专利名称：高危型人乳头瘤病毒检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种高危型人乳头瘤病毒检测方法及试剂盒。
背景技术：
子宫颈癌是严重威胁妇女生命的恶性肿瘤，一旦发生，其存活和治愈率均非常低。科学研究证实，人乳头瘤病毒(HPV)是引发宫颈癌的必要条件，99.7％的宫颈癌病例中都发现有高危型HPV病毒的感染。由于引发宫颈癌病变的高危型HPV病毒为一类弱病毒，如能及时发现感染，及时调理治疗，病毒可被控制或清除，达到防治宫颈癌的目的。因此，控制宫颈癌的发生，重在预防，关键在早期筛查。我国人口众多，经济发展不均衡，特别是在广大农村开展HPV病毒感染的筛查，急需设备简单、操作简便、经济实用的检测技术。
HPV感染是一种通过性生活传播的传染病。HPV病毒有100多种亚型，在妇女生殖道中发现的有35种，能引起与宫颈癌的高危型HPV有13种16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，其中HPV 16和18型感染率最高。在捡出的所有型别中，HPV 16占50％，HPV 18占14％，HPV 45占8.4％，HPV 31占5.3％，HPV 33占2.8％。
人乳头状病毒(HPV)是微小的双链DNA病毒，病毒颗粒直径约60nm，无包膜，分子量为5000kD，包壳为由72个壳微粒组成对称偏斜的20面体，中间是含有7900bp的双链环状DNA。主要病毒壳蛋白基因位于L1片段。
HPV病毒感染鳞状上皮后，首先潜伏于基底细胞，其病毒DNA游离于宿主的细胞核内，但复制受到限制。随著基底细胞的分化成熟上移至表皮中浅层，解除了对病毒的抑制，于是发生了复制性感染。病毒在细胞内大量复制使细胞核增大，细胞变性引起线粒体肿胀、破坏或糖原溶解消失，形成空泡细胞，最终导致细胞死亡，形成宫颈糜烂溃疡。这种有病毒寄生、繁殖的上皮细胞并不发生恶变。HPV高危型病毒感染上皮后，其DNA则可能整合而使细胞基因发生突变，细胞异型性更为显著，不典型增生的程度加重，范围向表皮中浅层扩展，当累及表皮全层时便转变为原位癌，并可进一步发展为浸润癌。
依据高危病毒感染途径和其DNA可能与被感染细胞基因组整合而使细胞基因发生突变的特点，采用核酸检测技术检测病毒基因是检测HPV高危型病毒的唯一选择，而衡量检测方法的最关键指标是检测技术的灵敏度和特异度。
目前比较成熟的病毒检测技术是利用核酸探针直接与靶DNA进行分子杂交，然而在该方案中如果被检靶DNA信号较弱，则灵敏度和特异度均较低。PCR技术也被应用于病毒检测，但普通PCR技术由于只进行一次特异性选择放大，因此检测特异度不高，会出现较高比例假阳性；此外由于该技术过于灵敏，导致检测结果不十分稳定。
最近发展的利用信号捕捉技术来检测HPV病毒的技术，是将标记的HPVRNA探针与被检测样品中的靶DNA杂交，杂合体信号被抗杂合体抗体捕捉，再通过荧光或酶标系统进行放大，用发光测定仪测定发光信号，以信号强度来确定靶DNA的含量。该技术操作自动化程度比较高，但由于所有信号的放大是基于RNA探针与被检测样品中的靶DNA直接杂交，检测特异度和灵敏度受到限制。
由于高危型HPV病毒多达13种亚型，因此近年来发展起来的DNA芯片技术也被用于HPV病毒的检测。该技术的原理也是基于病毒探针与样品中的病毒靶基因进行杂交，然后标记荧光发光，然而如果靶信号不强，其检测的灵敏度和特异度不高。同时由于技术和条件的限制，高密度DNA芯片稳定性还得不到保证。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对上述现有PCR技术检测特异性低、假阳性结果以及低密度DNA芯片技术不稳定性以及其为直接引物杂交，靶信号弱、背景干扰强、分辨率低的缺陷，提供一种新的高危型人乳头瘤病毒检测方法及试剂盒。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是构造一种高危型人乳头瘤病毒检测方法，包括以下步骤(a)采用一步法巢式PCR技术对被检测样品的靶DNA进行二次特异性放大；(b)采用低密度DNA芯片技术将经两次特异选择放大的被检测样品靶DNA与HPV高危型病毒特异片段进行杂交选择分型。
