专利名称：：检测抗癫痫药物过敏反应相关抗原基因型的试剂及临床应用方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于检测抗癫痫药物过敏反应相关抗原基因型的试剂及其临床应用方法，是一种利用PCR-SSP(序列特异性引物)检测抗癫痫药物过敏反应相关抗原基因型的方法。属于生物医药
技术领域：
。
背景技术：
：抗癫痫药物是弓l起皮肤型不良反应(cutaneousadversedrugreactions，cADRs)的常见因素之一。cADRs包括轻度的斑丘疹以及严重危及生命的皮肤反应，如Stevens-Johnson综合症(SJS)、中毒性表皮坏死松解症(TEN)及药物超敏综合症(HSS)。皮肤型不良反应影响健康，严重危及生命的皮肤反应的发生概率大约为I:IO,OOO，致死率达到30%以上，其中SCR/TEN的致死率高达40。/。。超过90%的严重皮肤反应发生在用药后的两个月。抗癫痫药物如卡马西平(carbamazepine，CBZ),苯巴比妥(phenobarbital)，苯妥英(phenytoin)及拉莫三嗪(lamotrigine)均与严重皮肤反应相关，其中卡马西平是一线抗惊撅药物，也是一种情绪稳定剂，主要用于癫痫及躁狂症的治疗，也用于精神分裂症及三叉神经的治疗。其中卡马西平是引起不良皮肤反应的最常见因素。在新使用卡马西平的个体中发生不良反应的概率为l:1，0001:10，000。美国FDA近期通知医务人员，使用卡马西平可导致危险的甚至致命的皮肤反应(StevensJohnson综合征和中毒性表皮坏死松解症)，在有特定人类白细胞抗原(HLA)等位基因HLA-BW502的患者中更常见。该等位基因几乎只见于有亚洲地区(包括南亚的印度)血统的患者，如中国汉族人种中HLA-BW502的比率高达14.5%，欧洲人种的概率很低，只有1-2%M(Lonjouetal.,2006)。中国裔、东南亚裔及印度裔已占了全球人口的约1/2，且其后嗣也遍布欧美各地，因此卡马西平引发Stevens-Johnson综合症候群确实可说是一全球性问题。如果患者有HLA-BW502流行地区的血统，如中国裔、东南亚裔及印度裔，在开始卡马西平治疗前应筛査HLA-BW502等位基因，以减低抗癫痫药物的高风险性。近来的研究表明，在中国或亚洲人种中HLA-B*1502和卡马西平导致的SJS相关性强。HLA-B位点分型中，顺序特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)方法是最常用的技术，该技术操作简单，特异性高。尽管国外已经有利用PCR-SSP技术进行HLA-B分型的试剂盒，但该试剂盒主要用于肾移植及骨髓移植。而且由于价格高，使用该试剂盒时检测位点多，程序复杂，因此，不适用于检测抗癫痫药物引起过敏反应相关抗原。综上所述，在服用卡马西平等抗癫痫药物之甜，对患者进行HLA-BW502的分型检测，从而降低高危药物的危险性，是非常有必要的。
发明内容本发明的第一个目的，是为了提供一种用于检测抗癫痫药物过敏反应相关抗原基因型的试剂。本发明的第二个目的，是为了提供一种用于检测抗癫痫药物过敏反应相关抗原基因型的试剂的临床应用方法。本发明的第一个目的可以通过采取如下措施达到检测抗癫痫药物过敏反应相关抗原基因型的试剂，其特征是1)包括Taq酶、七联管和PCR引物；2)PCR引物如序列表SEQIDN2:l所示。本发明的第一个目的还可以通过采取如下措施达到本发明的一种实施方式是序列表SEQIDN2:1所示的PCR引物包括四对该序列特异性引物及二对内参引物，适用于以人外周血或其它组织抽提的gDNA为模板进行PCR扩增。