.crtgtgcttccaagataagagc SEQ ID NO317Fy.GATA.normal.3.cr tgcttccaagataagagcca SEQ ID NO318Fy.GATA.normal.4.cr ttccaagataagagccaagga SEQ ID NO319Fy.GATA.normal.5.cr caagataagagccaaggact SEQ ID NO320Duffy GATAbox-mutation-alleleFy.GATA.mut.1 tccttggctcttaccttg SEQ ID NO321Fy.GATA.mut.2 tccttggctcttaccttgga SEQ ID NO322Fy.GATA.mut.3 tggctcttaccttggaagcSEQ ID NO323Fy.GATA.mut.4 gctcttaccttggaagcacag SEQ ID NO324Fy.GATA.mut.5 cttaccttggaagcacaggcg SEQ ID NO325Fy.GATA.mut.1.cr cctgtgcttccaaggtaagSEQ ID NO326Fy.GATA.mut.2.cr gtgcttccaaggtaagagcSEQ ID NO327Fy.GATA.mut.3.cr gcttccaaggtaagagccaSEQ ID NO328Fy.GATA.mut.4.cr ttccaaggtaagagccaagg SEQ ID NO329Fy.GATA.mut.5.cr caaggtaagagccaagga SEQ ID NO330Duffy Fyx-normal-alleleFy.X.(b).1ttttcagacctctcttccgct SEQ ID NO331
Fy.X.(b).2agacctctcttccgctggcSEQ ID NO332Fy.X.(b).3ctctcttccgctggcagc SEQ ID NO333Fy.X.(b).4ctcttccgctggcagctc SEQ ID NO334Fy.X.(b).5cttccgctggcagctctg SEQ ID NO335Fy.X.(b).1.cr cagagctgccagcggaa SEQ ID NO336Fy.X.(b).2.cr agctgccagcggaagag SEQ ID NO337Fy.X.(b).3.cr ctgccagcggaagagagg SEQ ID NO338Fy.X.(b).4.cr gccagcggaagagaggtc SEQ ID NO339Fy.X.(b).5.cr cagcggaagagaggtctg SEQ ID NO340Duffy Fyx-mutation-alleleFy.X.1gcttttcagacctctcttctgctSEQ ID NO341Fy.X.2tcagacctctcttctgctggc SEQ ID NO342Fy.X.3acctctcttctgctggcagc SEQ ID NO343Fy.X.4ctcttctgctggcagctctg SEQ ID NO344Fy.X.5cttctgctggcagctctgcSEQ ID NO345Fy.X.1.cr gcagagctgccagcagaa SEQ ID NO346Fy.X.2.cr gagctgccagcagaagagag SEQ ID NO347Fy.X.3.cr agctgccagcagaagagagg SEQ ID NO348Fy.X.4.cr gccagcagaagagaggtctg SEQ ID NO349Fy.X.5.cr cagcagaagagaggtctgaaa SEQ ID NO350Kidd-allele-aJk.a.1cagccccatttgaggaca SEQ ID NO351Jk.a.2gccccatttgaggacatcta SEQ ID NO352Jk.a.3ccatttgaggacatctactttg SEQ ID NO353Jk.a.4atttgaggacmctactttgga SEQ ID NO354Jk.a.5gaggacatctactttggactct SEQ ID NO355Jk.a.1.cr cagagtccaaagtagatgtcctcSEQ ID NO356JK.a.2.cr agtccaaaagatgtcctcaaa SEQ ID NO357Jk.a.3.cr aaagtagatgtcctcaaatggg SEQ ID NO358Jk.a.4 cr tagatgtcctcaaatggggc SEQ ID NO359Jk.a.5.cr atgtcctcaaatggggctgSEQ ID NO360Kidd-allele-bJk.b.1tcagccccatttgagaacaSEQ ID NO361Jk.b.2gccccaatgagaacatctaSEQ ID NO362Jk.b.3cccatttgagacatctactttg SEQ ID NO363Jk.b.4atttgagaacatctactttggacSEQ ID NO364Jk.b.5gagaacatctactttggactctgSEQ ID NO365Jk.b.1.cr ccagagtccaaagtagatgttctc SEQ ID NO366Jk.b.2.cr agagtccaaagtagatgttctcaaa SEQ ID NO367Jk.b.3.cr ccaaagtagatgttctcaaatggSEQ ID NO368
Jk.b.4.cr agtagatgttctcaaatggggcSEQ ID NO369Jk.b.5.cr atgttctcaaatggggctga SEQ ID NO370Kell-K1-alleleKEL.1.1 tccttaaactttaaccgaatgct SEQ ID NO371KEL.1.2 ttaaactttaaccgaatgctgaga SEQ ID NO372KEL.1.3 aactttaaccgaatgctgagactt SEQ ID NO373KEL.1.4 aaccgaatgctgagacttctg SEQ ID NO374KEL.1.5 cgaatgctgagacttctgatgag SEQ ID NO375KEL 1.6 CR actcatcagaagtctcagcattc SEQ ID NO376KEL 1.7 CR tcagaagtctcagcattcggt SEQ ID NO377KEL 1.8 CR aagtctcagcattcggttaaagSEQ ID NO378KEL 1.9 CR tctcagcattcggttaaagtttaa SEQ ID NO379KEL 1.10 CR agcattcggttaaagtttaagga SEQ ID NO380Kell-K2-alleleKEL.2.1 ccttaaactttaaccgaacgctSEQ ID NO381KEL.2.2 aactttaaccgaacgctgaga SEQ ID NO382KEL.2.3 ctttaaccgaacgctgagacttSEQ ID NO383KEL.2.4 aaccgaacgctgagacttct SEQ ID NO384KEL.2.5 cgaacgctgagacttctgatg SEQ ID NO385KEL 2.6 CR tcatcagaagtctcagcgttc SEQ ID NO386KEL 2.7 CR cagaagtctcagcgttcggt SEQ ID NO387KEL 2.8 CR agtctcagcgttcggttaaag SEQ ID NO388KEL 2.9 CR tctcagcgttcggttaaagtt SEQ ID NO389KEL 2.10 CR agcgttcggttaaagtttaaggSEQ ID NO390Kell-K3-alleleKEL.3.1 aatctccatcacttcatggct SEQ ID NO391KEL.3.2 tccatcacttcatggctgtt SEQ ID NO392KEL.3.3 atcacttcatggctgtcca SEQ ID NO393KEL.3.4 acttcatggctgttccagtt SEQ ID NO394KEL.3.5 tcatggctgttccagtttc SEQ ID NO395KEL.3.1.cr agaaactggaacagccatgaa SEQ ID NO396KEL.3.2.cr aactggaacagccatgaagtg SEQ ID NO397KEL.3.3.cr tggaacagccatgaagtgatg SEQ ID NO398KEL.3.4.cr acagccatgaagtgatggag SEQ ID NO399KEL.3.5.cr gccatgaagtgatggagatt SEQ ID NO400Kell-K4-alleleKEL.4.1 tctccatcacttcacggct SEQ ID NO401KEL.4.2 ccatcacttcacggctgtt SEQ ID NO402KEL.4.3 cacttcacggctgttccaSEQ ID NO403KEL.4.4 acttcacggctgttccagSEQ ID NO404
KEL.4.5 tcacggctgttccagtttSEQ ID NO405KEL.4.1.cr aaactggaacagccgtgaa SEQ ID NO406KEL.4.2.cr ctggaacagccgtgaagtg SEQ ID NO407KEL.4.3.cr ggaacagccgtgaagtgatg SEQ ID NO408KEL.4.4.cr acagccgtgaagtgatggSEQ ID NO409KEL.4.5.cr gccgtgaagtgatggagaSEQ ID NO410Kell-K6-alleleKEL.6.1 tactgcctgggggctgccccgcc SEQ ID NO411KEL.6.2 tgggggctgccccgcctgt SEQ ID NO412KEL.6.3 gctgccccgcctgtgac SEQ ID NO413KEL.6.4 ctgccccgcctgtgacaaSEQ ID NO414KEL.6.5 gccccgcctgtgacaac SEQ ID NO415KEL.6.1.cr gttgtcacaggcggggc SEQ ID NO416KEL.6.2.cr ttgtcacaggcggggcagSEQ ID NO417KEL.6.3.cr tcacaggcggggcagcccSEQ ID NO418KEL.6.4.cr acaggcggggcagccccca SEQ ID NO419KEL.6.5.cr aggcggggcagccccca SEQ ID NO420Kell-K7-alleleKEL.7.1 actgcctgggggctgcctcgccSEQ ID NO421KEL.7.2 cctgggggctgcctcgcctgt SEQ ID NO422KEL.7.3 ggctgcctcgcctgtgacSEQ ID NO423KEL.7.4 ctgcctcgcctgtgacaacc SEQ ID NO424KEL.7.5 gcctcgcctgtgacaaccSEQ ID NO425KEL.7.1.cr ggttgtcacaggcgaggcSEQ ID NO426KEL.7.2.cr ggttgtcacaggcgaggcag SEQ ID NO427KEL.7.3.cr ttgtcacaggcgaggcagccc SEQ ID NO428KEL.7.4.cr acaggcgaggcagcccccagg SEQ ID NO429KEL.7.5.cr aggcgaggcagcccccagg SEQ ID NO430Lutheran a-alleleLu.a.1 ggagctcgcccccgcct SEQ ID NO431Lu.a.2 gctcgcccccgcctagc SEQ ID NO432L.u.a.3 cgcccccgcctagcctc SEQ ID NO433Lu.a.4 cccccgcctagcctcgg SEQ ID NO434Lu.a.5 cccgcctagcctcggct SEQ ID NO435Lu.a.1 CRagccgaggctaggcggg SEQ ID NO436Lu.a.2 CRccgaaggctaggcgggggSEQ ID NO437Lu.a.3 CRgaggctaggcgggggcg SEQ ID NO438Lu.a.4 CRgctaggcgggggcgagc SEQ ID NO439Lu.a.5 CRaggcggggggcgagctccSEQ ID NO440Lutheran b-allele
Lu.b.1gggagctcgcccccacct SEQ ID NO441Lu.b.2gagctcgcccccacctagcSEQ ID NO442Lu.b.3ctcgcccccacctagcctcSEQ ID NO443Lu.b.4cccccacctagcctcggctSEQ ID NO444Lu.b.5cccacctagcctcggctgaSEQ ID NO445Lu.b.1 CR tcagccgaggctaggtgggSEQ ID NO446Lu.b.2 CR agccgaggctaggtgggggSEQ ID NO447Lu.b.3 CR gaggctaggtgggggcgagSEQ ID NO448Lu.b.4 CR gctaggtgggggcgagctcSEQ ID NO449Lu.b.5 CR aggtgggggcgagctccc SEQ ID NO450MNS M-alleleM.1 gtgagcatatcagcatcaag SEQ ID NO451M.2 atcagcatcaagtaccactgg SEQ ID NO452M.3 catcaagtaccactggtgtg SEQ ID NO453M.4 taccactggtgtggcaatgc SEQ ID NO454M.5 ctggtgtggcaatgcaca SEQ ID NO455M.1.crtgtgcattgccacaccagtSEQ ID NO456M.2.crgcattgccacaccagtggta SEQ ID NO457M.3.crccacaccagtggtacttgatg SEQ ID NO458M.4.craccagtggtacttgatgctSEQ ID NO459M.5.crcttgatgctgatatgctcac SEQ ID NO460MNS N-alleleN.1 tgtgagcatatcagcattaag SEQ ID NO461N.2 atcagcattaagtaccactgaggSEQ ID NO462N.3 cattaagtaccactgaggtgg SEQ ID NO463N.4 accactgaggtggcaatgcSEQ ID NO464N.5 ctgaggtggcaatgcacact SEQ ID NO465N.1.crgtgtgcattgccacctcagt SEQ ID NO466N.2.crgcattgccacctcagtggta SEQ ID NO467N.3.crccacctcagtggtacttaatgc SEQ ID NO468N.4.crcctcagtggtacttaatgct SEQ ID NO469N.5.crcttaatgctgatatgctcaca SEQ ID NO470MNS S-allelebig.S.1 tttgctttataggagaaatgggaSEQ ID NO471big.S.2 ctttataggagaaatgggaca SEQ ID NO472big.S.3 ttataggagaaatgggacaacttg SEQ ID NO473big.S.4 gagaaatgggacaacttgtcc SEQ ID NO474big.S.5 aaatgggacaacttgtccatc SEQ ID NO475big.S.1.crgatggacaagttgtcccattt SEQ ID NO476big.S.2.crgacaagttgtcccatttctcc SEQ ID NO477
