专利名称：通过经遗传修饰的非天然生产微生物来生产β-内酰胺的制作方法
通过经遗传修饰的非天然生产微生物来生产/3-内酰胺 本发明涉及生产^-内酰胺化合物的方法以及可用于此类生产方法的细胞。
|3-内酰胺化合物目前作为内源次级代谢产物通过丝状微生物(例如
禾口爿cremow't/m c/j/^^ogewwm) 以商业规模生产。
微生物生产的3-内酰胺的例子是青霉烷类(penam)化合物，例如青 霉素V、(异)青霉素N和青霉素G;头孢菌素类(cephem)化合物，例 如，去乙酰氧基头孢菌素和其它酰基-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸，去乙酰 头孢烷酸和其它酰基-7-氨基去乙酰头孢烷酸，头孢菌素C和其它氨基-7-氨基-头孢垸酸；棒烷类化合物，例如，棒酸；碳青霉烯类化合物，例如亚 胺培南(imipenem)和亚胺硫霉素(thienamycin);以及单环内酰胺化合 物，例如，氨曲南(aztreonam)。
天然的^-内酰胺生产生物的例子是A; wg"/船(A m'^/a"力、
尸ew/c/〃/wm (尸.c/z/7犯gewww 、 尸.wa/g7'ove似e 、 尸.gn、eq/^/vwm)禾口
商业应用的生物中/3-内酰胺化合物的生产水平数年来已提高了很多。 例如，现代的尸em'"'〃/wm c力o^oge"wm生产菌株被报道能生产大约40-50 g/ 了，而原始菌株仅生产大约1 mg/1 (Elander, R.P. (2002) University of Wisconsin contributions to the early development of penicillin and cephalosporin antibiotics, Afevw 52， 270-278; Elander, R.P. (2003)
Industrial production of /3-lactam antibiotics, yl/ / / TVfz'croZn'o/ jS/otec/mo/ 61, 385-392)。
这种提高的生产水平是通过经典的诱变技术实现的(Elander, R. (1983) Strain improvement and preservation of /3-lactam producing microorganisms. In A丄.Demain and N. Solomon (eds.) Antibiotics containing the /3-lactam structure I, Springer- Verlag, New York, N.Y.， 97-146)。
此外，重组DNA技术的应用使得能在天然仅能生产青霉核类/3-内酰 胺的尸em'"7/^m菌株中生产头孢烯类/3-内酰胺。另一方面，通常生产头孢 烯类化合物的Jc"mom'"m菌株己被遗传修饰为能生产青霉核类化合物。
但是，使用天然能生产/3-内酰胺的微生物的一个严重缺点在于，这些 微生物通常在其生产阶段为丝状生物体。该丝状属性在发酵期间带来了严 重的困难。实际的流变学(rheology)高度依赖于培养条件，并且可能从 沉淀生长变为粘稠生长。前者导致营养运送问题，后者导致了氧运送的限 制。此外，菌丝的各个区室(compartment)在发酵期间有差异从生长顶 点或尖端细胞(具有所谓的"spitzenk6rper"作为新生长的端点)，年轻 的、看上去健康的亚顶点细胞，以及老的并且高度液泡化的细胞。这些不 同的细胞可能生产水平有所不同，并且对培养条件应答不同，这妨碍了工 艺控制。
