水稻叶形控制基因sll1及其应用的制作方法

专利名称：水稻叶形控制基因sll1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻SLL1(Shallot Like Leaf 1)基因，以及利用转基因互补实验鉴定该基因的功能；同时还涉及利用该基因调控叶片厚壁纤维组织，从而通过调节水稻的叶片内部结构，增加农作物的叶肉细胞数目和叶绿素含量；同时利用该基因调节叶片卷曲，用以获得农作物的理想株型，提高农作物的产量。
背景技术：
水稻作为单子叶植物的模式植物，具有单子叶植物叶的典型特点。水稻叶由叶片和叶鞘组成，叶片可分为表皮层，叶肉层和维管层三个组成部分。在维管层中包括靠近远轴面的韧皮部、靠近近轴面的木质部、外周的维管束鞘薄壁细胞以及将维管束和表皮紧密相连的厚壁纤维细胞。在正常的叶片中，厚壁细胞出现在近轴面和远轴面，起机械支撑的作用。厚壁细胞是具有均匀增厚的此生壁和木质化的死细胞，叶脉中的厚壁组织主要包括有运输能力的木质部细胞和表皮下方的厚壁纤维细胞。从叶肉细胞分化形成到木质化导管元素，厚壁组织等死细胞的分化，是细胞程序化死亡的一个典型事例。人们利用体外培养的百日菊(Zinnia)叶肉细胞是研究维管分化的经典系统。而在水稻中的研究尚未见报道。
叶片发育是一个非常复杂的过程，包括了细胞分裂和延伸、极性决定、组织分化等诸多方面。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，叶片形态的研究一直备受关注。迄今为止，在水稻中已发现了近11个卷叶基因座，目前仅限於表型、生理及遗传初定位等方面，至今仍未见成功克隆水稻卷叶有关基因的报道。
本发明利用叶形极端卷曲的突变体，通过图位克隆技术首先克隆到了SLL基因，该基因编码一种MYB-DNA结合域的转录因子，并以此控制水稻叶片中叶肉细胞中维管分化的程序性死亡过程，通过影响厚壁组织的形成来控制叶片形态。水稻叶片中厚壁元素的程序化死亡问题还是研究的空白，但以前的研究表明，细胞程序性死亡与植物抗逆密切相关，现有报道也认为Myb转录因子和抗逆有着密切的联系。
叶畸形在拟南芥和玉米中的研究主要集中在极性建成方面，叶片近轴面属性的建立需要PHAN家族和HD-ZIP III家族等，叶片远轴面属性的建立需要YABBY家族和KANADI家族等，这些轴性决定基因多数编码与转录相关的调控因子。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种从水稻卷叶突变体中克隆的新基因SLL1，该基因编码一个SHAQKYF类的MYB-DNA结合域的转录因子，主要通过调控远轴面维管组织分化中的程序化死亡来控制叶形的卷曲程度。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻叶形控制基因SLL1编码的蛋白质，该蛋白质具有Seq ID No2所示的氨基酸序列。
作为本发明的水稻叶形控制基因SLL1编码的蛋白质的改进氨基酸序列还包括在SeqID No2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
本发明还提供了编码上述蛋白质的基因，该基因具有Seq ID No1所示的核苷酸序列。
作为本发明的基因的改进核苷酸序列还包括在Seq ID No1所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。
本发明还提供了含有上述基因的质粒。
本发明还提供了含有上述基因的植物表达载体。
本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有基因序列。
作为本发明的宿主细胞的改进该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。
本发明还提供了一种培育植物叶片卷曲的方法，包括用上述植物表达载体转化植物细胞，再将转化的植物细胞培育成植株。
作为本发明的培育方法的改进转化采用农杆菌介导法或基因枪法。
具体的说本发明所提供的从水稻卷叶突变体中克隆的新基因SLL1，具有如图4和seq ID No1所示的DNA序列。也包括在取代一个核苷酸而产生的突变体等位基因，还含具有相同功能并能达到本发明目的的基因序列。
