专利名称：对聚合物分子进行测序的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物聚合物分子的测序方法。该方法尤其适用于多核苷酸测序。
背景技术：
用于表征分子或其生物学反应的技术改进在一定程度上推动了分子研究的进展。特别是，对核酸DNA和RNA的研究就受益于序列分析和杂交反应研究方面的技术发展。
通常用于大规模DNA测序的主要方法是链终止法。该方法最初由Sanger和Coulson(Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1977；745463-5467)所开发，该方法有赖于四种核苷酸的双脱氧衍生物的使用，所述双脱氧衍生物在聚合酶反应中被掺入到新生多核苷酸链中。一旦掺入，双脱氧衍生物就会终止聚合酶反应，然后，产物通过凝胶电泳分离，并对其进行分析以揭示具体双脱氧衍生物掺入链中的位置。
尽管所述方法被广泛使用并且可获得可靠的结果，但是人们也认识到该方法速度慢、劳动强度大且费用昂贵。
US-A-5302509公开了一种对固定在固体支持物上的多核苷酸进行测序的方法。所述方法有赖于在DNA聚合酶的存在下，将具有不同荧光标记的3’-封闭碱基A、G、C和T掺入至所固定的多核苷酸。聚合酶可掺入与靶多核苷酸互补的碱基，但是却被3’-封闭基团阻止进一步加入。然后测定所掺入碱基的标记，并通过化学断裂除去封闭基团，使得发生进一步聚合。但是，这种需要去除封闭基团的过程耗费时间，并且必须高效进行。
WO-A-00/39333描述了一种通过将靶多核苷酸序列转换成第二种多核苷酸来对多核苷酸进行测序的方法，所述第二种多核苷酸其中含有确定的序列和位置信息。靶标的序列信息在第二种多核苷酸中被所谓“放大”，从而使得可更容易地区分靶分子中的单个碱基。这可通过使用具有预定核酸序列的“放大标签”来实现。靶分子上的每种碱基即腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶用各自的放大标签表示，由此将原始靶序列转换为放大的序列。接下来再利用常规技术测定放大标签的序列，并由此确定靶多核苷酸的具体序列。
虽然所述方法有用，但是长聚合物的测序还是存在问题，并且需要对大量聚合物片段测序，然后还需要进行很多序列重建。人们一直希望，特别是在对聚合物进行从头测序时，提高可读长度和简化所需的重建。
发明内容
本发明基于这样一种发现靶聚合物可以通过把位置和序列信息编码进靶聚合物连续降解产生的片段而进行测序。所述片段可被用于靶聚合物的序列重建。
根据本发明的第一方面，对靶聚合物分子进行测序的方法包括如下步骤(i)用一种可对靶聚合物的至少一端进行连续降解的试剂处理靶聚合物；(ii)将不同降解聚合物的降解端的至少一部分转换为可读信号序列，并且用表示相对降解顺序的标签来标记每种所述的降解聚合物；(iii)测定可读信号序列的序列；并且(iv)利用步骤(iii)中得到的序列数据和对每个有关标签的鉴定来确定靶聚合物的序列。
具体实施例方式
本发明用于测定靶聚合物分子的序列。该方法特别适用于从头测序。
本发明方法有以下几个基本步骤首先，连续降解靶聚合物。然后用两种标记来标记每个片段。第一种标记被称为“可读信号序列”，它包含片段的序列信息，第二种标记指的是“位置标签”，此标记的加入用于显示片段由于降解反应而被移出时的位置。所有的片段都被“可读信号序列”和“位置标签”标记上之后，检测这些标记，可得到每个片段的序列信息及其在靶多核苷酸上的位置。然后，通过比对每个被测序片段的种类和顺序，可将所述信息用于确定靶聚合物序列。
优选地，降解反应之后，将样品移出并且放入各自独立的隔室中用于分析。因此每个样品含有靶聚合物的不同长度的片段，也因此在降解端具有不同于其它片段的序列。
该方法可提供靶聚合物的序列信息。本文所使用的术语“聚合物”指的是任何含有连接的单体单元的分子。优选地，所述聚合物是生物聚合物，特别是多核苷酸或者多肽。术语“多核苷酸”为本技术领域所熟知，用于指一系列连接的核酸碱基，例如DNA或RNA。包括PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)和2-O-methRNA在内的核酸模拟物也在本发明范围内。靶多核苷酸可以是单链也可以是双链。