此外，使用这些丝状的天然/3-内酰胺生产生物，不能进行对涉及和/或 影响j8-内酰胺生产的因素的研究。首先，较之&cAen'c/^ c^等生物，难 于对它们应用标准分子生物学技术。转化是通过脆弱的原生质体在聚乙二 醇中进行的，不能获得完整的保持为游离的质粒，整合大部分是随机并且 多拷贝的。在顶部，菌丝区室是多细胞核的，最重要的物种，尸. cAow ge做m没有有性循环，并且，备选的拟有性(parasexual)循环也非 常低效。所有这些因素严重地妨碍了对重要基因的鉴定。
就这个原因来说，人们需要能更好地适合用于大规模生产，并且没有 丝状微生物典型的不利性质的/3-内酰胺生产生物。此外，人们需要微生物 具有下述益处其中/3-内酰胺生产所涉及的因素可被更为容易地研究。
迄今为止，由于多种因素，在非丝状、微生物单个细胞中还不能建立 起对^内酰胺的生产。
卩-内酰胺合成的第一个明确认定步骤是所谓的非核糖体肽合成酶组的
酶催化的，在这种情况下为，5-(L-a-氨基己二酰)-L-半胱氨酰-D-缬氨酸合 成酶(ACVS)。这些模块(modular)酶催化一系列复杂的氨基酸活化以 及随后的肽键形成。面包酵母(S. cerev^M)等物种不具有此类酶，因此 不能被用来进行此类反应。此外，编码ACVS的基因； cZ^S大约12 kb 长。加上启动子和终止子，需要将14 kb的表达盒稳定整合进酵母基因 组。
/3-内酰胺合成的第二步是未知的、复杂的生物化学过程之一，是通过 异青霉素N合酶(IPNS)的非血红素亚铁氧化。该酶受细胞中很多标准化 合物的严重抑制(谷胱甘肽、Mn、 Zn、 pH改变等)。酵母在某些生长条 件下具有非常高的谷胱甘肽水平，这可能导致对IPNS酶的严重抑制。
^-内酰胺合成的第三步由6-APA:AcylCoA酰基转移酶(AT)催化， 其由被三个真菌内含子打断的基因编码。酵母仅有极少数具有内含子的基 因，这些内含子也与真菌内含子不同，它们需要被除去，以获得在酵母中 的正确表达。此外，AT仅在异源二聚体时有功能。两种组分都通过自动 加工从基因编码的初始多肽获得，产生10和29 kDa的肽。该自动加工在 酵母细胞中是否能运作是未知的。
/3-内酰胺酶不稳定性的缺点广为人知，用新的酶对丝状真菌中的环境 进行持续更新，以支持对/ -内酰胺的连续生产。以前不知道酵母是否具有 该更新能力。
天然的/5-内酰胺生产者已进化出了特别适用于有效运出(3-内酰胺以保 持高生产水平的分泌系统。
最后但并非全部，/3-内酰胺是毒性产品。非天然生产者可能不能在有 这些化合物的情况下存活。
根据本发明，我们吃惊地发现，^-内酰胺生产可在不天然产生/3-内酰 胺化合物的微生物中，即不具有导致/3-内酰胺化合物形成的生物合成途径 的微生物中建立。因此，在第一个方面，本发明提供了一种微生物，其不 天然产生^-内酰胺化合物，并且经/3-内酰胺化合物生产所涉及的多核苷酸 转化过。
优选地，该不天然产生/3-内酰胺化合物的微生物以单个细胞的形式生
长，更优选地，是以单个细胞形式生长的真核微生物。最优选地，不天然
产生/3-内酰胺化合物的微生物是酵母。
用于本发明的合适的酵母是Sacc/mram少c^ (X cerev&ae 、 >S. 6a戸wtw 、 》S. ax7'gw— 、 CawA'(ia (C. g7a6rato 、 C. 、 C. ma/加a 、 C.