本发明的一种实施方式是序列表SEQIDN2:1所示的PCR引物系利用序列特异性引物PCR-SSP，根据HLA-B序列设计而成。本发明的一种实施方式是所述七联管可以为12或24个7联管两种包装，每个七联管做一人份量，七联管的最左边为第一反应管，从左至右依此为二至七反应管，于一20。C保存。本发明的一种实施方式是所述Taq酶包括12ul和24ul两种规格，浓度为5UAH，于一20。C保存。本发明的第二个目的可以通过采取如下措施达到检测抗癫痫药物过敏反应相关抗原基因型的试剂的临床应用方法，其特征在于1)设计如序列表SEQIDNa:1所示的PCR引物，利用该PCR引物4对该序列特异性引物HS1、HS2、HS3和HS4及2对内参引物HC1、HC2，设定用特异性引物HS1、HS2、HS3和HS4扩增HLA-B基因的第二、三、四号外显子，反应编号分别为Sl、S2、S3、S4;用内参引物HC1扩增HLA-DRB1的3号内含子、HC2扩增APC基因的15外显子，APC指腺瘤性息肉adenamoutouspolyposiscoil，反应编号为C1、C2;2)以人外周血或其它组织抽提的gDNA为模板进行PCR扩增，即特异性引物HS1、HS2、HS3和HS4扩增样本的HLA-B基因的第二、三、四号外显子，用内参引物HC1扩增HLA-DRB1的3号内含子、HC2扩增APC基因的15外显子；3)采用2.0%或其他大于或小于2.0%百分含量的凝胶电泳检测，当被检测的所有样本均出现反应编号为C1、C2的特异目的片段时(内对照产物)，表明扩增反应成功有效；当反应编号为S1、S2、S3、S4的特异目的片段都出现时，表明样本的基因型为HLA-B*1502。本发明的第二个目的还可以通过采取如下措施达到临床应用方法包括如下具体步骤1)将前述的Taq酶、七联管和PCR引物制作成试剂盒，可以包括12或24个7联管两种包装，每个7联管做1人份，于一2(TC保存，包括DNA样品在内用前达到室温；2)将Taq酶保持在装有冰的器皿上；3)取8ulDNA及1ulTaq酶混匀，先用震动器震动310秒钟，再用微型离心机离心15秒钟，在震动和离心过程中避免液体附于管壁上端；4)在每个联管孔加上述混合液l.125ul，在加液过程中，使液体顺管壁流下，避免交叉污染，可轻轻震动7联管，确保每孔样品流到孔底；5)应用ABI9600/9700扩增仪或类似功能的PCR仪进行PCR扩增；通过设计4条特异性引物扩增患者HLA-B基因的第二、三、四号外显子，从而对患者进行HLA-BW502的分型检测；6)先将扩增后的样本储存在-2(TC冰箱中待用，再将扩增产物上样于2.0%的凝胶孔中，最后进行电泳，电泳时间为30-40分钟，电泳载体为微胶系统，电泳电压为150-200伏。本发明具有如下突出的有益效果本发明是利用PCR-SSP技术检测抗癫痫药物引起过敏反应相关抗原的方法，是一种PCR-SSP技术专一检测HLA-B*1502基因型，通过设计4条特异性引物扩增HLA-B基因的第二、三、四号外显子，从而对患者进行HLA-BW502的分型检测，从而降低高危药物的危险性。具有操作简单、准确率高和成本低的有益效果。特别适用于中国或亚洲人种中患者在服用卡马西平等抗癫痫药物之前，通过HLA-B*1502基因型检测，以确定能否服用卡马西平等抗癫痫药物。图1是用引物HS1扩增HLA-B基因夕卜2-4号显子的电泳凝胶成像图。图2是用引物HS2扩增HLA-B基因夕卜2号显子的电泳凝胶成像图。图3是用引物HS3扩增HLA-B基因夕卜2-3号显子的电泳凝胶成像图。图4是用引物HS4扩增HLA-B基因外2-3号显子的电泳凝胶成像图。图5是用内参引物HC1扩增HLA-B基因内参1的电泳凝胶成像图。