专利名称：：用于改良生产天冬氨酸衍生的氨基酸及化学品的改变的乙醛酸支路的制作方法用于改良生产天冬氨酸衍生的氨基酸及化学品的改变的乙醛酸支路优先权的要求本申请要求2005年6月20日提交的待决美国临时专利申请第60/692，341号的优先权。该临时申请完整地引入此处作为参考。
背景技术：
：以下包括可能对本发明的理解有用的信息。这并非承认此处提供的任何信息是当前所描述或要求保护的本发明的现有技术或资料，或具体地或隐含地引用的任何出版物或文献是现有技术。本发明涉及，但不限于，微生物学和微生物遗传学领域。本发明涉及例如新的细菌林、新的核苷酸序列、新的氨基酸序列、和使用这些细菌林、新核苷酸序列和/或新氨基酸序列发酵生产氨基酸，包括但不限于L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-高丝氨酸和L-异亮氨酸的方法。优选地，生产L-苏氨酸。本发明也涉及生产动物祠料添加剂。本发明还涉及精细化学品，包括但不限于上述氨基酸的发酵和合成。在大肠杆菌(Escherichiacoli)中，氨基酸L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-高丝氨酸、L-赖氨酸和L-甲硫氨酸通过共同的生物合成途径从天冬氨酸盐(天冬氨酸)获得其全部或部分的碳原子(G.N.Cohen，"TheCommonPathwaytoLysine,MethionineandThreonine,"pp.147-171，《AminoAcids:BiosynthesisandGeneticRegulation》，K.M.Herrmann和R.LSomerville，编，Addison-WesleyPublishingCo.，Inc.，Reading,Mass.(1983)):天冬氨酸—天冬氨酰磷酸—天冬氨酸半醛—高丝氨酸——THR/ILELYSMET而天冬氨酸来源于草酰乙酸(OAA)。根据Gokarn等的美国专利6，455，284号的报道，可以使用需氧发酵生产草酰乙酸衍生的氨基酸。不幸的是，方法的产量会受到严格的碳流代谢调节的限制。一般地，据说无论该代谢系统受到怎样的干扰，流向0AA的碳流量都保持恒定。J.Vallino等，Biotechnol.Bioeng.41:633,646(1993)。克服此代谢调节对于增加0AA衍生的氨基酸及其它产品的生产将是有利的。在需氧细菌代谢中，葡萄糖的碳原子可以在三羧酸循环(TCA)(又称作柠檬酸循环或Krebs循环)中被完全氧化为二氧化碳。TCA循环从OAA与乙酰辅酶A缩合形成柠檬酸开始。图l显示细菌大肠杆菌中该需氧代谢途径的例子。除了作为TCA循环中的主要分子，0AA还可以用作氨基酸，包括L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-高丝氨酸和L-赖氨酸合成的前体。鉴于0AA对TCA循环的重要性，为了TCA循环的进一步进展，应替换掉用于氨基酸生物合成的0AA。因此，许多生物体发展了可以再生用于TCA循环的中间体的"回补途径"。一些生物体中，例如一些植物和微生物中，TCA循环中间体可以通过称作"乙醛酸支路"(也称作"乙醛酸旁路"或"乙醛酸循环")的回补途径自乙酰辅酶A形成。图2显示大肠杆菌中的乙醛酸支路。该乙醛酸支路允许生物体生长在某些底物(例如，乙酸、脂肪酸或一些长链烷烃)上补充它们的0AA。由于此类底物不提供可以被羧化以形成TCA循环所需的0AA的3-碳中间体，故该机制是有用的。碳流在TCA循环和乙醛酸支路之间的分支点被认为是异柠檬酸(K.Walsh等，J.Biol.Chem.259:15，9646-9654(1984))。在乙醛酸支路中，来自TCA循环的异柠檬酸被异柠檬酸裂解酶裂解为乙醛酸和琥珀酸。然后苹果酸合酶用于将乙醛酸与乙酰辅酶A缩合以形成苹果酸。琥珀酸和苹果酸均可以用于通过TCA循环产生0AA。一般地，编码乙醛酸旁路酶的基因的表达被认为受到严格控制，以致于当可以获得用于TCA循环的某些3-碳化合物时这些基因会受到阻遏o可以观察到以下反应aceA，异柠檬酸裂解酶异柠檬酸^乙醛酸+琥珀酸aceB，苹果酸合酶A:乙酰辅酶A+H20+乙醛酸^苹果酸+辅酶AglcB，苹果酸合酶G:乙酰辅酶A+H20+乙醛酸^苹果酸+辅酶A在大肠杆菌中，编码乙醛酸支路酶的基因位于aceA^操纵子中。它们被认为受到大量的转录调节因子，包括例如IclR(A.Sunnarborg等，J.Bact.，172:2642-2649(1990))、FadR(S.Maloy等，J.Bad.148:83-90(1981))、FruR(A.Chia等，J.Bact.，171:2424-2434(1989))，和ArcA贝S.Iuchi等，LBact.，171:868-873(1989))的控制。已经报道aceA^操纵子自位于ace"上游的(？7。型启动子表达(E.Resniketal，J.Bact.178:9，2715-2717(1996))。大肠杆菌K-12林的aceA4J操纵子的核苷酸序列见SEQIDNO:1。Keseler，I.M.，等，Nuc.AcidsRes.，33:D334-357(2005)。该操纵子被认为受到自iclR表达并由乙酸或脂肪酸上的生长所激活的阻遏蛋白的调节(E.Resnik等，见前)。aceA基因(SEQIDNO:2)(Keseler，I.M.等，见前)据报道编码异柠檬酸裂解酶(SEQIDNO:3)(Keseler，I.M.等，见前)，aceB基因(SEQIDNO:4)(Keseler，I.M.等，见前)据报道产生苹果酸合酶A(SEQIDNO:5)(Keseler，I.M.等，见前)。glcDFGB操纵子(SEQIDNO:6)(Keseler,I.M.等，见前)中的最后一个基因glcB(SEQIDNO:7)(Keseler，I.M.等，见前)据报道编码苹果酸合酶G(SEQIDNO:8)(Keseler,I.M.等，见前)，当苹果酸合酶A缺乏时该酶可以替代乙醛酸支路中的苹果酸合酶A。(L.N.Ornston，等J.Bact.，98:2，1098-1108(1969);W.Farmer,等App.&Env.Microbiol,63:8，3205-3210(1997);M.0h，等，J.Biol，Chem.，277:15，13175—13183(2002)。)野生型大肠杆菌菌抹的许多特征已有报道。例如，F.R.Blattner等Science,1997Sep5277(5331):1453-74中报道了大肠杆菌K-12林的基因组。一些作者已经报道过将碳流引向OAA的尝试，因为据假定增加碳向OAA的流动将增加可以使用OAA作为前体进行合成的生物化学品的产生。所作的努力包括敲除充当aceA^的阻遏物的基因或增强抑制aceWJ的基因(以避免碳流入乙醛酸支路)。例如，Rieping等的美国专利6，630，332号报道，通过过表达斷0基因(该基因产生苹果酸醌氧化还原酶)增加肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中苏氨酸的产生。Park等的欧洲专利申请EP1408123Al才艮道，使用已经敲除了尸a^基因的微生物生产L-苏氨酸。Rieping等的美国专利申请公布2003/0059903A1号以及Rieping等的国际公布W002/081722报道用于生产L-苏氨酸的方法，该方法包括发酵其中aceA基因或编码aceA基因的核苷酸序列被衰减或关闭的肠杆菌科细菌。Rieping等的国际专利公布WO03/038106A2号报道使用经修饰增强了fadR基因产物和/或iclR基因产物(两者均是aceBAK操纵子的转录阻遏物)的活性水平的细菌生产L-苏氨酸的方法。Hermann等的国际专利公布W003/008616号报道用于制备L-苏氨酸的方法，该方法包括发酵经修饰以致aceK基因产物的表达被衰减的肠杆菌科细菌。用于培养细菌细胞、向宿主细胞引入分离的DNA分子、以及对分离的核酸分子进行分离、克隆和测序等的方法和技术一般是本领域技术人员已知的。这些方法和技术描述在许多标准的实验室手册中，例如，Davis等，BasicMethodsInMolecularBiology(1986)，.Miller,J.H.，ExperimentsinMolecularGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1972);Miller,J.H.AShortCourseinBacterialGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1992);SingerM.和Berg，P.，Genes&Genomes,UniversityScienceBooks,MillValley,Calif.(1991);SambrookJ.等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989);Kaufman,P.B.等，HandbookofMolecularandCellularMethodsinBiologyandMedicine,CRCPress,BocaRaton,FIa.(1995);MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,Glick，B.R.和Thompson,J.E.编，CRCPress,BocaRaton,Fla.(1993);Smith-Keary，P.F.MolecularGeneticsofEscherichiacoli，TheGuiIfordPress,NewYork,N.Y.(1989);Schleif，R.F.和Wensink，P.C.PracticalMethodsinMolecularBiology,Springer-Verlag(1981);Singer,M.和Berg,P.Genes&Genomes,UniversityScienceBooks,MillValley,California(1991);Kaufman,P.B.等,HandbookofMolecularandCellularMethodsinBiologyandMedicine,CRCPress,BocaRaton,Florida(1995)5Plasmids:APracticalApproach,第2版，Hardy,K，D.编，OxfordUniversityPress,NewYork,NY(1993);Vectors:EssentialData,Gacesa,P.和Ramji，D.P.编，JohnWiley&SonsPub.，NewYork,NY(1994);PCRprimer:ALaboratoryManual,Dieffenbach，CW.和Dveksler，G.S.编ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,NY(1995)'，PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,Innis，M.A.等编.AcademicPress,SanDiego,CA(1990);GuidetoElectroporationandElectrofusions,Chang,D.等编，AcademicPress,SanDiego，CA(1992);PromiscuousPlasmidsofGram-NegativeBacteria,ThomasCM.编，AcademicPress,London(1989);TheBiologyofPlasmids,Summers,D.K.，BlackwellScience,Cambridge,MA(1996);UnderstandingDNAandGeneCloning:AGuidefortheCurious,Drlica，K.编，JohnWileyandSonsPub.，NewYork,NY(1997);Vectors:ASurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses,Rodriguez,R.L.等编，Butterworth，Boston,MA(1988);BacterialConjugation,Clew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序列、天然发现的序列及突变序列。非天然启动子和/或非天然核糖体结合位点可以例如通过重组或者通过诱变天然aceBAK或glcB启动子或结合位点而引入。在本发明再一方面，前面讨论的非天然启动子可以选自由例如tac启动子、trc启动子、lac启动子、lpp启动子、trp启动子、入-PL启动子、PR启动子、lacUV5启动子、araBAD启动子和lpp-lac启动子组成的組中的至少一种启动子。提及启动子可以包括但不限于共有序列和突变序列。鉴于本公开和Brosius等(见前)及Mulligan等(见前)，本领域技术人员可以意识到在教导使用tac启动子的实施例中使用trc启动子可以获得相似结果。一方面，本发明包括通过发酵生产L-氨基酸产品的方法，所述方法包括在发酵培养基中培养细菌，其中所述细菌生产所述L-氨基酸并含有重组核酸构建体，该构建体具有使至少一种选自由aceBAK操纵子中的基因和glcB基因组成的组的基因在所述细菌中超量表达的可操作配置；在所述发酵培养基和所述细菌中的至少一种中富集所述L-氨基酸；和从所述发酵培养基和所述细菌中的至少一种中分离所述L-氨基酸，以生产L-氨基酸产品。在本发明再一方面，上述细菌的属选自埃希氏杆菌属、棒杆菌属和短杆菌属。所述细菌可以是例如大肠杆菌。在本发明再一方面，所述重组核酸包含位于aceBAK操纵子和/或glcB基因中的至少一种基因上游的非天然启动子序列，其中该非天然启动子与aceBAK操纵子和/或glcB基因中的所述至少一种基因可操作地连接。所述启动子可以选自tac启动子、trc启动子、lac启动子、lpp启动子、trp启动子、A-PL启动子、入-h启动子、或者本领域技术人员基于本公开将意识到的其它启动子。过表达的基因可以选自aceB、aceA和glcB。非天然启动子可以替代操纵子中的天然启动子，其中可以缺失、间断、或者部分缺失和部分间断该天然启动子。可以在操纵子中除天然启动子外再插入非天然启动子。在本发明再一方面，如上提供生产L-氨基酸产品的方法，其中aceBAK基因产物和glcB基因产物中的至少一种是所述微生物中唯一的过表达的基因产物。在本发明另一方面，所述L-氨基酸选自L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-高丝氨酸、L-赖氨酸和L-曱硫氨酸。在再一方面，所述L-氨基酸是L-苏氨酸。在再一方面，本发明包括过表达aceBAK操纵子中基因以及glcB基因中的至少一种基因的细菌。该微生物的属可以选自埃希氏杆菌属、棒杆菌属和短杆菌属。该细菌可以是大肠杆菌菌林。鉴于本公开，本领域技术人员将意识到此处适用于大肠杆菌中异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶G及其编码基因的教导可以应用于棒杆菌属中的异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶G。SEQIDN0:26显示在谷氨酸棒杆菌菌株ATTC13032中编码苹果酸合酶G的基因(glcB)。SEQIDNO:27显示在谷氨酸棒杆菌菌林ATTC13032中编码异柠檬酸裂解酶的基因(aceA)。在本发明再一方面，所述细菌是大肠杆菌、乳糖发酵短杆菌、黄色短杆菌或谷氨酸棒杆菌的菌林。在本发明另一方面，所述细菌包括被非天然启动子调节的aceBAK操纵子和/或glcB基因中的至少一种基因。另一方面，本发明细菌中的非天然启动子选自tac启动子、trc启动子、lac启动子、lpp启动子、trp启动子、入-P^启动子、入-Pa启动子。在本发明再一方面，所述非天然启动子是tac启动子(Ptac)。本发明再一方面包括其中aceBAK操纵子中的天然启动子被非天然启动子替代、间断、或部分替代和部分间断的细菌。在本发明另一方面，本发明细菌包括插入aceBAK操纵子中但不替代或间断aceBAK操纵子中的天然启动子的非天然启动子。在本发明再一方面，在本发明细菌中，glcDFGB中的天然启动子已经被非天然启动子替代或间断，其中该非天然启动子与glcB基因可操作地连接。在本发明再一方面，提供本发明的细菌，其中非天然启动子插入glcDFGB操纵子中与glcB基因可操作地连接但不替代或间断该glcDFGB操纵子中的天然启动子。本发明再一方面提供于2005年5月11日保藏的、具有NRRLB—30844、NRRLB-30845、NRRLB-30846、NRRLB-30847、NRRLB-30848、NRRLB-30849、NRRLB-30850和NRRLB-30851的保藏号的细菌菌林。