专利名称：一种β－甘露聚糖酶基因及其编码产物的氨基酸序列和制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种酸性β-甘露聚糖酶基因及其编码产物的氨基酸序列和制备方法。
背景技术：
β-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)，是一类能够水解含β-1，4D-甘露糖苷键的内切水解酶，属于半纤维素酶类。水解的底物有半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖和甘露聚糖，产物有少量的单糖和2～10个单糖分子构成的寡糖。在纸浆漂白、饲料加工、食品加工、生物量转化等方面具广阔的应用前景。
β-甘露聚糖酶主要来源于微生物。在微生物生产的β-甘露聚糖酶中，根据最适作用pH值范围可分为酸性β-甘露聚糖酶、中性β-甘露聚糖酶和碱性β-甘露聚糖酶。不同用途的β-甘露聚糖酶需要具有不同的酶学性质。目前，新的β-甘露聚糖酶的克隆和高活性的β-甘露聚糖酶的分离成为寻找新的β-甘露聚糖酶的热点。
由于β-甘露聚糖酶应用的不断拓宽，实践中对各种具有特殊性质的β-甘露聚糖酶要求越来越高，虽然已有报道从多种微生物中获得β-甘露聚糖酶，但是仍然需要更适合实际应用需要的高效β-甘露聚糖酶，寻找更多可供研发的β-甘露聚糖酶。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种编码Armillariella tabescens(假密环菌)的酸性β-甘露聚糖酶的基因序列及其基因编码的氨基酸序列，扩大β-甘露聚糖酶基因资源，从而为开发适合不断发展的对β-甘露聚糖酶的需要及基因工程改造的需要，提供更加丰富的优良候选基因。
本发明的另一目的在于提供上述β-甘露聚糖酶的基因序列的制备方法。
本发明涉及的Armillariella tabescens(假密环菌)是无毒可食用的丝状真菌，它具有高效表达β-甘露聚糖酶及容易纯化制备酶制剂的特征。
本发明的目的通过下述技术方案实现所述β-甘露聚糖酶的基因序列是通过下述方法制备的提取经魔芋精粉诱导的高活性的Armillariella tabescens总RNA，利用Genebank的同源序列设计简并引物进行PCR扩增出保守区，然后再根据保守区设计基因特异性引物进行3’RACE(快速扩增末端)和5’RACE，克隆出全长目的基因。
所述β-甘露聚糖酶基因具有如下核苷酸序列ATGCATCTGCTCGCTTTTCTGTCTCTGAGTACATTCCTGTGCTCTGCGTTCGCTGCTGTTCCTGAGTGGGGCCAATGTGGCGGCATTGGATGGACAGGACGGACCACTTGCGTTAGTGGTACAGTATGCGCAGCTCTCAATGACTATTATTCTCAATGTGTGCCTGGAACGGCCACAACAACGGCCGCTCCCACGACTGCTACATCAACAACCATTTCTTCCACTTCTCGCACAACTGCTACGTCGACCACAGCTTCCGCACCATCTTCTACTGGCTTTGTAACTACCTCTGGCACAGAGTTCCGCCTCAACGGTGCCAAATTTACTATCTTCGGCGCCAACTCATACTGGGTCGGGTCGATGGGCTATAGCACTACAGATATGAATAAGGCCTTCGCAGACATCGCGGCTACAGGTGCCACCGTCGTCCGCACATGGGGCTTCAATGAGGTAACGAGTCCTAACGGGATTTATTACCAGAGTTGGTCCGGAAGTACACCAACTATCAACACAGGTTCTACGGGTCTTCAAAACTTTGATGCCGTCGTCGCTGCCGCTGCTGCACATGGCTTGAGGCTTATTGTTGCCTTAACGAACAACTGGTCCGACTATGGTGGAATGGATGTATACGTTAACCAAATTGTCGGGTCTGGCTCTGCGCACGATTTATTCTATACCGACTGTGAGGTTATATCTACTTACATGAACTACGTCAAGACCTTCGTCTCGCGCTATGTGAACGAACCTACTATTTTAGGTTGGGAGCTTGCAAATGAACCTAGATGCAAGGGGAGTACCGGGACGACCTCTGGATCATGCACTGCAACGACTATCACAAAATGGGCCGCGGCAATTTCAGCGTACATCAAGTCGATCGATCCCAACCATCTTGTCGGGATAGGAGATGAAGGGTTCTACAATGAACCTAGCGCACCTACATATCCATATCAAGGTAGCGAAGGTATCGATTTTGATGCAAATTTGGCCATTAGAAGCATTGATTTCGGTACATTCCATTCCTATCCTATCAGCTGGGGTCAAACCACTGATCCTCAGGGATGGGGTACGCAATGGATCGCTGATCATGCAACGTCAATGACAGCTGCGGGAAAGCCCGTAATCTTAGAGGAGTTTGGAGTCACCACTAATCAAGCAACTGTTTATGGCGCCTGGTATCAGGAAGTTGTCTCTTCGGGTCTTACTGGTGCTCTTATTTGGCAAGCTGGTTCTTATTTATCATCCGGAGCTACTCCGGACGACGGATATGCAAT门ATCCTGATGATCCTGTATATCCCCTGGAAACCTCCTATGCGGTTACATTGAAAGCGCGGGCGTAG3’所述β-甘露聚糖酶基因的编码产物，具有如下氨基酸序列
