专利名称：一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测样品中细菌的试剂盒，特别涉及一种快速检测样 品中单增李斯特菌的试剂盒。
背景技术：
单核细胞增生李斯特氏菌(简称单增李斯特菌Z历朋OC/fOg朋M)是 一种人畜共患致病菌，可使人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症及造成怀孕妇女流
产、死胎等疾病，死亡率高达30 70%。该病广泛存在于土壤、人和动物的粪
便中，很容易污染食品而引起食物中毒和李斯特病大爆发。近年来己有不少国家
报道了由于污染单增李斯特菌发生的食物中毒事件。早在1929年，就有报道该 菌对人有致病性，最严重的一次是1985年在美国加里福尼亚地区，应食用乳酪 引起的单增李斯特菌食物中毒。目前该菌每年在美国已成为由食物污染引起死亡 的四大病原菌之一。此外由于该菌在4'C冰箱保存的食品中也可生长繁殖，故其 危害性进一步增大。因此世界各国政府部门对其菌越来越重视，纷纷制定一些新 的食品安全法规，并把单增李斯特菌纳入法定强检项目。我国每年大量进口水产 品，加入WT0以来，进出口贸易呈直线上升态势，传统的单增李斯特菌检验方法， 检验周期冗长，至少需要5 14d才能得出结果，歩骤繁琐且检验精度低。为了 适应对外贸易发展的新需要，实现与国际检测技术接轨，有必要建立一种简便、 快速、准确的检出方法，以更好的为检验检疫事业服务。
近年来，国内外的研究人员建立了多种快速检测食品中单增李斯特菌的方 法，包括商海涛等的"李斯特氏菌因子血清的制备及食品检测的免疫磁性分离一 PCR (MIPA)方法的建立"(中国兽医学报，1999， 19(4) :339-343)、寇运同等. 的"用免疫磁珠捕集法快速检测食品中的单核细胞增生李斯特菌"(检验检疫科 学，2001, 11(6) :12-13)、 0 Connor等的PCR/DNA探针方法、孙焕冬等"半套式 聚合酶链反应检测牛奶中部分肠道致病菌"(职业与健康，2002, 18(3) :43-44) 等方法。上述方法样品均需前增菌，延长了检出的时间且检测的灵敏度低。还没 有解决快速检出单增李斯特菌的问题。
随着分子生物学技术的发展，聚合酶链反应(PCR)技术在国际上得到了越 来越广泛的应用，不少用PCR检测致病菌的方法己十分成熟，并在某些国家成为
官方认可的方法。
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载 体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学 活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相 载体表面的抗原或抗体起反应。用洗漆的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合 物与液体中的其它物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在 固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反 应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接 相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接 地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
PCR-ELISA技术的原理是PCR 5'端标记上地高辛或生物素等非放射性标记 物，扩增产物滴加到固定有特异性探针的微孔板上，再加入抗地高辛或生物素酶 标抗体一辣根过氧化物酶结合物，最终加底物显色。在酶标板上测定OD值判定 结果。根据内标的读数作出标准曲线，并利用标准曲线读出样品单增李斯特菌的 含量。本发明采用PCR—ELISA方法，利用单增李斯特菌毒力簇金属蛋白酶基因 (/职力作为PCR的靶基因，应用地高辛标记的DIG-PCR-ELISA技术进行检测单增 李斯特菌的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒，以 便可以快速、灵敏、准确地检出样品中单增李斯特菌，适合于各种样品的大批量 检测。本发明的技术方案为本发明的试剂盒主要由以下几种试剂配方组成
试剂A: DNA提取液；
试剂B: PCR引物和探针；
试剂C: PCR反应液，其中含有特定一对引物(LM1;5'端被地高辛标记的 LM2 )， 其序列分别为5，-GAAAAAGCATTTGCCAT-3'和 5'-GCAACTTCCGGCTCAGC-3';