本文所使用的术语“碱基”指的是每个核酸单体，A、T(U)、G或者C。这些缩写表示核苷酸碱基腺嘌呤、胸腺嘧啶(尿嘧啶)、鸟嘌呤和胞嘧啶。当多核苷酸为RNA时以尿嘧啶替代胸腺嘧啶，或者用dUTP将尿嘧啶引入DNA中，这也是本技术领域所熟知的。
术语“多肽”也为本技术领域熟知，用于指一系列连接的氨基酸分子。该术语意在包括短肽序列和长蛋白质序列。
本发明的方法包括对靶聚合物的连续降解以产生不同长度的片段。降解可以发生在靶聚合物的一端，也可以在两端进行。连续降解靶聚合物的方法是本技术领域所熟知的，例如酶法消化。本领域技术人员应理解的是，核酸酶适用于降解多核苷酸而蛋白酶和肽酶适用于降解多肽。在优选的实施方案中，在适于酶活性的条件下，使用外切核酸酶或者外切蛋白酶(exoprotease)；所述酶分别从多核苷酸和多肽上连续移去末端单体单元。适合酶活性的条件对于本领域技术人员来说是显而易见的。
在连续的降解反应过程中，降解靶聚合物样品优选的以特定的时间间隔从反应混合物中移出，并被放入各自独立的隔室中。因此每个独立的隔室中就含有不同长度的片段；从降解反应中较早移出的片段将长于从降解反应中较晚移出的片段。也可在降解反应开始之前就将样品移出，因此这样的第一个样品含有全长的靶聚合物。在降解反应的过程中可任意次地移出样品，优选以预定的时间间隔移出，这样设计可用来优化产生的片段数目。本文所使用的术语“样品片段”指的是降解过程中移出的片段。
从反应混合物中移出样品后，必需终止降解反应。适用于终止酶反应的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。已知改变温度和pH值以及加入抑制剂都可以使酶失活。优选地，用于终止降解的技术不会破坏样品片段或者对样品片段有不良影响。如果用外切核酸酶将样品片段化，可用本领域已知的技术使外切核酸酶失活。例如，先加入含有Tris碱和EDTA的缓冲液，再加热到70℃，从而使外切核酸酶III失活。Erase-a-Base技术(Promega公司)中使用了该技术，其中将1μl S1核酸酶终止缓冲液(0.3M Tris碱，0.05M EDTA)加入到2.5μl反应体积中，然后在70℃加热10分钟(参见Promega Erase-a-Base系统技术手册#006，可从www.promega.com和Henikoff，Nucleic Acids Res.1990 May 25；18(10)2961-2966获得)。
另一个用于终止降解反应的技术是从样品中移去降解酶。适用于从混合物中特定地移出一种酶的技术为本领域所熟知，例如使用亲和层析，其中将该酶的结合配偶体固定化，而酶则在接触固定化的亲和配偶体时从样品中被移去。或者在降解反应之前，可将每个靶聚合物固定在固相支持物上；优选地，靶聚合物被固定在珠子上，所述珠子使得整分试样可在进行降解反应时被移去。降解反应过程中被移出的每个珠子样品都含有固定其上的样品片段。之后，可以通过洗涤这些有样品的珠子而去除酶，这应为一个本领域技术人员所理解。在该实施方案中，需要确保连接有聚合物的珠子在降解反应过程中保持为均一混合物以确保降解一致。可以通过简单的摇动或搅拌珠子来实现这一点。
将生物聚合物固定在例如珠子等支持物上的方法为本领域所熟知，例如通过利用生物素-抗生物素蛋白的相互作用、光刻法技术和有赖于将各个聚合物“放置”在支持物的确定位置上的技术可以将多核苷酸固定。
固定化可以通过特定的共价或者非共价相互作用来实现。所述相互作用应足以保持在移去不想要的反应组分的洗涤步骤中聚合物都结合在支持物上。固定化优选地仅发生在一端，例如多核苷酸的5’端或者3’端，以便聚合物仅有一端与支持物连接。但是，聚合物可在其全长的任何位置上与支持物连接，这种连接所起的作用就是将多核苷酸限制在支持物上。