MHLLAFLSLSTFLCSAFAAVPEWGQCGGIGWTGQTTCVSGTVCAALNDYYSQCVPGTATTTAAPTTATSTTISSTSRTTATSTTASAPSSTGFVTTSGTEFRLNGAKFTIFGANSYWVGLMGYSTTDMNKAFADIAATGATVVRTWGFNEVTSPNGIYYQSWSGSTPTINTGSTGLQNFDAVVAAAAAHGLRLIVAITNNWSDYGGMDVYVNQIVGSGSAHDLFYTDCEVISTYMNYVKTFVSRYVNEPTILGWELANEPRCKGSTGTTSGSCTATTITKWAAAISAYIKSIDPNHLVGIGDEGFYNEPSAPTYPYQGSEGIDFDANLAISSIDFGTFHSYPISWGQTTDPQGWGTQWIADHATSMTAAGKPVILEEFGVTTNQATVYGAWYQEVVSSGLTGALIWQAGSYLSSGATPDDGYAIYPDDPVYSLETSYAVTLKARA。
所述β-甘露聚糖酶的基因序列的制备方法包括如下步骤(1)提取经魔芋精粉诱导的Armillariella tabescens总RNA，利用Genebank的同源序列设计简并引物进行PCR扩增出氨基酸序列保守区cDNA序列，针对这些保守区设计出简并引物，以简并引物(5’GGTCCGGTGCTAGGCCTACNATHAAYAC3’；5’CGCGGTTCATTTGCCARYTCCCANGC3’)进行克隆，扩增得到约298bp大小的片段(片段A)；通过Blastx(基本局域联配搜寻工具)，进行相似性搜索，检索结果表明，与β-甘露聚糖酶具有最大同源性，但并不完全相同，这表明所扩增片段为新的潜在的β-甘露聚糖酶cDNA序列；(2)根据上述所获得的部分cDNA序列，设计基因特异性引物(5’TCCACCATAGTCGGACCAGTTGTTCG3’)，通过5’RACE末端扩增获得675pb的片段(片段B)，与保守区有101bp的重叠；(3)片段A和B片段拼接成序列M，再根据序列M设计基因特异性引物(5’ACAGAGTTCCGCCTCAACGGTGCCAA3’)，通过3’RACE末端扩增获1266bp的片段(片段C)，与5’RACE有321bp的重叠；(4)将上述3个片段(片段A、B、C)进行序列拼接，得到大小为1449bp的核甘酸序列，ORF编码由445个氨基酸组成的蛋白质，其中N端的前18个氨基酸为信号肽(MHLLAFLSLSTFLCSAFA)，成熟肽由427个氨基酸组成。
通过本发明从Armillariella tabescens克隆到的β-甘露聚糖酶基因cDNA序列与报道的序列不同，表达产物为重组酸性β-甘露聚糖酶。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果本发明通过基因重组来生产酸性β-甘露聚糖酶，扩大β-甘露聚糖酶基因资源，从而为开发适合不断发展的对β-甘露聚糖酶的需要及基因工程改造的需要，提供更加丰富的优良候选基因。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1β-甘露聚糖酶基因的克隆提取经魔芋精粉诱导的高活性的Armillariella tabescens总RNA，从Genebank蛋白数据库中检索出4个物种与真菌亲缘关系较近β-甘露聚糖酶序列，物种分别是Agaricus bisporus(双孢磨菇)，Aspergillus fumigatus Af293(烟曲霉)，Aspergillus aculeatus(棘孢曲霉)，Hypocrea jecorina或Trichodermareesei(里氏木霉)，经多序列比对软件clustalx分析，得出序列之间的保守区，再输入block make(蛋白质分类与同源性数据库)分析得到无间隙的氨基酸序列保守区；最后用引物设计软件CodeHop(Consensus Degenerate HybridOligonucleotide