本发明中Seq ID No2所示的蛋白质属於SHAQKYF类的MYB-DNA结合域的转录因子蛋白家族，其中进行一个或几个氨基酸的替换、插入或缺失氨基酸所获得的功能类似物。SLL1与拟南芥KANADI蛋白同源性为56％；KANADI蛋白编码一种名为GARP家族的转录因子，也具有MYB-DNA结合域，并调节表皮毛和心皮的极性发育。
本发明所提供的含有图4和seq ID No1所示序列的基因或部分基因片段的载体，如图7所示，该载体可以表达由上述核酸序列编码的多肽或同源类似物。
本发明所提供的植物叶片卷曲的培育方法，是一种用SLL1进行高效植物遗传转化的方法；具体地说，是利用植物表达载体转化植物细胞以影响农作物叶片形态方法。
实现本发明的具体技术步骤如下一、水稻卷叶突变体SLL1的分离和遗传分析本发明所采用的水稻叶片极端卷曲卷叶突变体是将“日本晴”粳稻品种(japonica)经1％浓度的化学诱变剂(ethyl methane sulphonate，EMS)处理后，再通过大量筛选而得到的表型稳定的突变体sll-1。该突变体除了叶片表现出卷曲外，其它表型均与野生型相似，如图1所示。大量的杂交实验证明，我们所得到的是一个符合单基因控制遗传规律的隐性突变体。
二、图位克隆控制水稻叶形的SLL1基因1、SLL1基因的初步定位为了分离SLL1基因，本发明首先建立了一个大的多态性高的定位群体，由sll-1与籼稻品种南京6号(Indica)杂交而形成的F2群体，再通过图位克隆的方法，并利用STS、SSR等分子标记对SLL1位点进行初步定位，将其初步定位在第9染色体的长臂上，并介于RM3700和RM1896两SSR标记之间，见图2。
2、SLL1基因的精细定位通过对BAC克隆B1040D06的序列分析，发展了2个新的SSR标记和12个STS标记，如表1所示，将SLL1精确定位于STS标记T5904-7和T5904-9之间，29.57kb的范围之内。通过测序分析此区段的开放阅读框(ORF)推测候选基因，将SLL1基因精确定位于BAC克隆B1040D06的103061-108515的位置(图3)。
表1、新发展的具有多态的SSR标记和STS标记


3、SLL1基因的鉴定和功能分析利用pCAMBIA1300质粒构建互补载体(图7)，通过转基因技术，进行功能互补的转基因研究，结果表明本发明获得了使突变体恢复正常功能的转基因水稻(图8)，证明了本发明正确克隆了SLL1基因，明确SLL1基因的DNA序列(图4)和cDNA序列(图5)，氨基酸序列分析表明SLL1基因编码一个SHAQKYF类的MYB-DNA结合域的转录因子(图6)。图5所示的cDNA序列，其核苷酸序列即为Seq ID No3。
在水稻中，SLL1基因功能的丧失造成叶片远轴面厚壁纤维细胞的缺失，并导致叶片向近轴面的卷曲。进一步的实验表明，该基因编码一个SHAQKYF类的MYB-DNA结合域的转录因子，主要通过调控远轴面维管组织分化中的程序化死亡来控制叶形的卷曲程度。该基因在揭示叶形发生卷曲的分子机理，了解叶片叶肉细胞、维管组织和厚壁纤维组织的分化发育，以及单子叶植物叶片极性建成等方面具有重要的理论价值。叶形是作物的重要农艺性状，在品种改良和理想株形分子设计育种占有重要的地位。利用转基因技术可以对植物的叶片卷曲程度进行改良，提高叶片的叶绿素含量以及提高光合作用效率，加速干物质的积累，提高农业产量，具有广阔的应用前景。
我国是水稻生产和消费大国，随着人口的增长，对水稻需求将呈上升趋势。高产和超高产是作物育种永恒的主题，是确保我国粮食安全和农业可持续发展最有效的保障。SLL1基因的克隆和应用，对超级水稻理想株形的分子设计育种奠定了分子理论基础和提供了可直接利用的有利基因资源。无论是对稻作科学的发展，实现我国水稻单产的第三次突破，还是对解决新世纪我国粮食安全问题，都具有重大意义。


图1是水稻日本晴野生型与卷叶突变体sll1的叶片表型图；图2是SLL1在水稻第9染色体上的初步定位图；
图3是SLL1基因的精细定位图；图4是5LL1基因的DNA序列；图5是SLL1基因的cDNA序列；图6是SLL1基因编码的氨基酸序列；图7是互补载体构建质粒图谱；图8是功能互补实验T1代转基因水稻的表型图。
具体实施例方式
参照上述附图，对本发明的具体实施方式
进行详细说明。
图1中的“a”代表叶片横截面，“b”代表植株表型。
图8中的“sll1”代表卷叶突变体，“sll1/SLL1”代表转SLL1基因T1代突变体植株。
实施例11、水稻材料水稻(Oryza sativa L.)突变体Shallot-like leaf1(sll1)，原始野生型材料为“日本晴”粳稻品种。