本领域技术人员应知晓将聚合物固定在支持物质上的合适方法。本领域技术人员应理解，可对支持物进行适当的包被以利于固定化。用于连接多核苷酸的适当的包被方法包括环氧包被(例如3-缩水甘油基丙氧基三甲氧基硅烷(3-glycidyloxypropyltrimethoxysilane))，超级醛(superaldehyde)包被，巯基硅烷和异硫氰酸盐。或者使用一些交联基团，包括PAMAM树状结构(Benters et al.，Chem Biochem.，2001；2686-694)和Zhao等人描述的固定化交联剂(Zhao et al.，Nucleic AcidsResearch，2001；29(4)955-959)。
在另一个实施方案中，降解反应不会被立即终止。而是在样品片段从降解反应中被移出后将可读信号序列立即与其连接。
至少每个样品片段的一部分被转换成可读信号序列。在单个碱基和完整样品片段之间的任何部分都可以被转换。优选地，每个样品片段的至少三个单体单元被转换，更优选地，在3到100个单体之间，例如20个单体单元。如果靶聚合物仅从一端降解，至少每个样品片段的相应末端被转换为可读信号序列。例如，如果从靶多核苷酸的3’末端开始降解，样品片段中的至少三个3’碱基被转换成为可读信号序列。如果靶序列两端都被降解，则每个片段的任何一端或者两端就可被转换。在优选的实施方案中，每个样品片段的完整的序列被转换成为可读信号序列。更优选的是所有样品片段的可读信号序列的组合代表了靶多核苷酸的完整序列。
本文中所使用的术语“可读信号序列”指的是包含标记或连接标记的方式的序列，所述标记可使在随后的读出步骤中至少一部分序列被鉴定。任何标记都可以使用；使用标记对生物聚合物进行测序的方法为本技术领域所熟知。例如，多肽可以通过加入一种试剂来转换成为可读信号序列，所述试剂可与N末端氨基酸残基相互作用并可使末端残基在随后的读出步骤中被鉴定。常用的试剂包括丹磺酰氯和异硫氰酸苯酯(PITC)。PITC被用于多肽测序的“Edman降解法”中，该方法为本技术领域中所熟知。多核苷酸可以通过任何适当的技术被转换成可读信号序列。可以使用多核苷酸测序的链终止(“Sanger”)法，其中样品片段可被转换含有双脱氧核苷三磷酸的可读信号序列。
本领域技术人员应理解，为了获得样品片段中一系列单体单元的序列需要进行多次测序循环。这也是在本发明范围之内的。
在优选的实施方案中，可读信号序列是多核苷酸，所述多核苷酸含有至少两个代表样品片段中单个单体单元的碱基。样品片段的序列信息在可读信号序列中被所谓“放大”，使得可以更容易地区分靶分子上的各碱基。这些先前被描述为“被放大的(或者放大的)标签”序列的优选可读信号序列，在本申请中被称为“被放大的可读信号序列”。WO-A-00/39333和WO04/94663中给出了这些序列的实例，这些文献均通过引用方式纳入本说明书。正如在现有技术中已知的，任何生物聚合物都可被转换成为被放大的可读信号序列。WO-A-00/39333描述了多核苷酸向被放大的可读信号序列的转换。WO04/94663中描述了蛋白质和肽向多核苷酸的放大的可读信号序列的转换，该文献通过引用方式纳入本说明书。
每个放大的可读信号序列优选包含两个或者更多的核苷酸碱基，优选包含2至50个核苷酸碱基，更优选2至20个碱基，最优选4至10个碱基，例如6个碱基。在优选的实施方案中，每个被放大的可读信号序列中有三个不同的碱基。例如，一个碱基与读出步骤中引入的被标记的核苷酸互补，一个碱基作为“间隔物”在掺入的标记之间提供间隔，还有一个碱基作为一个终止信号。
正如在共同未决申请PCT/GB04/01665中公开的，被放大的可读信号序列中可包括二元代码。在所述“二元”实施方案中，每个被放大的可读信号序列包括两个不同序列的单元，所述单元代表了样品片段上的所有四个碱基。这两个单元作为一个二元系统，其中一个单元表示“0”另外一个表示“1”。样品片段上的每个碱基可用被放大的可读信号序列中的这两个单元的组合来表征。例如，腺嘌呤可用“0”+“0”表示，胞嘧啶可用“0”+“1”表示，鸟嘌呤可用“1”+“0”表示，胸腺嘧啶可用“1”+“1”表示。需对这些单元之间进行区分，所以可在每个单元中掺入“终止”信号。根据样品片段上的碱基是在奇数位置还是偶数位置，还可以优选使用不同单元表示“1”和“0”。