实施方案也提供作为这些保藏的微生物的衍生物的细菌菌林。例如，本领域技术人员将意识到可以在这些保藏菌林上进行各种修饰，包括所述代谢流量(Metabolicflux)的进一步修饰以及营养需求的改变，而不减弱aceBAK操纵子或glcB基因的过表达。在再一方面，本发明包括含有非天然启动子的重组核酸，其具有使编码大肠杆菌aceA蛋白、aceB蛋白和glcB蛋白中的至少一种蛋白的基因在细菌中过表达的可操作配置，其中所述基因包括下列中的至少一个a)编码选自SEQIDNO:3、5、8的蛋白质的DM;b)才艮据SEQIDNO:9、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24和SEQIDNO:25中的至少一个的核酸；c)仅就遗传密码而言与根据b)的核酸简并的核酸；d)含有根据a)或b)的核酸的沉默突变的核酸；e)与b)的核酸至少80%、优选地至少90%、更优选地至少95%—致的核酸；f)在严紧条件下可以与根据b)的DM杂交的核酸。在再一方面，本发明提供含有前段a)、b)、c)、d)或e)中描述的至少一种多核苷酸的载体。附图简述图l描述大肠杆菌的三羧酸循环。来自L.N.Ornston等J.Bact.，98:2，1098-1108(1969)的图。图2描述大肠杆菌的乙醛酸支路。自K.Walsh等J.Biol.Chem.259:15，9646-9654(1984)修饰的图。图3描述带有抗生素标志和tac启动子的PCR产物向染色体中的整合。使用同源重组以交换用于表达aceBAK和glcB基因的启动子。spcR-壮观霉素抗性盒，kanR-卡那霉素抗性盒。朝右的箭头显示异源启动子(Ptac)的大概位置。含有spcR或kanR以及tac启动子的线性PCR产物(顶线)交换进入染色体(中线)以产生具有驱动aceBAK或glcB菌林(底线)n图4显示用于构建本文中所列菌林的引物的5'-3'序列。带下划线的残基提供与aceB等位基因或与glcB等位基因的序列同源性，并使得可以通过同源重组实现向染色体中的插入。粗体残基编码tac启动子。图5显示tac启动子与7种不同的Ptac-基因融合物，包括tac启动子(Ptac)的序列(SEQIDNO:9)和7种不同Ptac插入构建体的启动子区序列(起始密码子(ATG)被加以框线)。所显示的Ptac-aceBAK(SEQIDNO:19)为菌林s4391-184-l和菌林s4538-006-l中所发现的。所显示的Ptac(2)-aceB(SEQIDNO:20)为菌株s4480-140-5中所发现的。所显示的Ptac(3)-aceBAK(SEQIDNO:21)为菌林s4480-148-l中所发现的。所显示的Ptac(4)-aceBAK(SEQIDNO:22)为菌林s4480-199-l中所发现的。所显示的Ptac(5)-aceBAK(SEQIDNO:23)为菌林s4538-003-l中所发现的。所显示的Ptac\lac-aceBAK(SEQIDNO:24)为菌林s4480-199-4中所发现的。所显示的Ptac-glcB(SEQIDNO:25)为菌林s4397-109-2及菌林s4538-006-l中所发现的。表1显示本文中给出的菌抹的菌林编号和相关基因型。表l也给出在PCR扩增用于构建本文所列的菌林的DM时使用的引物和模板。表2列出带有tac启动子融合物的各种菌林的苹果酸合酶(MS)及异柠檬酸裂解酶(ICL)的比活性。表3、表4和表5列出测量tac启动子融合物菌林的苏氨酸效价及产量的摇瓶实验的结果。发明详述如下所讨论的，本发明提供用于生产天冬氨酸衍生的氨基酸和化学品的、具有改良性质的微生物菌林。提供制备此类菌林的方法。这些方法包括改变aceBAK操纵子、aceA基因、aceB基因、glcB基因、或它们的组合的表达。表达的改变可以通过增强转录、和/或解除天然的转录控制来实现。也考虑置换这些基因的天然启动子；例如，用tac启动子(Ptac)置换它们的天然启动子。本发明还涉及提供本发明新特性的基因构建体，包括栽体，其中该栽体可以是，但不限于，质粒、粘粒、病毒、噬菌体、转座子或微型染色体。I.定义本文所用某些术语是本领域普通技术人员所使用的，并具有本领域技术人员所通常理解的一般含义。本文旨在包括这些一般含义的最完整范围。然而，为了本说明书和权利要求(包括其中术语被给予的范围)的清楚、一致的理解，对于宣称的含义可能与此处提供的定义相矛盾的情况，提供以下定义，在这些情况下由所提供的定义来支配。注意，术语"a"或"an"实体指一或多个/种该实体；例如，"多核苷酸(apolynucleotide)"应理解为代表一或多个/种多核苷酸。如此，术语"a"、"an"、"一或多个/种"及"至少一个/种"在本文中可以互换使用。染色体整合。在本文中，术语"染色体整合"指外源DNA片段插入宿主生物的染色体中。组成型。本文中，术语"组成型"指这样的启动子，该启动子被表达并且已知不受控于完全造成表达终止的调节；即，该启动子总是"开启的"。内源。本文中，术语"内源"指在生物体中天然存在于该生物体内的DNA序列。aceA基因。本文中，术语"aceA基因"指编码具有异柠檬酸裂解酶活性的蛋白质的核酸序列。异柠檬酸裂解酶催化乙醛酸循环中异柠檬酸向乙醛酸和琥珀酸的可逆裂解。aceA基因的一个例子编码根据SEQIDN0:3的蛋白质。来自各种细菌菌林的异柠檬酸裂解酶基因序列的其它实例包括编码根据SEQIDNO:28至SEQIDNO:35的蛋白质的那些序列。典型的aceA基因实例包括SEQIDN0:2和SEQIDNO:27中给出的核酸序列。来自各种细菌菌林的aceA基因的其它实例包括根据SEQIDNO:36至41的那些。aceB基因。本文中，术语"aceB基因"指编码具有苹果酸合酶A活性的蛋白质的核酸序列。该活性催化乙酰辅酶A与乙醛酸及水反应形成S-苹果酸和辅酶A。来自各种细菌菌林的aceB基因的实例包括编码才艮据SEQIDNO:42至48的蛋白质的那些。典型的aceB基因实例包括SEQIDNO:4和SEQIDNO:26中给出的核酸序列。来自各种细菌菌林的aceB基因的其它典型实例包括根据SEQIDNO:49至53的那些。glcB基因。本文中，术语"glcB基因"指编码具有苹果酸合酶G活性的蛋白质的核酸序列。该活性也催化乙酰辅酶A与乙醛酸及水反应形成S-苹果酸和辅酶A。glcB基因的一个实例编码根据SEQIDNO:8的蛋白质。具有苹果酸合酶G活性的蛋白质序列可以通过与SEQIDNO:8比与SEQIDNO:42具有更高的氨基酸序列同一性而区别于具有苹果酸合酶A活性的那些蛋白质序列。来自各种细菌菌林的glcB基因的实例包括编码根据SEQIDNO:7的蛋白质的那些。来自各种细菌菌林的glcB基因的其它典型实例包括根据SEQIDNO:58至60的那些序列。异源。本文中，术语"异源"指来自不同来源或者来自相同来源的不同位置的结构。诱导物。本文中，术语"诱导物"指发挥作用刺激从诱导型启动子的转录的分子。诱导物(通常，但并不总是，外部分子)的存在将刺激转录。分离的多核苷酸。本文中，术语"分离的多核苷酸"指已经自其天然环境中取出的多核苷酸，DNA或RNA。例如，载体中包含的重组DNA分子被认为是分离的。分离的DNA分子的其它实例包括维持在异源宿主细胞中的重组DNA分子或者溶液中纯化的(部分地或基本上纯化的)DNA分子。在作为一个混合克隆文库的一员并且尚未与文库中的其它克隆分离的克隆中所包含的核酸分子，或者自细胞或细胞裂解物中分离或移出的染色体中包含的核酸分子，不是"分离的"。分离的RNA分子包括本发明中所包括的DNA分子的体内或体外RNA转录物。分离的DNA也包括通过PCR扩增产生的DNA。重组核酸。本文中，术语"重组核酸"指经过操作将来自异源来源的核酸融合在一起的多核苷酸序列。天然启动子。本文中，术语"天然启动子"指在亲本菌林中与基因可操作地连接的内源启动子。非天然启动子。本文中，术语"非天然启动子"一方面是指与不4接的内;源1动子。非天然启动;也可以是异源i动子rs非天然启动子也可以是其序列相对于亲本菌林已经发生改变、缺失、置换和/或突变的启动子。此类改变、缺失、置换和/或突变可以通过任何机制产生。一些可能的机制包括但不限于化学诱变、紫外线诱变、重组或者本领域技术人员认可的其它方式。非天然启动子可以通过一个或多个改变、缺失、置换或突变而产生。