"仿z.c"似、C. 6oWw" 、 C. ,ra/n.cafo) 、 A7w_yverom_yces (K /acto 、 X". 附anaVmtw、 iC Aermoto/eraws)、 7a6at/a2^附a oZ mer/、尸z'c/n'a (尸.awg"5^a (= /7a/weww/a / o/j7wor/ Aa)、尸.5or6"o/ /n7a) 、TarrovWa /z) o/z'rtca 、
本发明的上下文中使用的术语"单个细胞"指绝大部分或仅以单个细 胞的形式生长的微生物，S卩，并非绝大部分或仅以菌丝、沉淀和/或作为丝 状生物的形式生长的微生物。这有利地允许将微生物培养至比用丝状生物 所可能达到的细胞密度要高得多的细胞密度。
一些时候，天然作为单个细胞生长的微生物的生长行为可能由于，例 如，遗传修饰而发生变化。例如，己知能导致酵母发芽问题的修饰。技术 人员将理解，此类可能不一定完全以单个细胞形式生长的、经修饰的生物
仍然在本发明的范围内。
本发明具有多项优点发酵培养液粘度降低，例如，较低的搅拌速度 就足以确保发酵培养液的适当混合，获得发酵罐中更高的氧运送速率的可 能性，由此允许碳源以增加的补料速率向发酵罐中补料，获得更高的经/3-内酰胺途径的碳通量的可能性，细胞间的无差别使得所有细胞都是生产细 胞。
/3-内酰胺化合物的生产所涉及的多核苷酸包含编码^-内酰胺生物合成
途径的酶的多核苷酸序列。作为0-内酰胺生物合成途径的一部分的酶的例 子是
(三)肽合成酶，诸如5-(L-o;-氨基己二酰)-L-半胱氨酰-D-缬氨酸合 成酶(ACVS )例如，由尸em'cz7/z'wm c/ o^oge肌w的； cZ^3基因编码，
"非含亚铁加双氧酶，诸如异青霉素N合酶(IPNS)，例如由 尸ewz'c/〃/wm c/z/3^ogewwm的/ c6C基因编石马
.差向异构酶，诸如IPN差向异构酶，例如由S&eptomyces c/avi^gen^
的cefD基因编码，
*酰基转移酶，诸如6-APA:AcylCoA acyl转移酶(AT)，例如由 尸em'cz7/Zw附c/z^^oge"wm白勺； e"D^"基因编石马，
扩环酶(expandase )，例如去乙酰氧基头孢菌素C合酶 (DAOCS )， 其包含 Jcremom'wm cA^yogewwm 的 ce/EF 基因或 ^re/7tow少(:M c/avw/z'gen^的ce/E基因所编码的酶，
*羟化酶，诸如去乙酰头孢菌素C合酶，其包含Aremom'Mm cA，ogew應的c^/EF基因或5V"tom_yc&y c/aWz.gen 的ce/E基因所编码 的酶，
*转移酶，诸如O-氨甲酰转移酶(CAT)，例如由&^^om>Y^ c/avw/z'gerM51的c附ci7基因编石马。
优选地，对/3-内酰胺化合物的生产所涉及的多核苷酸还包含编码下述 蛋白质的多核苷酸序列，所述蛋白质在不天然产生/3-内酰胺化合物的微生 物对i3-内酰胺化合物的生产中起支持性作用。具有支持性作用表示，该蛋 白质并非3-内酰胺化合物生物合成途径的一部分，但是该蛋白质对于有效 的/3-内酰胺生产来说是必要的。"对有效的^-内酰胺生产来说是必要的" 表示该蛋白质对于^-内酰胺生产来说可能是必须的，即，当其不存在时， 在微生物中没有可测量到的/3-内酰胺生产，甚至当存在所有相关生物合成 酶时，和/或其可能对于获得合适的/5-内酰胺生产水平来说是必要的，艮口， 当其不存在时微生物中仅可检测到非常低的/3-内酰胺生产。具有支持性功
能的蛋白质的例子是
*&内酰胺生物合成途径的调控蛋白，例如cpcW (Schmitt, EK. and Kuck, U (2000) The fUngal CPCRl protein, which binds specifically to beta-lactam biosynthesis genes, is related to human regulatory factor X transcription factors, J Biol Chem. 275:9348-9357); c/<xR (Perez-Redondo R, Rodriguez-Garcia A, Martin JF, Liras P. (1998) The claR gene of Streptomyces clavuligerus, encoding a LysR-type regulatory protein controlling clavulanic acid biosynthesis, is linked to the clavulanate-9-aldehyde reductase (car) gene, Mol. Microbiol. 27:831-843); ccai (Perez-Llarena FJ, Liras P, Rodriguez-