试剂D: ELISA反应液(l.结合buffer; 2.生物素标记的捕获探针LM4和IS5; 3.变性液;4.杂交液;5.洗液I; 6.anti-DIG-POD; 7.洗液II; 8.显色底物A; 9.显色底 物B; IO.终止液)，其中5'端被生物素标记的探针LM4和IS5序列分别为 5，-GGTCAGAGTGAAGCTCATGT-3'和5'-TACGTACTCTCGATCACGTC-3，。
链(霉)亲和素包被的96孔板。
试剂C、 D中所含的特定引物每种含量应不少于O.,M。 本发明所提供的快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒的使用方法如下
一、 前处理样品及DNA的提取
1. 离心机选取参数10000g，将lmL的待测细菌培养液离心10分钟，弃上清 液。
2. 沉淀重悬在50(VL50mMNaOH中，且重悬液在加热器中95'C温育10分 钟，用80pL 1M Tris-HCl中和；
3. —20。C保存DNA留用。
二、 PCR反应
取lpL待检样品DNA加入反应管C中，混匀后在PCR仪中进行以下反应
95 °C10分钟95 °C30秒
59 °C30秒-95。C至72'C这三组循环35次
72 °C30秒
72 °C5分钟4°C停止三、ELISA反应
L200nL结合buffer加入lnL2.5^M生物素标记的捕获探针LM4(终浓 度为2.5pM),加入链(霉)亲和素包被的96孔板中，20。C 25。C 孵育2小时，去掉buffer。
2. PCR产物通过加入等体积的变性液孵育10min变性，lOpL已变性的 PCR产物与lOOpL杂交液混合后加入反应板中，50。C杂交30min， 然后用预热的wash buffer I 50°C洗4次。
3. 每孔加入稀释的anti-DIG-POD (原浓度150U/mL,l:2000稀释) lOOpL， 37。C孵育30min。
4. 室温用wash buffer II洗4次。
5. 加入显色底物A和B后反应15 min。最后加终止液100pL终止反应，
用酶标仪450nm检测吸光度。
反应结束后，根据内标的读数作出标准曲线，并利用标准曲线中单增李斯特 菌的拷贝数。使用本发明的试剂盒，经实际试验，证明可以快速、准确、半定量 地检出样品中的单增李斯特菌。
本发明的有益效果是本发明检测单增李斯特菌PCR-ELISA试剂盒，可对 单增李斯特菌能进行半定量检测，其方法比常规电泳检测方法灵敏度高，可达 104CFU/mL，在5 6小时即可完成检验。可以快速、准确、半定量地检出样品中 的单增李斯特菌，适合于各种样品的大批量检测。
具体实施例方式猪肉糜和青菜用快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒检测。试 剂盒组成为
试剂A: DNA提取液,其组成为50mM NaOH, 1M Tris-HQ; 试剂B: PCR引物LM1、 LM2和探针LM4和IS5;
试剂C: PCR反应液，每管25pL扩增反应体系组成中含2pL 0. 025mol r'MgCl2; 0. 4pM 1对弓I物LM1禾口LM2为1^L; 10xPCR buffre 2. 5pL; 200|iM dNTP lpL; Taq酶0. 75U; 15U尿嘧啶-DNA糖基化酶；DNA lpL (终浓 度为10 100ng/mL); ddH20 15. 85pL;
试剂D: ELISA反应液，组成为1.结合buffer(10mMTris-HC1, lOOmMNaCl, lmM EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，O. 15%(V/V)TritonX-100, pH 7. 5 ); 2.生物素标记探 针LM4、 IS5(终浓度为2.5pM); 3.变性液(125函aOH; 20mMEDTA); 4.杂交液
(2. 5xSSC, 2x Denhardt， s solution, 10mM Tris—HC1， 1 mM EDTA'pH7. 5); 5.洗液I (lxSSC, 2x Denhardt' s solution, 10mM Tris-HCl, 1 mMEDTA, pH7. 5); 6.抗-DIG (地高辛)-POD (150U/mL，用时1:2000稀释)7.洗液II
(lOOmMTris-HQ, 150 mM NaCl, 0.05%(V/V)Tween (吐温) 20, 0. 5%(W/V) blocking reagent (反应终止剂),100|ig/mL DNA from herring sperm
(鲱鱼精DNA) ， pH7.5 ; 8.显色底物A:O. 4 mM TMB(四甲基联苯胺)、显色底物 B (0.02% H202); 9.终止液(50mM H2S04)
按本发明所提供的快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒的使用方法，先用 试剂A提取样品中的DNA,进行PCR反应，反应结束后取20nLPCR反应液加至 ELISA反应液中根据OD值换算样品中单增李斯特菌的拷贝数。
