重组微生物的制作方法

专利名称：重组微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于生产有用蛋白质或多肽的重组微生物，以及涉及该蛋白质和多肽。
背景技术：
微生物广泛用于工业生产大量有用物质，包括酒精饮料、例如味噌和酱油之类的某些类型的食品、氨基酸、有机酸、核酸相关物质、抗生素、糖、脂质和蛋白质。这些物质还发现具有多种用途，包括食品、医药品、洗涤剂、例如化妆品之类的日用品和各种化工原料。
在利用微生物工业生产有用物质时，生产率的提高是一个主要关注点，因此一种方法是通过诱变或其它基因手段进行微生物育种。最近，特别是随着微生物遗传学和生物技术的进步，通过基因重组技术进行更有效的有用微生物育种，并与其相关地是正在开发用于获得重组基因的宿主微生物。例如，已经进一步改进了枯草杆菌Marburg No.168，其作为宿主微生物已经被证实是安全且具有优异特性的。
然而，微生物本身拥有各种基因使其能够应对自然界中的环境变化，因此，它们在只采用有限的生产媒介的工业生产中不一定表现出蛋白质和类似物质的高生产效率。

发明内容
本发明提供一种重组微生物，其通过将编码异性蛋白质或多肽的基因转移到至少一种参与麦芽糖的膜渗透的基因(特别是glvR或glvC)或一个或多个与该基因功能相当的基因缺失或被剔除的微生物的突变株上而制备。


图1示意性地显示了通过SOE-PCR(SOE重叠延伸拼接法)(参见Gene，77，61(1989))缺失基因以制备DNA片段的方法，和使用该DNA缺失目标基因的方法(用抗药性基因取代目标基因)。
具体实施例方式
本发明针对一种通过将编码蛋白质或多肽的基因转移到能够以提高的生产率生产蛋白质或多肽并且由本发明人鉴别的宿主微生物上而获得的重组微生物，以及针对使用该重组微生物生产蛋白质或多肽的方法。
本发明人在微生物基因组上编码的许多不同基因中对有用蛋白质或多肽的生产中不需要或有害的基因进行了广泛的研究，并意外地发现，当参与用作培养基的主要碳源的麦芽糖的膜渗透的特异性基因或与该基因功能相当的基因从微生物的基因组中缺失或剔除之后，编码目标蛋白质或多肽的基因转移到微生物上，与缺失或剔除之前的情况相比，目标蛋白质或多肽的生产率提高。
使用本发明的重组微生物，可以以高效率大规模地生产目标蛋白质或多肽。
在本发明中，氨基酸序列之间的同源性和核酸序列之间的同源性都使用Lipman-Pearson法(Science，227，1435(1985))测定。具体而言，将ktup参数(相匹配的单元大小)设定为2，使用Genetyx-Win(Software Development Co.，Ltd.)的遗传信息处理软件开发的同源性分析程序(Search Homology)进行计算。
对构成本发明的微生物的母体微生物没有特别的限制，只要其含有参与麦芽糖膜渗透的基因。具体而言，可以使用如表1所示的任何枯草杆菌基因或与其功能相当的基因。当使用含有麦芽糖或麦芽低聚糖作为主要碳源的培养基进行培养时，该微生物优选为另一种具有不同麦芽糖渗透体系的上述基因不参与其中的类型。基因可以是野生型或突变体。具体例子包括枯草杆菌和属于芽孢杆菌属的类似微生物、属于梭状芽孢杆菌属的微生物和酵母。其中，优选属于芽孢杆菌属的微生物。特别是从已经获得该微生物的完全基因组信息、并由此确立了基因工程技术和基因组工程技术、并且该微生物具有细胞外分泌所得蛋白质的能力的角度考虑，优选枯草杆菌。
使用本发明的微生物生产的目标蛋白质或多肽的例子包括酶、生理活性物质，和其它发现在食品、医药品、化妆品、洗涤剂、纤维处理剂、临床化验剂等有用的蛋白质和多肽。
在本发明中，要缺失或剔除的基因是那些参与麦芽糖的膜渗透的基因。这些基因是表1所示的任一枯草杆菌基因，或者选自与其功能相当的基因。
此处所含表中的各个基因的名称、数量和功能与Nature，390，249-256(1997)中报道并由JAFAN(Japan Functional Analysis Networkfor Bacillus subtilis；BSORF DB)在互联网上公开(http:∥bacillus.genome.ad.jp/，2003年6月17日更新)的枯草杆菌基因组数据相符。