图6是用内参引物HC2扩增HLA-B基因内参2的电泳凝胶成像图。具体实施方式实验材料1、使用抗癫痫药物患者的全血gDNA或其他组织的gDNA2、主要试剂Taq酶(鼎国)，dNTPS，PCRbuffer3、引物及扩增目的片段参照图1图6，2%凝胶检测样本抗癫痫药物相关抗原基因型，M:DNA标记；l:卡马西平耐受患者2:正常；3:卡马西平-SJS患者；1,2，3的内参反应C1、C2均有特异性目的条带，及S4反应条带，3还具S1、S2，S3反应条带，表明仅卡马西平-SJS患者为HLA-BW502基因型。本实施例中，针对HLA-B*1502(序列号为No.D50293)的2，3，4号外显子设计4对序列特异性引物；内参1为HLA-DRB1的3号内含子扩增产物，内参2为APC(腺瘤性息肉，adenamoutouspolyposiscoil)基因的15外显子扩增产物，扩增条带大小，反应编号等见表l。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>4、反应体系及PCR程序配置12.5WPCR反应体系如下gDNA:10-50ng，dNTPs:200MM，Taq酶0.625U，各引物终浓度1MM(赛百盛)，反应缓冲液终浓度lXPCRbuffer。PCR反应程序94°C60s，l个循环；94°C30s，56°C30s72°C45s，30个循环；4'C保存。5、检测2.0%凝胶电泳检测，电压150200V，时间30分钟，凝胶成像系统成像。经过对60个居住在台湾的汉族卡马西平导致的SJS患者(CBZ-JSJ)，144位卡马西平耐受患者(CBZ-tolerant)和93位未使用卡马西平的正常对照进行基因分型。卡马西平导致的SJS患者全部为HLA-BW502等位基因型，而耐受的患者只有3%，正常对照只有9%。进一步研究表明HLA-BW502与卡马西平导致的SJS/TEN存在强相关性，与MPE或HSS无相关性。最近有报道6位卡马西平导致的SJS/TEN患者基因型为HLA-BM502，达到100%，而正常对照为14.5%，卡马西平导致的SJS/TEN与HLA-BW502存在强相关，与台湾报道的基本一致。在欧洲进行的一项研究中，12位卡马西平导致的SJS/TEN患者有4位为HLA-BW502，而且父母之一为亚裔。序列表引物序列(5'-3'):针对HLA-B*1502的2，3，4号外显子设计4对序列特异性引物HS1:F:CGAGAGAGCCTGCGGAACR:GCCCACTTCTGGAAGGTTCTHS2:F:CGCGAGTCCGAGGATGGCR:GCAGGTTCCGCAGGCTCTHS3:F:CGCGAGTCCGAGGATGGCR:GAGCCACTCCACGCACAGHS4:F:GGAGTATTGGGACCGGAACR:GCCATACATCCTCTGGATGA针对HLA-B*1502的内参1、内参2设计4对序列特异性引物HC1:F:TGCCAAGTGGAGCACCCAAR:GCATCTTGCTCTGTGCAGATHC2:F:ATGATGTTGACCTTTCCAGGGR:TTCTGTAACTTTTCATCAGTTGC权利要求1、检测抗癫痫药物过敏反应相关抗原基因型的试剂，其特征是1)包括Taq酶、七联管和PCR引物；2)PCR引物如序列表SEQID№1所示。2、如权利要求l检测抗癫痫药物过敏反应相关抗原基因型的试剂，其特征是:所述的序列表SEQIDNa:1所示的PCR引物包括四对该序列特异性引物及二对内参引物，适用于以人外周血或其它组织抽提的gDNA为模板进行PC財广增。3、如权利要求2检测抗癫痫药物过敏反应相关抗原基因型的试剂，其特征是-序列表SEQIDN2:1所示的PCR引物系利用序列特异性引物PCR-SSP，根据HLA-BH4502序列设计而成。