Primers)针对这些保守区设计出多对简并引物，以其中的一对简并引物(5’GGTCCGGTGCTAGGCCTACNATHAAYAC3’；5’CGCGGTTCATTTGCCARYTCCCANGC3’)进行保守区克隆，取约1ul总RNA合成第一条cDNA进行PCR，扩增条件94℃变性2min，第一个循环按94℃30s，69℃30s，72℃1min，以后每个循环的退火温度下降1℃，共计5个循环；然后按94℃30s，64℃30s，72℃1min进行30循环，最后72℃5min；扩增得到约300bp大小的片段，将PCR产物回收并克隆到PMD-18T载体上，转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选和酶切鉴定阳性克隆，挑取正确的阳性克隆(蓝色克隆)进行测序；测序结果显示得到的片段大小为298bp(片段A)，通过软件Blastx，进行相似性搜索，检索结果表明，与β-甘露聚糖酶具有最大同源性，但并不完全相同，这表明所扩增片段为新的潜在的β-甘露聚糖酶cDNA序列。根据所获得的部分cDNA序列，设计基因特异性引物(5’TCCACCATAGTCGGACCAGTTGTTCG3’)，取约1ul总RNA合成第一条cDNA，进行5’RACE末端的扩增，条件为94℃3min第一个循环按94℃45s，71℃45s，72℃1.5min，以后每个循环的退火温度下降1℃，共计5个循环。然后按94℃1min，66℃1min，72℃1.5min，30个循环，最后72℃5min，扩增产物经筛选、鉴定、测序，获得675pb的片段(片段B)，与保守区有101bp的重叠，片段A和B片段拼接成序列M，再根据序列M设计基因特异性引物(5’ACAGAGTTCCGCCTCAACGGTGCCAA3’)，取约1ul总RNA合成第一条cDNA，进行3’RACE末端的扩增。条件为94℃3min45s，72℃5min第一个循环按94℃45s，71℃45s，72℃3min，以后每个循环的退火温度下降1℃，共计4个循环；然后按94℃1min，68℃45s，72℃3min，30个循环，最后72℃5min，扩增产物经筛选、鉴定、测序。通过3’RACE末端扩增获1266bp的片段(片段C)，与5’RACE有321bp的重叠。所得的片段(片段A、B、C)均为同一基因的部分序列。用序列分析软件将上述3个片段(片段A、B、C)进行拼接，得到大小为1449bp的核甘酸序列，ORF编码由445个氨基酸组成的蛋白质，其中N端的前18个氨基酸为信号肽(MHLLAFLSLSTFLCSAFA)，成熟肽由427个氨基酸组成。
实施例2高拷贝重组表达质粒pPICZαA-M的构建参照pPICZαA载体的酶切位点，将β-甘露聚糖酶基因cDNA序列去除信号肽序列后加EcoRI和KpnI酶切位点，并在终止密码子TAG前加CAC CACCAC CAC CAC CAC(6His)进行全长PCR，引物为(5’CCGGAATTCGCTGTTCCTGAGTGGGGCCAATG3’；5’CGGGGTACCCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCGCCCGCGCTTTCAATGTAAC3’)，扩增条件94℃变性4min，第一个循环按94℃45s，70℃45s，72℃3min，以后每个循环的退火温度下降1℃，共计5个循环。然后按94℃45s，65℃45s，72℃3min进行25循环，最后72℃5min，扩增得到约1300bp大小的片段，测序结果显示得到的片段大小为1308bp和拼接的序列一致。
实施例3β-甘露聚糖酶在毕赤酵母GS115中高效表达Sac I单酶切重组表达质粒pPICZαA-M，电转化毕赤酵母GS115，重组表达组氨酸标签的β-甘露聚糖酶。在分别含100ug/ml、500ug/ml、1000ug/ml的zeocin的平板上均有生长，分别挑取单菌落平板培养，经1％甲醇诱导，重组菌GS115-pPICZαA-M在含有魔芋精粉的平板上均出现明显的水解圈，表现出高活性的β-甘露聚糖酶。分别挑取100ug/ml、500ug/ml、1000ug/ml的zeocin上生长的重组菌GS115-pPICZαA-M在BMGY培养基25ml/250ml中28～30℃，220～270转培养过夜，OD值达2～6，再转入BMMY培养基200ml/1000ml中28～30℃，220～270转培养，108小时，每隔12小时抽样检测，以GS115-pPICZαA为对照，蛋白含量测定及SDS-PAGE分析，发现在1000ug/ml的zeocin上生长的重组菌GS115-pPICZαA-M的目的蛋白含量较高，达细胞分泌总蛋白含量的50％以上。