权利要求
1.一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒，其特征是，该试剂盒由以下试剂组成试剂ADNA提取液；试剂BPCR引物和探针；试剂CPCR反应液，其中含有特定的1对引物LM1，5’端被地高辛标记的LM2，其序列分别为5’-GAAAAAGCATTTGCCAT-3’和5’-GCAACTTCCGGCTCAGC-3’；试剂DELISA反应液，其中含有特定的1对引物5’端被生物素标记的探针LM4和IS5，序列分别为5’-GGTCAGAGTGAAGCTCATGT-3’和5’-TACGTACTCTCGATCACGTC-3’。
2、 根据权利要求1所述的一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒，其 特征是所述的DNA提取液其组成为50mM NaOH， 1M Tris-HC1。
3、 根据权利要求1所述的一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒，其 特征是所述的PCR引物为LM1、 LM2，探针为LM4和IS5。
4、 根据权利要求1所述的一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒，其 特征是所述的PCR反应液为每管25pL扩增反应体系组成中含2pL 0. 025mol r'MgCl2; 0.4pMl对引物LMl和LM2为lpL; 10xPCR buffre 2. 5pL; 200nM dNTP lpL; Taq酶O. 75U; 15U尿喷啶-DNA糖基化酶；DNA lpL; ddH20 15. 85pL。
5、 根据权利要求4所述的一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒， 其特征是DNA的终浓度为10 100ng/mL。
6、 根据权利要求l所述的一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒，其 特征是ELISA反应液由以下组成结合buffer : lOmMTris-HC1 ， lOOmMNaCl ， lMmedta ， 体积比为 0.15%TritonX-100， pH7. 5 ;生物素标记探针LM4、 IS5，终浓度为2.5pM; 变性液125 mMNaOH， 20mMEDTA ; 杂交液2. 5xSSC，2x Denhardt' s solution, 10mM Tris-HCl， 1 mMEDTA，pH7. 5 ;洗液I: lxSSC，2x Denhardt' s solution, 10mM Tris-HC1, 1 mMEDTA, pH7.5;抗-DIG-POD:原浓度为150U/mL，用时1:2000稀释；洗液II: lOOmM Tris-HC1, 150 mM NaCl,体积比为0. 05%Tween 20，重量体 积比为0. 5%blocking reagent, lOOpg/mL腿from herring sperm, pH7. 5 ; 显色底物A: 0. 4 mM TMB ; 显色底物B: 0. 02% HA; 终止液50mM H2S04。
7、根据权利要求l所述的一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒，其 特征是试剂C、 D中所含的特定引物每种含量应不少于0.4pM。
全文摘要
本发明涉及一种检测样品中细菌的试剂盒，特别涉及一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒。主要解决常规电泳检测方法速度慢、灵敏度低的技术问题。本发明的技术方案为一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒，其特征是该试剂盒由以下试剂组成试剂ADNA提取液；试剂BPCR引物和探针；试剂CPCR反应液，其中含有特定的1对引物LM1，5’端被地高辛标记的LM2，其序列分别为5’-GAAAAAGCATTTGCCAT-3’和5’-GCAACTTCCGGCTCAGC-3’；试剂DELISA反应液，其中含有特定的1对引物5’端被生物素标记的探针LM4和IS5，序列分别为5’-GGTCAGAGTGAAGCTCATGT-3’和5’-TACGTACTCTCGATCACGTC-3’。本发明主要用于对样品中单增李斯特菌的快速检测。
文档编号C12Q1/04GK101113465SQ200610029348
公开日2008年1月30日 申请日期2006年7月25日 优先权日2006年7月25日
发明者李晓虹, 阎东丽, 伟 韩 申请人:中华人民共和国上海出入境检验检疫局