非天然启动子可以通过对一系列亲本菌林实施多个和/或连续的突变、改变、缺失和/或置换而产生。可操作地连接。本文中，术语"可操作地连接"、"可操作地结合"和"具有可操作的配置(operablyconfigured)"可互换使用，指核酸元件以功能性的关系连接。当一个核酸序列被放置在与另一核酸序列形成功能性关系的位置时，该核酸序列与该另一核酸序列可操作地连接。例如，如果一个启动子影响一个多肽编码区的转录，则该启动子与该多肽编码区可操作地连接。可操作地连接的核酸典型地紧靠在一起或者是连续的，并且在必要、最佳或可用的时候，使两个多肽编码区连续地连接在一起并处于共同的转录控制下，例如在操纵子中那样。操纵子。本文中，术语"操纵子"指一个连续部分的编码mRNA的核酸序列，其中两个或两个以上编码多肽的开放阅读框被转录为多顺反子信使RNA，并受到顺式作用启动子以及可能地能够用于分子控制转录的其它顺式作用调节序列的控制。启动子。本文中，术语"启动子"意味着用于结合RNA聚合酶以及起始转录的DNA序列部分，因此指能够在细胞中启动编码序列或其它功能性RNA表达的DNA序列。启动子序列通常，但并不总是，存在于基因的5，非编码区中，位于一个或多个编码多肽的开放阅读框的上游。启动子中在转录起始中起作用的序列元件常常由共有核苷酸序列来表征。启动子序列可以包括近侧的以及较远的上游元件。细菌启动子中保守的近侧元件的实例包括分别位于转录起始点上游10个和35个碱基位置的-10区和-35区。启动子可以例如是组成型的、诱导性的或者环境反应性的。启动子可以整个地来源于天然基因或者可以是杂合启动子。杂合启动子由来源于不同的天然启动子的不同元件组成，和/或可以包含合成DM片段。超量产生。本文中，术语"超量产生(或者过量生产)"指细胞产生的化合物的量大于参考菌林所产生的该化合物的量。参考菌林可以是例如，用于制备本发明菌抹的亲本菌林。参考菌林也可以是野生型菌林。过表达。本文中，术语"过表达"意味着基因产物(RNA和/或蛋白质)在经过突变、杂交、或重组DNA技术操作的后代生物中相对于在野生型菌林或未接受过此操作的亲本生物体中超量产生。菌林。本文中，术语"菌株"指具有一致的或基本上一致的表型和基因型特征的特定种细菌。除非有相反说明，否则术语"菌林"和"细胞，，在本文中可以互换使用。抑制因子和阻遏物。本文中，术语"抑制因子"和"阻遏物"指起阻断或降低自可去阻遏启动子的转录之作用的不同类型分子。抑制到抑制的小分子。阻遏物是可以与启动子的顺式作用转录调节元件结合并且该结合可以造成自所述启动子的转录受到抑制的蛋白质。抑制因子和阻遏物常常在宿主细胞中产生。可以将抑制因子加入宿主细胞正在生长或者将要生长于其中的培养基中。合成启动子。本文中，术语"合成启动子"指具有启动子活性并且已知不存在于自然界的核苷酸序列。产率。本文中，术语"产率"指相对于消耗的原料量而言所产生的产物量。就微生物所产生的氨基酸而言，产率指相对于所述过程所消耗的原料量而言所产生的氨基酸量。例如，当微生物消耗ioo克葡萄糖产生25克L-异亮氨酸时，相对于该葡萄糖，L-异亮氨酸的产率为25%。粘粒。本文中，术语"粘粒"指由质粒序列和入噬菌体的粘性末端组成的杂合栽体。外源的。本文中，术语"外源的"指生物体中非天然存在于该微生物中的DNA序列。染色体外元件。本文中，术语"染色体外元件"指未与染色体连接的元件。本发明的染色体外元件包括例如，但不限于，载体。栽体可以是例如但不限于质粒、粘粒、病毒、噬菌体转座子或微型染色体。同源。本文中，术语"同源"指来自相同来源或者具有相同的进化结构或功能的结构。同源重组。本文中，术语"同源重组"指两个DNA分子之间同源或几乎同源的序列的交换。亲本菌抹。本文中，术语"亲本菌株"指被突变、电穿孔或以其它方式改变以提供本发明菌林或宿主细胞的微生物菌株，或者在已经被突变、电穿孔或以其它方式改变以提供本发明菌株或宿主细胞的菌林之前的菌林。质粒。本文中，术语"质粒"指可以用作克隆载体的环状染色体外元件。内源启动子。本文中，术语"内源启动子"指在野生型的所选宿主微生物中天然存在的启动子序列。异源启动子。本文中，术语"异源启动子"指非天然存在于所选宿主微生物中的启动子序列。非天然启动子序列可以来自原核或真核生物。调节。本文中，术语"调节"指一些基因产物响应分子信号出现的水平上升或降低。这些基因产物可以是例如但不限于蛋白质和mRNA。调节可以是在特定环境下基因产物增加的"正调节"(或者"诱导")。调节可以是特定环境下基因产物降低的"负调节"(或"阻遏")。核糖体结合位点(RBS)。本文中，术语"核糖体结合位点"指mRM分子中与核糖体结合以起始翻译的区域。栽体。本文中，术语"栽体"指能够在宿主生物体中复制的DNA分子。除非另行说明，否则本文中新描述的所有核苷酸序列均使用自动DNA测序仪(例如，来自AppliedBiosystems，Inc.的373型)进行了确定。因此，正如本领域中对于通过此自动化方法确定的任何DNA序列所已知的，本文中所确定的任何核苷酸序列均可能含有一些错误。通过自动化确定的核苷酸序列典型地与所测序的DM分子的实际核苷酸序列有至少大约90%—致性，更典型地至少大约95%至至少大约99.9%—致性。II.菌抹和核苷酸本发明方面包括制备超量产生一种或多种氨基酸的细胞的方法以及由这些方法制备的细胞、这些细胞的后代、以及具有相似特征的细胞。尽管本文中在制备L-苏氨酸的情况下讨论本发明，但是应理解本发明的方法、菌林和构建体可以用于生产衍生自天冬氨酸的其它氨基酸或化学品，包括但不限于L-曱硫氨酸、L-异亮氨酸、L-高丝氨酸和本发明的细菌和方法可以利用或不利用原有启动子或基因的"敲除"。"敲除"指通过插入或缺失在物理上置换启动子或基因以致该启动子或基因无功能。当非天然启动子与aceBAK操纵子或glcB基因可操作地连接时，天然启动子可以被间断或者缺失(整个地或部分地)。备选地，可以将非天然启动子置于该非天然启动子可操作地连接的基而，在此情况下，非天然启动子也将发挥作用以独立于天然启动子的方式启动转录。有大量的启动子适用于本发明。它们包括例如，但不限于启动子tac，trc，lac，lpp，trp，入PL，入PR，lacUV5，araBAD，lpp-lac,phoA，recA，proU，cst-l,tetA，cadA,nar，cspA，Tl，T71ac，T31acT-lac，T4基因32，nprMlac，VHb及蛋白质A。图5显示tac启动子的一个示例性核苷酸序列(SEQIDNO:9)(Proc.Natl.Acad.Sci80:21-25.，deBoer等)。其它启动子的序列是本领域已知的，它们在本发明中的应用鉴于本公开将是明显的。本发明菌林的一条或多条染色体可以包括一个以上的aceBAK操纵子和/或glcDFGB操纵子或glcB基因，而且每个操纵子或基因均可以独立地具有与该操纵子或基因可操作地连接的非天然的或天然的启动子。如果染色体中存在一个以上的aceBAK操纵子、glcDFGB操纵子和/或glcB基因，则它们可以包括相同或不同的非天然启动子。除了包括与至少一个aceBAK操纵子、glcDFGB操纵子和/或glcB基因可操作地连接的非天然aceBAK操纵子、glcDFGB操纵子和/或glcB基因启动子的启动子，本发明菌林还可以包括可操作地与aceBAK操纵子、、glcDFGB操纵子和/或glcB基因以及非天然启动子连接的核糖体结合位点，其中该核糖体结合位点是天然的aceBAK操纵子、glcDFGB操纵子和/或glcB基因的核糖体结合位点或者是非天然的核糖体结合位点。在本发明中使用的非天然核糖体结合位点包括来自lac、thrA、folA、araC、araB、galE、ompA、trypE、lamB、MS2夕卜壳蛋白和QB外壳蛋白的核糖体结合位点。应当理解，在整个本公开中，本发明中公开的核苷酸序列和/或启动子应理解为包括这些序列和/或启动子的共有序列、在本发明的一些方面中也包括与所公开的序列至少90%、91%、92%、"％、"％、95°/。、96%、97%、98%、99%或100%—致的核苷酸序列。作为一种具体实施方式，可以利用序列分析计算机程序，例如用于Windows的0MIGA2.0版(可获自OxfordMolecular,Ltd.(Oxford,U.K.))常规地确定任何特定核苷酸序列是否与一个核苷酸序列或互补核苷酸序列具有至少大约90%、91°/。、92%、93%、94%、95%、96°/。、97%、98%、99°/。或100°/。一致性。