SEQUENCE LISTING<110>暨南大学<120>一种β-甘露聚糖酶基因及其编码产物的氨基酸序列和制备方法<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1338<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>通过Genebank的同源序列设计简并引物进行PCR扩增出保守区，然后再根据保守区设计基因特异性引物进行3’RACE和5’RACE，克隆出β-甘露聚糖酶基因编码的核苷酸序列<400>1atgcatctgc tcgcttttct gtctctgagt acattcctgt gctctgcgtt cgctgctgtt 60cctgagtggg gccaatgtgg cggcattgga tggacaggac ggaccacttg cgttagtggt120acagtatgcg cagctctcaa tgactattat tctcaatgtg tgcctggaac ggccacaaca180acggccgctc ccacgactgc tacatcaaca accatttctt ccacttctcg cacaactgct240acgtcgacca cagcttccgc accatcttct actggctttg taactacctc tggcacagag300ttccgcctca acggtgccaa atttactatc ttcggcgcca actcatactg ggtcgggtcg360atgggctata gcactacaga tatgaataag gccttcgcag acatcgcggc tacaggtgcc420accgtcgtcc gcacatgggg cttcaatgag gtaacgagtc ctaacgggat ttattaccag480agttggtccg gaagtacacc aactatcaac acaggttcta cgggtcttca aaactttgat540gccgtcgtcg ctgccgctgc tgcacatggc ttgaggctta ttgttgcctt aacgaacaac600tggtccgact atggtggaat ggatgtatac gttaaccaaa ttgtcgggtc tggctctgcg660cacgatttat tctataccga ctgtgaggtt atatctactt acatgaacta cgtcaagacc720ttcgtctcgc gctatgtgaa cgaacctact attttaggtt gggagcttgc aaatgaacct780
agatgcaagg ggagtaccgg gacgacctct ggatcatgca ctgcaacgac tatcacaaaa 840tgggccgcgg caatttcagc gtacatcaag tcgatcgatc ccaaccatct tgtcgggata 900ggagatgaag ggttctacaa tgaacctagc gcacctacat atccatatca aggtagcgaa 960ggtatcgatt ttgatgcaaa tttggccatt agaagcattg atttcggtac attccattcc1020tatcctatca gctggggtca aaccactgat cctcagggat ggggtacgca atggatcgct1080gatcatgcaa cgtcaatgac agctgcggga aagcccgtaa tcttagagga gtttggagtc1140accactaatc aagcaactgt ttatggcgcc tggtatcagg aagttgtctc ttcgggtctt1200actggtgctc ttatttggca agctggttct tatttatcat ccggagctac tccggacgac1260ggatatgcaa tttatcctga tgatcctgta tatcccctgg aaacctccta tgcggttaca1320ttgaaagcgc gggcgtag 1338<210>2<211>445<212>PRT<213>Artificial sequence<220>
<223>通过Genebank的同源序列设计简并引物进行PCR扩增出保守区，然后再根据保守区设计基因特异性引物进行3’RACE和5’RACE，克隆出β-甘露聚糖酶基因编码的氨基酸序列<400>2Met His Leu Leu Ala Phe Leu Ser Leu Ser Thr Phe Leu Cys Ser Ala1 5 10 15Phe Ala Ala Val Pro Glu Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Thr20 25 30Gly Gln Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Val Cys Ala Ala Leu Asn Asp35 40 45Tyr Tyr Ser Gln Cys Val Pro Gly Thr Ala Thr Thr Thr Ala Ala Pro50 55 60Thr Thr Ala Thr Ser Thr Thr Ile Ser Ser Thr Ser Arg Thr Thr Ala65 70 75 80