在本发明所述的高危型人乳头瘤病毒检测方法中，在所述步骤(a)中，还包括设计合成特异引物NP1、NP2、NP3和NP4，增加被检样品中病毒靶DNA的单链DNA扩增的比例，使被检样品中病毒靶DNA信号得到有效的特异性放大，其中NP3和NP4为标记引物，包括荧光标记、生物素标记、地高辛标记中的一种或多种。
在本发明所述的高危型人乳头瘤病毒检测方法中，所述特异引物的序列分别为NP15’-aataaaccttattggttaca-3’，NP25’-actgttgttgatac-3’，NP35’-gtaaatcatattcctc-3’，NP45’-tgaaaaataaactgtaaatca-3’。
在本发明所述的高危型人乳头瘤病毒检测方法中，所述特异引物NP1与NP4的Tm值显著高于NP2与NP3的Tm值；且NP1、NP4，NP2、NP3均与多种高危型HPV病毒的特异序列具有高度同源性。
在本发明所述的高危型人乳头瘤病毒检测方法中，所述步骤(b)包括将高危型HPV病毒特异片段探针固定在低密度DNA芯片上，将经两次特异选择放大的被检测样品靶DNA特异片段反应物与与高危型HPV病毒特异片段探针进行特异杂交选择，检测样品荧光，若发光则为阳性；或者所述步骤(b)包括将经两次特异选择放大的被检测样品靶DNA特异片段反应物转移到低密度DNA芯片上，与高危型HPV病毒特异片段探针进行选择性特异结合，加相应酶反应底物后检测样品显色，若显色则为阳性。
在本发明所述的高危型人乳头瘤病毒检测方法中，所述高危型HPV病毒片段探针5’端用氨基和8-12个胸腺嘧啶T修饰和/或加手臂分子以减少杂交时的空间位阻，所述高危型HPV病毒片段探针基因序列为
HPV165’-CATATCTACTTCAGAAAC-3’或5’-GCCATATCTACTTCAGAAACTA-3’；HPV185’-TACACAGTCTCCTGTACC-3’或5’-TCTACACAGTCTCCTGTACCTG-3’；HPV585’-AGTAPPPACTAAGGAAGG-3’或5’-GAAGTAPPPACTAAGGAAGGTA-3’HPV315’-AATTGCAAACAGTGATAC-3’或5’-GCAATTGCAAACAGTGATAC-TA3’；HPV455’-TACACAAAATCCTGTGCC-3’或5’-TCTACACAAAATCCTGTGCCAA-3’；HPV515’-CACTGCTGCGGTTTCCCC-3’或5’-GCCACTGCTGCGGTTTCCCCAA-3’；HPV525’-GGTPPPTAAAAAGCAAAG-3’或5’-GAGGTPPPTAAAAAGCAAAGCA-3’；HPV335’-AAGTAACTAGTPPPGACA-3’或5’-ACAAGTAACTAGTPPPGACACT-3’；HPV355’-TGTGTCTTCTAGTGACAG-3’或5’-GCTGTGTCTTCTAGTGACAGTA-3’；HPV395’-TATAGAGTCTTCCATACC-3’或5’-TCTATAGAGTCTTCCATACCTT-3’；HPV565’-TACAGAACAGTPPPTAAG-3’或5’-GCTACAGAACAGTPPPTAAGTA-3’；HPV595’-TACTACTTCTTCTATTCC-3’或5’-TCTACTACTTCTTCTATTCCTA-3’；HPV685’-TACTGAATCAGCTGTACC-3’或5’-ACTACTGAATCAGCTGTACCAA-3。
本发明还提供一种高危型人乳头瘤病毒检测试剂盒，包括有将待检样品进行扩增的装置及试剂、低密度芯片、进行杂交的试剂和装置以及酶联和/或荧光检测的试剂和装置。