表1

来源于其它微生物的基因，优选来源于属于芽孢杆菌属的细菌的基因，其具有与表1所示的任一枯草杆菌相同的功能，或具有与表1所示任一基因的核苷酸序列70％或更高的同源性，优选80％或更高的同源性，更优选90％或更高，进一步优选95％或更高，仍然更优选98％或更高的同源性的，应该被认为与表1所示的基因功能相当，并因此构成根据本发明要缺失或剔除的基因。
上述基因在其并入细胞的过程中参与麦芽糖的膜渗透；即，磷酸烯醇丙酮酸依赖的糖磷酸转移酶系统(PTS，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.，4，37，2002)。具体而言，这些基因包括包含在PTS中的编码麦芽糖-特异性通透酶IICB的glvC基因；编码用于含有glvC基因的glv操纵子的正调节因子的glvR基因；以及与其功能相当的基因。如果缺失或剔除任意上述基因，就可以想象得到细胞的麦芽糖膜渗透性降低。然而，本发明人意外地发现现在使用其中任意基因通过采用含有麦芽糖作为主要碳源的培养基的酶生产培养物以缺失或剔除的宿主微生物，与使用传统宿主微生物相比，实现蛋白质生产率的显著提高。
顺便提及，ptsH基因(BG10200)和ptsI基因(BG10201)也已知通过PTS参与了细胞中麦芽糖的摄取。因此，预测缺失或剔除ptsH和ptsI的任一种可以有效提高蛋白质的生产率。因此，如果缺失或剔除表达包括上述两种基因的pts操纵子所需的调节基因glcT基因(BG12593)，可以提高蛋白质的生产率。
另一种实现本发明的方法是通过将另一来源的DNA片段插入目标基因或将突变体引入该基因的转录/转译起始区域以使目标基因失活或剔除。然而，优选物理缺失目标基因。要缺失或剔除的基因数是一个或更多，并可以缺失两个或更多基因。当构筑本发明的微生物时，可以缺失或失活除了参与麦芽糖膜渗透的基因以外的一个或多个基因。在这种情况下，预计会有更改进的效果。
在缺失或剔除基因的示例性的方法中，根据之前提出的方案缺失或剔除表1所示的任一目标基因。或者，进行基因的随机缺失或通过剔除进行突变，然后对蛋白质生产率进行评测并进行基因分析。
目标基因可以通过同源重组而缺失或剔除。也就是，用合适的质粒载体克隆含有部分目标基因的DNA片段从而获得环形重组质粒，并将所得质粒转移到母体微生物的细胞中。此后，通过在目标基因的部分区域中进行同源重组，使母体微生物基因组上的目标基因裂解，从而完成目标基因的失活。或者，通过碱基的取代或插入来使目标基因突变(剔除)，或者通过PCR或类似方法构成含有目标基因序列外的区域但不含目标基因的线型DNA片段，并将由此制成的基因或片段转移到母体微生物的细胞中。在母体微生物基因组的目标基因中突变点外部的两个位点上，或在目标基因序列外的两个区域上，发生双交换同源重组，从而替换成基因组上的目标基因缺失或剔除的基因片段。
特别是当用于构筑本发明的微生物的母体微生物是枯草杆菌时，由于一些文献已经描述了缺失或剔除目标基因的方法(参见，例如，Mol.Gen.Genet.，223，268 1990)，可以根据这些方法的任何一种重复，从而生产本发明的宿主微生物。
基因随机缺失或失活可以通过使用与上述通过使用随机克隆的DNA片段诱发同源重组的方法类似的方法，或通过用γ射线或类似射线辐射母体微生物而进行。
接下来将更详细地描述通过使用为缺失目的而设计的DNA片段采用双交换的缺失方法，该DNA片段是通过SOE-PCR制备的(Gene，77，61，1989)。然而，在本发明中，缺失基因的方法不仅仅限于下述方法。