Thr Ser Thr Thr Ala Ser Ala Pro Ser Ser Thr Gly Phe Val Thr Thr85 90 95Ser Gly Thr Glu Phe Arg Leu Asn Gly Ala Lys Phe Thr Ile Phe Gly100 105 110Ala Asn Ser Tyr Trp Val Gly Leu Met Gly Tyr Ser Thr Thr Asp Met115 120 125Asn Lys Ala Phe Ala Asp Ile Ala Ala Thr Gly Ala Thr Val Val Arg130 135 140Thr Trp Gly Phe Asn Glu Val Thr Ser Pro Asn Gly Ile Tyr Tyr Gln145 150 155 160Ser Trp Ser Gly Ser Thr Pro Thr Ile Asn Thr Gly Ser Thr Gly Leu165 170 175Gln Asn Phe Asp Ala Val Val Ala Ala Ala Ala Ala His Gly Leu Arg180 185 190Leu Ile Val Ala Ile Thr Asn Asn Trp Ser Asp Tyr Gly Gly Met Asp195 200 205Val Tyr Val Asn Gln Ile Val Gly Ser Gly Ser Ala His Asp Leu Phe210 215 220Tyr Thr Asp Cys Glu Val Ile Ser Thr Tyr Met Asn Tyr Val Lys Thr225 230 235 240Phe Val Ser Arg Tyr Val Asn Glu Pro Thr Ile Leu Gly Trp Glu Leu245 250 255Ala Asn Glu Pro Arg Cys Lys Gly Ser Thr Gly Thr Thr Ser Gly Ser260 265 270Cys Thr Ala Thr Thr Ile Thr Lys Trp Ala Ala Ala Ile Ser Ala Tyr275 280 285Ile Lys Ser Ile Asp Pro Asn His Leu Val Gly Ile Gly Asp Glu Gly290 295 300Phe Tyr Asn Glu Pro Ser Ala Pro Thr Tyr Pro Tyr Gln Gly Ser Glu305 310 315 320
Gly Ile Asp Phe Asp Ala Asn Leu Ala Ile Ser Ser Ile Asp Phe Gly325 330 335Thr Phe His Ser Tyr Pro Ile Ser Trp Gly Gln Thr Thr Asp Pro Gln340 345 350Gly Trp Gly Thr Gln Trp Ile Ala Asp His Ala Thr Ser Met Thr Ala355 360 365Ala Gly Lys Pro Val Ile Leu Glu Glu Phe Gly Val Thr Thr Asn Gln370 375 380Ala Thr Val Tyr Gly Ala Trp Tyr Gln Glu Val Val Ser Ser Gly Leu385 390 395 400Thr Gly Ala Leu Ile Trp Gln Ala Gly Ser Tyr Leu Ser Ser Gly Ala405 410 415Thr Pro Asp Asp Gly Tyr Ala Ile Tyr Pro Asp Asp Pro Val Tyr Ser420 425 430Leu Glu Thr Ser Tyr Ala Val Thr Leu Lys Ala Arg Ala435 440 44权利要求
1.一种β-甘露聚糖酶基因，其特征在于，所述酶基因的核苷酸序列如下atgcatctgc tcgcttttct gtctctgagt acattcctgt gctctgcgtt cgctgctgtt60cctgagtggg gccaatgtgg cggcattgga tggacaggac ggaccacttg cgttagtggt120acagtatgcg cagctctcaa tgactattat tctcaatgtg tgcctggaac ggccacaaca180acggccgctc ccacgactgc tacatcaaca accatttctt ccacttctcg cacaactgct240acgtcgacca cagcttccgc accatcttct actggctttg taactacctc tggcacagag300ttccgcctca