2、分析和定位群体纯合的sll1突变体和原始野生型品种南京6号进行杂交，F1代自交，得到F2群体，并从中选出711个sll1突变个体作为定位群体。在分蘖初期每株取1克左右的嫩叶，用来提取总DNA。
3、SSR和STS标记定位SLL1基因采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约100mg水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1.5ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于100μl超纯水中。每一个SSR和STS反应用2μlDNA样品。
在SLL1基因的初步定位阶段，对由152个F2个体组成的小群体进行SLLP分析，根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的SLLP引物，根据已知的反应条件进行PCR扩增，经5％琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(EB)染色，检测PCR产物的多态性，将SLL1初步定位在第9号染色体长臂RM3700和RM1896标记间。
4、SLL1基因的精细定位在精细定位SLL1基因时，通过对BAC克隆B1040D06的序列分析，发展了两个新的SSR标记和12个STS标记，对F2群体中选出的711个与突变体表型一致的突变个体进行SSLP和STS分析。将SLL1精确定位于STS标记T5904-7和T5904-9之间，29.57kb的范围之内。
根据BAC克隆B1040D06序列，设计40对引物，采用PCR方法分别从sll1和野生型日本晴的基因组中扩增出这29.75kb，进行测序分析。发现突变体sll1扩增的产物比野生型日本晴有一个碱基的替换(G到A)。在根据cDNA水平检测发现该突变事件发生在剪接位点上，导致mRNA不能正常剪接。根据BAC克隆B1040D06序列的基因注释信息(TIGR)，该基因编码一个MYB-DNA结合域的转录因子。通过测序分析此区段的开放阅读框(ORF)推测候选基因，将SLL1基因定位于BAC克隆B1040D06的103061-108515的位置。该基因共包含6个外显子(Exon)和5个内含子(Intron)。
5、SLL1 cDNA全长基因的获得与功能的预测通过全长测序，经过几轮扩增得到了SLL1基因的cDNA全长序列(图6)。在上述研究的基础上发现了基因发生突变的位置，并预测该基因编码一个SHAQKYF类的MYB-DNA结合域的转录因子，通过调控远轴面厚壁组织的程序化死亡，以调控植株叶片的形状。
实施例2植物转化将BAC克隆B1040D06用BglII和SSe8387I进行完全酶切，电泳分离后割取8KB左右的DNA片段连接到pCAMBIA1300多克隆位点中的同尾酶BamHI和PstI切点上，该DNA片段覆盖了整个ORF的基因组区域，还包括ATG上游1.6KB启动子序列。
这个质粒通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中转化水稻。我们利用突变体幼胚诱导的愈伤组织，经过诱导培养基培养3周后，挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有40mg/LHygromycin的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有50mg/L预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。对植株进行鉴定和连续的观察，发现植株叶片恢复了正常的形态，于同一生长阶段的突变体比较，叶片伸展不在卷曲，对其进行切片发现，厚壁纤维细胞的发育恢复正常(图8)。