一种提高水稻种子中赖氨酸含量的方法及其专用载体的制作方法

专利名称：一种提高水稻种子中赖氨酸含量的方法及其专用载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种提高植物赖氨酸含量的方法及其专用载体，特别是涉及一种提高水稻种子中赖氨酸含量的方法及其专用载体。
背景技术：
必需氨基酸，是指人体自身不能合成或合成速度不能满足人体需要，必须从食物中摄取的氨基酸。赖氨酸是八种必需氨基酸之一，被称为“第一必需氨基酸”，是蛋白质的重要组成部分。赖氨酸在生物机体的代谢中具有重要作用，赖氨酸缺乏会引起蛋白质功能障碍，影响生物的生长发育。赖氨酸具有旋光性，生物体只能利用左旋体(L型)赖氨酸。
中国人的饮食结构以谷物为主，摄入的蛋白质也主要来源于谷类。但植物性蛋白中的赖氨酸含量普遍偏低，如每百克大米中的赖氨酸含量仅相当于牛肉的1/5，大豆的1/10；食用精米中的蛋白质平均含量仅为6.3-7.1％，是谷类作物中最低的，其赖氨酸含量仅为总质量的0.22-0.28％，是列于第一位的限制性氨基酸(Juliano BO，Gu C.Rice and Human Nutrition.BeijingChina Agricultural University Press，1995.31-40)。因此，提高水稻种子中的赖氨酸含量，可以大大改善水稻的营养品质，从而带来巨大的经济效益和社会效益(王为民，赵倩等.水稻转高赖氨酸蛋白质基因(sb401)植株的获得及种子中蛋白质和氨基酸的含量分析.作物学报，2005.31(5)603-607)。
利用传统的水稻育种技术进行水稻的品种改良，虽可大幅提高水稻的产量，但其周期长，且难以解决诸如稻米中氨基酸营养组分不均衡和维生素A缺乏等问题。近年来，转基因技术的推广应用，大大缩短了作物品质改良的周期，而且通过导入多个优良性状基因，可使同一作物的多个性状得到改良。
高等植物的赖氨酸合成代谢途径和细菌、酵母相似，都是由天冬氨酸经过一些天冬氨酸家族的不同代谢途径合成的。植物中的赖氨酸分解代谢途径示意图如图1A所示(α-AASAα-氨基脂肪半醛(α-amino adipic semialdehyde)；AAT天冬氨酸转氨酶(Asp aminotransferase)；AS天冬氨酸合成酶(Asp synthase)；3-ASA3-天冬氨酸脂肪半醛(3-aspartic semialdehyde；)；ASN天冬酰胺酶(Asparaginase)；AK天冬氨酸激酶(Asp kinase)；CGS胱硫醚合酶(cystathionine γ-synthase)；GOGAT谷氨酸合成酶(Glu synthase)；HSD高丝氨酸脱氢酶(homoserinedehydrogenase))，在此合成途径中有两个受反馈抑制调节的关键酶，即天冬氨酸激酶(Asp kinase，AK)和二氢吡啶羧酸合酶，其中，天冬氨酸激酶受苏氨酸和赖氨酸反馈抑制，而且赖氨酸又是二氢吡啶羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase，DHPS)的反馈调节抑制因子(Zhu XH and Gad Galili.Increased Lysine Synthesis Coupledwith a Knockout of Its Catabolism Synergisticaily Boosts Lysine Content andAlso Transregulates the Metabolism of Other Amino Acids in Arabidopsis Seeds.Plant Cell，2003.15845-853)。遗传学和分子学方面的研究证明，赖氨酸在植物体内合成的主要限速步骤是赖氨酸对DHPS的反馈抑制，因此，在提高赖氨酸合成关键酶表达量的同时去除赖氨酸对DHPS的抑制，将有助于提高赖氨酸的含量。此外，细菌中的DHPS酶对反馈抑制不敏感，因此在植物中特异表达细菌的DHPS基因可以提高赖氨酸含量(Karchi，H.，Shaul，O.，and Galili，G.(1994).Lysine synthesisand catabolism are coordinately regulated during tobacco seed development.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，2577-2581；Falco，S.C.，Guida，T.，Locke，M.，Mauvais，J.，Sandres，C.，Ward，R.T.，and Webber，P.(1995).Transgenic canolaand soybean seeds with increased lysine.Bio/Technology 13，577-582)。
高等植物和细菌、酵母赖氨酸代谢途径的不同之处在于赖氨酸的分解代谢。在高等植物及动物中，赖氨酸-酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氢酶(Lys ketoglutaratereductase/saccharopine dehydrogenase，LKR/SDH)催化分解赖氨酸为α-氨基脂肪酸和谷氨酸。LKR和SDH连接成为一个双功能多肽，LKR首先将赖氨酸和α-酮戊二酸转化为酵母氨酸，SDH又将酵母氨酸转化为α-氨基半醛(α-aminoadipicsemi-aldehyde)和谷氨酸。α-氨基半醛在以后的代谢中又被转化为乙酰CoA和谷氨酸分子。然而在酵母、真菌和细菌中，LKR和SDH酶是两个不同的多肽(酵母中的赖氨酸分解代谢途径示意图如图1B所示)。植物中赖氨酸分解代谢途径的意义还不完全清楚，但是一些研究提供的间接证据表明这条途径对于种子发育过程中赖氨酸在体内平衡的调节起到了作用。尤其是在植物的种子中，赖氨酸含量提高的同时，也会增加赖氨酸分解关键酶LKR/SDH的活性，致使赖氨酸在种子中不能得到有效积累(Zhu XH，Tang GL.Fabienne Granier.A T-DNA Insertion Knockout of the BifunctionalLysine-Ketoglutarate Reductase/Saccharopine DehydrogenaseGene ElevatesLysine Levels in Arabidopsis Seeds.Plant Physiol.，2001.1261539-1545)。