acggtgccaa atttactatc ttcggcgcca actcatactg ggtcgggtcg360atgggctata gcactacaga tatgaataag gccttcgcag acatcgcggc tacaggtgcc420accgtcgtcc gcacatgggg cttcaatgag gtaacgagtc ctaacgggat ttattaccag480agttggtccg gaagtacacc aactatcaac acaggttcta cgggtcttca aaactttgat540gccgtcgtcg ctgccgctgc tgcacatggc ttgaggctta ttgttgcctt aacgaacaac600tggtccgact atggtggaat ggatgtatac gttaaccaaa ttgtcgggtc tggctctgcg660cacgatttat tctataccga ctgtgaggtt atatctactt acatgaacta cgtcaagacc720ttcgtctcgc gctatgtgaa cgaacctact attttaggtt gggagcttgc aaatgaacct780agatgcaagg ggagtaccgg gacgacctct ggatcatgca ctgcaacgac tatcacaaaa840tgggccgcgg caatttcagc gtacatcaag tcgatcgatc ccaaccatct tgtcgggata900ggagatgaag ggttctacaa tgaacctagc gcacctacat atccatatca aggtagcgaa960ggtatcgatt ttgatgcaaa tttggccatt agaagcattg atttcggtac attccattcc 1020tatcctatca gctggggtca aaccactgat cctcagggat ggggtacgca atggatcgct 1080gatcatgcaa cgtcaatgac agctgcggga aagcccgtaa tcttagagga gtttggagtc 1140accactaatc aagcaactgt ttatggcgcc tggtatcagg aagttgtctc ttcgggtctt 1200actggtgctc ttatttggca agctggttct tatttatcat ccggagctac tccggacgac 1260ggatatgcaa tttatcctga tgatcctgta tatcccctgg aaacctccta tgcggttaca 1320ttgaaagcgc gggcgtag 1338。
2.权利要求1所述的β-甘露聚糖酶基因的编码产物，其特征在于，所述编码产物具有如下氨基酸序列Met His Leu Leu Ala Phe Leu Ser Leu Ser Thr Phe Leu Cys Ser Ala1 5 10 15Phe Ala Ala Val Pro Glu Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Thr20 25 30Gly Gln Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Val Cys Ala Ala Leu Asn Asp35 40 45Tyr Tyr Ser Gln Cys Val Pro Gly Thr Ala Thr Thr Thr Ala Ala Pro50 55 60Thr Thr Ala Thr Ser Thr Thr Ile Ser Ser Thr Ser Arg Thr Thr Ala65 70 75 80Thr Ser Thr Thr Ala Ser Ala Pro Ser Ser Thr Gly Phe Val Thr Thr85 90 95Ser Gly Thr Glu Phe Arg Leu Asn Gly Ala Lys Phe Thr Ile Phe Gly100 105 110Ala Asn Ser Tyr Trp Val Gly Leu Met Gly Tyr Ser Thr Thr Asp Met115 120 125Asn Lys Ala Phe Ala Asp Ile Ala Ala Thr Gly Ala Thr Val Val Arg130 135 140Thr Trp Gly Phe Asn Glu Val Thr Ser Pro Asn Gly Ile Tyr Tyr Gln145 150 155 160Ser Trp Ser Gly Ser Thr Pro Thr Ile Asn Thr Gly Ser Thr Gly Leu165 170 175Gln Asn Phe Asp Ala Val Val Ala Ala Ala Ala