用于缺失目的的DNA片段是如下构成的片段抗药标记基因在ca.0.2至3kb上游序列的侧面之间插入并且处于要缺失的基因的上游，以及抗药标记基因在ca.0.2至3kb下游序列的侧面之间插入并且处于相同基因的下游。在PCR的第一次循环中，制备下列三个片段要缺失的上游片段和下游片段，和抗药标记基因。例如，要在该步骤中使用的引物可以是专门设计的引物，以便将抗药性基因的上游10-30碱基对序列加入到上游片段的下端，以及将抗药性标记基因的下游10-30碱基对序列加入到下游片段的上端(图1)。
接下来，使用在第一次循环中制备的三个PCR片段作为模板，使用上游片段的上部引物和下游片段的下部引物(外部引物)进行PCR的第二次循环。该步骤导致与如上制成的抗药性基因序列中的抗药性标记基因片段退火接合，并通过PCR扩增，可以获得在上游片段和下游片段之间插有抗药性标记基因的DNA片段(图1)。
当采用抗氯霉素基因作为抗药性标记基因时，可以使用合适的DNA模板和如表2所示的引物组和传统的PCR酶试剂盒(例如PyrobestDNA聚合酶(Takara Shuzo的产品)在文献中描述的典型条件下(参见，例如，PCR Protocols.Current Methods and Applications，Edited by B.A.White，Humana Press，pp.251(1993)，Gene，77，61，1989)通过SOE-PCR获得用于缺失基因的DNA片段。
当由此获得的用于实现基因缺失的DNA片段通过转化方法(competent method)或类似方法引入细胞中时，在要缺失的基因上游和下游存在的同源区域中发生细胞内基因重组。因此，其中的目标基因已经被抗药性基因取代的细胞可以通过使用抗药性标记物而选择性地分离(图1)。具体而言，当在细胞中引入通过表2所列的引物组而制备的用于基因缺失的DNA片段时，分离出在含有氯霉素的琼脂培养基上生长的菌落，并通过例如使用基因组作模板的PCR之类的合适方法来证实通过被抗氯霉素基因取代而缺失了目标基因。
随后，当将编码目标蛋白质或多肽的基因转移到表1所示的任一枯草杆菌基因或一个或多个选自与其相对应的基因的基因从中缺失或剔除的宿主突变微生物菌株上时，可以获得本发明的微生物。
对编码目标蛋白质或多肽的基因没有特别的限制。蛋白质和多肽的例子包括用于工业用途的例如洗涤剂、食品、纤维、饲料、化学品、药品和诊断用药之类的生理活性多肽和酶。工业酶从功能上可以分成氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶/合成酶。优选地，可以使用例如纤维素酶、α-淀粉酶和蛋白质酶之类的水解酶。具体例子包括属于水解酶分类中的族5的纤维素酶(Bioche M.J.，280，309，1991)；特别是源自微生物的纤维素酶，更特别是源自芽孢杆菌属的纤维素酶。这些类型的工业酶的其它具体例子包括源自芽孢杆菌属并含有氨基酸序列号2或4的碱性纤维素酶、氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被缺失、取代或添加的碱性纤维素酶，以及含有与所述氨基酸序列具有70％同源性，优选80％同源性，更优选90％同源性，进一步优选95％同源性，特别优选98％或更高同源性的另一氨基酸序列的纤维素酶。
α-淀粉酶的具体例子包括源自微生物的α-淀粉酶，优选源自芽孢杆菌属的液化淀粉酶。更具体的例子包括源自芽孢杆菌属并含有序列号22的氨基酸序列的碱性淀粉酶，以及含有与所述氨基酸序列具有70％同源性，优选80％同源性，更优选90％同源性，进一步优选95％同源性，特别优选98％或更高同源性的另一氨基酸序列的淀粉酶。氨基酸序列的同源性通过Lipman-Pearson法(Science，227，1435(1985))计算。蛋白酶的具体例子包括源自微生物，特别是源自属于芽孢杆菌属的微生物的丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。
蛋白酶的具体例子包括源自微生物，优选源自属于芽孢杆菌属的微生物的丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。