big. S.3.cr aagttgtcccatttctcctataSEQ ID NO478big S.4.crtgtcccatttctcctataaagca SEQ ID NO479big.S.5.crcccatttctcctataaagcaaaa SEQ ID NO480MNS s-allelelittle.s.1tgctttataggagaaacggga SEQ ID NO481little.s.2tttataggagaaacgggaca SEQ ID NO482little.s.3ggagaaacgggacaacttg SEQ ID NO483little.s.4gagaaacgggacaacttgtc SEQ ID NO484little.s.5aaacgggacaacttgtccat SEQ ID NO485little.s.1.cr tggacaagttgtcccgttt SEQ ID NO486little.s.2.cr acaagttgtcccgtttctcc SEQ ID NO487little.s.3.cr agttgtcccgtttctcctata SEQ ID NO488little.s.4.cr tgtcccgtttctcctataaagcSEQ ID NO489little.s.5.cr cccgtttctcctataaagca SEQ ID NO490MNS U-positive-alleleU.pos.1 ttgctgctctctttagctcc SEQ ID NO491U.pos.2 ctctctttagctcctgtagtgat SEQ ID NO492U.pos.3 agctcctgtagtgataatactca SEQ ID NO493U.pos.4 gtagtgataatactcattatttttg SEQ ID NO494U.pos.5 taatactcattatttttggggtg SEQ ID NO495U.pos.1.crcaccccaaaaataatgagtatta SEQ ID NO496U.pos.2.crcaaaaataatgagtattatcactacaSEQ ID NO497U.pos.3.cragtattatcactacaggagctaaa SEQ ID NO498U.pos.4.cratcactacaggagctaaagag SEQ ID NO499U.pos.5.crgagctaaagagagcagcaaa SEQ ID NO500MNS U-negative-alleleU.neg.1 ttttgctgctctctttatctccSEQ ID NO501U.neg.2 gctctctttatctcctgtagagat SEQ ID NO502U.neg.3 tatctcctgtagagataacactca SEQ ID NO503U.neg.4 gtagagataacactcattattttt SEQ ID NO504U.neg.5 taacactcattatttttggggtSEQ ID NO505U.neg.1.craccccaaaaataatgagtgttaSEQ ID NO506U.neg.2.craaaaataatgagtgttatctctaca SEQ ID NO507U.neg.3.cragtgttatctctacaggagataaa SEQ ID NO508U.neg.4.cratctctacaggagataaagagag SEQ ID NO509U.neg.5.crgagataaagagagcagcaaaatta SEQ ID NO510Rhesus C-allele(307T)Rh.big.C.1tgagccagttcccttctgg SEQ ID NO511Rh.big.C.2gagccagttcccttctggSEQ ID NO512Rh.big.C.3ctgagccagttcccttctg SEQ ID NO513
Rh.big.C.4 ccttctgggaaggtggtcSEQ ID NO514Rh.big.C.5 ccttctgggaaggtggtca SEQ ID NO515Rh.big.C.1.cr tgaccaccttcccagaagg SEQ ID NO516Rh.big.C.2.cr gaccaccttcccagaaggSEQ ID NO517Rh.big.C.3.cr ccagaagggaactggctcSEQ ID NO518Rh.big.C.4.cr ccagaagggaactggctca SEQ ID NO519Rh.big.C.5.cr cagaagggaactggctcag SEQ ID NO520Rhesus c-allele(307C)Rh.little.c.1 gagccagttccctcctggSEQ ID NO521Rh.little.c.2 agccagttccctcctgg SEQ ID NO522Rh.little.c.3 tgagccagttccctcctgSEQ ID NO523Rh.little.c.4 cctcctgggaaggtggt SEQ ID NO524Rh.little.c.5 cctcctgggaaggtggtcSEQ ID NO525Rh.little.c.1.cr gaccaccttcccaggaggSEQ ID NO526Rh.little.c.2.cr accaccttcccaggagg SEQ ID NO527Rh.little.c.3.cr ccaggagggaactggct SEQ ID NO528Rh.little.c.4.cr ccaggagggaactggctcSEQ ID NO529Rh.little.c.5.cr caggagggaactggctcaSEQ ID NO530Rhesus BigC-intron2-specific-insert-alleleRhC.intron.2.1 agggtgccctttgtcacttc SEQ ID NO531RhC.intron.2.2 gccctttgtcacttcccagt SEQ ID NO532RhC.intron.2.3 cctttgtcacttcccagtgg SEQ ID NO533RhC.intron.2.4 ttgtcacttcccagtggtacaaSEQ ID NO534RhC.intron.2.5 tcacttcccagtggtacaatcaSEQ ID NO535RhC.intron.2.1.cr gaagtgacaaagggcaccct SEQ ID NO536RhC.intron.2.2.cr actgggaagtgacaaagggc SEQ ID NO537RhC.intron.2.3.cr ccactgggaagtgacaaagg SEQ ID NO538RhC.intron.2.4.cr tgtaccactgggaagtgacaaaSEQ ID NO539RhC.intron.2.5.cr tgattgtaccactgggaagtgaSEQ ID NO540Rhesus BigC-intron2-specitic-insert-negative-allelePCR的设置被选择为使得仅当存在bigC-intron2-specific-insert时才形成PCR产物。Antitag(用于去除背景)用于计算基因分型的比率。
Rhesus E-alleleRh.big.E.1 gccaagtgtcaactctcctct SEQ ID NO541Rh.big.E.2 caagtgtcaactctcctctgct SEQ ID NO542Rh.big.E.3 gtgtcaactctcctctgctgag SEQ ID NO543Rh.big.E.4 caactctcctctgctgagaagtcSEQ ID NO544Rh.big.E.5 tctcctctgctgagaagtcc SEQ ID NO545Rh.big.E.1.crggacttctcagcagaggagag SEQ ID NO546
Rh.big.E.2.crcttctcagcagaggagagttga SEQ ID NO547Rh.big.E.3.crctcagcagaggagagttgacac SEQ ID NO548Rh.big.E.4.crgcagaggagagttgacacttg SEQ ID NO549Rh.big.E.5.crgaggagagttgacacttggcSEQ ID NO550Rhesus c-alleleRh.little.e.1gccaagtgtcaactetgctct SEQ ID NO551Rh.little.e.2caagtgtcaactctgctctgct SEQ ID NO552Rh.little.e.3tgtcaactctgctctgctgag SEQ ID NO553Rh.little.e.4caactctgctctgctgagaag SEQ ID NO554Rh.little.e.5tctgctctgctgagaagtccSEQ ID NO555Rh.little.e.1.cr ggacttctcagcagagcagag SEQ ID NO556Rh.little.e.2.cr ttctcagcagagcagagttga SEQ ID NO557Rh.little.e.3.cr tcagcagagcagagttgacac SEQ ID NO558Rh.little.e.4.cr gcagagcagagttgacacctg SEQ ID NO559Rh.little.e.5.cr gagcagagttgacacttggcSEQ ID NO560Rhesus RHD-alleleRhD1 ttccccacagctccatcat SEQ ID NO561RhD2 acagctccatcatgggctacSEQ ID NO562RhD3 tccatcatgggctcaacttcSEQ ID NO563RhD4 tcatgggctacaacccagctSEQ ID NO564RhD5 gggctacaacttcagcttgct SEQ ID NO565RhDcr1 agcaagctgaagttgtagccc SEQ ID NO566RhDcr2 agctgcagttgtagcccatga SEQ ID NO567RhDcr3 gaagttgtagcccatgatggSEQ ID NO568RhDcr1 gcccatgatggagctgt SEQ ID NO569RhDcr5 tgatggagctgtggggaa SEQ ID NO570Rhesus RHD-negative-allelePCR的设置被选择为使得仅当存在RHD基因时才形成PCR产物。Antitag(用于去除背景)用于计算基因分型的比率。
Rhesusr′s-alleler′s.T.1 ggaaggtcaacttggtgca SEQ ID NO571r′s.T.2 ggaaggtcaacttggtgcagt SEQ ID NO572r′s.T.3 caacttggtgcagttggtg SEQ ID NO573r′s.T.4 acttggtgcagttggtggt SEQ ID NO574r′s.T.5 ttggtgcagttggtggtgatSEQ ID NO575r′s.T.1.cr catcaccaccaactgcaccaSEQ ID NO576r′s.T.2.cr caccaccaactgcaccaagtSEQ ID NO577r′s.T.3.cr accaactgcaccaagttgacSEQ ID NO578
r′s.T.4.cractgcaccaagttgaccttcc SEQ ID NO579r′s.T.5.crtgcaccaagttgaccttcc SEQ ID NO580Rhesus r′s-negative-allelePCR的设置被选择为使得仅当存在r′s基因时才形成PCR产物。Antitag(用于去除背景)用于计算基因分型的比率。
Rhesus DVI-allelePCR的设置被选择为使得仅当存在正常RHD基因时才形成PCR产物。Antitag(用于去除背景)用于计算基因分型的比率。
DVI-probes for presence normal RHD alleleRh.DVI.1 atttcaaccctcttggcctt SEQ ID NO581Rh.DVI.2 aaccctcttggcctttgttt SEQ ID NO582Rh.DVI.3 tcttggcctttgtttccttg SEQ ID NO583Rh.DVI.4 ggtatcagcttgagagctcg SEQ ID NO584Rh.DVI.5 atcagcttgagagctcggag SEQ ID NO585Rh.DVI.1.cr aaggccaagagggttgaaat SEQ ID NO586Rh.DVI.2.cr aaacaaaggccaagagggtt SEQ ID NO587Rh.DVI.3.cr caaggaaacaaaggccaaga SEQ ID NO588Rh.DVI.4.cr cgagctctcaagctgatacc SEQ ID NO589Rh.DVI.5.cr ctccgagctctcaagctgat SEQ ID NO590Rhesus RHD-Pseudogene-mutation-alleleRhD Y 1 tttctttgcagacttaggtgc SEQ ID NO591RhD Y 2 ctttgcagacttaggtgcaca SEQ ID NO592RhD Y 3 tttgcagacttaggtgcacagtSEQ ID NO593RhD Y 4 acttaggtgcacagtgcgg SEQ ID NO594RhD Y 5 cttaggtgcacagtgcggt SEQ ID NO595RhD Y cr 1 caccgcactgtgcacctaa SEQ ID NO596RhD Y cr 2 ccgcactgtgcacctaagtc SEQ ID NO597RhD Y cr 3 gcactgtgcacctaagtctgc SEQ ID NO598RhD Y cr 4 tgcacctaagtctgcaaaga SEQ ID NO599RhD Y cr 5 cacctaagtctgcaaagaaatagcg SEQ ID NO600Rhesus RHD-Pseudogcnc-normal-alleleRhD non Y 1 ctatttctttgcagacttatgtgc SEQ ID NO601RhD non Y 2 tctttgcagacttatgtgcacaSEQ ID NO602RhD non Y 3 ttgcagacttatgtgcacagtgSEQ ID NO603RhD non Y 4 acttatgtgcacagtgcggt SEQ ID NO604RhD non Y 5 cttatgtgcacagtgcggtg SEQ ID NO605RhD non Y cr 1 acaccgcactgtgcacataa SEQ ID NO606RhD non Y cr 2 accgcactgtgcacataagtc SEQ ID NO607RhD non Y cr 3 gcactgtgcacataagtctgc SEQ ID NO608