在本发明所述的高危型人乳头瘤病毒检测试剂盒中，所述将待检样品进行扩增的装置及试剂包括使用一步法巢式PCR技术对被检测样品病毒靶DNA进行两次特异性放大的装置和试剂、以及合成的特异引物NP1、NP2、NP3和NP4；所述低密度芯片监控系统包括由空白点、阳性内参照、阴性内参照组成；所述进行杂交的试剂和装置包括各种反应缓冲液、洗涤液、标记产物、高危型HPV病毒探针、高危型HPV病毒靶DNA检测标准品、DNA芯片固相载体基片、快捷杂交系统；所述酶联和/或荧光检测的试剂和装置包括荧光检测设备和/或酶联反应底物、各种反应缓冲液、洗涤液、显色液。
在本发明所述的高危型人乳头瘤病毒检测试剂盒中，所述高危型HPV病毒为多种病毒亚型包括HPV16、HPV18、HPV58、HPV31、HPV45、HPV51、HPV52、HPV33、HPV35、HPV39、HPV56、HPV59、HPV68。
本发明的高危型HPV病毒检测方法采用一步法巢式PCR技术，可同时扩增13种高危型病毒特异靶DNA片段，一次反应可检测出多种病毒亚型。此外，本发明将被检测样品的靶DNA信号通过两次特异选择性放大，大大提高了阳性样品的靶信号。
通过精密设计、大量实验，本发明针对普通PCR检测方法和DNA芯片检测技术应用于检测13种高危型HPV病毒存在的问题，大大的降低了背景信号的干扰，克服了普通PCR的不足；采用低密度DNA芯片技术，不但能将特异选择的多种高危型HPV病毒进行亚型鉴定，并可同时测定多个样品，为了提高杂交反应灵敏度，在第二次将靶DNA信号进行放大时，采用不平衡引物技术，调整NP2与NP3引物加量的比例，使第二次特异选择放大时，(标记的)特异性单链靶DNA片段分子数大幅度增加，大幅度提高其检测的灵敏度。采用荧光和酶联两种标记杂交显色技术来鉴定多种病毒亚型，可适应不同用户的需要，适应人群筛查和不同检测条件的需要，经济实用。
具体实施例方式
本发明为一种巢式PCR(Nest PCR)技术与低密度芯片技术相结合的高危型人乳头瘤病毒(HPV)检测方法，克服了普通PCR检测特异性低，假阳性结果多等不足及高密度DNA芯片技术检测结果不稳定性、背景干扰强等缺陷，具有高灵敏度、高特异度、稳定性好等优点。
本发明首先采用一步法巢式PCR技术对被检测样品的靶DNA进行二次特异性放大，同时采用不对称引物及其标记技术，增加被检样品中病毒靶DNA的单链DNA扩增的比例，使被检样品中病毒靶DNA信号得到有效的特异性放大。然后采用低密度DNA芯片技术，将经两次特异选择放大的被检测样品靶DNA与多种HPV高危型病毒特异片段进行杂交选择分型，既提高了灵敏度和特异度，又简便实用。
在本发明中，可选择特异设计的NP1、NP2、NP3和NP4引物与被检测样品靶DNA进行特异选择扩增(其中NP3和NP4为标记引物，可以为荧光或生物素标记)。特异引物NP1、NP2、NP3和NP4合成时，NP1与NP4的Tm值显著高于NP2与NP3的Tm值，NP1、NP4，NP2、NP3均与多种高危型HPV病毒的特异序列具有高度同源性。例如，特异引物NP1、NP2、NP3和NP4序列可分别为NP15’-aataaaccttattggttaca-3’；NP25’-actgttgttgatac-3’；NP35’-gtaaatcatattcctc-3’；NP45’-tgaaaaataaactgtaaatca-3’。
在本发明中，可将两对特异设计的引物同时加样，并通过设定反应条件，使两次特异选择在同一反应中完成。此外，还可通过调整NP2与NP3引物加量的比例，使选择特异性单链靶DNA片段分子数大幅度增加，并同时对该单链片段进行标记。