Garcia A， Martin JF. (1997) A regulatory gene (ccaR) required for cephamycin and clavulanic acid production in Streptomyces clavuligerus: amplification results in overproduction of both /3-lactam compounds, J. Bacteriol. 179: 2053-2059)，
*将/5-内酰胺生物合成途径的前体运送至细胞中合适位点的转运蛋 白，诸如ATP型结合盒(ABC)蛋白，例如，aal、 aa5、 aa7、 aalO、 dd2 (WO 01/32904)以及诸如易化扩散载体超家族(Multi-Facilitator Superfamiliy, MFS)蛋白，例如cefT (Ullan， R. V" Liu， G., Casqueiro, J" Gutierrez, S., BaAuelos， O. & Martin, J. F. (2002) The cefT gene of Acremonium chrysogenum encodes a putative multidrug efflux pump protein that significantly increases cephalosporin C production. Mol Genet Genomics 267, 673-683)，
，初级代谢中涉及的酶，尤其地，作为半胱氨酸前体的初级代谢产物 形成中涉及的酶，例如om51，其编码O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶(WO 99/01561);以及作为氨基己二酸前体的初级代谢产物形成中涉及的酶，例 如赖氨酸的(Casqueiro J, Gutierrez S, BaAuelos O, Hijarrubia MJ， Martin JF. (1999) Gene targeting in Penicillium chrysogenum: disruption of the Iys2 gene leads to penicillin overproduction, J Bacteriol. 181:1181-1188》
侧链活化所必需的酶，例如pc/编码的苯基乙酰基辅酶A连接酶 (WO 97/02349)，
ACVS对氨基酸活化中涉及的酶，例如编码的A^wgWM5 mV/w/aws磷酸》乏酰巯基乙胺(phosphopantenoyl )转移酶(Keszenman-Pereyra D, Lawrence S, Twfieg ME, Price J， Turner G. (2003) The npgA7 cfwA gene encodes a putative 4'-phosphopantetheinyl transferase which is essential for penicillin biosynthesis in Aspergillus nidulans, Curr Genet. 43:186- 190》
*过氧化物酶体增殖涉及的酶，例如pexll编码的PexllP (WO 00/71579)。
除编码/3-内酰胺生物合成酶的天然存在的基因或编码具有支持性功能 作用的蛋白质的天然存在的多核苷酸之外，还可使用编码这些酶或支持性
蛋白质的人工突变体的多核苷酸序列。此类突变体较之天然的酶或蛋白质 可能显示出更高的稳定性、增强的性能(例如增强的活性或不同的定位) 或不同的特异性。
不天然产生/5-内酰胺化合物但其中将根据本发明建立/5-内酰胺的微生 物可以按照本领域熟知的方法方便地制备。
简言之，/5-内酰胺生产涉及的多核苷酸可被包括进合适的载体。此类
载体可以是环状或线性的载体。此外，载体可提供游离复制，即载体在细
胞基因组DNA之外的复制，或者载体需要多核苷酸向基因组中的整合。 优选地，载体是表达载体，其提供/3-内酰胺生产涉及的多核苷酸在其中将 建立^-内酰胺的微生物中的表达。^-内酰胺生产所涉及的多核苷酸的编码 序列与调控序列一起提供，以确保被编码多肽的表达。调控序列可以是天 然与所讨论的编码序列相关联的那些，或者可以是针对其确保在选用的微 生物中合适的表达的能力选出来的序列。/3-内酰胺生产涉及的多核苷酸可 被包括进一种载体，或者可针对每种不同的多核苷酸包括进单独的载体。 如果/3-内酰胺生产所涉及的两种或多种多核苷酸被组合，那么可以向每种 多核苷酸提供各自的调控区域(多顺反子组织)，或者可以使用一种调控 区域用于两种或多种多核苷酸(根据所谓的单顺反子或操纵子结构)。还 可以将某些多核苷酸组合于一种载体中，以及对于其它多核苷酸使用单独 的载体。