下面给出示例奇数模版序列“0”TTTTTTA(CCC)“1”TTTTTTG(CCC)偶数模板序列“0”CCCCCCA(TTT)“1”CCCCCCG(TTT)在这个实例中，划线的碱基是在聚合酶反应中标记核苷酸的靶标，括号中的碱基用作终止信号，而剩余的碱基提供标记间的间隔。
优选地，将样品片段中的多个单体单元转换成为放大的可读信号序列。每个被放大的可读信号序列保持连续地与靶聚合物相连，由此形成含有一系列被放大的可读信号序列单元的单个多核苷酸分子，所述单个多核苷酸分子编码靶聚合物序列。
在读出步骤中能够区分不同的被放大的可读信号序列，例如包括在聚合反应中，或互补寡核苷酸杂交时，或在常规测序反应中掺入具有可检测标记的核苷酸。以上实例中，可采用掺入具有可检测标记的核苷酸。聚合酶反应过程中引入的核苷酸混合物在奇数位置(1、3、5等)由FluorX-dUTP，Fluor Y-dCTP和dATP(混合物中不含dGTP)组成。对于“0”，不存在Fluor Y的互补碱基，对于1”，不存在Fluor X的互补碱基。因此在聚合酶反应过程中，如果存在单元“0”就可以通过监测Fluor X来检测，而若存在“1”，则可以通过监测Fluor Y来检测。
在所有的偶数位置(2，4，6等)核苷酸混合物包括相同的两种荧光标记的核苷酸，但使用dGTP而不是dATP，而且用一个或者多个T碱基定义终止信号。
在“识读”了每个被放大的可读信号序列以后，就可以引入缺失的互补核苷酸(例如dGTP或者dATP)使之在终止序列掺入，从而重新启动此过程。未掺入的核苷酸在下次读出步骤前被洗掉。
通过本领域中已知的方法，每个样品片段都可以被转换成为被放大的可读信号序列(或其系列)。可以采纳WO-A-00/39333中公开的转换方法，所述方法使用了限制酶。例如，如果样品片段是多核苷酸，可以将样品片段连接进载体，所述载体在插入位点附近带有一个IIS类限制性位点，或者将样品片段改造为使之含有这样的位点。然后用适当的IIS类限制酶切割该限制性位点，从而在样品片段上产生一个突出端。
然后可使用含有一个或者多个被放大的可读信号序列单元的适当的接头结合到突出端的一个或者多个碱基上。一旦接头的突出端和被切割的载体杂交上，这些分子就可被连接起来。这种连接只有在整个突出端完全互补才可以实现。之后，用平端连接将接头的另一端连接到载体上。通过适当地设置其他II类限制性位点(或者其他合适的限制性酶位点)——所述位点可以与前面使用的酶相同或者不同——可实现切割，从而使得可在第一个接头指向的序列下游的靶序列上形成一个突出端。利用这个方法，邻近的或者重叠的序列可以被连续转换成带有确定序列单元的序列。
在可读信号序列转换之后而在读出步骤之前，每个独立的隔室中的样品片段任选可被固定在固相支持物上以例如形成阵列。正如前文所述，将生物聚合物固定在支持物上的方法为本领域所熟知。可以通过将多核苷酸随机分配在微珠、纳米颗粒和平坦表面上来进行固定化。适宜的支持物是本领域已知的，包括玻璃片、陶瓷和硅表面以及塑料物质。支持物通常是一个平的(平面的)表面。
样品片段可以被固定在支持物上形成阵列，而该阵列可以在固相支持物上排列成随机或者有序的模式。优选地，所用阵列是样品片段包含在不同的光学可辨区的单分子阵列，例如WO-A-00/06770中公开的多核苷酸阵列，其内容通过引用的方式纳入本说明书。
优选地，每个样品片段含有可读信号序列，所述可读信号序列可以互补于至少一个其他的样品片段的可读信号序列。更优选地，这种互补是介于多个可读信号序列间的，其中所述可读信号序列表示样品片段上多个单体单元，例如在2至20个碱基之间的互补，如多核苷酸中的3、4或者5个碱基的互补。这就确保了分散的样品片段中的可读信号序列信息间有所重叠，使得靶序列可以基于这些冗余的重复区而被重建，这一点应为本领域技术人员所理解。不同样品片段上可读信号序列间的互补性越强，序列重建就越简单。