在使用低密度DNA芯片进行杂交选择分型时，可采用信号选择识别及放大系统(A)将高危型HPV病毒特异片段探针固定在杂交膜或微孔板上，将经两次特异选择放大的被检测样品靶DNA特异片段反应物与与高危型HPV病毒特异片段探针进行特异杂交选择。洗涤去除未结合的反应物后，检测样品荧光，发光为阳性，不发光为阴性。其中高危型HPV病毒特异片段探针5’端用氨基和8-12个胸腺嘧啶T修饰和/或加手臂分子以减少杂交时的空间位阻，所述高危型HPV病毒片段探针基因序列为HPV165’-CATATCTACTTCAGAAAC-3’或5’-GCCATATCTACTTCAGAAACTA-3’；HPV185’-TACACAGTCTCCTGTACC-3’或5’-TCTACACAGTCTCCTGTACCTG-3’；HPV585’-AGTAPPPACTAAGGAAGG-3’或5’-GAAGTAPPPACTAAGGAAGGTA-3’；HPV315’-AATTGCAAACAGTGATAC-3’或5’-GCAATTGCAAACAGTGATAC-TA3’；HPV455’-TACACAAAATCCTGTGCC-3’或5’-TCTACACAAAATCCTGTGCCAA-3’；HPV515’-CACTGCTGCGGTTTCCCC-3’或5’-GCCACTGCTGCGGTTTCCCCAA-3’；HPV525’-GGTPPPTAAAAAGCAAAG-3’或5’-GAGGTPPPTAAAAAGCAAAGCA-3’；
HPV335’-AAGTAACTAGTPPPGACA-3’或5’-ACAAGTAACTAGTPPPGACACT-3’；HPV355’-TGTGTCTTCTAGTGACAG-3’或5’-GCTGTGTCTTCTAGTGACAGTA-3’；HPV395’-TATAGAGTCTTCCATACC-3’或5’-TCTATAGAGTCTTCCATACCTT-3’；HPV565’-TACAGAACAGTPPPTAAG-3’或5’-GCTACAGAACAGTPPPTAAGTA-3’；HPV595’-TACTACTTCTTCTATTCC-3’或5’-TCTACTACTTCTTCTATTCCTA-3’；HPV685’-TACTGAATCAGCTGTACC-3’或5’-ACTACTGAATCAGCTGTACCAA-3。
低密度DNA芯片的固相载体基片可为杂交膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃片、硅片和凝胶中的一种。
此外，在使用低密度DNA芯片进行杂交选择分型时，还可采用信号选择识别及放大系统(B)将经两次特异选择放大的被检测样品靶DNA特异片段反应物转移到杂交膜上，与高危型HPV病毒特异片段探针进行选择性特异结合，洗涤去除未结合的反应物，加相应酶反应底物，检测样品显色。若显色则为阳性，而不显色则为阴性。
以下是上述HPV病毒检测方法实施例实施例一(一)芯片的制备选择玻片为芯片载体，用去离子水将高危型HPV病毒探针稀释，溶解在500mmol/L pH9.0的Na2CO3/NaHCO3溶液中制成终浓度为10nmol/L的样品，将样品加于点样板中，室温下固定48～72h，晾干备用。芯片监控系统由空白点、阳性内参照和阴性内参照组成。阳性的荧光信号平均值超过阴性点信号的三倍以上判定为阳性的标准。
(二)DNA制备采用DNA提取试剂盒进行，4℃保存。
(三)待检样品扩增1、取0.2mlEP管，在冰浴条件下依次加入无菌双蒸水16.5ul，10倍PCR反应缓冲液2.5ul，dNTP 0.5ul，特异引物NP1、NP2、NP3和NP4各1ul，待检HPV标准品1ul，Taq酶0.5ul，其中引物NP3、NP4为荧光标记引物。不加模板的扩增体系做阴性对照。
2、混匀后放入PCR仪进行扩增，扩增产物4℃保存。
(四)杂交1、取0.2ml EP管，依次加入杂交液10ul，荧光标记产物2ul，混匀，滴于芯片表面，盖上盖玻片。
2、置于湿杂交盒内，40-50℃下杂交1小时。
4、杂交后芯片用SSC、SDS溶液洗5分钟，再用无菌双蒸水冲洗干净。
5、室温干燥。
(五)扫描检测将杂交干燥后的芯片插入阵列扫描仪(例如GMS418 Array Scanner)扫描，以检测结果。其中扫描发光为阳性，否则为阴性。