优选地，编码目标蛋白或多肽的基因在其上游区域具有一个或多个适当地接合到其上的与基因的转录、转译或分泌有关的调节区域(具体而言，一个或多个选自包含启动子和转录起始位点的转录起始调节区域；包含核蛋白体结合位点和起始密码子的转译起始区域；和分泌信号肽区域的区域)。优选将由转录起始调节区域、转译起始调节区域和分泌信号区域构成的三个区域接合到目标基因上。更优选分泌信号肽区域是源自属于芽孢杆菌属的微生物的纤维素酶基因，且转录起始区域和转译起始区域是该纤维素酶基因上游的0.6至1kb区域。在一个优选例子中，在例如日本专利申请(公开)第2000-210081号和第190793/1990号中公开的源自属于芽孢杆菌属的微生物的纤维素酶基因；即，源自KSM-S237菌株(FERM BP-7875)或KSM-64菌株(FERMBP-2886)的纤维素酶基因的转录起始调节区域、转译起始区域、和分泌信号肽区域，适当地接合到目标蛋白或多肽的结构基因上。更具体地，要接合的优选DNA片段包括序列号1的碱基数量为1至659的核苷酸序列；序列号3的纤维素酶基因的碱基数量为1至696的核苷酸序列；含有与所述任意一种核苷酸序列具有70％同源性，优选80％同源性，更优选90％同源性，进一步优选95％同源性，特别优选98％或更高同源性的核苷酸序列的DNA片段；或含有缺失了所述任意一种核苷酸序列的一部分的核苷酸序列的DNA片段。优选将这些DNA片段的一种适当地接合到目标蛋白质或多肽的结构基因上。正如此处所用，含有缺失上述任意一种核苷酸序列的一部分的核苷酸序列的DNA片段是指不含上述任意一种核苷酸序列的一部分并具有与该基因的转录、转译和分泌有关的功能的DNA片段。
本发明的重组微生物可以通过传统的转化技术获得，其中将含有包括编码目标蛋白质或多肽的基因并接合到适当的质粒载体上的DNA片段的重组质粒转移到宿主微生物细胞中。或者，重组微生物可以利用通过将上述DNA片段接合到与宿主微生物基因组的某一部分同源的一个合适区域上而制备的DNA片段，并直接插入宿主微生物基因组中而获得。
使用本发明的重组微生物获得的目标蛋白质或多肽可以按照如下方式生产将相应的细胞株植入含有可同化的碳源和氮源以及其它主要组分的培养基上；通过传统的微生物培养法培养细胞株；随后，收集并提纯蛋白质或多肽。对培养基的成分和组成没有特别的限制，并且培养基优选含有麦芽糖或麦芽低聚糖作为碳源以进行令人满意的培养。
通过前述方法，可以生产宿主突变微生物株，其中表1所示的任一枯草杆菌基因或一个或多个选自与其功能相当的基因的基因已经缺失或剔除。此外，通过使用这种突变株，可以生产重组微生物。由此，通过使用突变株或重组微生物可以有效地生产有用的蛋白质或多肽。
下面将详细描述属于枯草杆菌的已经从中缺失了枯草杆菌的glvC基因(BG11848)或glvR基因(BG11847)的重组菌株的构筑方法，以及使用该重组微生物生产纤维素酶和α-淀粉酶的方法的实施例。
实施例实施例1使用从枯草杆菌168菌株中提取的用作模板的基因组DNA样品和表2所示的两个引物组(glvC-AF和glvC-A/CmR；和glvC-B/CmF和glvC-BR)制备在该基因组上的glvC基因上游侧侧面的0.5kb片段(A)和在glvC基因下游侧侧面的0.5kb片段(B)。使用用作模板的重组质粒pC194(J.Bacteriol.150(2)，815(1982))和由表2所示的glvC-A/CmF和glvC-B/CmR构成的引物组制备含有抗氯霉素基因的0.9kb片段(C)。随后，使用表2所示的引物glvC-AF和glvC-BR进行SOE-PCR，并结合使用由此制成的三个片段(A)、(B)和(C)作为模板，制备1.9kbDNA片段，其中在该序列中接合了片段(A)、(B)和(C)(参见图1)。使用由此制成的DNA片段，通过转化方法转化枯草杆菌168菌株。收集在含氯霉素的LB琼脂培养基中生长的菌落作为转化体。提取上述得到的转化体的基因组，在其上进行的PCR证实glvC基因已经被缺失并被抗氯霉素基因取代。
表2