用于将多核苷酸引入选用的微生物的转化方法对于多种类型的微生物 来说是常用的。
具体地，可以通过下述方法来转化酵母细胞首先提供每种都用想要 的多核苷酸之一转化过的不同的酵母细胞群体，随后使各种经转化的酵母 细胞群体杂交，由此获得含有所有想要的多核苷酸的酵母细胞群体。或 者， 一旦经过转化，可使用不同的选择标记，或者，在通过可获得的系统 除去选择标记的情况下使用同样的选择标记来转化酵母细胞(例如，cre-lox, FLP-FRT,综述见Gilbertson L. (2003) Cre-lox recombination: Creative tools for plant biotechnology, Trends Biotechnol. 21:550-555; Luo H, Kausch AP (2002) Application of FLP/FRT site-specific DNA recombination system inplants, Genet Eng (NY). 24:1 -16)。
在一种实施方式中，应当将尸.cAow ge丽m的； d^8、 pc6C、 和pe/基因(分别编码ACVS、 IPNS、 AT禾QPCL)置于X ce^v^^特异 性启动子(例如M五725-启动子)和& cwev&ae特异性终止子(例如 M五"5-终止子)的控制下；并且将各个表达盒整合进酵母基因组。对这四 种不同的酶的酶活进行的测定按照本领域己知的方法来进行抗体可用于
探测蛋白质的存在，特异性试验用于测定酶的比活性。此类试验的例子可 在Theilgaard H， van Den Berg M, Mulder C, Bovenberg R, Nielsen J. (2001) Quantitative analysis of PeniciUium chrysogenum Wis54-1255 transformants over expressing the penicillin biosynthetic genes, Biotechnol Bioeng 72:379-388. (对ACVS而言)；Theilgaard et al (2001)(对IPNS而言)；Tobin MB, Fleming MD， Skatrud PL, Miller JR. (1990) Molecular characterization of the acyl-coenzyme A:isopenicillin N acyltransferase gene (penDE) from PeniciUium chrysogenum and Aspergillus nidulans and activity of recombinant enzyme in Escherichia coli. J Bacteriol. 172:5908-5914 (对AT而言)和Minambres B， Martinez- Bianco H, Olivera ER, Garcia B, Diez B, Barredo JL, Moreno MA, Schleissner C， Salto F, Luengo JM. (1998) Molecular cloning and expression in different microbes of the DNA encoding Pseudomonas putida U phenyl acetyl-CoA ligase. Use of this gene to improve the rate of benzyl penicillin biosynthesis in PeniciUium chrysogenum. J Biol Chem. 271:33531- 33538 (对 PCL而言)中找到。
根据本发明对/5-内酰胺化合物的生产或对^-内酰胺中间产物例如 ACV或IPN的生产可以通过例如基于LC-MS的试验方便地测定。