OMIGA⑧使用基于緩慢完全的动态规划比对法的CLUSTALW比对算法以及开放缺口罚分为10以及延伸缺口罚分为5.0的默认参数，以找到两个核苷酸序列之间的最佳比对。当使用CLUSTALW或其它序列比对程序来确定一个特定序列是否与参考序列具有例如95%—致性时，可以对这些参数进行设置以便在参考核苷酸序列的全长范围计算一致性百分数并允许在参考序列中有不超过核苷酸总数5%的缺口、错配或插入。本发明也可以使用本领域已知的其它序列分析方法和程序。本公开中描述的实验利用的是GCGWisconsinPackage(WisconsinPackagelO.3或11.1版,AccelrysInc.，SanDiego,CA。SeqLAb的部分基于"遗传数据环境(GDE)"，其最初由Illinois大学微生物系(Urbana-champaign，Illinois,USA)开发并许可给GCG)，这是一个可以从Accelrys⑧获得的测序程序。所用的WisconsinPackage⑧的元件包括GAP、SSEARCH、FASTA和BLAST。2005年5月11日于农业研究机构保藏中心(theNationalCenterforAgriculturalUtilizationResearch,Peoria,Illinois)保藏、并分别具有NRRLB-30844、NRRLB-30845、NRRLB-30846、NRRLB-30847、NRRLB-30848、NRRLB-30849、NRRLB-30850和NRRLB-30851保藏号的细菌菌抹s4397-184-l、s4480-140—5、s4480-148-l、s4480-199-l、s4538-003-l、S4480-199-4、s4397-109-2和s4538-006-2，展示了本发明的多个方面。例如，在s4397-184-1中tac启动子已经在大肠杆菌中与aceBAK操纵子可操作地连接。当在摇瓶中检测时，该菌林能够相对于野生型大肠杆菌中的苹果酸合酶活性和苏氨酸效价具有增加的苹果酸合酶活性和增加的苏氨酸效价。有关这些菌林的结果在下面的实施例4和5中有更完全的阐述。在再一方面，本发明包括包含与aceA基因、aceB基因和glcB基因中的至少一个可操作地连接的非天然启动子的核酸，其中所述核酸分别编码异柠檬酸裂解酶、苹果酸合酶A、或苹果酸合酶G中的至少一个。对应于aceA基因的多肽的非限制性实例包括根据SEQIDN0:3和SEQIDN0:28至35的蛋白质。典型的aceA基因实例包括SEQIDNO:2和SEQIDNO:27中给出的核酸序列。来自各种细菌菌林的aceA基因的其它实例包括根据SEQIDNO:36至41的那些核酸序列。对应于aceB基因的多肽的非限制性实例包括根据SEQIDNO:42至48的蛋白质。对应于g1cB基因的多肽的非限制性实例包括根据SEQIDNO:8和SEQIDNO:54至57的蛋白质。前述多核苷酸的非限制性实例是根据SEQIDNO:9、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:36至41、SEQIDNO:45至53、以及SEQIDNO:58至60的核酸。所述多核苷酸也可以是就遗传密码子而言与前述多核苷酸序列之一简并的、根据该前述多核苷酸序列的DM,或者含有前述序列的沉默突变的DNA。此类沉默突变描述在Bowie,J.U.等"破译蛋白质序列中的信息对氨基酸替代的耐受"Science247:1306-1310(1990)。所述多核苷酸也可以是与所述DNA具有至少80%、优选地至少90%、更优选地至少95%—致性的DNA、具有简并性改变的DNA、或者具有如上讨论的沉默改变的DNA、或者可以在严紧杂交条件与以上讨论的任何DM杂交的多核普酸。本发明还可以包括提供此段中的任何多核苷酸的载体。III.DNA构建体另一方面，本发明包括含有与至少一个非天然启动子可操作地连接的大肠杆菌aceBAK操纵子和/或glcDFGB操纵子的至少一部分，例如，glcB基因、aceA基因和/或aceB基因的DNA构建体(例如栽体)。本发明的DNA构建体还可以包括对于所包括的基因而言并非天然大肠杆菌核糖体结合位点的核糖体结合位点，例如lac核糖体结合位点。当然，本发明的DNA构建体可以包括本领域已知的其它调节元件或额外的DM元件。本发明的DNA构建体可以是一个或多个载体。本发明的载体可以包含至少一个调节元件。例如，调节元件可以是启动子、操纵基因、激活子(activator)、阻遏子(repressor)、和/或增强子。栽体也可以包含一个或多个起始序列和/或一个或多个核糖体结合位点。栽体还可以包含选择标记。调节元件可以位于宿主细胞的染色体上和/或其它栽体中。在本发明的一个方面，提供包含与至少一个对于大肠杆菌而言异源的启动子可操作地连接的aceA基因、aceB基因或glcB基因的DM构建体。在本发明再一方面，DM构建体还包含至少一个核糖体结合位点，所述核糖体结合位点与aceA基因、aceB基因或glcB基因以及非天然大肠杆菌aceA、aceB或glcB启动子的启动子可操作地连接，其中所述至少一个核糖体位点不是这些基因的天然大肠杆菌核糖体结合位点。本发明栽体可以是但不限于质粒、粘粒、病毒、噬菌体、转座子或微型染色体。本发明再一方面，与aceA基因、aceB基因或glcB基因在DNA构建体中可操作地连接的启动子可以是例如但不限于tac、trc、lac、lpp、trp、入Pl、入Pr、lacUV5、araBAD、lpp-lac、phoA、recA、proU、cst-l、tetA、cadA、nar、cspA、T7、T71ac、T31ac、T-lac、T4基因32、nprMlac、VHb和蛋白质A。在本发明再一方面，提供包括本发明DNA构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是微生物，包括例如大肠杆菌细胞，并且可以还包括可能为本领域技术人员所期望的修饰或内含物。所述宿主细胞可以产生L-苏氨酸。一方面，所述宿主细胞与不带有至少一个本发明DNA构建体的亲本细胞相比以更高产率产生L-苏氨酸。IV.用于氨基酸生产的培养基和方法
技术领域：
：本发明还涉及一般地上面描述的及以下要求保护的菌林和宿主细胞在生产氨基酸的发酵方法中的用途。此类氨基酸可以包括例如天冬氨酸家族的氨基酸。天冬氨酸家族的氨基酸可以包括例如L-苏氨酸、L-曱硫氨酸、L-异亮氨酸、L-高丝氨酸和L-赖氨酸。氨基酸可以通过例如在含有至少一种碳源、至少一种氮源以及，适当地，无机盐、生长因子等等的合成培养基或天然培养基中培养本发明的菌林或宿主细胞而获得。适宜碳源的实例包括但不限于碳水化合物，例如，葡萄糖、果糖、淀粉、蔗糖、淀粉水解物、纤维素水解物以及糖蜜；有机酸，例如乙酸、丙酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸、和富马酸；以及醇类，例如甘油和乙醇。适宜氮源的实例包括但不限于氨，包括氨气和氨水；无机或有机酸的铵盐，例如氯化铵、磷酸铵、硫酸铵和乙酸铵；和其它含氮物质，包括肉骨、蛋白胨、玉米浆、酪蛋白水解物、豆饼水解物和酵母提取物。适用于本发明的培养基包括但不限于下列培养基1.基本培养基。Davis基本培养基(每升含有7.Og磷酸氢二钾、2.0g磷酸二氢钾、Q.5g/1柠檬酸钠、0.1硫酸镁、1.0g硫酸铵，pH7.0，补充碳源(典型地葡萄糖)至0.1%(w/v)以及按需补充氨基酸源(典型地0.r/。水解酪蛋白氨基酸(w/v)或0.15°/。酵母提取物(w/v))。2.LB(10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、10g/lNaCl)3.BTY2(1.Og/1K2H0P4、10.0g/1(NH4)2S04、40.8g/1Bis-Tris、15g/l酵母提取物(Difco)、32.5g/l葡萄糖和1.2g/lMgS04-7H20，pH7.0)3.BTY3(1.Og/1K2HOP4、10.0g/l(NH4)2S04、40.8g/lBis-Tris、20ml/l的50%固体玉米浆(Sigma)、25.0g/l葡萄糖和1.2g/lMgS04-7H20pH7.0，按需补充氨基酸源(典型地1.0°/。水解酪蛋白氨基酸或1.5%酵母提取物(w/v))。可以使用本发明菌林以例如分批型或补料-分批型发酵法商业生产氨基酸。在分批型发酵中，在发酵开始时添加营养物。