实施例2按照与实施例1所述相似的方式，使用表2所示的两个引物组(glvR-AF和glvR-A/CmR；和glvR-B/CmF和glvR-BR)制备在该基因组上的glvR基因上游侧侧面的0.6kb片段(A)和在glvR基因下游侧侧面的0.6kb片段(B)。在质粒pUC18的XbaI-BamHI裂解位点插入质粒pC194的抗氯霉素基因(J.Bacteriol.150(2)，815(1982))，由此制备重组质粒pCBB31。将用作模板的重组质粒pCBB31和由表2所示的glvR-A/CmF和glvR-B/CmR构成的引物组制备含有抗氯霉素基因的0.9kb片段(C)。随后，使用表2所示的引物glvR-AF和glvR-BR进行SOE-OCR，并结合使用由此制成的三个片段(A)、(B)和(C)作为模板，制备2.2kb DNA片段，其中在该序列中接合了片段(A)、(B)和(C)(参见图1)。使用由此制成的DNA片段，通过转化方法转化枯草杆菌168菌株。收集在含氯霉素的LB琼脂培养基中生长的菌落作为转化体。提取上述转化体的基因组，在其上进行的PCR证实glvR基因已经被缺失并被抗氯霉素基因取代。按照类似方法，使用两个引物组(glcT-AF和glcT-A/CmR；和glcT-B/CmF和glcT-BR)分离glcT基因已经被缺失并被抗氯霉素基因取代的转化体。
实施例3在实施例1和2获得的每种基因缺失的菌株中和在用作对照物的枯草杆菌168菌株中，通过原生质体转化法引入重组质粒pHY-S237。重组质粒pHY-S237的制备如下将源自芽孢杆菌KSM-S237菌株的编码碱性纤维素酶的DNA片段(3.1kb)(序列号1，日本专利申请(公开)第2000-210081号)插入穿梭载体pHY300PLK的限制性内切酶BamHI裂解位点。将由此制成的每种细胞株在LB培养基(5毫升)中以30℃震荡培养过夜。将培养液(0.03毫升)注入2×L-麦芽糖培养基(2％胰胨、1％酵母提取物、1％NaCl、7.5％麦芽糖、7.5ppm4-5水合硫酸锰和15ppm四环素)中，然后在30℃震荡培养三天。在培养完成后，通过离心去除细胞，并测定由培养物获得的上层清液的碱性纤维素酶活性，由此计算细胞在培养过程中分泌出的碱性纤维素酶的量；即，在细胞外生成的碱性纤维素酶的量。从表3中清楚看出，与对照物168菌株(野生型菌株)相比，在使用基因缺失的可形成孢子的菌株作为宿主的所有情况下，碱性纤维素酶的生产或分泌都被证实更为有效。
表3

实施例4在实施例1至3获得的每种基因缺失的菌株中和在用作对照物的枯草杆菌168菌株中，通过原生质体转化法引入重组质粒pHSP-K38。重组质粒pHSP-K38的制备如下在穿梭载体pHY300 PLK的限制性内切酶BagII-XbaI裂解位点插入如下制成的2.1kb片段(序列号21)将包含碱性纤维素酶基因的启动子区域和信号序列区域部分的上游0.6kb片段(序列号3)与编码源自芽孢杆菌KSM-K38菌株的碱性淀粉酶基因的成熟酶区域(Asp1-Gln480)的DNA片段(1.5kb)的上游侧接合(日本专利申请(公开)第2000-184882号，Eur.J.Biochem.，268，2974(2001))。将由此获得的每种细胞株在LB培养基(5毫升)中以30℃震荡培养过夜。将培养液(0.03毫升)注入2×L-麦芽糖培养基(2％胰胨、1％酵母提取物、1％NaCl、7.5％麦芽糖、7.5ppm4-5水合硫酸锰和15ppm四环素)中，然后在30℃震荡培养三至六天。在培养完成后，通过离心去除细胞，并测定由培养物获得的上层清液的碱性淀粉酶的活性，由此计算在培养过程中细胞分泌出的碱性淀粉酶的量；即，在细胞外生成的碱性淀粉酶的量。从表4中清楚看出，与对照物168菌株(野生型菌株)相比，在使用基因缺失的菌株作为宿主的情况下，碱性淀粉酶的生产或分泌被证实更为有效。
表4

序列表<110>花王株式会社<120>Host microorganisms<130>KS0796<150>JP 2003-379114<151>2003.11.7<160>20<170>PatentIn Ver.3.1<210>1<211>3150<212>DNA<213>芽孢杆菌KSM-S237<220>