RhD non Y cr 4tgtgcacataagtctgcaaagSEQ ID NO609RhD non Y cr 5cacataagtctgcaaagaaatagcgSEQ ID NO610Yt-a-alleleYt.a.1gcgggagacttccacggSEQ ID NO611Yt.a.2gggagacttccacggcct SEQ ID NO612Yt.a.3gagacttccacggcctgc SEQ ID NO613Yt.a.4gacttccacggcctgcaSEQ ID NO614Yt.a.5ttccacggcctgcaggta SEQ ID NO615Yt.a.1 CR tacctgcaggccgtggaa SEQ ID NO616Yt.a.2 CR tgcaggccgtggaagtcSEQ ID NO617Yt.a.3 CR gcaggccgtggaagtctc SEQ ID NO618Yt.a.4 CR aggccgtggaagtctccc SEQ ID NO619Yt.a.5 CR ccgtggaagtctcccgcSEQ ID NO620Yt-b-alleleYt.b.1gcgggagacttcaacggc SEQ ID NO621Yt.b.2gggagacttcaacggcctg SEQ ID NO622Yt.b.3gagacttcaacggcctgca SEQ ID NO623Yt.b.4gacttcaacggcctgcag SEQ ID NO624Yt.b.5ttcaacggcctgcaggtaa SEQ ID NO625Yt.b.1 CR ttacctgcaggccgttgaa SEQ ID NO626Yt.b.2 CR ctgcaggccgttgaagtc SEQ ID NO627Yt.b.3 CR tgcaggccgttgaagtctc SEQ ID NO628Yt.b.4 CR caggccgttgaagtctccc SEQ ID NO629Yt.b.5 CR gccgttgaagtctcccgc SEQ ID NO630使用已有的软件程序，本领域人员将能够设计出针对其他血细胞抗原等位基因的探针。
DNA阵列可以是包括例如72种不同探针的有限阵列，不过优选地所述阵列包括基本上所有以上所列的探针。
为了有助于促进探针与阵列支持物的结合并能够充分接近扩增产物，探针寡聚物通常会具有接头分子和反应基团，优选地位于寡聚物的5′端，用于与支持物结合。所有这些对于本领域人员来说都是熟知的，仅仅作为例证而言，合适的接头例如是C6(1，6-亚己基(hexamethylene)，即-(CH2)6-)，而合适的反应基团例如是氨基。
阵列支持物探针位于合适的支持物上，它们通常通过化学方式与之连接。支持物可以是玻片或任何其他合适的支持物，例如塑料、硅或者多孔金属氧化物。通常要对支持物进行预处理以增强寡聚物的结合，例如通过以聚-L-赖氨酸、氨基硅烷、醛或环氧树脂(epoxy)进行包被而预处理。可以采用各种技术以实现探针的结合，例如UV照射、非特异性静电吸附、采用碳二亚胺(carbodiimide)(EDC)化学方法通过5′氨基或磷酸基团进行共价结合，等等。
为了避免非特异性杂交，通常优选地将携带探针的阵列支持物与预杂交溶液进行孵育，这是本领域人员所熟知的，而为了准备用于杂交的探针，优选地将其变性，例如通过在大约80℃或者更高的温度进行加热。
对照为了对背景进行校正，优选地加入一些具有不存在于供者DNA中的序列的探针，可预期这些探针不与扩增产物杂交。可通过减去在这些背景对照点上测得的信号来校正在等位基因特异性探针点上测得的信号。此类背景校正探针或者Antitag的合适的实例是以下探针a3、a9、a17、a23、a27、a33、a35、a38、a42和a43a3 cagaccataagcacaggcgtSEQ ID NO631，a9 gctcgtccacagtgcgttatSEQ ID NO632，a17 cggcgttcaagcaaaccgaaSEQ ID NO633，a23 gacatatagctccactcagaSEQ ID NO634，a27 tagggtactgatgagcactcSEQ ID NO635，a33 tcagccctatcgcaggatgtSEQ ID NO169，a35 gagacacttgacagtagccaSEQ ID NO170，a38 ggcagggcacctcagtttatSEQ ID NO171，a42 tcaccagccagactgtgtagSEQ ID NO172，a43 cttcacgcaagttgtccagaSEQ ID NO173。
此外，可以加入至少一种阳性探针。这种探针应该互补于加入到扩增产物中的一种标记的阳性对照寡聚物。例如阳性探针可以是以下寡聚物CS05CS05gtcctgacttctagctcatgSEQ ID NO174，其能够与其标记的互补物catgagctagaagtcaggac杂交，后者被加入到扩增产物混合物中，然后将混合物施加到DNA阵列上。
杂交条件扩增产物与DNA阵列中的探针通常在50至65℃之间，优选地在大约56℃，杂交一段充分的时间，例如15分钟至10小时，更优选地为30分钟至4小时。
阵列布局阵列的布局完全是随心所欲的。通常，一个阵列支持物可携带大量的点，这些点位于可以是彼此相同(这是优选的)或者不同的多个区(blocks)内。每个点含有一种探针，且优选地将相似的探针置于彼此相距尽可能远的点上。优选地，各个等位基因特异性探针在每个区均有一个点，此外每个区还额外含有一些对照点。这样，一个区可包括128个等位基因特异性点、5个背景对照和一个阳性对照，总共134个点。
测定荧光信号标记的扩增产物与特定点的结合是基于这些点所发出的荧光信号而确定的。信号测定可以使用光电倍增管、扫描激光系统或者任何本领域人员已知的其他装置和技术。
评估所得数据为了就供者DNA的血细胞抗原基因型对所得数据进行评估，可使用Genepix Pro 5.0(Axon Instruments Inc.)将荧光信号强度转化为可进一步分析(例如采用Excel分析)的信号值。
实施例以下实施例仅用于阐述本发明，其无意于以任何方式限制本发明。在这些实施例中，实施例1在双等位基因人血小板抗原系统HPA-1至5和Gov上测试了本发明通过特定的多重PCR并结合等位基因特异性探针的DNA微阵列进行血细胞抗原基因分型的构思。对一组盲化的58份供者样品进行了这6种HPA系统的基因分型，其中仅在一个HPA系统中发现了一处偏差。可通过调整评分标准并对新的格式进行验证而克服这一偏差。然后在实施例2中证实了本发明的多重PCR以表2中的所有引物均得到良好结果。
实施例1表1显示了点样于聚赖氨酸包被的玻片上的探针的序列和Tm值。HPA-3和5的SNP分别位于富GC区域和少GC区域。因此，这些探针较其他寡核苷酸更短些或更长些，且Tm值在60-65℃以外。使用具有16SMP 3微点样针(Telechem)的Omnigrid100微阵列仪(Genemachines)，将溶解于0.4M NaHCO3(pH9.4)中的浓度为50μM的探针点样于聚-L-赖氨酸包被的玻片上。每一玻片含有48个区，每个区134个点，其对应于128种等位基因特异性探针、5种背景对照以及阳性对照CS05。相似的探针被点样于彼此相距尽可能远的点上。通过以250mJ/cm2(Stratalinkermodel 1800 UV Illuminator，Stratagene)进行UV照射使DNA交联。为防止非特异性杂交，将载片以100μl的预杂交溶液[400ng/μl酵母tRNA(Roche)，400ng/μl鲱精DNA(Gibco BRL)，5xDenhardt溶液，3.2xSSC和O.4％SDS]在65℃孵育30分钟。杂交前，将含有预杂交混合物的载片在80℃孵育2分钟以使得点样的DNA变性。预杂交后，将载片在2xSSC中室温条件下洗涤5分钟，共两次，并分别以70％(两次)、90％和100％的乙醇脱水各5分钟。
仅针对6种血小板抗原进行多重PCR，使用了5nM的各种HPA和gov引物(7.5nM的各种HPA-3引物)和1.2μM的各种标记了Cy5的通用引物。此外，如实施例2所述的多重PCR进行多重PCR。按照Pastinenet al.(2000)所述制备杂交反应室。使用硅橡胶格栅将玻片分成24隔不同的格。在对载片进行预加热(65℃，75分钟)的过程中，将40μl的多重PCR产物在95℃变性5分钟，置于冰上，并加入120μl冰冷的杂交溶液[2ng Cy5-标记的CS05(5′-catgagctagaagtcaggac-3′)的互补链和4xSSC]。为进行杂交，每个阵列加入80μl的该混合物并在56℃孵育3.5小时。然后将载片自600ml3xSSC中的杂交容器中取出，在50℃以2xSSC/0.1％SDS洗涤2次，在室温下以0.2xSSC洗涤2次，均各5分钟。以800rpm离心5分钟使玻片干燥，在Agilent G2565BA微阵列扫描仪中以10μm的分辨率进行扫描。光电倍增管电压持续设定在100％。每一载片分析6个不同供者的PCR产物，显示于图3。Genepix分析后，将所得数据转化成Excel。使用一组具有已知HPA分型的12个供者的样品来确定HPA评分标准。表3列出了评分标准。计算阴性对照(C)的中位信号强度Fmed平均值，将该背景值加上3个标准差自各个寡聚物的中位强度Fmed中减去，得到域值Fth，显示于表3第3栏。如果相配探针(allele a)和不相配探针(allele b)的Fth均为负值，则将该引物对自基因分型结果中排除。为进行基因分型，计算一组中的两个寡核苷酸(一个来自allele a，另一个来自allele b)的强度比率。在第6栏中计算出a-等位基因的Fmed-Fbg强度与两个等位基因的Fmed-Fbg强度之和的比率。这一公式a/(a+b)已经由Hinds etal.(2004)披露。原则上，对于基因型aa、ab或bb，这些比率的值应该分别为大约1.0、0.5或0.0。仅使用了正的Fmed-Fbg值，而负值在第5栏被设为1。随后，在第7栏中将这些比率转化为基因型。对于HPA-1、-2、-4和-5，比值超过0.75被分型为aa，低于0.25为bb，而在0.35至0.65之间为ab。由于PCR片段与代表a等位基因的探针具有高结合性，因此将HPA-3和Gov的标准分别调整为对于aa分别为0.95和0.8，对于bb分别为0.45和0.35，对于ab分别为在0.55至0.85之间和在0.45至0.7之间。在第7栏，频率最高的基因型以橙色示出。对于每一血型、每一区和每一样品，均如此进行。使用12个供者的样品来验收那些正确预测基因型的探针组。作为用于最终评分的标准如果预测出的是纯合子基因型，50％所使用的探针组应该预测出基因型，而如果预测出的是杂合子基因型，40％所使用的探针组应该预测出基因型(对于HPA-3为30％)。采用这些标准对一组盲化的58份样品进行基因分型。其中9份样品的结果显示于表4。所有58份样品的基因型均列于表5。56份样品的基因型可以按照本标准进行评分。仅在1份样品中获得了与其已知的基因型有偏差的结果。在该例中，33.3％的探针组指示是HPA-3bb基因型，而37.5％指示是HPA-3ab基因型，如表6所示。调整评分标准后使得分型结果完全一致。
实施例2以表2所列的引物构建引物混合物。PCR混合物中的引物浓度也列于表2。使用Qiagen多重试剂盒进行多重PCR。在多重PCR中，退火温度在PCR过程中没有改变，使用了两种荧光标记的通用引物。更具体地，在开始时，PCR混合物含有极少量的嵌合引物(5nM)和过量的荧光标记的通用引物(每种嵌合引物0.2μM的各种通用引物)。在温度方面，PCR开始为95℃，15分钟，随后是45个循环的94℃持续30秒，57℃持续90秒，72℃持续90秒，方案以72℃持续10分钟的最后聚合步骤结束。在最初几个循环中，扩增出极少量的PCR产物，不过如图1中的8％丙烯酰胺凝胶电泳所见，其足以在随后的循环中用作通用MAPH引物的模板。通过在5’端给MAPH引物标记上荧光标记物Cy5，仅需要两种荧光标记的引物便可对PCR产物进行高效标记。如White et al.(2002)所述，在ABI 3700毛细管测序仪(Applied Biossystems)上进行观察可对多重PCR产物进行更好的辨别，在本例中，仅有MAPH-rev标记了荧光团(FAM)。如图2的层析图所示，以所有设计的PCR引物进行多重PCR均产生了预期的峰型。这表明所有的基因片段均以相似的产率被扩增。
表1、探针的序列和解链温度。



每一寡核苷酸探针在其均具有氨基和C6间隔物等位基因特异性探针中多态性位点被突出显示。
表2、用于多重PCR产物的引物


*嵌合引物的Tm值不含MAPH-标签。
#Cy5标记的是5′端。
RHDψ-right和RHD-right C引物的基因特异性部分已被公开(Maaskant-van wijk et al.Transfusion 39，546，1999)。公开的引物序列Rex6AD35′-HPA-TGTCTAGTTTCTTACCGGCAAGT-3′；R10685′ATTGCCGGCTCCGACGGTATC-3′)BigC-left的基因特异性部分已作为公开引物部分被公开且BigC-rightintron2、RHex2rev、RHCEex5for引物部分已经被公开(Tax et al.Transfusion 42，634-44，2002)。
公开的引物序列R3485′-CTGAACAGTGTGATGACC-3′；c/rev5′-TGATGACCACCTTCCCAGG-3′；R6375′GCCCTCTTCTTGTGGATG-3′；C/for5′-CAGGGCCACCATTTGAA-3′；C/rev5′-GAACATGCCACTTCACTCCAG-3′)MN-引物部分已经被公开(Akane et al.Vox Sang，79，183-7，2000)公开的引物序列MN-left5′-GAGGGAATTTGTCTTTTGCA-3′和MN-right5′-AGAGGCAAGAATTCCTCC-3′。
表3、用于HPA-1基因分型的评分标准

样品的频率最高的基因型结果以粗体表示。被排除的基因型结果以粗体表示并加框。
表4、9份样品盲组的基因分型结果


样品的频率最高的基因型结果以粗体表示。被排除的基因型结果以粗体表示并加框。
表5、58份样品盲组的基因型


当对纯合子基因型的预测基因型高于50％或者对杂合子基因型的预测基因型高于40％(对HPA-3ab＞30％)时，基因型以粗体表示。
表6、与6种其他样品的结果相比，样品9的HPA-3基因分型结果

样品的频率最高的基因型结果以粗体表示。被排除的基因型结果以粗体表示并加框。样品9的基因型应该是HPA-3bb，因此以大写字母表示该样品的bb基因型。
表7、为多重PCR所额外测试的引物在一多重PCR中已经将这些引物与SEQ ID NO15至40的引物一起进行了测试。获得了具有正确大小的PCR产物。

*Tm值不包括MAPH标签。
参考文献-Alkane A，Mizukami H and Shiono H.2000.Classification of standardalleles of the MN blood group system.Vox Sang 79，183-187.
-Belgrade P，MarinoMM，Lubin M and Barany F.1996.A MultiplexPCR-Ligase Detection Reaction Assay for Human Identity Testing.GenomeSci.Technol.1，77-87.
-Berry JE，Murphy CM，Smith GA，Ranasinghe E，Finberg R，Walton J，Brown J，Navarrete C，Metcalfe P and Ouwehand WH.2000.Detection ofGov system antibodies by MAIPA reveals an immunogenicity similar to theHPA-5 alloantigens.Br J Haematol.110，735-742.
-Beuningen R van，van Damme H，Boender P，Bastiaensen N，Chan Aand Kievits T.2001.Fast and specific hybridisation using flow-throughmicroarrays on porous metal oxide.Clin.Chem.47，1931-1933.
-Brownie J，Shawcross S，Theaker J，Whitcombe D，Ferrie R，NewtonC and Little S.1997.The elimination of primer-dimer accumulation in PCR.Nucl.Acids Res.25，3235-3241.