Ala His Gly Leu Arg180 185 190Leu Ile Val Ala Ile Thr Asn Asn Trp Ser Asp Tyr Gly G1y Met Asp195 200 205Val Tyr Val Asn Gln Ile Val Gly Ser Gly Ser Ala His Asp Leu Phe210 215 220Tyr Thr Asp Cys Glu Val Ile Ser Thr Tyr Met Asn Tyr Val Lys Thr225 230 235 240Phe Val Ser Arg Tyr Val Asn Glu Pro Thr Ile Leu Gly Trp Glu Leu245 250 255Ala Asn Glu Pro Arg Cys Lys Gly Ser Thr Gly Thr Thr Ser Gly Ser260 265 270Cys Thr Ala Thr Thr Ile Thr Lys Trp Ala Ala Ala Ile Ser Ala Tyr275 280 285Ile Lys Ser Ile Asp Pro Asn His Leu Val Gly Ile Gly Asp Glu Gly290 295 300Phe Tyr Asn Glu Pro Ser Ala Pro Thr Tyr Pro Tyr Gln Gly Ser Glu305 310 315 320Gly Ile Asp Phe Asp Ala Asn Leu Ala Ile Ser Ser Ile Asp Phe Gly325 330 335Thr Phe His Ser Tyr Pro Ile Ser Trp Gly Gln Thr Thr Asp Pro Gln340 345 350Gly Trp Gly Thr Gln Trp Ile Ala Asp His Ala Thr Ser Met Thr Ala355 360 365Ala Gly Lys Pro Val Ile Leu Glu Glu Phe Gly Val Thr Thr Asn Gln370 375 380Ala Thr Val Tyr Gly Ala Trp Tyr Gln Glu Val Val Ser Ser Gly Leu385 390 395 400Thr Gly Ala Leu Ile Trp Gln Ala Gly Ser Tyr Leu Ser Ser Gly Ala405 410 415Thr Pro Asp Asp Gly Tyr Ala Ile Tyr Pro Asp Asp Pro Val Tyr Ser420 425 430Leu Glu Thr Ser Tyr Ala Val Thr Leu Lys Ala Arg Ala435 440 445。
3.一种β-甘露聚糖酶基因的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤(1)提取经魔芋精粉诱导的Armillariella tabescens总RNA，利用Genebank的同源序列设计简并引物进行PCR扩增出氨基酸序列保守区，针对保守区设计出简并引物，以简并引物5’GGTCCGGTGCTAGGCCTACNATHAAYAC3’；5’CGCGGTTCATTTGCCARYTCCCANGC3’进行保守区克隆，扩增得到298bp大小的片段A；(2)根据上述所获得的cDNA序列，设计基因特异性引物5’TCCACCATAGTCGGACCAGTTGTTCG3’，通过5’RACE末端扩增获得675pb的片段B，与保守区有101bp的重叠；(3)片段A和B片段拼接成序列M，再根据序列M设计基因特异性引物5’ACAGAGTTCCGCCTCAACGGTGCCAA3’，通过3’RACE末端扩增获1266bp的片段C，与5’RACE有321bp的重叠；(4)将上述3个片段进行序列拼接，最终得到大小为1449bp的核甘酸序列，ORF编码由445个氨基酸组成的蛋白质，其中N端的前18个氨基酸为信号肽，成熟肽由427个氨基酸组成。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，公开了一种β－甘露聚糖酶基因及其编码产物的氨基酸序列和制备方法，该制备方法经提取经魔芋精粉诱导的高活性的Armillariella tabescens总RNA，利用Genebank的同源序列设计简并引物进行PCR扩增出保守区，然后再根据保守区设计基因特异性引物进行3’RACE和5’RACE，克隆出β－甘露聚糖酶基因的全长cDNA。可与毕赤酵母等构建真核表达载体建立高效表达的酵母基因工程菌株。
文档编号C12N9/24GK1807644SQ20061003330
公开日2006年7月26日 申请日期2006年1月25日 优先权日2006年1月25日
发明者姚冬生, 黄小葵, 刘大岭, 谢春芳 申请人:暨南大学