本发明的第二个方面涉及一种方法，用于使用第一个方面的微生物来 生产P-内酰胺化合物。所述方法包括将第一个方面的微生物在有益于所述 j8-内酰胺化合物生产的条件下进行培养。培养条件对本发明来说并不重 要，只要能产生^-内酰胺化合物。通常已知的培养基和条件可以使用，技 术人员将容易地理解，生产的/3-内酰胺的类型将取决于在第一个方面的微 生物中表达的生物合成基因。/3-内酰胺化合物优选是青霉素G、青霉素V、己二酰-7-氨基去乙酰氧
基头孢烷酸(己二酰-7-ADCA)或己二酰-7-氨基-3-氨甲酰氧甲基-3-头孢 烯-4-羧酸(己二酰-7-ACCA)。可选地，所述方法还包含如果/5-内酰胺 化合物是青霉核类，在第6位去酰基化；如果/3-内酰胺是头孢烯类，在7 位去酰基化，以使得分别能生产例如6-氨基-青霉烷酸(6-APA) 、 7-ADCA或7-ACCA。
本发明的第三个方面涉及第一个方面的微生物用于鉴定影响^-内酰胺
生产的基因和/或因素的用途。这可以通过一系列实验来进行，例如
在生产和非生产条件下培养野生型S. ce"v&^和生产/5-内酰胺的X
ce^Ww'^，用可获得的"生物组学(omics)"技术(例如，转录本组
学、蛋白质组学、代谢物组学等)比较它们各自的应答，
用一定范围内不同的/3-内酰胺对在相关条件下生长的野生型X
cw，&^和生产^-内酰胺的61. cwevz'ie加以挑战，用可获得的"生物组
学"技术(例如，转录本组学、蛋白质组学、代谢物组学等)比较它们各
自的应答，
修饰生产/3-内酰胺的& cwev^'^中每种基因的表达(剔除，表达 以及过量表达)，用可获得的"生物组学"技术(例如，转录本组学、蛋 白质组学、代谢物组学等)分析它们各自的应答，
在生产/3-内酰胺的S. cern^^中表达任何可获得的基因和/或调控 因子(例如非编码RNA、 tRNA、上游调控RNA等)，用可获得的"生物 组学"技术(例如，转录本组学、蛋白质组学、代谢物组学等)分析它们 各自的应答，
修改用于野生型& ce^v^^和生产/3-内酰胺的& ce"v&ae的培养 条件(例如培养基组成、培养容器形状和/或补料系统)，用可获得的"生 物组学"技术(例如，转录本组学、蛋白质组学、代谢物组学等)比较它 们各自的应答。
这些分析的结果可被有利地整合，并用于产生对/3-内酰胺生产物种 (包括天然生产者，例如尸.cA^ysogewwm 、 A cA^sogewwm禾口 X c/avw/^en^)中的/5-内酰胺生产进一步提高的引导。
实施例 实施例1构建表达载体
基于酵母质粒pRS406 (Sikorski, R.S. and Hieter, P (1989) A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae， Genetics 122:19-27)来制造表达载体。从 pRS416Met25 (Mumberg D, Muller R， Funk M. (1995) Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene 156:119-122)分离Met25启动子和终止子区域(Johnston, M. et al (1997) The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XII, Nature 387 (6632 Suppl.), 87-90)。
构建pRS403Met25和pRS405Met25:用Sstl和Nael对pRS416Met25 进行限制性处理，得到Met25启动子和终止子片段。随后将该片段连接进 用Sst薩el消化过的pRS403和pRS405 (Sikorski, R.S. and Hieter, P， 1989)，得到想要的质粒。
构建pRS404Met25和pRS406Met25:用Sstl和Kpnl对pRS416Met25 进行限制性处理，得到Met25启动子和终止子片段。随后将该片段连接进 用Sstl/Kpnl消化过的pRS404禾卩pRS406 (Sikorski, R.S. and Hieter, P, 1989)，得到想要的质粒。
通过对P. chrysogenum的pcbC基因进行PCR扩增来制备用于将IPNS 基因整合进酵母染色体的质粒pRS406Met25pcbC (IPNS基因)(Carr, L.G., Skatrud, P丄.，Scheetz， M.E. II， Queener, S.W. and Ingolia， T.D. (1986) Cloning and expression of the isopenicillin N synthetase gene from Penicillium chrysogenum, Gene 48:257-266)，其中使用如下引物