在补料分批型发酵或长期的补料分批型发酵中，一种或多种营养物(l)连续地向培养物供应，(2)自发酵开始起供应或者在培养达到某个阶段后供应，和/或(3)当补充的所述营养物自培养基中被耗尽时供应。长期的分批或补料分批发酵的一种变异方案是重复的补料分批发酵或填充-和-抽取发酵(fill-and-drawfermentation),其中可以在特定时间移出发酵罐的部分内容物(例如，当发酵罐满时)而继续补给营养物。以此方式，可以相对于未使用此类方法时延长发酵至更长时间。另一类发酵，连续发酵或恒化培养，采用完全培养基的连续补料而培养液体被连续地或半连续地抽取出来以便发酵罐中培养液体积保持大致恒定。连续发酵在理论上可以维持无限长的时间。在分批发酵中，培养的生物可以一直生长直到培养基中的任一种必需营养物被耗尽或者发酵条件变得不利(例如，pH降低到可以抑制微生物生长的值)时。补料分批发酵中通常采取措施以维持有利的生长条件(例如，通过使用pH控制)并通过向培养物补给一种或多种必需营养物以防止这些营养物的耗竭。培养的^:生物通常将以营养物的补料速率所决定的速率持续生长。一些情况下单一一种营养物，非常常见的是碳源，将对生长是限制性的。相同的原则适用于连续发酵期间，在该过程中补给的培养基中一种营养物可以是限制性的而其它营养物均是过量的。在微生物停止生长后，该限制性的营养物一般将以极低浓度存在于培养液中。尽管可以使用不同类型的营养物限制，但是最常使用的碳源限制。其它限制性营养物的实例包括氮、硫、磷、痕量金属和氧源。维生素和氨基酸也可以是限制性营养物，尤其是在所培养的微生物对于限制性氨基酸或维生素而言是营养缺陷型的时候。培养后，可以根据多种方法中的一种或多种，从培养液部分地或完全地分离已经积累在培养液中的氨基酸(例如，L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-高丝氨酸、L-赖氨酸或L-异亮氨酸)。例如，据报道离子交换树脂可以用于根据美国专利5，342，766号所描述的方法纯化L-苏氨酸。该方法涉及首先从培养液中通过离心取出微生物，然后使用盐酸将培养液的pH调节至大约2。该酸化后的溶液随后通过强酸性阳离子交换树脂，并使用稀释的氨水洗脱吸附物。通过在真空下蒸发去除氨，并浓缩所得溶液。添加醇并随后冷却以提供L-苏氨酸晶体。从培养基中纯化L-异亮氨酸的另一方法描述在美国专利5,474,918号中。VI.实施例以下实施例仅仅是本发明一些方面的代表。本领域技术人员将理解本说明书中描述的本发明可以使用各种微生物及启动子来实施。这些实施例和其中所用的菌林不应解释为以未在权利要求中明确说明的任何方式限制本发明。实施例1实施例l描述通过以导致aceBAK操纵子中基因表达增加的方式将tac启动子插入aceB上游的位置，制备超量产生苹果酸合酶和异柠檬酸裂解酶的菌抹。通过用来自质粒pKD4(Datsenko和Wanner,2000)的编码卡那霉素抗性基因的线性DNA转化菌林s4370-69-2，将tac启动子(deBoer等，1983，和图5)插入野生型aceB基因的上游(图3)。菌林s4370-69-2作为亲本菌株缺乏抗生素抗性标记。其于2005年5月11日寸呆藏在农业研究才几构保藏中心(theNationalCenterforAgriculturalUtilizationResearch,Peoria,IlHnois)保藏，具有保藏号NRRLB-30843。在使用引物aceBUS-kan4(SEQIDNO:10)和特异于启动子构建体的引物(tacaceB-kan3(SEQIDNO:11)、tac(2)aceB-kan3(SEQIDNO:12)或tac(3)aceB-kan3(SEQIDNO:13))的聚合酶链式反应(PCR)中，质粒pKD4被用作模板。所有引物序列均列在图4中。备选地，使用菌林s4397-184-l(Ptac-aceBAK)(表l)的染色体DNA作为模板，使用引物aceBUS-kan4(SEQIDNO:10)和特异于启动子构建体的引物(tac(4)aceB(SEQIDNO:14)、tac(5)aceB(SEQIDNO:15)或aceB-tac\lacrev(SBQIDNO:16))。这些PCR产物含有卡那霉素抗性基因，在该基因的侧翼为与菌林MG1655(Blattner等，1997)的aceB等位基因序列同源的序列，且tac启动子替代了aceBAK启动子(Chung等，1988)。使用AdvantageHFTMpCR试剂盒(Clontech)遵循厂商指导进行PCR。50y1反应物包括5jal10xHFPCR反应緩冲液(Clontech专有配方)、10xHFdNTP混合物(Clontech专有配方)、1^150xAdvantage-HF聚合酶混合物(其由50%甘油、40mMTris-HCl(pH7.5)、50mMKCl、25mM(NH4)2S04、ImMEDTA、5mM2-巯基乙醇、0.25%Thesit、1.1|ig/ju1TagStart抗体、Clontech专有量的KlenTaq-lDNA聚合酶、和专有量的DeepVentDNA聚合酶组成)、每种引物(100pmo1/y1)各0.5p1和1m1才莫板DNA(1-50pg"l)。按如下在AppliedBiosystems9700热循环仪中进行循环94"C预处理4分钟，然后25个循环，每个循环为94°C10秒、55°C30秒和68'C90秒。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表l.8种不同过表达菌林的构建。所列为用于引入每种启动子基因融合物的引物和模板以及所得菌林的菌林名称。然后使用PCR产物，按照具有以下修改的以前描述过的方案(Datsenko和Wanner，2000)，转化带有质粒pKD46的菌林s4370-69-2:将带有质粒PKD46的菌林s4370-69-2在定轨摇床上30。C生长的50mlLB(Difco)培养物，于250ml带挡板的摇瓶中培养至OD,为0.4。然后加入0.5ml20%(w/v)阿拉伯糖，使培养物再生长2.0小时，此时才艮据Datsenko和Wanner(2000)的方案制备电感受态细胞。通过将1.0-3.0Mg沉淀的PCR产物悬浮在45jal电感受态细胞中并将该混合物转移至0.lcm电穿孔杯中，实施电穿孔。然后在Bio-RadGenePulser1I中以1.8kV、25pF和200Q对电穿孔杯进行脉沖。之后细胞在lml2YT(Difco)中37X:培养4小时，将整个lml铺在具有50jag/ml卡那霉素的LB琼脂(Difco)上，37t:孵育1-2天。按照Datsenko和Wanner(2000)所述，消除所得卡那霉素抗性菌林中的质粒pKD46，产生菌抹s4397—184-1(Ptac—aceBAK)、s4480-140-5(Ptac(2)-aceBAK)、s4480-148-l(Ptac(3)-aceBAK)、s4480-199-l(Ptac(4)-aceBAK)、s4538-003-l(Ptac(5)-aceBAK)和s4480-199-4(PtacAlac-aceBAK)(表1)。实施例2以下实施例描述通过以导致glcB基因产物表达增加的方式将tac启动子插入大肠杆菌glcB基因上游的位置，制备超量产生苹果酸合酶的菌林。通过用来自质粒pBSL175(Alexeyev等，1995)的编码壮观霉素抗性基因的线性DNA转化菌林s4370-69-2，将tac启动子(deBoer等，1983，和图5)插入glcB基因的上游，从而驱动GlcB表达(图3)。在使用引物glcBUS-spc2(SEQIDNO:18)和tac-glcB-spcl(SEQIDNO:17)(所有引物序列列在图4中)的PCR中，质粒pBSL175被用作模板。该PCR产物含有壮观霉素抗性基因，在该基因的侧翼为与MG1655(Blattner等，1997)的glcB等位基因序列同源的序列，而tac启动子替代了该glcB基因紧上游的DNA。使用Advantage-HFTMPCR试剂盒(Clontech)遵循厂商指导进行该PCR。50jii1反应物包括5p110xHFPCR反应緩冲液(Clontech专有配方)、5ju110xHFdNTP混合物(Clontech专有配方)、1y150xAdvantage-HF聚合酶混合物(其由50%甘油、40mMTris-HCl(pH7.5)、50mMKCl、25mM(NH4)2S04、lmMEDTA、5mM2-巯基乙醇、0.25%Thesit、1.1pg/ja1TagStart抗体、Clontech专有量的KlenTaq-lDNA聚合酶、和专有量的DeepVentDNA聚合酶组成)、每种引物(100pmol/jul)各0.5|nl和1ju1模板DNA(1-50pg/jal)。