-Chamberlain JS，Gibbs RA，Ranier JE，Nguyen PN，and Caskey CT.1988.Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus viamultiplex DNA amplification.Nucl.Acids Res.16，11141-11156.
-Cheek BJ，Steel AB，Torres MP，Yu YY and Yang H.2001.Chemiluminescence detection for hybridization assays on the flow-thru chip，a three-dimensional microchannel biochip.Anal Chem.73，5777-5783.
-Evans JG and Lee-Tataseo C.2002.Determination of the factor VLeiden single-nucleotide polymorphism in a commercial clinical laboratoryby use of NanoChip microelectronic array technology.Clin Chem.48，1406-1411.
-Fan JB，Chen X，Halushka MK，Berno A，Huang X，Ryder T，LipshutzRJ，Lockhart DJ and Chakravarti A.2000.Parallel genotyping of humanSNPs using generic high-density oligonucleotide tag arrays.Genome Res.10，853-860.
-Fodor SP，Read JL，Pirrung MC，Stryer L，Lu AT and Solas D.1991.Light-directed，spatially addressable parallel chemical synthesis.Science 251，767-773.
-Guo Z，Gatterman MS，Hood L，Hansen JA and Petersdorf EW.2001.Oligonucleotide arrays for high-throughput SNPs detection in the MHC classI genesHLA-B as a model system.Genome Res.12，447-457.
-Hacia JG，Brody LC，Chee MS，Fodor SP and Collins FS.1996.Detection of heterozygous mutations in BRCA1 using high densityoligonucleotide arrays and two-colour fluorescence analysis.Nat Genet.14，441-447.
-Heath KE，Day INM and Humphries SE.2000.Universal primerquantitative fluorescent multiplex(UPQFM)PCRa method to detect majorand minor rearrangements of the low density lipoprotein receptor gene.J.Med.Genet.37，272-280.
-Hinds DA，Stokowski RP，Patil N，Konvicka K，Kershenobich D，CoxDR and Ballinger DG.2004.Matching strategies for genetic associationstudies in structured populations.Am J Hum Genet.74，317-325.
-Huang JX，Mehrens D，Wiese R，Lee S，Tam SW，Daniel S，Gilmore J，Shi M and Lashkari D.2001.High-throughput genomic and proteomicanalysis using microarray technology.Clin Chem.47，1912-1916.
-Iwasaki H，Ezura Y，Ishida R，Kajita M，Kodaira M，Knight J，DanielS，Shi M and Emi M.2002.Accuracy of genotyping for single nucleotidepolymorphisms by a microarray-based single nucleotide polymorphism typingmethod involving hybridization of short allele-specific oligonucleotides.DNARes.9，59-62.
-Jobs M，Howell WM，Stromqvist L，Mayr T and Brookes AJ.2003.DASH-2flexible，low-cost，and high-throughput SNP genotyping bydynamic allele-specific hybridization on membrane arrays.Genome Res.13，916-924.
-Kajiyama T，Miyahara Y，Kricka LJ，Wilding P，Graves DJ，Surrey Sand Fortina P.2003.Genotyping on a thermal gradient DNA chip.GenomeRes.13，467-475.
-Lindroos K，Sigurdsson S，Johansson K，Ronnblom L and SyvanenAC.2002.Multiplex SNP genotyping in pooled DNA samples by afour-colour microarray system.Nucleic Acids Res.30，e70.
-Lu M，ShortreedMR，Hall JG，Wang L，Berggren T，Stevens PW，KelsoDM，Lyamichev V，Neri B and Smith LM.2002.A surface invasive cleavageassay for highly parallel SNP analysis.Hum.Mutat.19，416-422.
-Maaskant-van Wijk PA，Faas BH，de Ruijter JA，Overbeeke MA，vondem Borne AE，van Rhenen DJ and van der Schoot CE.1999.Genotyping ofRHD by multiplex polymerase chain reaction analysis of six RHD-specificexons.Transfusion 39，546.
-Metcalfe P，Watkins NA，Ouwehand WH，Kaplan C，Newman P，Kekomaki R，De Haas M，Aster R，Shibata Y，Smith J，Kiefel V and Santoso S.2003.Nomenclature of human platelet antigens.Vox Sang.85，240-245.
-Miller SA，Dykes DD and Polesky HF.1988.A simple salting outprocedure for extracting DNA from human nucleated cells.Nucl.Acids Res.16，1215.
-Mujumdar RB，Ernst LA，Mujumdar SR，Lewis CJ and Waggoner AS.1993.Cyanine dye labeling reagentssulfoindocyanine succinimidyl esters.Bioconjug.Chem.4，105-111.
-Park SJ，Taton TA andMirkin CA.2002.Array-based electricaldetection of DNA with nanoparticle probes.Science 295，1503-1506.
-Pastinen T，Kurg A，Metspalu A，Peltonen L and Syvanen AC.1997.Minisequencinga specific tool for DNA analysis and diagnostics onoligonucleotide arrays.Genome Res.7，606-614.
-Pastinen T，Raitio M，Lindroos K，Tainola P，Peltonen L and SyvanenAC.2000.A system for specific，high-throughput genotyping byallele-specific primer extension on microarrays.Genome Res.10，1031-1042.
-Prix L，Uciechowski P，Bockmann B，Giesing M and Schuetz AJ.2002.Diagnostic biochip array for fast and sensitive detection of K-ras mutations instool.Clin.Chem.48，428-435.
-Randen I，Sorensen K，Killie MK and Kjeldsen-Kragh J.2003.Rapidand reliable genotyping of human plaelet antigen(HPA)-1，-2，-3，-4，and-5 a/band Gov a/b by melting curve analysis.
-Transfusion 43，445-450.redid ME.2003.Applications of DNA-basedassays in blood group antigen and antibody identification.Transfusion43，1748-1757.
-Seltsam A，Wagner FF，Salama A and Flegel WA.2003.Antibodies tohigh-frequency antigens may decrease the quality of transfusion supportanobservational study.Transfusion 43，1563-1566.
-Shuber AP，Grondin VJ and Klinger KW.1995.A simplified procedurefor developing multiplex PCRs.Genome Research 5，488-493.
-Tax MG，van der Schoot CE，van Doom R，Douglas-Berger L，vanRhenen DJ and Maaskant-vanWijk PA.2002.RHC and RHc genotyping indifferent ethnic groups.Transfusion 42，634-444.
-Wang DG，Fan JB，Siao CJ，Berno A，Young P，Sapolsky R，GhandourG，Perkins N，Winchester E，Spencer J，Kruglyak L，Stein L，Hsie L，Topaloglou T，Hubbell E，Robinson E，Mittmann M，Morris MS，Shen N，Kilburn D，Rioux J，Nusbaum C，Rozen S，Hudson TJ and Lander ES.1998.Large-Scale Identification，Mapping，and Genotyping of Single-NucleotidePolymorphisms in the Human Genome.Science 280，1077-1082.
-Wen WH，Bernstein L，Lescallett J，Beazer-Barclay Y，Sullivan-HalleyJ，White M and Press MF.2000.Comparison of TP53 mutations identified byoligonucleotide microarray and conventional DNA sequence analysis.CancerRes.60，2716-2722.
-Wen SY，Wang H，Sun OJ，Wang SQ.2003.Rapid detection of theknown SNPs ofCYP2C9 using oligonucleotide microarray.World JGastroenterol.9，1342-1346.
-White S，Kalf M，Liu Q，Villerius M，Engelsma D，Kriek M，VollebregtE，Bakker B，van Ommen GJ，Breuning MH and den Dunnen JT.2002.Comprehensive detection of genomic duplications and deletions in the DMDgene，by use of multiplexamplifiable probe hybridisation.Am.J.Hum.Genet.71，365-374.
权利要求
1.一种血细胞抗原基因分型的方法，其包括对来自一哺乳动物物种的个体的DNA进行多重聚合酶链反应(PCR)以便扩增并以可检测方式标记至少两种不同的血细胞抗原的基因座的含有所述血细胞抗原的核苷酸多态性位点的区域，并使用如此扩增和标记的DNA片段来确定每一种所述血细胞抗原的基因型，所述多重PCR包括使用针对每一种待进行基因分型的血细胞抗原的至少一对血细胞抗原特异性嵌合引物以及至少一种以可检测方式标记的通用引物，其中所述至少一种通用引物具有不存在于所述哺乳动物物种的DNA中的独特序列，且其中每一嵌合引物对包括左侧嵌合引物和右侧嵌合引物，它们各自包括位于3′端的血细胞抗原特异性部分和位于5′端的通用部分，其中所述嵌合引物的通用部分的碱基序列对应于所述至少一种通用引物的碱基序列，且其中所述嵌合引物对的所述血细胞抗原特异性部分包含所述血细胞抗原的基因座的含有所述血细胞抗原的核苷酸多态性位点的区域。
2.权利要求1的方法，其中所述至少一种以可检测方式标记的通用引物所使用的摩尔量是每一嵌合引物的摩尔量的至少100倍，更优选地为至少200倍。
3.权利要求1或2的方法，其中使用具有不存在于所述哺乳动物物种的DNA中的独特序列的、以可检测方式标记的通用引物对，且其中对于每一嵌合引物对，所述嵌合引物对的一个成员的通用部分的碱基序列对应于所述通用引物对的一个成员的碱基序列，且所述嵌合引物对的另一成员的通用部分的碱基序列对应于所述通用引物对的另一成员的碱基序列。
4.权利要求3的方法，其中一种所述通用引物具有碱基序列gccgcgaattcactagtg(SEQ ID NO2)，而另一所述通用引物具有碱基序列ggccgcgggaattcgatt(SEQ ID NO1)。
5.权利要求14中任一项的方法，其中每一通用引物在其5′端携带荧光标记物，优选地为Cy5。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述哺乳动物物种是人，所述DNA是基因组DNA，且所述血细胞抗原包括选自如下一组中的至少两种成员、优选地所有成员HPA1、HPA2、HPA3、HPA4、HPA5、Gov、JK1/2、FY1/2、GATAbox、KEL1/2、KEL3/4、RHCEex2/RHex2、RHCEex5/RHex5、RHDψ、RHD、BigC、MN、U和JO。