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表SEQ ID NO11 ATGGCGCCGA TGATGCTGCA GCCGCTCGAC GCCGGCGGCG GCGCGTCGGC GCCGCCGCCG61CCGATCCGCG GGATACCTAT CTACAACGGC CCCGGCGGGT TCCCGTTCCT GCAGCCGTCG121 CCCACCGCCG GCGACGTCGG CCACCACCAC CACCACCACC CCAAGATGGG ATTCTACAGC181 TCGTACCACC ACCCATCCAC GTGGCCCTCC ACGTCGCCGT CCCCGCTCGC GGCGCCGCCG241 GGCGCCGCGT CGTCGCCGCT CGACCCCACG GCGGCGTTCC TCTCCTCCCC CCACCACCGG301 ATGCTGTCCG CCGCCTCGGG GAGGCTCAAC GGCATGCTCT CCGTCTCCGA CACCCTCCGC361 AGCTACGGCG TCCCCGGCGC CGCCGCCCCC GGCGTCATCG GCGGCGCGCA CCACCACCAC421 CACCACCTCC ACGGCGGCCA GCCGTTCGTC GGCGCCCTCG CGTCCCGCTT CATGCCCAAG481 CTCCCCGCCA AGCGCAGCAT GCGCGCGCCG CGCATGCGCT GGACGAGCAC CCTCCACGCC541 CGCTTCGTCC ACGCCGTCGA GCTCCTCGGC GGCCACGAGA GTACGCCCCC GCCATCATCG601 TCGTCGTCCT CCTCCTCCTT CTCACCACCA TCATCAACGA GCTCGATCAA TCTGATGAGA661 ATCCAATCTT GTTCTTGGCA GGGGCGACGC CCAAGTCGGT GCTGGAGCTC ATGGACGTCA721 AGGATCTGAC GCTAGCGCAT GTCAAGAGCC ACCTCCAGGT ATCCCGCCAT TGCCGACCAA781 TTCTCACAGC TCGATCGATC GATCAAACAC CACTCACCAC TGCACCATCT CTCTCTTTCT841 CTCTCTCGAT TTCGATTCCA TTCAGCTTCT GTTCTTGATC ATCTTGTTTG GGTGAGACAA901 AGATGCCAAT GCAGTAACTC CTGAGTTAGT GAAGAAACTG CCATTCTTGG GAGCAGAGAG961 AGAGAGTGTG TGTGTGACAT GTTTGGGGAT GTGTGTGCAA GAGAGAAGAG AGAGAGAGAG1021 GGGAAAAAAG TTGCCATCAT TACACAATAA TGCATTGCAT CTGCATCTGT GCTACTAGCT1081 CCTTCCTTAG CTCTAGTCAT ACTAGCGTAT ATGTGCACGG CCCAAAGCAC TCTCACACAC1141 AAACACAAGA GAGAGAGAGA GAGAGAGAAG AAGAAGATGA GAGATGAGAG AGAGTAGGAC1201 ATATTTTGTG TGTGTTTCTT TGCTGCTTGT CTTTTGCAAT GGCTTCAACC TCCTGGTTTC1261 ATTTTGATCT CACAAAAAAT GTGTGTGTGT GTGTAAATAT ATATATTGAT CTTCTTTTTG1321 TTGGACTTTT GTGTTTTATT ACTGCAGATG TATCGCACCG TGAAGAGCAC TGACAAGCCT1381 GCAGCCTCTT CAGGTGATTT TTTTTACCAT GGCAGCTACT AGTAGTAGTA GTAGTAGCTA1441 ATTTAGCTAA GCTCCATTTT GCTTTTCTTT TTTTTTGGCG TTGTGCATTG CGTTTTACAT1501 TACATTGTTG CTATGGTTTT TTTGACGTGT AGGGCCGGCG GACGGCGGCT CCGGCGACGA1561 GGAGTTCGCC GGCGGCGGGC AGGCGGCGTC GGGCGGCGGC GACAGCATGT GCCTGAGGGG1621 TGGCGGCGGC GGCGGGGTGG CCGCGGCGGC GTTCGCGGAG CACGGCCGGT CGGCGTCGGA1681 GGGCGCCGCC AGCTCGGTCG GCGGCGGCGG CGGCGGCGAC ATGGACCAGT CGTCGGCCGG1741 CAACACCAGC ACCACCAGGT GGAGCAACTC CTCAAGGTAC ACACATGGCA GAGTTGCATT1801 TCAAGTCTTT CAGATTAATT ATATATCTAC ATTGTTATGC CATCTTTAAT TAATTAAAAA1861 TGAAATTAAT CAATCAGAAT GTCATGAGAT GATGATGATG ATGATAATAA TACTAGGATA1921 GGAAGAGGAT GATATGATGG ATGGGTGTGC TATGTGTGTT TTTAAGTGTG TTTTAGCTTA1981 GAACCAAAGG CAACACCAAC AAACTTTGGC ATGCATTGAT GATGTATCTA AATATGAGTT2041 AGTGACATGC AAAATTAACC TGCCAAGTAC AACCTCTATT TATTAATTCC CAAAAAAATC2101 TCATGGAGGA GAAGGGAGAG AGAGAGATAG TAGTAATGTG TGGTGATGCA TGGCTAAAAA2161 AGCTTAGCAA AAGAATGTTT TGGGGGCACA CACACACACA CCTGGAGAGG GAGTTGCCTA2221 TGTTTAGGTG GCCAATGTTG TTATGTCACA CAAAAGACCA AAAAGTCACA CACCCCATGG2281 CTTGGCCTCC TCCTCCCCCC TTGACCTGTG CAGTTAGCTA GGCTTCTTCT CTTCTCTCCC2341 TCTGTGTTTG GTTTTTGTGG AGCTAAAAAC ATTTTAAAAA TCTTGCAAAC ATTGTGTGTA2401 AAAATAGGTT CTTGGGCTCT GCCCATTGTC CTCTAGCTTC TCTCAAATCT CTCTCTCTCT
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权利要求
1.一种水稻叶形控制基因SLL1编码的蛋白质，其特征在于该蛋白质具有Seq ID No2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的水稻叶形控制基因SLL1编码的蛋白质，其特征在于所述氨基酸序列还包括在Seq ID No2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
3.一种编码权利要求1或2所述蛋白质的基因，其特征在于该基因具有Seq ID No1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述核苷酸序列还包括在Seq ID No1所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。
5.一种含有权利要求3或4所述基因的质粒。
6.一种含有权利要求3或4所述基因的植物表达载体。
7.一种宿主细胞，其特征在于该宿主细胞含有权利要求3或4所述的基因序列。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。
9.一种培育植物叶片卷曲的方法，其特征在于包括用权利要求6所述的植物表达载体转化植物细胞，再将转化的植物细胞培育成植株。
10.根据权利要求9所述的培育方法，其特征在于所述转化采用农杆菌介导法或基因枪法。
全文摘要
本发明公开了一种水稻叶形控制基因SLL1编码的蛋白质，该蛋白质具有Seq ID No2所示的氨基酸序列。本发明还公开了编码该蛋白质的基因，该基因具有Seq ID No1所示的核苷酸序列。本发明还公开了含有上述基因的质粒、植物表达载体和宿主细胞。本发明还公开了培育植物叶片卷曲的方法用上述植物表达载体转化植物细胞，再将转化的植物细胞培育成植株。本发明的从水稻卷叶突变体中克隆的新基因SLL1，编码一个SHAQKYF类的MYB－DNA结合域的转录因子，主要通过调控远轴面维管组织分化中的程序化死亡来控制叶形的卷曲程度。
文档编号C12N1/21GK1923850SQ200610052840
公开日2007年3月7日 申请日期2006年8月9日 优先权日2006年8月9日
发明者钱前, 薛红卫, 张光恒, 胥倩, 朱旭东, 徐淑平, 曾大力, 郭龙彪, 胡江 申请人:中国水稻研究所