本发明可检测出高危型HPV病毒的多种病毒亚型，具体包括HPV16、HPV18、HPV58、HPV31、HPV45、HPV51、HPV52、HPV33、HPV35、HPV39、HPV56、HPV59、HPV68等。
本发明的检测方法对应的试剂盒包括有将待检样品进行扩增的装置及试剂；低密度芯片以及进行杂交的试剂和装置。在使用荧光标记时，还包括对低密度芯片进行扫描的装置。
上述的将待检样品进行扩增的装置及试剂包括使用一步法巢式PCR技术对被检测样品病毒靶DNA进行两次特异性放大的装置和试剂。此外，上述的将待检样品进行扩增的试剂还包括特异引物NP1、NP2、NP3、NP4、反应缓冲液、Tap酶等。
所述低密度芯片监控系统包括由空白点、阳性内参照、阴性内参照组成。
而进行杂交的试剂和装置则包括杂交液、洗涤液、标记产物以及高危型HPV病毒探针、高危型HPV病毒靶DNA检测标准品、DNA芯片固相载体基片、快捷杂交系统等。
所述酶联和荧光检测的试剂和装置包括荧光检测设备、酶联反应底物、各种反应缓冲液、洗涤液、显色液。对低密度芯片进行扫描的装置可以为阵列扫描仪(例如GMS418 Array Scanner)。
应用本发明提供的高危型HPV病毒检测方法制备的新型高危型HPV病毒检测试剂盒采用组合式加样及快速、简便杂交系统，使经两次特异选择性放大的靶DNA信号快速与多种高危型HPV病毒探针进行杂交反应，使检测程序简便、快速。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式
，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
权利要求
1.一种高危型人乳头瘤病毒检测方法，其特征在于，包括以下步骤(a)采用一步法巢式PCR技术对被检测样品的靶DNA进行二次特异性放大；(b)采用低密度DNA芯片技术将经两次特异选择放大的被检测样品靶DNA与HPV高危型病毒特异片段探针进行杂交选择分型。
2.根据权利要求1所述的高危型人乳头瘤病毒检测方法，其特征在于，在所述步骤(a)中，还包括设计合成特异引物NP1、NP2、NP3和NP4，增加被检样品中病毒靶DNA的单链DNA扩增的比例，使被检样品中病毒靶DNA信号得到有效的特异性放大，其中NP3和NP4为标记引物，包括荧光标记、生物素标记、地高辛标记中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的高危型人乳头瘤病毒检测方法，其特征在于，所述特异引物的序列分别为NP15’-aataaaccttattggttaca-3’，NP25’-actgttgttgatac-3’，NP35’-gtaaatcatattcctc-3’，NP45’-tgaaaaataaactgtaaatca-3’。
4.根据权利要求2所述的高危型人乳头瘤病毒检测方法，其特征在于，所述特异引物NP1与NP4的Tm值显著高于NP2与NP3的Tm值；且NP1、NP4，NP2、NP3均与多种高危型HPV病毒的特异序列具有高度同源性。
5.根据权利要求1所述的高危型人乳头瘤病毒检测方法，其特征在于，所述步骤(b)包括将高危型HPV病毒特异片段探针固定在低密度DNA芯片上，将经两次特异选择放大的被检测样品靶DNA特异片段反应物与探针进行特异杂交选择，检测样品荧光，若发光则为阳性。
6.根据权利要求1所述的高危型人乳头瘤病毒检测方法，其特征在于，所述步骤(b)包括将经两次特异选择放大的被检测样品靶DNA特异片段反应物转移到低密度DNA芯片上，与高危型HPV病毒特异片段探针进行选择性特异结合，加相应酶反应底物后检测样品显色，若显色则为阳性。