按如下在AppliedBiosystems9700热循环仪中进行循环94。C预处理4分钟，然后25个循环，每个循环为94°C10秒、55°C30秒和68'C90秒。然后使用PCR产物，根椐具有以下改变的以前描述过的方案(Datsenko和Wanner,2000)，转化带有质粒pKD46的菌林s4370-69-2:将带有质粒PKD46的菌林s4370-69-2在定轨摇床上30'C生长的50mlLB(Difco)培养物，于250ml带挡板的摇瓶中培养至OD,为0.4。然后加入0.5ml20%(w/v)阿拉伯糖，使培养物再生长2.0小时，此时才艮据Datsenko和Wanner(2000)的方案制备电感受态细胞。通过将1.0-3.0|ig沉淀的PCR产物悬浮在45p1电感受态细胞中并将该混合物转移至0.1cm电穿孔杯中，实施电穿孔。然后在Bio-RadGenePulserII中以1.8kV、25jaF和200Q对电穿孔杯进行脉沖。之后细胞在1ml2YT(Difco)中37"C培养4小时，将整个1ml铺在具有10jug/ml壮观霉素的LB琼脂(Difco)上，37X:孵育2-3天。按照Datsenko和Wanner(2000)所述，消除所得壮观霉素抗性菌林中的质粒pKD46，产生菌林s4397-109-2。实施例3以下实施例描述通过以导致glcB及aceBAK基因产物组成型地过量表达的方式将tac启动子引入大肠杆菌glcB上游以及aceBAK操纵子上游的位置，制备超量产生苹果酸合酶及异柠檬酸裂解酶的菌林。通过用来自质粒pKD4(Datsenko和Wanner)的编码卡那霉素抗性基因的线性DNA转化菌林s4370-69-2，将tac启动子(deBoer等，1983:和图5)插入菌林s4397-109-2的野生型aceB基因上游(图3)。在使用引物aceBUS-kan4(SEQIDNO:10)和tacaceB-kan3(SEQIDNO:11)(所有引物序列列在图4中)的PCR中，质粒pKD4被用作模板。该PCR产物含有卡那霉素抗性基因，在该基因的侧翼为与菌林MG1655(Blattner等，1997)的aceB等位基因序列同源的序列，其中tac启动子替代了该aceBAK启动子(Chung等，1988)。使用Advantage-HFPCR试剂盒(Clontech)遵循厂商指导进行该PCR。50ji1反应物包括51lOxHFPCR反应緩冲液(Clontech专有配方)、5ju110xHFdNTP混合物(Clontech专有配方)、1ju150xAdvantage-HF聚合酶混合物(其由50%甘油、40mMTris-HCl(pH7.5)、50mMKCl、25mM(NH4)2S04、ImMEDTA、5mM2-巯基乙醇、0.25%Thesit、1.1|ig/ji1TagStart抗体、Clontech专有量的KlenTaq-lDNA聚合酶、和Clontech专有量的DeepVentDNA聚合酶组成)、每种引物(100pmo1/p1)各0.5|i1和1|i1模板DNA(卜50pg/ji1)。按如下在AppliedBiosystems9700热循环仪中进行循环94X:预处理4分钟，然后25个循环，每个循环为94X:10秒、55°C30秒和68'C90秒。然后使用PCR产物，才艮据具有以下改变的以前描述过的方案(Datsenko和Wanner,2000),转化带有质粒pKD46的菌林s4370-109-l:将带有质粒pKD46的菌林s4370-109-l在定轨摇床上30匸生长的50mlLB(Difco)培养物，于250ml带挡板的摇瓶中培养至OD,为0.4。然后加入0.5ml20%(w/v)阿拉伯糖，使培养物再生长2.0小时，此时根据Datsenko和Wanner(2000)的方案制备电感受态细胞。通过将1.0-3.0ng沉淀的PCR产物悬浮在45p1电感受态细胞中并将该混合物转移至0.lcm电穿孔杯中，实施电穿孔。然后在Bio-RadGenePulserII中以1.8kV、25yF和200Q对电穿孔杯进行脉沖。之后细胞在lml2YT(Difco)中37C培养4小时，将整个lml铺在具有50jug/ml卡那霉素的LB琼脂(Difco)上，37"C孵育1-2天。按照Datsenko和Wanner(2000)所述，消除所得卡那霉素抗性菌抹中的质粒pKD46，产生菌株s4538-006-l。实施例4以下实施例i兌明通过将tac启动子放置于glcB和aceBAK操纵子上游并驱动glcB和aceBAK操纵子表达以提供组成型高表达水平的乙醛酸支路酶。乙酪酸支路基因的表达水平通过测量苹果酸合酶和异柠檬酸裂解酶的酶比活性水平来评价。用于酶试验的培养物在补充了0.1%(w/v)水解酪蛋白氨基酸(Difco)和0.4%(w/v)葡萄糖或0.4%(w/v)甘油与0.4%乙酸钠(w/v)的组合的50mlDavis基本培养基(Difco)中于250ml带挡板的摇瓶中在NewBrunswickG53摇床上240rpm、37C培养。才艮据Ornston和Ornston(1969)的方法，通过J艮踪游离辅酶A自乙酰辅酶A的乙醛酸依赖性释放，测量苹果酸合酶的水平。根据Maloy等(1980)的方法，通过跟踪乙醛酸的异柠檬酸依赖性生产，测量异柠檬酸裂解酶的水平。表2显示相对于野生型，将tac启动子引入aceB基因之前可以增加苹果酸合酶和异柠檬酸裂解酶两者的酶水平而无论是使用葡萄糖还是使用甘油加乙酸盐进行培养。表2还显示将tac启动子引入glcB基因之前极大地增加苹果酸合酶的水平，但是异柠檬酸裂解酶水平不变。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表2.7种过表达菌林以及亲本菌林(s4370-69-"的苹果酸合酶和异柠檬酸裂解酶比活性。每种菌林/培养基组合最少分析6次并显示平均值。这些菌林在具有0.1。/。水解酪蛋白氨基酸(Difco)的Davis基本培养基(Difco)中生长。碳源为0.4%葡萄糖或者0.4%甘油+0.乙酸钠。实施例5以下实施例说明过表达乙醛酸支路酶在增加苏氨酸生产菌株中的苏氨酸产率及效价中的用途。使用培养基BTC3(1.0g/lK2HP04，10.0g/1(NH4)2S04，40.8g/1Bis-Tris，20ml/1的50%固体玉米浆(Sigma),25.Og/l葡萄糖，和1.2g/1MgS04-7H20pH7.0)，在摇瓶中检测这些过表达菌林的性能。使用活跃生长的LB(Difco)培养物接种培养基BTY2(1.0g/1K2HP04，10.0g/1(NH4)2S04，40.8g/1Bis-Tris，15g/1酵母提取物(Difco)，32.5g/1葡萄糖和1.2g/1MgS04-7H20pH7.0)(0.1ml于20mlBTY2中)。18小时后，将0.25mlBTY2传代至20mlBTC3中。再24小时后，收获BTC3培养物，并测定苏氨酸和葡萄糖的浓度。所有培养物在250ml带挡板的摇瓶中于NewBrunswickG53摇床上240rpm、37。C生长。结果显示在表3、4和5中。表3、4和5.摇瓶中突变菌林的苏氨酸生产。培养物在培养基BTC3中生长并且测定苏氨酸和葡萄糖的浓度。所示代表性实验为每个菌抹6个摇瓶的平均值。当不同表显示相同菌林时，结果以周隔开。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表4<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>实施例6实施例6包括通过引入包括与大肠杆菌的天然glcB启动子可操作地连接的lac启动子的质粒，制备过表达苹果酸合酶G的菌林。实施例6是一个预示性实施例。实施例6中的实验和程序尚未实施，并仅旨在进行举例说明。构建含有来自大肠杆菌菌林s4370-69-2的glcB基因的基于pUC的质粒，其中所述基因与该基于pUC的质粒的lac启动子可操作地连接。该质粒的构建可以通过本领域已知的方法基于本公开进行。通过电穿孔将lac::glcB质粒引入s4370-69-2亲本菌林，产生通过lac启动子的运作过表达glcB的菌株。该质粒的包含可以通过限制性作图和Southern印迹分析来展示。