5' CAAGTTTTCACCGCGGTTTTTCTAGTTAACATGATATCGAT TCCC-3'(SEQIDNO: 1)
和
5'- GAGTCCGGGATTTCTAGATCCCGGTCGAC陽3' (SEQ ID NO: 2)， 随后克隆进pCRTOP02.1载体(Invitrogen，按照厂商提供的说明书进
行)，接着用Xhol和Spel进行限制性酶消化，随后在XhoI/Spel限制性 处理过的pRS406Met25载体中连接pcbC片段。
构建PCL整合质粒pRS403Met25pcl : 用 Xbal/BamHl对 pRS403Met25进行限制性处理，与Xbal/BamHl消化过的PCR扩增PCL 基因连接(WO 97/02349)，其中使用如下引物
5'-CCATTATTTTTCTAGACACCCATATGGTTTTTTTACCTCC-3' (SEQ ID NO: 3)禾口 5'- CAAAAGATGGATCCGCTCGTCATGAAGAG-3' (SEQ ID NO: 4)。
构建AT (penDE)整合质粒pRS405Met25penDE:用下述引物对penDE 基因(Tobin et al, 1990)进行PCR扩增
5'- CAAAAGATGGATCCGCTCGTCATGAAGAG-3' (SEQ ID NO: 5) 和5'- CCATTATTTTTCTAGACCATATGCTTCACATCC画3' (SEQ ID NO: 6) 随后用Xbal、 BamHI进行限制性处理，将得到的penDE片段连接进用 Xbal、 BamHI限制性处理过的pRS405Met25中。
按照下文所述构建ACVS (pcbAB)整合质粒pRS404DestACVS。通过 下述方法构建质粒pRS404Dest，首先扩增pDEST15 (Invitrogen)的 CapccJB选择盒，其中使用下述引物
5'-GGGGGCGGCCGCACAACTTTGTATAGAAAAGTTGAG AAACGTAAAATGATATAAAT-3' (SEQ ID NO: 7)和
5'-GGGGCGCCGGCGACAACTTTTTTGTACAAAGTTGAGAAACG TAAAATGATATAAAT-3' (SEQ ID NO: 8),
接着连接进pCR2.1 TOPO，产生质粒pCR2.1/catccdB。然后用Muni消化 质粒pCR2.1/catccdB ，将catccdB片段连接进EcoRI消化过的 pRS404Met25，产生pRS404Dest。通过扩增获得pcbAB基因(Diez, B., Gutierrez, S.， Barredo, J丄.，van Solingen, P.， van der Voort, LH. and Martin, J. F. (1990) The cluster of penicillin biosynthetic genes. Identification and characterization of the pcbAB gene encoding the alpha曙aminoadipyl-cysteinyl-valine synthetase and linkage to the pcbC and penDE genes, J. Biol. Chem. 265: 16358-16365)，其中使用下述引物 5'画CACCATGACTCAACTGAAGCCAC-3' (SEQ ID NO: 9)禾口 5'-ATAGCGAGCGAGGTGTTC-3' (SEQ ID NO: 10)。
按照厂商说明书，将平末端PCR片段克隆进pENTR/SD/D-Topo载体 (Invitrogen)，产生pENTR/SD/ACVS 。
按照Invitrogen的Gateway说明书，用pRS404Dest对pENTR-SD-ACVS进行Gateway LR-反应，获得最终的整合质粒pRS404DestACVS。
实施例2 转化S. cerevisiae 将得到的、携带有编码ACVS、 IPNS、 PCL和AT的基因的质粒转化 进酵母 iSacc/^ra附ycas CEN-Pk2-lc (Wieczorke R， Krampe S，