7.根据权利要求5或6所述的高危型人乳头瘤病毒检测方法，其特征在于，所述高危型HPV病毒片段探针5’端用氨基和8-12个胸腺嘧啶T修饰和/或加手臂分子以减少杂交时的空间位阻，所述高危型HPV病毒片段探针基因序列为HPV165’-CATATCTACTTCAGAAAC-3’或 5’-GCCATATCTACTTCAGAAACTA-3’；HPV185’-TACACAGTCTCCTGTACC-3’或 5’-TCTACACAGTCTCCTGTACCTG-3’；HPV585’-AGTAPPPACTAAGGAAGG-3’或 5’-GAAGTAPPPACTAAGGAAGGTA-3’；HPV315’-AATTGCAAACAGTGATAC-3’或 5’-GCAATTGCAAACAGTGATAC-TA3’；HPV455’-TACACAAAATCCTGTGCC-3’或 5’-TCTACACAAAATCCTGTGCCAA-3’；HPV515’-CACTGCTGCGGTTTCCCC-3’或5’-GCCACTGCTGCGGTTTCCCCAA-3’；HPV525’-GGTPPPTAAAAAGCAAAG-3’或5’-GAGGTPPPTAAAAAGCAAAGCA-3’；HPV335’-AAGTAACTAGTPPPGACA-3’或5’-ACAAGTAACTAGTPPPGACACT-3’；HPV355’-TGTGTCTTCTAGTGACAG-3’或5’-GCTGTGTCTTCTAGTGACAGTA-3’；HPV395’-TATAGAGTCTTCCATACC-3’或5’-TCTATAGAGTCTTCCATACCTT-3’；HPV565’-TACAGAACAGTPPPTAAG-3’或5’-GCTACAGAACAGTPPPTAAGTA-3’；HPV595’-TACTACTTCTTCTATTCC-3’或5’-TCTACTACTTCTTCTATTCCTA-3’；HPV685’-TACTGAATCAGCTGTACC-3’或5’-ACTACTGAATCAGCTGTACCAA-3。
8.一种高危型人乳头瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，包括有将待检样品进行扩增的装置及试剂、低密度芯片、进行杂交的试剂和装置以及酶联和/或荧光检测的试剂和装置。
9.根据权利要求8所述的高危型人乳头瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，所述将待检样品进行扩增的装置及试剂包括使用一步法巢式PCR技术对被检测样品病毒靶DNA进行两次特异性放大的装置和试剂、以及合成的特异引物NP1、NP2、NP3和NP4；所述低密度芯片监控系统包括由空白点、阳性内参照、阴性内参照组成；所述进行杂交及结果检测的试剂和装置包括各种反应缓冲液、洗涤液、标记产物以及高危型HPV病毒探针、高危型HPV病毒靶DNA检测标准品、DNA芯片固相载体基片、快捷杂交系统；所述酶联和/或荧光检测的试剂和装置包括荧光检测设备和/或酶联反应底物、各种反应缓冲液、洗涤液、显色液。
10.一种高危型人乳头瘤病毒检测方法，其特征在于，所述高危型HPV病毒为多种病毒亚型包括HPV16、HPV18、HPV58、HPV31、HPV45、HPV51、HPV52、HPV33、HPV35、HPV39、HPV56、HPV59、HPV68。
全文摘要
本发明涉及一种高危型人乳头瘤病毒检测方法，包括以下步骤(a)设计合成合适的特异引物，采用一步法巢式PCR(Nest PCR)技术对被检测样品的靶DNA进行二次特异性放大；(b)结合低密度DNA芯片技术将经两次特异选择放大的被检测样品靶DNA与HPV高危型病毒特异片段进行杂交选择分型，采用荧光检测或直接显色信号识别。本发明还提供一种对应的试剂盒。本发明采用一步法巢式PCR技术与低密度芯片技术相结合，可同时扩增13种高危型病毒特异靶DNA片段，一次反应可检测出多种病毒亚型，具有快速高效、灵敏度特异度高、经济实用等优点，适用于高危型HPV病毒感染检测和人群HPV感染筛查使用。
文档编号C12Q1/68GK101082064SQ20061006104
公开日2007年12月5日 申请日期2006年6月2日 优先权日2006年6月2日
发明者张春发, 邓柳红 申请人:深圳市隆阳生物科技有限公司