4、如权利要求l检测抗癫痫药物过敏反应相关抗原基因型的试剂，其特征是:所述七联管可以为12或24个7联管两种包装，每个七联管做一人份量，七联管的最左边为第一反应管，从左至右依此为二至七反应管，于一2(TC保存。5、如权利要求l检测抗癫痫药物过敏反应相关抗原基因型的试剂，其特征是:所述Taq酶包括12yl和24ixl两种规格，浓度为5U/W，于一2(TC保存。6、检测抗癫痫药物过敏反应相关抗原基因型的试剂的临床应用方法，其特征是1)设计如序列表SEQIDN2:1所示的PCR引物，利用该PCR引物4对该序列特异性引物HS1、HS2、HS3和HS4及2对内参引物HC1、HC2，设定用特异性引物HS1、HS2、HS3和HS4扩增HLA-B基因的第二、三、四号外显子，反应编号分别为S1、S2、S3、S4;用内参引物HC1扩增HLA-DRB1的3号内含子、HC2扩增APC基因的15外显子，APC指腺瘤性息肉adenamoutouspolyposiscoil，反应编号为C1、C2;2)以人外周血或其它组织抽提的gDNA为模板进行PCR扩增，即特异性引物HS1、HS2、HS3和HS4扩增样本的HLA-B基因的第二、三、四号外显子，用内参引物HC1扩增HLA-DRB1的3号内含子、HC2扩增APC基因的15外显子；3)采用凝胶电泳检测，当被检测的所有样本均出现反应编号为C1、C2的特异目的片段时，表明扩增反应成功有效；当反应编号为S1、S2、S3、S4的特异目的片段都出现时，表明样本的基因型为HLA-B*1502。7、如权利要求6所述的检测抗癫痫药物过敏反应相关抗原基因型的试剂的临床应用方法，其特征是包括如下具体步骤1)将前述的Taq酶、七联管和PCR引物制作成试剂盒，可以包括12或24个7联管两种包装，每个7联管做1人份，于一2(TC保存，包括DNA样品在内用前达到室温；2)将Taq酶保持在装有冰的器皿上；3)取8ulDNA及1ulTaq酶混匀，先用震动器震动310秒钟，再用微型离心机离心15秒钟，在震动和离心过程中避免液体附于管壁上端；4)在每个7联管孔加上述混合液1.125ul，在加液过程中，使液体顺管壁流下，避免交叉污染，可轻轻震动7联管，确保每孔样品流到孔底；5)应用ABI9600/9700扩增仪或类似功能的PCR仪进行PCR扩增；通过设计4条特异性引物扩增患者HLA-B基因的第二、三、四号外显子，从而对患者进行HLA-BW502的分型检测；6)扩增后的样本可以立即上样检测，也可以将扩增后的样本储存在-2(TC冰箱中待用，再将扩增产物上样于2.(m的凝胶孔中，最后进行电泳，电泳时间为30-40分钟，电泳载体为微胶系统，电泳电压为150-200伏。全文摘要本发明涉及一种用于检测抗癫痫药物过敏反应相关抗原基因型的试剂及其临床应用方法，其特征是1)包括Taq酶、七联管和PCR引物；2)PCR引物如序列表SEQID№1所示。其临床应用方法的特征在于1)利用序列特异性引物PCR-SSP，根据HLA-B序列设计4对该序列特异性引物及2对内参引物，以人外周血或其它组织抽提的gDNA为模板进行PCR扩增；2)采用凝胶电泳检测，从而确定样本的基因型为HLA-B*1502。本发明具有操作简单、准确率高和成本低的有益效果。特别适用于中国或亚洲人种中患者在服用卡马西平等抗癫痫药物之前，通过HLA-B*1502基因型检测，以确定能否服用卡马西平等抗癫痫药物。文档编号C12Q1/68GK101353698SQ200810026919公开日2009年1月28日申请日期2008年3月21日优先权日2008年3月21日发明者廖卫平,石奕武,高玫梅申请人:广州医学院第二附属医院