Weierstall T， Freidel K， Hollenberg CP, Boles E， (1999) Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae, FEBS Lett. 464:123-128)。使用Gietz RD, Woods RA (2002， Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier D N A/polyethylene glycol method, Methods Enzymol. 350:87-96)所述的基于锂-离子的高效酵母转化程序和鲱鱼精运载体DNA处理作为方案。使用营养 缺陷型标记HIS、 LEU、 TRP和URA进行整合子选择，这按照本领域已 知的那样来进行。通过PCR和Southern杂交印记分析，得到的菌株携带 有编码ACVS、 IPNS、 AT和PCL的青霉素生物合成基因。
实施例3探测生物合成酶和酶活性 通过在酵母最小限度培养基(1XYNB， 20mM磷酸盐，pH 6.8， 2% 葡萄糖)上进行培养，针对酶活性对可能的青霉素生产酵母菌株加以筛 选。在这些条件下，由于不存在甲硫氨酸，Met25启动子完全被遏制。酵 母生长过夜，直到达到4-5的OD600。随后，对细胞进行沉淀，使用超声 波处理或玻璃珠，获得不含细胞的提取物。针对青霉素生物合成酶的产生 对裂解物部分和可溶上清液加以筛选。在库马西(Coomassie)染色的 SDS-PAGE凝胶上，通过Western杂交印记进行分析，分析显示了生物合 成酶的产生。LC-MS被用于展示青霉素生物合成中间产物ACV、 IPN和
PenG的形成。
实施例4探测抗生素活性 将经过菌落纯化的酵母菌株转移至激发/3-内酰胺生产的琼脂平板，在 25°C培养24-168小时。在2xTY中将/3-内酰胺敏感型E. coli ESS菌株 (Hsu JS, Yang YB， Deng CH, Wei CL， Liaw SH， Tsai YC (2004) Family shuffling of expandase genes to enhance substrate specificity for penicillin G. Appl Environ Microbiol.70:6257-6263)培养至对数中期，在预热过的0.8% 2xTY琼脂中稀释，小心地分布到酵母菌落上。在37。C培养过夜后，通过 菌落周围的澄清区域(所谓的晕轮)，可以观察到生产/3-内酰胺的菌株。
权利要求
1.一种微生物，其不天然产生β-内酰胺化合物，但通过对所述微生物进行遗传修饰后能生产β-内酰胺化合物。
2. 如权利要求1的微生物，其经过了在所述/5-内酰胺化合物的生产中 所涉及的多核苷酸的转化，从而提供了能生产所述/3-内酰胺化合物的微生 物。
3. 如权利要求2的微生物，其中所述^-内酰胺的生产中所涉及的所述 多核苷酸是编码所述/3-内酰胺化合物生物合成途径的酶的多核苷酸序列。
4. 如权利要求3的微生物，其中，所述/3-内酰胺化合物的生物合成途 径的酶选自由ACVS、 IPNS和AT构成的组。
5. 如权利要求2-4中任何一项所述的微生物，其还经过了编码下述蛋 白质的多核苷酸序列的转化，所述蛋白质在对所述/3-内酰胺化合物的生产 中具有支持性作用。
6. 如前述权利要求中任意一项的微生物，其是酵母。
7. 如权利要求6所述的酵母，其中所述酵母属于&zcdraramF"、
8. —种方法，用于生产/3-内酰胺化合物，所述方法包括在有益于生产 所述卩-内酰胺化合物的条件下培养根据前述权利要求中任意一项所述的微生物，所述方法可选地包含如果所述P-内酰胺化合物是青霉核类，则在第6位去酰基化；如果所述/3-内酰胺是头孢烯类，则在7位去酰基化
9. 如权利要求8所述的方法，其中所述/3-内酰胺化合物是青霉素G、 青霉素V、 6-APA、己二酰-7-ADCA、己二酰-7-ACCA、 7-ADCA、 7-ACCA、 7-ACA。
10. 如权利要求1-7的微生物用于鉴定影响/3-内酰胺生产的因素的用途。
全文摘要
本发明描述了用beta-内酰胺生物合成所涉及的多核苷酸对不天然产生beta-内酰胺化合物的微生物的转化，以及此类经转化微生物在生产beta-内酰胺化合物或者在鉴定beta-内酰胺化合物合成所涉及基因或因素中的用途。例如，编码来自P.chrysogenum的ACV、IPNS、AT和PCL的基因通过遗传工程被插入S.cerevisiae。
文档编号C12P37/00GK101098963SQ200580042491
公开日2008年1月2日 申请日期2005年12月8日 优先权日2004年12月10日
发明者巴斯特安·罗米恩, 翰德里克·简·诺尔曼, 马可·亚历山大·伯格·范德, 鲁洛夫·阿利·兰斯·伯韦比格 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司