<221>CDS<222>(573)..(3044)<223>
<220>
<221>sig_peptide<222>(573)..(659)<223>
<220>
<221>mat_peptide<222>(660)..()<223>
<400>1gatttgccga tgcaacaggc ttatatttag aggaaatttc tttttaaatt gaatacggaa60taaaatcagg taaacaggtc ctgattttat ttttttgagt tttttagaga actgaagatt120gaaataaaag tagaagacaa aggacataag aaaattgcat tagttttaat tatagaaaac180gcctttttat aattatttat acctagaacg aaaatactgt ttcgaaagcg gtttactata240aaaccttata ttccggctct tttttaaaac agggggtaaa aattcactct agtattctaa300tttcaacatg ctataataaa tttgtaagac gcaatatgca tctctttttt tacgatatat360gtaagcggtt aaccttgtgc tatatgccga tttaggaagg ggggtagatt gagtcaagta420
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权利要求
1.一种重组微生物，其通过将编码异性蛋白质或多肽的基因转移到至少一种参与麦芽糖的膜渗透的基因缺失或被剔除的微生物的突变株上而制备。
2.如权利要求1所述的重组微生物，其中所述参与麦芽糖的膜渗透的基因是枯草杆菌基因glvR或glvC或与该基因功能相当的基因。
3.如权利要求1或2所述的重组微生物，其中所述微生物是枯草杆菌或属于芽孢杆菌属的另一细菌。
4.如权利要求1至3任意一项所述的重组微生物，其中一个或多个选自转录起始调节区域、转译起始调节区域和分泌信号区域的区域接合到编码异性蛋白质或多肽的基因的上游区域。
5.如权利要求4所述的重组微生物，其中所述一个或多个区域是由转录起始调节区域、转译起始调节区域和分泌信号区域构成的三个区域。
6.如权利要求4或5所述的重组微生物，其中所述分泌信号区域来自属于芽孢杆菌属的细菌的纤维素酶基因，而所述转录起始调节区域和所述转译起始调节区域各自来自该纤维素酶基因上游的0.6至1kb区域。
7.如权利要求5所述的重组微生物，其中由所述转录起始调节区域、所述转译起始调节区域和所述分泌信号区域构成的三个区域是序列号1的纤维素酶基因的碱基数为1至659的核苷酸序列；序列号3的纤维素酶基因的碱基数为1至696的核苷酸序列；含有与所述核苷酸序列的任意一种具有70％同源性的核苷酸序列的DNA片段；或含有缺失了所述核苷酸序列的任意一种的一部分的核苷酸序列的DNA片段。
8.一种生产蛋白质或多肽的方法，其使用如权利要求1至7任意一项所述的重组微生物。
9.一种生产蛋白质或多肽的方法，其特征在于包括在含麦芽糖的培养基中培养如权利要求1至7任意一项所述的重组微生物。
全文摘要
本发明提供一种通过将编码蛋白质或多肽的基因转移到能够以提高的生产率生产蛋白质或多肽并且由本发明人鉴别的宿主微生物上而获得的重组微生物，以及使用该重组微生物生产蛋白质或多肽的方法。该重组微生物通过将编码异性蛋白质或多肽的基因转移到至少一种参与麦芽糖的膜渗透的基因缺失或被剔除的微生物的突变株上而制备。
文档编号C12N15/75GK1875095SQ20048003169
公开日2006年12月6日 申请日期2004年11月5日 优先权日2003年11月7日
发明者东畑正敏, 泽田和久, 尾崎克也, 关口顺一 申请人:花王株式会社