除了每个样品片段中的至少一部分用可读信号序列标记之外，每个片段还用表示片段从降解反应中被移出时间的“位置标签”来标记。在优选的实施方案中，每个样品片段用不同的位置标签进行标记，从而确定它从降解反应中被移出的时间。任何适于标记生物聚合物的标签都可以使用。在优选的实施方案中，位置标签是荧光团。适宜的荧光团为本技术领域所熟知，例如Alexa染料(Molecular Probes)BODIPY染料(Molecular Probes)花青染料(Amersham Biosciences Ltd.)四甲基罗丹明(Perkin Elmer，Molecular Probes，Roche Diagnostics)香豆素(Perkin Elmer)得克萨斯红(Molecular Probes)荧光素(Perkin Elmer，Molecular Probes，Roche Diagnostics)对于本领域中技术人员而言，很显然在读出步骤中可以使用任意荧光检测技术来检测荧光团。荧光团检测技术的实例概括如下。
在另一个优选实施方案中，位置标签是具有预先确定序列的“放大标签”。为避免疑义，如上文和WO-A-00/39333中所描述的，一个放大标签含有两个或者更多的碱基。优选地，位置标签为包含预定系列的放大标签的多核苷酸。当将放大标签用作位置标签时，它并不表示样品片段的序列；它是一个在读出步骤中可被识别的预定序列。通过使用多核苷酸形式的可读信号序列和位置标签，其中所述多核苷酸含有具有两个或多个碱基的不同单元——即“放大标签”，从而使读出步骤得到了简化，因为可读信号序列和位置标签都可以用相同的技术读出。任何能将放大标签连接在样品片段上的方法都可以使用。优选地，使用WO-A-00/39333(和本说明中所总结的内容)中公开的基于限制酶/连接的技术。
位置标签可以直接连接在样品片段上，或者连接在可读信号序列上。在优选的实施方案中，当可读信号序列和位置标签都是包含具有两个或更多碱基的不同单元的放大标签时，位置标签和可读信号序列是连续的，形成含有两种标记的多核苷酸单链。或者，位置标签和可读信号序列连接到样品片段的相反的两端。
每个样品片段的至少一部分被编码样品片段序列的可读信号序列和表明在降解反应中的位置的位置标签标记后，就可在读出步骤中检测出每个片段所含有的数据，从而确定每个片段的序列及其在靶分子中的位置。然后，可将这些被测序的片段重新排列从而给出靶聚合物的序列。当标签和可读信号序列都是被放大的标签序列的时候，可采用任何适宜的技术进行读出步骤，例如采用WO-A-00/39333和PCT/GB04/01665所描述的和在本说明中所总结的技术。如上所述，优选的检测技术利用了选定的、具有可检测标记的核苷酸或者利用掺入了可用于后续间接标记的基团的核苷酸，采用聚合酶反应以掺入与可读信号序列的碱基互补的碱基，并监测任何掺入情况。
为了进行基于聚合酶反应的读出步骤，通常需先将引物序列与被放大的可读信号序列多核苷酸退火，引物序列可被聚合酶识别并作为互补链继续延伸的起始位点。引物序列可以作为相对于所述多核苷酸的独立组分加入，所述多核苷酸含有可以使引物退火的互补序列。聚合酶反应优选地在允许互补核苷酸一次一个单元地受控掺入的条件下进行。这使得可通过检测掺入的标记对每个被放大的信号序列单元进行归类。如上所述，因为每个单元优选地含有一个“终止”序列，所以可以通过仅提供那些掺入到第一单元所需的核苷酸来控制掺入。因为每个单元都可通过特异的标记被识别，所以可以在每个循环中将两个不同的单元(0和1)区分开。这使得可以检测出任何掺入的标记，并且能够鉴定出待测单元并确定其位置。
当可读信号序列和位置标签都是被放大的标签序列时，读出方法可按照以下方式进行(i)在可以发生聚合反应的条件下，使含有确定单元的可读信号序列与核苷酸dATP、dTTP、dGTP和dCTP中的至少一种相接触，其中所述的至少一种核苷酸包含特异性针对该核苷酸的可检测标记；(ii)移出所有未掺入的核苷酸并检测所有掺入情况；(iii)从所有掺入的核苷酸上移去标记；并且(iv)重复步骤ii)到iv)，由此鉴定出不同的单元，并由此确定靶多核苷酸的序列。