7.权利要求6的方法，其中所述嵌合引物包括选自如下一组中的至少两对、优选地基本上所有对HPA1-leftgccgcgaattcactagtgcttcaggtcacagcgaggt SEQ ID NO3HPA1-right ggccgcgggaattcgattgctccaatgtacggggtaaa SEQ ID NO4HPA2-leftgccgcgaattcactagtgtgaaaggcaatgagctgaag SEQ ID NO5HPA2-right ggccgcgggaattcgattagccagactgagcttctcca SEQ ID NO6HPA3-leftgccgcgaattcactagtggcctgaccactcctttgcSEQ ID NO7HPA3-right ggccgcgggaattcgattggaagatctgtctgcgatcc SEQ ID NO8HPA4-leftgccgcgaattcactagtgatccgcaggttactggtgag SEQ ID NO9HPA4-right ggccgcgggaattcgattccatgaaggatgatctgtgg SEQ ID NO10HPA5-leftgccgcgaattcactagtgtccaaatgcaagttaaattaccag SEQ ID NO11HPA5-right ggccgcgggaattcgattacagacgtgctcttggtaggt SEQ ID NO12HPA15-left gccgcgaattcactagtgtgtatcagttcttggttttgtgatg SEQ ID NO13HPA15-right ggccgcgggaattcgattaaaaccagtagccacccaag SEQ ID NO14JK1/2-left gccgcgaattcactagtggtctttcagccccatttgag SEQ ID NO15JK1/2-right ggccgcgggaattcgattgttgaaaccccagagtccaa SEQ ID NO16FY1/2-left gccgcgaattcactagtggaattcttcctatggtgtgaatga SEQ ID NO17FY1/2-right ggccgcgggaattcgattaagaagggcagtgcagagtc SEQ ID NO18GATAbox-left gccgcgaattcactagtgggccctcattagtccttgg SEQ ID NO19GATAbox-right ggccgcgggaattcgattgaaatgaggggcatagggataSEQ ID NO20Fyx-left gccgcgaattcactagtgtcatgcttttcagacctctcttc SEQ ID NO175Fyx-right ggccgcgggaattcgattcaagacgggcaccacaat SEQ ID NO176KEL1/2-leftgccgcgaattcactagtgaagggaaatggccatactga SEQ ID NO21KEL1/2-right ggccgcgggaattcgattagctgtgtaagagccgatcc SEQ ID NO22KEL3/4-leftgccgcgaattcactagtggcctcagaaactggaacagc SEQ ID NO23KEL3/4-right ggccgcgggaattcgattagcaaggtgcaagaacaactct SEQ ID NO24KEL6/7-leftgccgcgaattcactagtggcagcaccaaccctatgttc SEQ ID NO177KEL6/7-right ggccgcgggaattcgatttcaggcacaggtgagcttc SEQ ID NO178RHCEex2for gccgcgaattcactagtgcgtctgcttccccctccSEQ ID NO25RHex2rev ggccgcgggaattcgattctgaacagtgtgatgaccaccSEQ ID NO26RHDex3-leftgccgcgaattcactagtgtcctggctctccctctct SEQ ID NO179RHCEex3-right ggccgcgggaattcgatttttttcaaaaccccggaag SEQ ID NO180RHCEex5-left gccgcgaattcactagtgggatgttctggccaagtg SEQ ID NO27RHex5rev ggccgcgggaattcgattggctgtcaccacactgactg SEQ ID NO28RHDψ-left ggccgcggga attcgattgtagtgagctggcccatca SEQ ID NO29RHDψ-rightgccgcgaattcactagtgtgtctagtttcttaccggcaagt SEQ ID NO30RHD-leftB gccgcgaattcactagtgttataataacacttgtccacaggg SEQ ID NO31RHD-rightC ggccgcgggaattcgattcggctccgacggtatc SEQ ID NO32BigC-left gccgcgaattcagtagtgggccaccaccatttgaaSEQ ID NO33BigC-rightintron2 ggccgcgggaattcgattccatgaacatgccacttcac SEQ ID NO34RhDVI-left(fw) ggccgcgggaattcgattctttgaaattaagcacttcacaga SEQ ID NO181RhDVI-right(rev) gccgcgaattcactagtggccagaatcacactcctgct SEQ ID NO182MN-leftgccgcgaattcactagtgtgagggaatttgtcttttgca SEQ ID NO35MN-right ggccgcgggaattcgattcagaggcaagaattcctcca. SEQ ID NO36Ss-leftgccgcgaattcactagtgtttttctttgcacatgtcttt SEQ ID NO183Ss-right ggccgcgggaattcgatttctttgtctttacaatttcgtgtgSEQ ID NO184U-left gccgcgaattcactagtgcgctgatgttatctgtcttatttttc SEQ ID NO37U-rightggccgcgggaattcgattgatcgttccaataataccagcc SEQ ID NO38DO-leftggccgcgggaattcgatttgatccctccctatgagctgSEQ ID NO185DO-right gccgcgaattcactagtgttatatgtgctcaggttcccagt SEQ ID NO186JO-leftgccgcgaatttcactagtgcctggcttaaccaaggaaaa SEQ ID NO39JO-right ggccgcgggaattcgatttcatactgctgtggagtcctg SEQ ID NO40Colton-leftgccgcgaattcactagtggccacgaccctctttgtct SEQ ID NO187Colton-right ggccgcgggaattcgatttacatgagggcacggaagatSEQ ID NO188Diego-left gccgcgaattcactagtgacttattcacgggcatccagSEQ ID NO189Diego-rightggccgcgggaattcgattaagctccacgttcctgaagaSEQ ID NO190Wr-leftgccgcgaattcactagtgggcttcaaggtgtccaactcSEQ ID NO636Wr-right ggccgcgggaattcgattaggatgaagaccagcagagcSEQ ID NO637Yt-leftggccgcgggaattcgattccttcgtgcctgtggtagatSEQ ID NO638Yt-right gccgcgaattcactagtgttctgggacttctgggaatgSEQ ID NO639Lu-leftgccgcgaattcactagtgggacccagagagagagagactg SEQ ID NO640Lu-right ggccgcgggaattcgattgggagtccagctggtatgg SEQ ID NO641。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中多重PCR所用的DNA聚合酶是Taq聚合酶或类似的耐热聚合酶，且多重PCR的每一循环包括在90至98℃进行15至60秒(优选地在大约94℃进行大约30秒)的热变性步骤，在54至60℃进行60至120秒(优选地在大约57℃进行大约90秒)的退火步骤，以及在68至76℃进行60至120秒(优选地在大约72℃进行大约90秒)的引物延伸步骤。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中基于50μl的反应体积，所述多重PCR使用来自所述个体的大约100ng的基因组DNA，大约5nM的每一嵌合引物，每一嵌合引物对大约0.2μM的每一种以可检测方式标记的通用引物和大约25μl的2x含MasterMix的缓冲液、各种dNTP和DNA聚合酶。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中通过将多重PCR扩增的产物经变性后与存在于DNA阵列中或以任何其他形式存在例如载于珠上的血细胞抗原等位基因特异性寡核苷酸探针进行杂交，并分析杂交模式，以确定每一所述血细胞抗原的基因型。
11.权利要求10的方法，其中所述等位基因特异性探针的长度为15至40个核苷酸，优选地为17至30个核苷酸。
12.权利要求10或11的方法，其中所述阵列含有针对血细胞抗原的每一等位基因至少两种、优选地至少5种不同的有义探针和至少两种、优选地至少5种不同的反义探针，其中的每一探针均覆盖所述核苷酸多态性位点，但覆盖的是不同的位置。
13.权利要求11的方法，其中所述阵列含有选自如下一组中的至少72种不同的探针、优选地基本上所有探针HPA1-allele aHPA-1aa tacaggccctgcctctgggSEQ ID NO41HPA-1ab aggccctgcctctgggct SEQ ID NO42HPA-1ac ccctgcctctgggctcaccSEQ ID NO43HPA-1ad tgcctctgggctcacctcgSEQ ID NO44HPA-1ae ctctgggctcacctcgctgSEQ ID NO45HPA-1aa CR cagcgaggtgagcccagagSEQ ID NO46HPA-1ab CR cgaggtgagcccagaggcaSEQ ID NO47HPA-1ac CR ggtgagcccagaggcagggSEQ ID NO48HPA-1ad CR agcccagaggcagggcct SEQ ID NO49HPA-1ae CRcccagaggcagggcctgta SEQ ID NO50HPA1-allele bHPA-1ba tacaggccctgcctccggg SEQ ID NO51HPA-1bb aggccctgcctccgggctSEQ ID NO52HPA-1bc ccctgcctccgggctcacSEQ ID NO53HPA-1bd ctgcctccgggctcacctSEQ ID NO54HPA-1be ctccgggctcacctcgctSEQ ID NO55HPA-1ba CRagcgaggtgagcccggagSEQ ID NO56HPA-1bb CRaggtgagcccggaggcagSEQ ID NO57HPA-1bc CRgtgagcccggaggcagggSEQ ID NO58HPA-1bd CRagcccggaggcagggcctSEQ ID NO59HPA-1be CRcccggaggcagggcctgta SEQ ID NO60HPA2-allcle aHPA-2aa ctgacgcccacacccaagSEQ ID NO61HPA-2ab ctcctgacgcccacacccSEQ ID NO62HPA-2ac ggctcctgacgcccacacSEQ ID NO63HPA-2ad agggctcctgacgcccacSEQ ID NO64HPA-2ae ccagggctcctgacgcccSEQ ID NO65HPA-2aa CRcttggfgtgtgggcgtcag SEQ ID NO66HPA-2ab CRgggtgtgggcgtcaggagSEQ ID NO67HPA-2ac CRgtgtgggcgtcaggagccSEQ ID NO68HPA-2ad CRgtgggcgtcaggagccctSEQ ID NO69HPA-2ae CRgggcgtcaggagccctggSEQ ID NO70HPA2-allele bHPA-2ba cctgatgcccacacccaag SEQ ID NO71HPA-2bb ctcctgatgcccacaccca SEQ ID NO72HPA-2bc ggctcctgatgcccacacc SEQ ID NO73HPA-2bd agggctcctgatgcccaca SEQ ID NO74HPA-2be ccagggctcctgatgcccSEQ ID NO75HPA-2ba CRcttgggtgtgggcatcagg SEQ ID NO76HPA-2bb CRtgggtgtgggcatcaggag SEQ ID NO77HPA-2bc CRggtgtgggcatcaggagcc SEQ ID NO78HPA-2bd CRtgtgggcatcaggagccct SEQ ID NO79HPA-2be CRgggcatcaggagccctggSEQ ID NO80HPA3-allele aHPA-3aa ccatccccagcccctcccSEQ ID NO81HPA-3abgcccatccccagcccctcSEQ ID NO82HPA-3acctgcccatccccagccccSEQ ID NO83HPA-3ad1 gctgcccatccccagcccSEQ ID NO84HPA-3adggctgcccatccccagccSEQ ID NO85HPA-3ad2 gggctgcccatccccagcSEQ ID NO86HPA-3aeggggctgcccatcccca SEQ ID NO87HPA-3aa CRgggaggggctggggatggSEQ ID NO88HPA-3ab CRgaggggctggggatgggcSEQ ID NO89HPA-3ac CRggggctggggatgggcagSEQ ID NO90HPA-3ad1 CRgggctggggatgggcagcSEQ ID NO91HPA-3ad CRggctggggatgggcagccSEQ ID NO92HPA-3ad2 CRgctggggatgggcagcccSEQ ID NO93HPA-3ae CRtggggatgggcagcccc SEQ ID NO94HPA3-allcle bHPA-3baccagccccagcccctcc SEQ ID NO95HPA-3bbgcccagccccagcccct SEQ ID NO96HPA-3bcctgcccagccccagccc SEQ ID NO97HPA-3bd1 gctgcccagccccagcc SEQ ID NO98HPA-3bdggctgcccagccccagc SEQ ID NO99HPA-3bd2 gggctgcccagccccag SEQ ID NO100HPA-3beggggctgcccagcccca SEQ ID NO101HPA-3ba CRggaggggctggggctgg SEQ ID NO102HPA-3bb CRaggggctggggctgggc SEQ ID NO103HPA-3bc CRgggctggggctgggcag SEQ ID NO104HPA-3bd1 CRggctggggctgggcagc SEQ ID NO105HPA-3bd CRgctggggctgggcagcc SEQ ID NO106HPA-3bd2 CRctggggctgggcagccc SEQ ID NO107HPA-3be CRtggggctgggcagcccc SEQ ID NO108HPA4-allele aHPA-4aagccacccagatgcgaaagSEQ ID NO109HPA-4abcacccagatgcgaaagctSEQ ID NO110HPA-4accccagatgcgaaagctcaSEQ ID NO111HPA-4adcagatgcgaaagctcaccSEQ ID NO112HPA-4aegatgcgaaagctcaccagSEQ ID NO113HPA-4aa CRctggtgagctttcgcatcSEQ ID NO114HPA-4ab CRggtgagctttcgcatctgSEQ ID NO115HPA-4ac CRtgagctttcgcatctggg SEQ ID NO116HPA-4ad CRagctttcgcatctgggtg SEQ ID NO117HPA-4ac CRctttcgcatctgggtggc SEQ ID NO118HPA4-allele bHPA-4bagccacccagatgcaaaag SEQ ID NO119HPA-4bbccacccagatgcaaaagctSEQ ID NO120HPA-4bcacccagatgcaaaagctcac SEQ ID NO121HPA-4bdcagatgcaaaagctcaccaSEQ ID NO122HPA-4begatgcaaaagctcaccagtaa SEQ ID NO123HPA-4ba CRttactggtgagcttttgcatc SEQ ID NO124HPA-4bb CRtggtgagcttttgcatctgSEQ ID NO125HPA-4bc CRgtgagcttttgcatctgggt SEQ ID NO126HPA-4bd CRagcttttgcatctgggtggSEQ ID NO127HPA-4bc CRcttttgcatctgggtggc SEQ ID NO128HPA5-allele aHPA-5aagagtctacctgtttactatcaaagaggSEQ ID NO129HPA-5abagtctacctgtttactatcaaagaggta SEQ ID NO130HPA-5acgtctacctgtttactatcaaagaggtaa SEQ ID NO131HPA-5adctacctgtttactatcaaagaggtaaaa SEQ ID NO132HPA-5aeacctgtttactatcaaagaggtaaaaaSEQ ID NO133HPA-5aa CRtttttacctctttgatagtaaacaggtSEQ ID NO134HPA-5ab CRttttacctctttgatagtaaacaggtag SEQ ID NO135HPA-5ac CRttacctctttgatagtaaacaggtagac SEQ ID NO136HPA-5ad CRtacctctttgatagtaaacaggtagact SEQ ID NO137HPA-5ae CRcctctttgatagtaaacaggtagactcSEQ ID NO138HPA5-allele bHPA-5bagagtctacctgtttactatcaaaaaggSEQ ID NO139HPA-5bbagtctacctgtttactatcaaaaaggta SEQ ID NO140HPA-5bcgtctacctgtttactatcaaaaaggtaat SEQ ID NO141HPA-5adctacctgtttactatcaaaaaggtaaaa SEQ ID NO142HPA-5beacctgtttactatcaaaaaggtaaaaaSEQ ID NO143HPA-5ba CRtttttacctttttgatagtaaacaggtSEQ ID NO144HPA-5bb CRttttacctttttgatagtaaacaggtag SEQ ID NO145HPA-5bc CRttacctttttgatagtaaacaggtagac SEQ ID NO146HPA-5bd CRtacctttttgatagtaaacaggtagact SEQ ID NO147HPA-5be CRcctttttgatagtaaacaggtagactcSEQ ID NO148HPA15-allele aGov-aa ttattatcttgacttcagttacaggattt SEQ ID NO149Gov-ab tcttgacttcagttacaggatttacc SEQ ID NO150Gov-ac tgacttcagttacaggatttaccaa SEQ ID NO151Gov-ad cttcagttacaggatttaccaagaat SEQ ID NO152Gov-ae cagttacaggatttaccaagaatttg SEQ ID NO153Gov-aa CRcaaattcttggtaaatcctgtaactg SEQ ID NO154Gov-ab CRattcttggtaaatcctgtaactgaag SEQ ID NO155Gov-ac CRtggtaaatcctgtaactgaagtcaa SEQ ID NO156Gov-ad CRggtaaatcctgtaactgaagtcaaga SEQ ID NO157Gov-ae CRaaatcctgtaactgaagtcaagataataa SEQ ID NO158HPA15-allcle bGov-ba tatcttgacttcagttccaggatt SEQ ID NO159Gov-bb cttgacttcagttccaggatttac SEQ ID NO160Gov-bc gacttcagttccaggatttaccaSEQ ID NO161Gov-bd ttcagttccaggatttaccaag SEQ ID NO162Gov-be cagttccaggatttaccaagaatt SEQ ID NO163Gov-ba CRaattcttggtaaatcctggaactg SEQ ID NO164Gov-bb CRcttggtaaatcctggaactgaa SEQ ID NO165Gov-bc CRggtaaatcctggaactgaagtcaSEQ ID NO166Gov-bd CRgtaaatcctggaactgaagtcaag SEQ ID NO167Gov-be CRaatcctggaactgaagtcaagata. SEQ ID NO168Colton-a-alleleCo.a.1 aacaaccagacggcggt SEQ ID NO191Co.a.2 accagacggcggtccag SEQ ID NO192Co.a.3 cagacggcggtccagga SEQ ID NO193Co.a.4 gacggcggtccaggacaa SEQ ID NO194Co.a.5 cggcggtccaggacaac SEQ ID NO195Co.a.1.crgttgtcctggaccgccgt SEQ ID NO196Co.a.2.crtcctggaccgccgtctg SEQ ID NO197Co.a.3.crctggaccgccgtctggt SEQ ID NO198Co.a.4.crggaccgccgtctggttg SEQ ID NO199Co.a.5.craccgccgtctggttgtt SEQ ID NO200Colton-b-alleleCo.b.1 ggaacaaccagacggtggtSEQ ID NO201Co.b.2 acaaccagacggtggtccag SEQ ID NO202Co.b.3accagacggtggtccagga SEQ ID NO203Co.b.4gacggtggtccaggacaacgSEQ ID NO204Co.b.5cggtggtccaggacaacg SEQ ID NO205Co.b.1.cr cgttgtcctggaccaccgt SEQ ID NO206Co.b.2.cr ttgtcctggaccaccgtctgSEQ ID NO207Co.b.3.cr ctggaccaccgtctggttgtSEQ ID NO208Co.b.4.cr ggaccaccgtctggttgttcSEQ ID NO209Co.b.5.cr accaccgtctggttgttcc SEQ ID NO210Diego-a-alleleDi.a.1gtgaagtccacgccggc SEQ ID NO211Di.a.2gaagtccacgccggcct SEQ ID NO212Di.a.3agtccacgccggcctcc SEQ ID NO213Di.a.4tccacgccggcctccct SEQ ID NO214Di.a.5acgccggcctccctggcc SEQ ID NO215Di.a.1.cr gccagggaggccggcgt SEQ ID NO216Di.a.2.cr agggaggccggcgtgga SEQ ID NO217Di.a.3.cr ggaggccggcgtggact SEQ ID NO218Di.a.4.cr aggccggcgtggacttc SEQ ID NO219Di.a.5.cr ggccggcgtggacttca SEQ ID NO220Diego-b-alleleDi.b.1ggtgaagtccacgctggc SEQ ID NO221Di.b.2gtgaagtccacgctggcct SEQ ID NO222Di.b.3tgaagtccacgctggcctccSEQ ID NO223Di.b.4gaagtccacgctggcctccct SEQ ID NO224Di.b.5acgctggcctccctggccc SEQ ID NO225Di.b.1.cr ggccagggaggccagcgt SEQ ID NO226Di.b.2.cr cagggaggccagcgtgga SEQ ID NO227Di.b.3.cr agggaggccagcgtggact SEQ ID NO228Di.b.4.cr ggaggccagcgtggacttc SEQ ID NO229Di.b.5.cr ggccagcgtggacttcacc SEQ ID NO230Diego Wr-a-alleleWr.a.1tgggcttgcgttccaagt SEQ ID NO231Wr.a.2ggcttgcgttccaagtttc SEQ ID NO232Wr.a.3ttgcgttccaagtttccca SEQ ID NO233Wr.a.4cgttccaagtttcccatct SEQ ID NO234Wr.a.5tccaagtttcccatctgga SEQ ID NO235Wr.a.1 CR tccagatgggaaacttggaSEQ ID NO236Wr.a.2 CR agatgggaaacttggaacgSEQ ID NO237Wr.a.3 CR tgggaaacttggaacgcaaSEQ ID NO238Wr.a.4 CR gaaacttggaacgcaagccSEQ ID NO239Wr.a.5 CR acttggaacgcaagccca SEQ ID NO240Diego Wr-b-alleleWr.b.1 gggcttgctgttccgagttSEQ ID NO241Wr.b.2 gcttgcgttccgagtttc SEQ ID NO242Wr.b.3 ttgcgttccgagtttccc SEQ ID NO243Wr.b.4 cgttccgagtttcccatc SEQ ID NO244Wr.b.5 tccgagtttcccatctgg SEQ ID NO245Wr.b.1 CR ccagatgggaaactcgga SEQ ID NO246Wr.b.2 CR gatgggaaactcggaacg SEQ ID NO247Wr.b.3 CR gggaaactcggaacgcaa SEQ ID NO248Wr.b.4 CR gaaactcggaacgcaagc SEQ ID NO249Wr.b.5 CR aactcggaacgcaagccc SEQ ID NO250Dombrock-a-allelcDo.a.1 taccacccaagaggaaactSEQ ID NO251Do.a.2 ccacccaagaggaaactggSEQ ID NO252Do.a.3 acccaagaggaaactggttg SEQ ID NO253Do.a.4 caagaggaaactggttgcaSEQ ID NO254Do.a.5 aggaaactggttgcagttga SEQ ID NO255Do a 6 cr ctcaactgcaaccagtttcc SEQ ID NO256Do a 7 cr caactgcaaccagtttcctc SEQ ID NO257Do a 8 cr tgcaaccagtttcctcttgg SEQ ID NO258Do a 9 cr accagtttcctcttgggtgg SEQ ID NO259Do a 10 cr cagtttcctcttgggtggta SEQ ID NO260Dombrock-b-allelcDo.b.1 taccacccaagaggagactSEQ ID NO261Do.b.2 ccacccaagaggagactggSEQ ID NO262Do.b.3 acccaagaggagactggttg SEQ ID NO263Do.b.4 caagaggagactggttgcaSEQ ID NO264Do.b.5 aggagactggttgcagttga SEQ ID NO265Do b 6 cr ctcaactgcaaccagtctcc SEQ ID NO266Do b 7 cr caactgcaaccagtctcctc SEQ ID NO267Do b 8 cr tgcaaccagtctcctcttgg SEQ ID NO268Do b 9 craccagtctcctcttgggtggSEQ ID NO269Do b 10 crcagtctcctcttgggtggt SEQ ID NO270Dombrock-Joseph(a)positive alleleJo.a.pos.1ccccagaacatgactaccacSEQ ID NO271Jo.a.pos.2ccagaacatgactaccacaca SEQ ID NO272Jo.a.pos.3agaacatgactaccacacacgc SEQ ID NO273Jo.a.Pos.4catgactaccacacacgctgt SEQ ID NO274Jo.a.pos.5actaccacacacgctgtgg SEQ ID NO275Jo.a.pos.1.cr gccacagcgtgtgtggtagtSEQ ID NO276Jo.a.pos.2.cr acagcgtgtgtggtagtcatg SEQ ID NO277Jo.a.pos.3.cr agcgtgtgtggtagtcatgtt SEQ ID NO278Jo.a.pos.4.cr cgtgtgtggtagtcatgttctg SEQ ID NO279Jo.a.pos.5.cr gtggtagtcatgttctggggSEQ ID NO280Dombrock-Joseph(a)negative alleleJo.a.neg.1ctaccccagaacatgactatcac SEQ ID NO281Jo.a.neg.2cccagaacatgactatcacaca SEQ ID NO282Jo.a.neg.3cagaacatgactatcacacacgc SEQ ID NO283Jo.a.neg.4catgactatcacacacgctgtg SEQ ID NO284Jo.a.neg.5actatcacacacgctgtggcSEQ ID NO285Jo.a.neg.1.cr aatagccacagcgtgtgtgatagtSEQ ID NO286Jo.a.neg.2.cr cacagcgtgtgtgatagtcatg SEQ ID NO287Jo.a.neg.3.cr cagcgtgtgtgatagtcatgtt SEQ ID NO288Jo.a.neg.4.cr cgtgtgtgatagtcatgttctgg SEQ ID NO289Jo.a.neg.5.cr gtgatagtcatgttctggggtag SEQ ID NO290Duffy-a-alleleFy.A.1ccagatggagactatggtgcc SEQ ID NO291Fy.A.2atggagactatggtgccaacSEQ ID NO292Fy.A.3ggagactatggtgccaacctg SEQ ID NO293Fy.A.4gactatggtgccaacctggaSEQ ID NO294Fy.A.5tatggtgccaacctggaag SEQ ID NO295Fy.A.1.cr cttccaggttggcaccata SEQ ID NO296Fy.A.2.cr tccaggttggcaccatagtcSEQ ID NO297Fy.A.3.cr aggttggcaccatagtctccSEQ ID NO298Fy.A.4.cr gttggcaccatagtctccatSEQ ID NO299Fy.A.5.cr gcaccatagtctccatctggSEQ ID NO300Duffy-b-alleleFy.B.1cccagatggagactatgatgcc SEQ ID NO301Fy.B.2gatggagactatgatgccaacSEQ ID NO302Fy.B.3tggagactatgatgccaacctg SEQ ID NO303Fy.B.4gactatgatgccaacctggaaSEQ ID NO304Fy.B.5tatgatgccaacctggaagc SEQ ID NO305Fy.B.1.cr gcttccaggttggcatcata SEQ ID NO306Fy.B.2.cr ttccaggttggcatcatagtcSEQ ID NO307Fy.B.3.cr caggttggcatcatagtctccSEQ ID NO308Fy.B.4.cr gttggcatcatagtctccatcSEQ ID NO309Fy.B.5.cr gcatcatagtctccatctgggSEQ ID NO310Duffy GATAbox-normal-alleleFy.GATA.normal.1 agtccttggctcttatcttg SEQ ID NO311Fy.GATA.normal.2 agtccttggctcttatcttggaSEQ ID NO312Fy.GATA.normal.3 cttggctcttatcttggaagc SEQ ID NO313Fy.GATA.normal.4 gctcttatcttggaagcacaggSEQ ID NO314Fy.GATA.normal.5 cttatcttggaagcacaggcgcSEQ ID NO315Fy.GATA.normal.1.cr gcctgtgcttccaagataag SEQ ID NO316Fy.GATA.normal.2.cr tgtgcttccaagataagagc SEQ ID NO317Fy.GATA.normal.3.cr tgcttccaagataagagcca SEQ ID NO318Fy.GATA.normal.4.cr ttccaagataagagccaaaggaSEQ ID NO319Fy.GATA.nonnal.5.cr caagataagagccaaggact SEQ ID NO320Duffy GAJAbox-mutation-allelcFy.GATA.mut.1 tccttggctcttaccttgSEQ ID NO321Fy.GATA.mut.2 tccttggctcttaccttgga SEQ ID NO322Fy.GATA.mut.3 tggctcttaccttggaagc SEQ ID NO323Fy.GATA.mut.4 gctcttaccttggaagcacag SEQ ID NO324Fy.GATA.mut.5 cttaccttggaagcacaggcg SEQ ID NO325Fy.GATA.mut.1.cr cctgtgcttccaaggtaag SEQ ID NO326Fy.GATA.mut.2.cr gtgcttccaaggtaagagc SEQ ID NO327Fy.GATA.mut.3.cr gcttccaaggtaagagcca SEQ ID NO328Fy.GATA.mut.4.cr ttccaaggtaagagccaagg SEQ ID NO329Fy.GATA.mut.5.cr caaggtaagagccaaggaSEQ ID NO330Duffy Fyx-normal-alleleFy.X.