在适宜培养基中培养本实施例中产生的菌抹以显示glcB的表达水平。此培养基可以是，但不限于，补充水解酪蛋白氨基酸及葡萄糖或者甘油和乙酸钠的组合的Davis基本培养基。与亲本菌林的相似实验相比，苹果酸合酶G的水平增加，这可以通过与亲本菌林中的比活性相比高最低2倍至最高75倍的比活性来说明。苹果酸合酶G水平的增加导致修饰菌林中L-苏氨酸的生产与亲本菌林中L-苏氨酸的生产相比增加，这可以通过如上所述在诸如BTC3等培养基中培养该修饰菌林来证明。含有质粒的该修饰菌林的培养物的L-苏氨酸产率比亲本菌林增加多达10%。本文中引用或提及的专利、专利申请、出版物、科学文献、书籍、网址及其它文献和资料指示本发明所属领域的技术人员的水平。这些引用的文献和资料均特此并入作为参考，就如同将这些文献和资料各自单独地以参考方式完整地并入或者完整地陈列或重印在此处。此外，要求)特此完整地并入本发明的说明书中并构成本发明说明书的一部分。申请人保留将来自任何此类专利、申请、出版物、科学文献、网有资料和信息物理地并入本说明书中的权利。申请人保留物理地并入到本文件任何部分，包括说明书的任何部分和以上提及的权利要求(包括但不限于任何原始权利要求)中的权利。本发明已经在本文中进行了宽而一般性的描述。落入此上位公开中的任何较窄类型和下位的组也构成这些发明的部分。这包括每个发明的一般描述，该描述(包括其任何权利要求)特此包括自该类中除去或任选地允许除去任何主题的前提条件或否定限制，无论所排除的所有此类变异方案均形成本发明原始说明书的一部分。此外，当以马库什组描述发明的特征或方面时，该发明应由此理解为就该马库什组的每一个和所有及任何单个成员或成员亚组进行了描述。在缺少本文中未具体公开的或者本文中未描述为必要的任何一个或多个元素、一个或多个限制因素的情况下实施。因此，例如，术语"包含，，、"包括，，、"含有，，、"例如"等应以开放式的非限制方式来理解。本发明人在要求保护其发明时，保留将任何过渡性短语替换为任何其它的过渡性短语的权利，并且本发明应理解为包括这些替换后的过渡方案并构成本发明原始说明书的部分。因此，例如，术语"包含，，可以用过渡性短语"基本上由……组成"或"由……组成，，之任一替换。正如本文及所附权利要求中使用的，除非上下文有清楚的相反说明，否则单数形式"a"、"an"和"the"包括对复数的提及。例或实施方案或方法。在任何情况下都不得将本专利解释为限于专利商标局的任何审查员或任何其它官员或雇员所作出的任何言论，除非请人特别地且无附加条件或无保留地明确采纳了该言论。本文中使用的术语和措词作为描述性而非限制性术语进行使用，在这些术语和措词或其任何部分的使用中无意排除目前已知的或者以后出现的任何等同物，不论该等同物是否在本文中进行过陈述或显示或描述，也不论该等同物是否被认为可预期的，而是应认可，各种修饰均在所要求保护的发明的范围内，不论这些权利要求在授权时是否因任何原因进行过或未进行过改变或修改。因此，应理解，尽管本发明已经通过优选实施方案和可选特性进行了具体公开，但是其中包含本文描述的具体方法和组合物是优选实施方案的代表，是示例性的，不旨在限制本发明的范围。其它的目的、方面和实施方案将是本领域技术人员在阅读本说明书后所明了的，包括在由权利要求的范围所定义的发明的精神内。在给出实施例的地方，说明书应解释为包括但不仅仅限于这些实施例。本领域技术人员将易于明了可以对此处公开的本发明进行各种替代和修饰而不偏离本发明的范围和精神，而且从本发明的描述(包括本文中以举例说明性方式给出的描述)，显然可以使用各种修饰方案和等价方案来实现本发明的构思而不偏离其范围。本领域技术人员将意识到可以在形式和细节上进行改变而不偏离本发明的精神和范围。所描述的实施方案应在所有方面均被视为举例说明性的而非限制性的。因此，例如，其它的实施方案也落入本发明的范围以及以下权利要求中。权利要求1.通过发酵生产L-氨基酸产品的方法，包括(a)在发酵培养基中培养细菌，其中所述细菌产生所述L-氨基酸并且含有重组核酸构建体，该构建体具有使得至少一种选自由aceBAK操纵子中的基因和glcB基因组成的组的基因在所述细菌中过表达的可操作配置；(b)在发酵培养基和细菌中的至少一种中富集所述L-氨基酸；和(c)从发酵培养基和细菌中的至少一种中分离所述L-氨基酸。2.权利要求1的方法，其中所述细菌是大肠杆菌(EscherichiacolU菌抹。3.权利要求1的方法，其中所述重组核酸包含可操作地连接在所述至少一种基因上游的启动子序列，该启动子序列对于所述aceBAK操纵子或glcB基因是非天然的。4.权利要求3的方法，其中所述启动子选自tac启动子、trc启动子、lac启动子、trp启动子、入-Pt启动子、入-PR启动子、lacUV5启动子、araBAD启动子、lpp启动子和lpp-lac启动子。5.权利要求3的方法，其中所述至少一种基因选自aceB、aceA和glcB.6.权利要求3的方法，其中所述非天然启动子替代所述aceBAK操纵子和glcB基因中的至少一个的天然启动子，并且其中所述天然启动子被缺失或间断。7.权利要求3的方法，其中插入所述非天然启动子而不造成所述aceBAK操纵子和glcB基因中的至少一个的天然启动子的缺失。8.权利要求l的方法，其中仅所述至少一种基因在所述细菌中过表达。9.权利要求1的方法，其中所述L-氨基酸选自L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-高丝氨酸、L-赖氨酸和L-甲硫氨酸。10.包含重组核酸的细菌，其中所述重组核酸具有使至少一种选自由aceBAK操纵子中的基因和glcB基因组成的组的基因在所述细菌中过表达的可操作配置。11.权利要求io的细菌，其中所述细菌是大肠杆菌菌林。12.权利要求io的细菌，其中所述重组核酸包含可操作地连接在所述至少一种基因上游的启动子序列，该启动子序列对于所述aceBAK操纵子或glcB基因是非天然的。13.权利要求12的细菌，其中所述非天然启动子选自Uc启动子、trc启动子、lac启动子、trp启动子、入-Pt启动子、入-Pa启动子、lacUV5启动子、araBAD启动子、lpp启动子和lpp-lac启动子。14.权利要求12的细菌，其中所述aceBAK操纵子的天然启动子被该非天然启动子替代。15.权利要求12的细菌，其中在所述aceBAK操纵子中插入所述非天然启动子而不置换或间断所述aceBAK操纵子的天然启动子。16.权利要求13的细菌，其中所述glcB基因的天然启动子被所述非天然启动子替代。17.权利要求13的细菌，其中所述非天然启动子与所述glcB基因可操作地连接而不替代与所述glcB基因可操作地连接的天然启动子。18.选自具有如下保藏号的菌林及其衍生物的细菌菌林NRRLB-30843、NRRLB-30844、NRRLB-30845、NRRLB-30846、NRRLB-30847、NRRLB-30848、NRRLB-30849、NRRLB-30850和證LB-30851。19.包含非天然启动子的重组核酸，其中该重组核酸具有使编码大肠杆菌aceA蛋白、aceB蛋白和glcB蛋白中的至少一种蛋白的基因在细菌中过表达的可操作配置，并且其中所述基因包括以下中的至少一个a)编码选自SEQIDNO:3、SEQIDNO:5和SEQIDNO:8的蛋白质的DM;b)才艮据SEQIDNO:9、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24和SEQIDNO:25中的至少一个的核酸；c)仅就遗传密码而言与根据b)的核酸简并的核酸;d)含有根据a)或b)的核酸的沉默突变的核酸；e)与b)的核酸至少80。/。一致的核酸；或f)在严紧条件下与根据b)的DNA杂交的核酸。20.包含权利要求19的至少一种核酸的载体。全文摘要本发明提供在生产天冬氨酸衍生的氨基酸及化学品方面具有改良性质的微生物株。本发明还提供制备此类株系的方法。这些方法包括改变aceBAK操纵子、glcB基因或者两者的表达。表达的改变可以通过增加转录、解除天然的转录控制和/或其它方式来实现。也可以考虑置换这些基因的天然启动子；例如，可以用tac启动子(Ptac)置换它们的天然启动子。文档编号C12P13/00GK101365797SQ200680030255公开日2009年2月11日申请日期2006年6月20日优先权日2005年6月20日发明者J·N·德里亚,S·W·乔丹申请人:阿彻-丹尼尔斯-米德兰公司