每个循环的步骤(i)中所要求的不同核苷酸的数量根据对放大信号序列单元的设计而定。如果每个单元仅含有一种碱基类型，则只需要一种核苷酸(具有可检测标记)。但是，如果使用了两种碱基(一种作为具有可检测标记的核苷酸的靶标，另一种提供不同靶碱基间的间隙)就需要两种核苷酸(一种结合到靶碱基上，另一种将碱基“填入”靶碱基间)。
用一个碱基作为终止信号的方法使得检测步骤可以在聚合酶反应不需要用封闭核苷酸阻止不受控制的掺入的条件下进行。当聚合酶混合物中没有“终止”碱基的互补碱基时，终止信号是有效的。因此，可在对每个单元表征后进行“填入”步骤，在该步骤中使用之前缺失的核苷酸，从而使得可与终止碱基互补，这就为下一个单元的表征提供了可能。这一步是在检测步骤之后进行的。一个单元的“终止”碱基和下一个单元的第一个碱基不应是同一种类型。这可以确保“填入”步骤不会进行到下一个单元。然后“填入”过程中所用的未掺入的核苷酸可被移出，随后就可以表征下一个单元。
对聚合酶和可检测标记的选择对于技术人员而言是显而易见的。以下内容仅用作指导a)Klenow和Klenow(exo-)可以有效地掺入四甲基罗丹明-4-dUTP和罗丹明-110-dCTP(Amersham Pharmacia Biotech)(Brakmannand Nieckchen，2001，Brakmann and Lbermann，2000)。
b)Vent、Taq和Tgo DNA聚合酶可以有效地掺入地高辛(dioxigenin)和荧光团，如AMCA、四甲基罗丹明、荧光素和Cy5而没有至少最高达几个的位置的间隔(Augustin et al.，(提供参考？)2001)。
c)T4 DNA聚合酶可有效填入荧光团标记的核苷酸。
优选的聚合酶是Klenow大片段(exo-)和T4 DNA聚合酶。
进行聚合酶反应所必需的其它条件，包括温度、pH、缓冲液组成等等，对于本领域技术人员而言是显而易见的。聚合反应步骤可能进行一段时间，这段时间足以使碱基掺入至第一单元。然后移去非掺入核苷酸，例如通过洗涤阵列，然后进行对掺入标记的检测。
另一种读出方式是使短的具有可检测标记的寡核苷酸与被放大的可读信号序列和/或位置标签上的单元进行杂交，并检测任何杂交结果。短的寡核苷酸具有与可读信号序列中特定单元互补的序列。例如，如果使用二元系统，而且样品片段中的每个单体通过被放大的可读信号序列单元(一个表示“0”另一个表示“1”)的不同组合来定义，则本发明将需要一个特异性针对单元“1”的寡核苷酸。在所述实施方案中，寡核苷酸的选择性杂交可以通过将每个单元设计成相对于其他单元的不同寡核苷酸序列来实现。这确保了杂交反应仅在有特定单元存在时发生，而对杂交结果的检测可鉴定出样品片段的特征。
在优选的实施方案中，标记为荧光部分。如上所述，可以使用的荧光团的许多实例是现有技术是已知的。可以使用常规的方法将适宜的荧光团连接到核苷酸上。具有适当标记的核苷酸也可以通过商业途径获得。标记通过可以在检测步骤后被去除的方式被连接。这可以通过常规方法完成，包括I.攻击信号本身d)漂白i)光漂白ii)化学漂白a)荧光淬灭i)通过针对荧光而产生的抗体(例如抗荧光素抗体，抗Oregon绿抗体)ii)通过FRET(在信号附近掺入可被用于淬灭信号的淬灭剂，例如Taqman方法)b)信号切割i)化学切割(例如还原碱基和信号间的二硫键)ii)光切割(例如引入硝基苄基或者叔丁基酮基)
iii)酶法(例如α-胰凝乳蛋白酶消化肽连头)II.携带信号的核苷酸b)核酸外切去除i)3’-5’核酸外切降解填入的核苷酸(例如外切核酸酶III或者在缺少某一特定核苷酸时激活DNA聚合酶的3’-5’核酸外切活性)c)限制酶消化ii)消化携带信号的双链DNA(例如可以被掺入到终止信号的ApaI、Dral、SmaI位点)另一种使用可以去除的标记的方法是利用在生物化学过程中可被再激活的失活标记。
优选的方法是通过光切割或者化学切割的方法。
当标记为荧光团时，掺入产生的荧光信号可以用光学方法测量，例如通过共聚焦显微镜。或者，灵敏的2-D检测器，例如电荷耦合检测器(CCD)，可用于显示产生的各个信号。