(b).1ttttcagacctctcttccgct SEQ ID NO331Fy.X.(b).2agacctctcttccgctggc SEQ ID NO332Fy.X.(b).3ctctcttccgctggcagcSEQ ID NO333Fy.X.(b).4 ctcttccgctggcagctc SEQ ID NO334Fy.X.(b).5 cttccgctggcagctctg SEQ ID NO335Fy.X.(b).1.crcagagctgccagcggaa SEQ ID NO336Fy.X.(b).2.cragctgccagcggaagag SEQ ID NO337Fy.X.(b).3.crctgccagcggaagagagg SEQ ID NO338Fy.X.(b).4.crgccagcggaagagaggtc SEQ ID NO339Fy.X.(b).5.crcagcggaagagaggtctg SEQ ID NO340Duffy Fyx-mutation-alleleFy.X.1 gcttttcagacctctcttctgct SEQ ID NO341Fy.X.2 tcagacctctcttctgctggc SEQ ID NO342Fy.X.3 acctctcttctgctggcagcSEQ ID NO343Fy.X.4 ctcttctgctggcagctctgSEQ ID NO344Fy.X.5 cttctgctggcagctctgc SEQ ID NO345Fy.X.1.crgcagagctgccagcagaa SEQ ID NO346Fy.X.2.crgagctgccagcagaagagagSEQ ID NO347Fy.X.3.cragctgccagcagaagagaggSEQ ID NO348Fy.X.4.crgccagcagaagagaggtctgSEQ ID NO349Fy.X.5.crcagcagaagagaggtctgaaa SEQ ID NO350Kidd-allele-aJk.a.1 cagccccatttgaggaca SEQ ID NO351Jk.a.2 gccccatttgaggacatctaSEQ ID NO352Jk.a.3 ccatttgaggacatctactttg SEQ ID NO353Jk.a.4 atttgaggacatctactttgga SEQ ID NO354Jk.a.5 gaggacatctactttggactct SEQ ID NO355Jk.a.1.crcagagtccaaagtagatgtcctc SEQ ID NO356Jk.a.2.cragtccaaagtagatgtcctcaaa SEQ ID NO357Jk.a.3.craaagtagatgtcctcaaatggg SEQ ID NO358Jk.a.4.crtagatgtcctcaaatggggcSEQ ID NO359Jk.a.5.cratgtcctcaaatggggctg SEQ ID NO360Kidd-allele-bJk.b.1 tcagccccatttgagaaca SEQ ID NO361Jk.b.2 gccccatttgagaacatctaSEQ ID NO362Jk.b.3 cccatttgagaacatctactttg SEQ ID NO363Jk.b.4 atttgagaacatctactttggac SEQ ID NO364Jk.b.5 gagaacatctactttggactctg SEQ ID NO365Jk.b.1.crccagagtccaaagtagatgttctcSEQ ID NO366Jk.b.2.cragagtccaaagtagatgttctcaaa SEQ ID NO367Jk.b.3.crccaaagtagatgttctcaaatgg SEQ ID NO368Jk.b.4.cragtagatgttctcaaatggggcSEQ ID NO369Jk.b.5.cratgttctcaaatggggctga SEQ ID NO370Kell-K1-alleleKEL.1.1 tccttaaactttaaccgaatgct SEQ ID NO371KEL.1.2 ttaaactttaaccgaatgctgaga SEQ ID NO372KEL.1.3 aactttaaccgaatgctgagactt SEQ ID NO373KEL.1.4 aaccgaatgctgagacttctg SEQ ID NO374KEL.1.5 cgaatgctgagacttctgatgag SEQ ID NO375KEL 1.6 CR actcatcagaagtctcagcattc SEQ ID NO376KEL 1.7 CR tcagaagtctcagcattcggt SEQ ID NO377KEL 1.8 CR aagtctcagcattcggttaaagSEQ ID NO378KEL 1.9 CR tctcagcattcggttaaagtttaa SEQ ID NO379KEL 1.10 CR agcattcggttaaagtttaagga SEQ ID NO380Kell-K2-alleleKEL.2.1 ccttaaactttaaccgaacgctSEQ ID NO381KEL.2.2 aactttaaccgaacgctgaga SEQ ID NO382KEL.2.3 ctttaaccgaacgctgagacttSEQ ID NO383KEL.2.4 aaccgaacgctgagacttct SEQ ID NO384KEL.2.5 cgaacgctgagacttctgatg SEQ ID NO385KEL 2.6 CR tcatcagaagtctcagcgttc SEQ ID NO386KEL 2.7 CR cagaagtctcagcgttcggt SEQ ID NO387KEL 2.8 CR agtctcagcgttcggttaaag SEQ ID NO388KEL 2.9 CR tctcagcgttcggttaaagtt SEQ ID NO389KEL 2.10 CR agcgttcggttaaagtttaaggSEQ ID NO390Kell-K3-alleleKEL.3.1 aatctccatcacttcatggct SEQ ID NO391KEL.3.2 tccatcacttcatggctgtt SEQ ID NO392KEL.3.3 atcacttcatggctgttcca SEQ ID NO393KEL.3.4 actrcatggctgttccagtt SEQ ID NO394KEL.3.5 tcatggctgttccagtttc SEQ ID NO395KEL.3.1.cr agaaactggaacagccatgaa SEQ ID NO396KEL.3.2.cr aactggaacagccatgaagtg SEQ ID NO397KEL.3.3.cr tggaacagccatgaagtgatg SEQ ID NO398KEL.3.4.cr acagccatgaagtgatggag SEQ ID NO399KEL.3.5.crgccatgaagtgatggagattSEQ ID NO400Kell-K4-alleleKEL.4.1 tctccatcacttcacggct SEQ ID NO401KEL.4.2 ccatcacttcacggctgtt SEQ ID NO402KEL.4.3 cacttcacggctgttcca SEQ ID NO403KEL.4.4 acttcacggctgttccag SEQ ID NO404KEL.4.5 tcacggctgttccagttt SEQ ID NO405KEL.4.1.craaactggaacagccgtgaa SEQ ID NO406KEL.4.2.crctggaacagccgtgaagtg SEQ ID NO407KEL.4.3.crggaacagccgtgaagtgatgSEQ ID NO408KEL.4.4.cracagccgtgaagtgatgg SEQ ID NO409KEL.4.5.crgccgtgaagtgatggaga SEQ ID NO410Kell-K6-alleleKEL.6.1 tactgcctgggggctgccccgcc SEQ ID NO411KEL.6.2 tgggggctgccccgcctgt SEQ ID NO412KEL.6.3 gctgccccgcctgtgac SEQ ID NO413KEL.6.4 ctgccccgcctgtgacaa SEQ ID NO414KEL.6.5 gccccgcctgtgacaac SEQ ID NO415KEL.6.1.crgttgtcacaggcggggc SEQ ID NO416KEL.6.2.crttgtcacaggcggggcag SEQ ID NO417KEL.6.3.crtcacaggcggggcagccc SEQ ID NO418KEL.6.4.cracaggcggggcagccccca SEQ ID NO419KEL.6.5.craggcggggcagccccca SEQ ID NO420Kell-K7-alleleKEL.7.1 actgcctgggggctgcctcgcc SEQ ID NO421KEL.7.2 cctgggggctgcctcgcctgt SEQ ID NO422KEL.7.3 ggctgcctcgcctgtgac SEQ ID NO423KEL.7.4 ctgcctcgcctgtgacaaccSEQ ID NO424KEL.7.5 gcctcgcctgtgacaacc SEQ ID NO425KEL.7.1.crggttgtcacaggcgaggc SEQ ID NO426KEL.7.2.crggttgtcacaggcgaggcagSEQ ID NO427KEL.7.3.crttgtcacaggcgaggcagccc SEQ ID NO428KEL.7.4.cracaggcgaggcagcccccagg SEQ ID NO429KEL.7.5.craggcgaggcagcccccagg SEQ ID NO430Lutheran a-alleleLu.a.1ggagctcgcccccgcct SEQ ID NO431Lu.a.2 gctcgcccccgcctagc SEQ ID NO432Lu.a.3 cgcccccgcctagcctc SEQ ID NO433Lu.a.4 cccccgcctagcctcgg SEQ ID NO434Lu.a.5 cccgcctagcctcggct SEQ ID NO435Lu.a.1 CR agccgaggctaggcggg SEQ ID NO436Lu.a.2 CR ccgaggctaggcggggg SEQ ID NO437Lu.a.3 CR gaggctaggcgggggcg SEQ ID NO438Lu.a.4 CR gctaggcgggggcgagc SEQ ID NO439Lu.a.5 CR aggcgggggcgagctcc SEQ ID NO440Lutheran b-allelcLu.b.1 gggagctcgcccccacct SEQ ID NO441Lu.b.2 gagctcgcccccacctagcSEQ ID NO442Lu.b.3 ctcgcccccacctagcctcSEQ ID NO443Lu.b.4 cccccacctagcctcggctSEQ ID NO444Lu.b.5 cccacctagcctcggctgaSEQ ID NO445Lu.b.1 CR tcagccgaggctaggtgggSEQ ID NO446Lu.b.2 CR agccgaggctaggtgggggSEQ ID NO447Lu.b.3 CR gaggctaggtgggggcgagSEQ ID NO448Lu.b.4 CR gctaggtgggggcgagctcSEQ ID NO449Lu.b.5 CR aggtgggggcgagctccc SEQ ID NO450MNS M-alleleM.1gtgagcatatcagcatcaag SEQ ID NO451M.2atcagcatcaagtaccactgg SEQ ID NO452M.3catcaagtaccactggtgtg SEQ ID NO453M.4taccactggtgtggcaatgc SEQ ID NO454M.5ctggtgtggcaatgcaca SEQ ID NO455M.1.cr tgtgcattgccacaccagtSEQ ID NO456M.2.cr gcattgccacaccagtggta SEQ ID NO457M.3.cr ccacaccagtggtacttgatg SEQ ID NO458M.4.cr accagtggtacttgatgctSEQ ID NO459M.5.cr cttgatgctgatatgctcac SEQ ID NO460MNS N-alleleN.1tgtgagcatatcagcaaaag SEQ ID NO461N.2atcagcattaagtaccactgaggSEQ ID NO462N.3cattaagtaccactgaggtgg SEQ ID NO463N.4accactgaggtggcaatgcSEQ ID NO464N.5 ctgaggtggcaatgcacactSEQ ID NO465N.1.cr gtgtgcattgccacctcagtSEQ ID NO466N.2.cr gcattgccacctcagtggtaSEQ ID NO467N.3.cr ccacctcagtggtacttaatgc SEQ ID NO468N.4.cr cctcagtggtacttaatgctSEQ ID NO469N.5.cr cttaatgctgatatgctcaca SEQ ID NO470MNS S-allelebig.S.1 tttgctttataggagaaatggga SEQ ID NO471big.S.2 ctttataggagaaatgggaca SEQ ID NO472big.S.3 ttataggagaaatgggacaacttgSEQ ID NO473big.S.4 gagaaatgggacaacttgtcc SEQ ID NO474big.S.5 aaatgggacaacttgtccatc SEQ ID NO475big.S.1.cr gatggacaagttgtcccattt SEQ ID NO476big.S.2.cr gacaagttgtcccatttctcc SEQ ID NO477big.S.3.cr aagttgtcccatttctcctata SEQ ID NO478big.S.4.cr tgtcccatttctcctataaagca SEQ ID NO479big.S.5.cr cccatttctcctataaagcaaaa SEQ ID NO480MNS s-allelelittle.s.1 tgctttataggagaaacggga SEQ ID NO481little.s.2 tttataggagaaacgggacaSEQ ID NO482little.s.3 ggagaaacgggacaacttg SEQ ID NO483little.s.4 gagaaacgggacaacttgtcSEQ ID NO484little.s.5 aaacgggacaacttgtccatSEQ ID NO485little.s.1.crtggacaagttgtcccgttt SEQ ID NO486little.s.2.cracaagttgtcccgtttctccSEQ ID NO487little.s.3.cragttgtcccgtttctcctata SEQ ID NO488Iittle.s.4.crtgtcccgtttctcctataaagc SEQ ID NO489little.s.5.crcccgtttctcctataaagcaSEQ ID NO490MNS U-positive-alleleU.pos.1 ttgctgctctctttagctccSEQ ID NO491U.pos.2 ctctctttagctcctgtagtgat SEQ ID NO492U.pos.3 agctcctgtagtgataatactca SEQ ID NO493U.pos.4 gtagtgataatactcattatttttg SEQ ID NO494U.pos.5 taatactcattatttttggggtg SEQ ID NO495U.pos.1.cr caccccaaaaataatgagtatta SEQ ID NO496U.pos.2.cr caaaaataatgagtattatcactaca SEQ ID NO497U.pos.3.cr agtattatcactacaggagctaaaSEQ ID NO498U.pos.4.cr atcactacaggagctaaagag SEQ ID NO499U.pos.5.cr gagctaaagagagcagcaaaSEQ ID NO500MNS U-negative-alleleU.neg.1ttttgctgctctctttatctcc SEQ ID