常规的光学检测装置如下显微镜落射荧光(Epi-fluorescene)物镜 油浸(100×，1.3NA)光源 激光或灯滤光片带通反射镜分色镜和二向色楔形镜(dichroic wedge)检测器光电倍增管(PMT)或者CCD相机也可使用不同的装置，包括A.全内反射荧光显微镜(TIRFM)光源 一种或者多种激光背景控制 无需针孔检测器CCD相机(视频和数字成像系统)B.共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)光源 一种或者多种激光背景降低 一种或者多种针孔孔径检测器a)单一针孔用于不同荧光波长的光电倍增管
(PMT)检测器[最终图像由计算机随时间逐点形成]。
b)数千针孔(旋转的尼普科夫圆盘(Nipkow disk))CCD相机检测图像[最终图像由相机直接记录]。
C.双光子(TPLSM)和多光子激光扫描显微镜光源一个或者多个激光背景控制无需针孔检测器 CCD相机(视频和数字成像系统)优选的方法是TIRFM和共聚焦显微镜。
应理解的是，虽然本说明书中提供了适用于被放大的可读信号序列的技术的具体实例，但是放大的可读信号序列和“放大的标签”的位置标签可以用任何适当的读出平台识读。
当可读信号序列不是放大的可读信号序列，例如它是PITC标记的多肽或者ddNTP标记的多核苷酸时，可以使用任何适当的读出步骤。如本领域所熟知的，色谱和电泳是常用的读出步骤。
对于本领域技术人员而言很显然，一旦知道了每个片段的序列，根据可以表明每个片段在靶分子中顺序的位置标签，即可重建靶聚合物分子的序列。每个可读信号序列的重叠区也有助于序列重建。这可利用常规的软件程序来完成。本文引用的每份出版物的内容均通过引用的方式纳入本说明书。
权利要求
1.一种对靶聚合物分子进行测序的方法，包括如下步骤(i)用一种可对靶聚合物的至少一端进行连续降解的试剂处理靶聚合物；(ii)将不同降解聚合物的降解端的至少一部分转换成可读信号序列，并将每种所述降解聚合物用表示相对降解顺序的标签进行标记；(iii)测定可读信号序列的序列；并且(iv)利用步骤iii)中获得的序列数据和对每个相关标签的识别确定靶聚合物的序列。
2.根据权利要求1的方法，其中降解聚合物样品在降解反应过程中的预定时间点被移出并置于独立隔室中用于分析。
3.根据权利要求1或者权利要求2的方法，其中每个可读信号序列含有一个与至少一个其它降解聚合物的可读信号序列互补的区域。
4.根据前述任一项权利要求的方法，其中所有降解聚合物的所述可读信号序列的组合表示所述靶聚合物的序列。
5.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述靶聚合物为多核苷酸。
6.根据权利要求5的方法，其中所述多核苷酸为DNA。
7.根据权利要求1至4任一项的方法，其中所述靶聚合物为多肽。
8.根据权利要求1至6任一项的方法，其中所述试剂为外切核酸酶。
9.根据权利要求7的方法，其中所述试剂为蛋白酶。
10.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述可读信号序列是或者包括放大标签。
11.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述标签是或者包括具有预定序列的放大标签。
12.根据权利要求1至10任一项的方法，其中所述标签是荧光团。
全文摘要
一种对靶聚合物分子进行测序的方法，包括如下步骤(i)用一种可对靶聚合物的至少一端进行连续降解的试剂处理靶聚合物；(ii)将不同降解聚合物的降解端的至少一部分转换成可读信号序列，并将每种所述降解聚合物用表示相对降解顺序的标签进行标记；(iii)测定可读信号序列的序列；并且(iv)利用步骤(iii)中获得的序列数据和对每个相关标签的鉴定来测定靶聚合物的序列。
文档编号C12Q1/68GK101076604SQ200580042466
公开日2007年11月21日 申请日期2005年10月12日 优先权日2004年10月13日
发明者P·莱克索 申请人:灵维泰公司