NO501U.neg.2gctctctttatctcctgtagagatSEQ ID NO502U.neg.3tatctcctgtagagataacactcaSEQ ID NO503U.neg.4gtagagataacactcattatttttSEQ ID NO504U.neg.5taacactcattatttttggggt SEQ ID NO505U.neg.1.cr accccaaaaataatgagtgtta SEQ ID NO506U.neg.2.cr aaaaataatgagtgttatctctaca SEQ ID NO507U.neg.3.cr agtgttatctctacaggagataaaSEQ ID NO508U.neg.4.cr atctctacaggagataaagagag SEQ ID NO509U.neg.5.cr gagataaagagagcagcaaaattaSEQ ID NO510Rhesus C-allele(307T)Rh.big.C.1 tgagccagttcccttctgg SEQ ID NO511Rh.big.C.2 gagccagttcccttctgg SEQ ID NO512Rh.big.C.3 ctgagccagttcccttctg SEQ ID NO513Rh.big.C.4 ccttctgggaaggtggtc SEQ ID NO514Rh.big.C.5 ccttctgggaaggtggtca SEQ ID NO515Rh.big.C.1.cr tgaccaccttcccagaagg SEQ ID NO516Rh.big.C.2.cr gaccaccttcccagaagg SEQ ID NO517Rh.big.C.3.cr ccagaagggaactggctc SEQ ID NO518Rh.big.C.4.cr ccagaagggaactggctca SEQ ID NO519Rh.big.C.5.cr cagaagggaactggctcag SEQ ID NO520Rhesus c-allele(307C)Rh.little.c.1 gagccagttccctcctgg SEQ ID NO521Rh.little.c.2 agccagttccctcctgg SEQ ID NO522Rh.littlc.c.3 tgagccagttccctcctg SEQ ID NO523Rh.little.c.4 cctcctgggaaggtggt SEQ ID NO524Rh.little.c.5 cctcctgggaaggtggtc SEQ ID NO525Rh.little.c.1.cr gaccaccttcccaggagg SEQ ID NO526Rh.little.c.2.cr accaccttcccaggagg SEQ ID NO527Rh.little.c.3.cr ccaggagggaactggct SEQ ID NO528Rh.little.c.4.cr ccaggagggaactggctc SEQ ID NO529Rh.little.c.5.cr caggagggaactggctca SEQ ID NO530Rhesus BigC-intron2-specific-insert-alleleRhC.intron.2.1 agggtgccctttgtcacttc SEQ ID NO531RhC.intron.2.2 gccctttgtcacttcccagt SEQ ID NO532RhC.intron.2.3 cctttgtcacttcccagtgg SEQ ID NO533RhC.intron.2.4 ttgtcacttcccagtggtacaaSEQ ID NO534RhC.intron.2.5 tcacttcccagtggtacaatcaSEQ ID NO535RhC.intron.2.1.crgaagtgacaaagggcaccct SEQ ID NO536RhC.intron.2.2.cractgggaagtgacaaagggc SEQ ID NO537RhC.intron.2.3.crccactgggaagtgacaaagg SEQ ID NO538RhC.intron.2.4.crtgtaccactgggaagtgacaaaSEQ ID NO539RhC.intron.2.5.crtgattgtaccactgggaagtgaSEQ ID NO540Rhesus E-alleleRh.big.E.1 gccaagtgtcaactctcctct SEQ ID NO541Rh.big.E.2 caagtgtcaactctcctctgctSEQ ID NO542Rh.big.E.3 gtgtcaactctcctctgctgagSEQ ID NO543Rh.big.E.4 caactctcctctgctgagaagtc SEQ ID NO544Rh.big.E.5 tctcctctgctgagaagtcc SEQ ID NO545Rh.big.E.1.crggacttctcagcagaggagag SEQ ID NO546Rh.big.E.2.crcttctcagcagaggagagttgaSEQ ID NO547Rh.big.E.3.crctcagcagaggagagttgacacSEQ ID NO548Rh.big.E.4.crgcagaggagagttgacacttg SEQ ID NO549Rh.big.E.5.crgaggagagttgacacttggc SEQ ID NO550Rhesus e-alleleRh.little.e.1gccaagtgtcaactctgctct SEQ ID NO551Rh.little.e.2caagtgtcaactctgctctgctSEQ ID NO552Rh.little.e.3tgtcaactctgctctgctgag SEQ ID NO553Rh.little.e.4caactctgctctgctgagaag SEQ ID NO554Rh.little.e.5tctgctctgctgagaagtcc SEQ ID NO555Rh.little.e.1.cr ggacttctcagcagagcagag SEQ ID NO556Rh.little.e.2.cr ttctcagcagagcagagttga SEQ ID NO557Rh.little.e.3.cr tcagcagagcagagttgacac SEQ ID NO558Rh.little.e.4.cr gcagagcagagttgacacttg SEQ ID NO559Rh.little.e.5.cr gagcagagttgacacttggc SEQ ID NO560Rhesus RHD-alleleRhD1 ttccccacagctccatcat SEQ ID NO561RhD2 acagctccatcatgggctac SEQ ID NO562RbD 3 tccatcatgggctacaacttcSEQ ID NO563RhD 4 tcatgggctacaacttcagctSEQ ID NO564RhD 5 gggctacaacttcagcttgctSEQ ID NO565RhD cr 1agcaagctgaagttgtagcccSEQ ID NO566RhD cr 2agctgaagttgtagcccatgaSEQ ID NO567RhD cr 3gaagttgtagcccatgatgg SEQ ID NO568RhD cr 4gcccatgatggagctgtSEQ ID NO569RhD cr 5tgatggagctgtggggaa SEQ ID NO570Rhesus r’s-alleler′s.T.1ggaaggtcaacttggtgca SEQ ID NO571r′s.T.2ggaaggtcaacttggtgcagtSEQ ID NO572r′s.T.3caacttggtgcagttggtg SEQ ID NO573r′s.T.4acttggtgcagttggtggt SEQ ID NO574r′s.T.5ttggtgcagttggtggtgat SEQ ID NO575r′s.T.1.cr catcaccaccaactgcacca SEQ ID NO576r′s.T.2.cr caccaccaactgcaccaagt SEQ ID NO577r′s.T.3.cr accaactgcaccaagttgac SEQ ID NO578r′s.T.4.cr actgcaccaagttgaccttccSEQ ID NO579r′s.T.5.cr tgcaccaagttgaccttcc SEQ ID NO580Rhesus DVI-alleleRh.DVI.1atttcaaccctcttggcctt SEQ ID NO581Rh.DVI.2aaccctcttggcctttgttt SEQ ID NO582Rh.DVI.3tcttggcctttgtttccttg SEQ ID NO583Rh.DVI.4ggtatcagcttgagagctcg SEQ ID NO584Rh.DVI.5atcagcttgagagctcggag SEQ ID NO585Rh.DVI.1.cr aaggccaagagggttgaaat SEQ ID NO586Rh.DVI.2.cr aaacaaaggccaagagggtt SEQ ID NO587Rh.DVI.3.cr caaggaaacaaaggccaaga SEQ ID NO588Rh.DVI.4.cr cgagctctcaagctgatacc SEQ ID NO589Rh.DVL.5.cr ctccgagctctcaagctgat SEQ ID NO590Rhesus RHD-Pseudogene-mutation-alleleRhD Y 1 tttctttgcagacttaggtgcSEQ ID NO591RhD Y 2 ctttgcagacttaggtgcacaSEQ ID NO592RhD Y 3 tttgcagacttaggtgcacagt SEQ ID NO593RhD Y 4 acttaggtgcacagtgcgg SEQ ID NO594RhD Y 5 cttaggtgcacagtgcggt SEQ ID NO595RhD Y cr 1caccgcactgtgcacctaa SEQ ID NO596RhD Y cr 2ccgcactgtgcacctaagtc SEQ ID NO597RhD Y cr 3gcactgtgcacctaagtctgcSEQ ID NO598RhD Y cr 4tgcacctaagtctgcaaaga SEQ ID NO599RhD Y cr 5cacctaagtctgcaaagaaatagcgSEQ ID NO600Rhesus RHD-Pseudogene-normal-alleleRhD non Y 1 ctatttctttgcagacttatgtgc SEQ ID NO601RhD non Y 2 tctttgcagacttatgtgcaca SEQ ID NO602RhD non Y 3 ttgcagacttatgtgcacagtg SEQ ID NO603RhD non Y 4 acttatgtgcacagtgcggt SEQ ID NO604RhD non Y 5 cttatgtgcacagtgcggtg SEQ ID NO605RhD non Y cr 1acaccgcactgtgcacataa SEQ ID NO606RhD non Y cr 2accgcactgtgcacataagtcSEQ ID NO607RhD non Ycr 3 gcactgtgcacataagtctgcSEQ ID NO608RhD non Y cr 4tgtgcacataagtctgcaaagSEQ ID NO609RhD non Y cr 5cacataagtctgcaaagaaatagcgSEQ ID NO610Yt-a-alleleYt.a.1gcgggagacttccacggSEQ ID NO611Yt.a.2gggagacttccacggcct SEQ ID NO612Yt.a.3gagacttccacggcctgc SEQ ID NO613Yt.a.4gacttccacggcctgcaSEQ ID NO614Yt.a.5ttccacggcctgcaggta SEQ ID NO615Yt.a.1 CR tacctgcaggccgtggaa SEQ ID NO616Yt.a.2 CR tgcaggccgtggaagtcSEQ ID NO617Yt.a.3 CR gcaggccgtggaagtctc SEQ ID NO618Yt.a.4 CR aggccgtggaagtctccc SEQ ID NO619Yt.a.5 CR ccgtggaagtctcccgcSEQ ID NO620Yt-b-alleleYt.b.1gcgggagacttcaacggc SEQ ID NO621Yt.b.2gggagacttcaacggcctg SEQ ID NO622Yt.b.3gagacttcaacggcctgca SEQ ID NO623Yt.b.4gacttcaacggcctgcag SEQ ID NO624Yt.b.5ttcaacggcctgcaggtaa SEQ ID NO625Yt.b.1 CR ttacctgcaggccgttgaa SEQ ID NO626Yt.b.2 CR ctgcaggccgttgaagtc SEQ ID NO627Yt.b.3 CR tgcaggccgttgaagtctc SEQ ID NO628Yt.b.4 CRcaggccgttgaagtctcccSEQ ID NO629Yt.b.5 CRgccgttgaagtctcccgc SEQ ID NO630。
14.权利要求10-13中任一项的方法，其中所述寡核苷酸探针在5′端包括接头、优选地为-(CH2)6-部分，以及反应基团、优选地为氨基，用于附着于阵列支持物、优选地为聚L-赖氨酸包被的玻片。
15.权利要求10-14中任一项的方法，其中所述阵列包括一或多种具有不存在于所述哺乳动物物种的DNA中的序列的寡核苷酸以降低背景，所述寡核苷酸优选地选自如下一组a3cagaccataagcacaggcgtSEQ ID NO631，a9gctcgtccacagtgcgttatSEQ ID NO632，a17 cggcgttcaagcaaaccgaaSEQ ID NO633，a23 gacatatagctccactcagaSEQ ID NO634，a27 tagggtactgatgagcactcSEQ ID NO635，a33 tcagccctatcgcaggatgtSEQ ID NO169，a35 gagacacttgacagtagccaSEQ ID NO170，a38 ggcagggcacctcagtttatSEQ ID NO171，a42 tcaccagccagactgtgtagSEQ ID NO172，a43 cttcacgcaagttgtccagaSEQ ID NO173。
16.权利要求10-15中任一项的方法，其中所述阵列包括一或多种阳性杂交对照，优选地为CS05gtcctgacttctagctcatgSEQ ID NO174，并且其以可检测方式标记的互补物被加入到多重PCR扩增产物中。
17.权利要求10-16中任一项的方法，其中在加入多重PCR扩增产物之前，对所述探针进行预杂交和DNA变性处理。
18.权利要求10-17中任一项的方法，其中将未经过预纯化的变性的多重PCR扩增产物施加于DNA阵列。
19.权利要求10-18中任一项的方法，其中对于每一血细胞抗原，使用各个等位基因的信号强度的比率来指定基因型。
20.用于通过权利要求1-19中任一项的方法进行血细胞抗原基因分型的试剂盒，其包括针对每一种待进行基因分型的血细胞抗原的一对血细胞抗原特异性嵌合引物，以及至少一种如权利要求1-7中任一项所定义的以可检测方式标记的通用引物，优选地为一对以可检测方式标记的通用引物。
21.权利要求20的试剂盒，进一步包括如权利要求10-15中任一项所定义的DNA阵列。
22.一组用于多重PCR的血细胞抗原特异性嵌合引物对，其包括选自如权利要求7中所定义的组中的至少两个引物对、优选地为基本上所有的引物对。
23.一组用于血细胞抗原基因分型的血细胞抗原等位基因特异性寡核苷酸探针，其包括选自如权利要求13中所定义的组中的至少72种不同的探针、优选地为基本上所有的探针。
全文摘要
本发明提供了一种血细胞抗原基因分型的方法，其包括对来自一哺乳动物物种的个体的DNA进行多重聚合酶链反应(PCR)以便扩增并以可检测方式标记至少两种不同的血细胞抗原的基因座的含有血细胞抗原的核苷酸多态性位点的区域，并用如此扩增并标记的DNA片段来确定每一种所述血细胞抗原的基因型。多重PCR包括使用针对每一种待进行基因分型的血细胞抗原的至少一对血细胞抗原特异性嵌合引物和至少一种以可检测方式标记的通用引物，优选地为一对以可检测方式标记的通用引物。通用引物具有不存在于所述哺乳动物物种的DNA中的独特序列。每一嵌合引物对包括左侧嵌合引物和右侧嵌合引物，各引物包括3′端的血细胞抗原特异性部分和5′端的通用部分。嵌合引物的通用部分的碱基序列对应于所述至少一种通用引物的碱基序列。嵌合引物对的血细胞抗原特异性部分包含所述血细胞抗原的基因座的含有血细胞抗原的核苷酸多态性位点的区域。本发明还提供了用于通过此方法进行血细胞抗原基因分型的试剂盒，一组血细胞抗原特异性嵌合引物对和一组血细胞抗原等位基因特异性寡核苷酸探针。
文档编号C12Q1/56GK101027408SQ200580017847
公开日2007年8月29日 申请日期2005年3月31日 优先权日2004年4月1日
发明者西格里德·赫尔马·维尔马·贝布尔, 亨德里卡·维林加-杰尔斯马, 约翰内斯·特奥多鲁斯·登邓内恩, 马申卡·德哈斯 申请人:桑昆血液供给基金会