研究人员已对植物种子中的赖氨酸代谢进行了一些相关研究。如在转基因烟草中组成型表达对赖氨酸反馈抑制不敏感的细菌DHPS基因，结果营养器官中游离赖氨酸的含量显著提高，但是种子中却没有提高(Shaul O，Galili G.Increased lysinesynthesis in transgenic tobacco plants expressing a bacterialdihydrodipicolinate synthase in their chloroplasts.Plant J，1992.2203-209；Shaul O，Galili G.Concerted regulation of lysine and threonine synthesis intobacco plants expressing bacterial feedback-insensitive aspartate kinase anddihydrodipicolinate synthase.Plant Mol Biol，1993.23759-768)，同时还发现在上述转基因植株的种子中，具有赖氨酸依赖性的LKR/SDH的活性也随之显著增强，表明在种子中存在诱导性的赖氨酸分解代谢途径，其可能的作用是在种子发育过程避免过多的赖氨酸积累(Zhu XH，Tang GL，Fabienne Granier.A T-DNA InsertionKnockout of the Bifunctional Lysine-Ketoglutarate Reductase/SaccharopineDehydrogenaseGene Elevates Lysine Levels in Arabidopsis Seeds.PlantPhysiol.，2001.1261539-1545)。但是，同转基因烟草相比，在转基因大豆、玉米和油菜种子的发育和发芽过程中，游离的赖氨酸没有受到分解代谢较大影响而得到积累，而且，赖氨酸的分解产物也有过量积累(Falco SC，Guida T，Locke M，MauvaisJ，Sandres C，Ward RT，Webber P Transgenic canola and soybean seeds withincreased lysine.Biotechnol.1995.13577-582；Mazur B，Krebbers E，TingeyS.Gene discovery and product development for grain quality traits.Science，1999.285372-375)。另外，敲除LKR基因的拟南芥突变体的生长不受影响，而且赖氨酸也可得到一定程度的积累，表明赖氨酸分解代谢对于植物的正常生长和种子发育不是必须的，只是一系列调控网络中的一个，而不是一个特定的阻止赖氨酸提高而造成潜在毒性的调节方式(Zhu XH，Tang GL，Fabienne Granier.A T-DNA InsertionKnockout of the Bifunctional Lysine-Ketoglutarate Reductase/SaccharopineDehydrogenaseGene Elevates Lysine Levels in Arabidopsis Seeds.PlantPhysiol.，2001.1261539-1545)。
由于稻米的蛋白质含量主要受遗传基因控制，因此利用基因工程将自然界植物体内分子量较小、而且富含赖氨酸的蛋白质基因导入水稻，是一条提高稻米赖氨酸含量的途径(王为民，赵倩等.水稻转高赖氨酸蛋白质基因(sb401)植株的获得及种子中蛋白质和氨基酸的含量分析.作物学报，2005.31(5)603-607)。这种方法在水稻和玉米中已有成功运用的先例，如1993年，刘博林从云南四棱豆(Psophocarpustetragonolobus)种子中筛选出高赖氨酸植物品种，从中纯化出一种赖氨酸含量为11％的蛋白质，且富含苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸等必需氨基酸，并获得了此编码高赖氨酸蛋白质的cDNA克隆及其序列(Liu BL，Jing YX，Kuang TY.Screening oflysine-rich plant species and identification of the purified proteins.ActaBot Sin，1993.35(1)22-25)。1995年，Zheng等将菜豆种子蛋白质基因导入水稻中表达，使得转基因水稻种子总蛋白含量增加4％，赖氨酸含量也有所提高(ZhengZ，Kazuhiko S，Kunisuke T.The bean seed storage protein β-phaseolin issynthesized，processed and accumulated in the vacuolartype-II protein bodiesof transgenic rice endosperm.Plant Physiol，1995.109777-786)。1996年，Moom等在体外对谷蛋白基因进行修饰，插入合成甲硫氨酸、赖氨酸的序列，将修饰过的基因导入水稻后，也可以提高赖氨酸的含量(Moon E，Wu R.Genetic modification of arice glutelin cDNA and expression of the engi-neered glutelin gene intransgenic rice plant.InKhush GS eds.Rice Genetics IIIProc 3rdIntern RiceGenet Symp.IRRI，Philippines，1994.814-816)。1999年，张秀君将马铃薯花粉特异水溶性蛋白的cDNA导入玉米，获得了赖氨酸含量提高10％以上的转基因玉米(ZhangXJ，Liu JQ，Zhao Q，Yu JJ，Ao GM.Transfer of high lysine-rich gene into maizeby microprojecile bombardment and detection of transgenic plants.J AgricBiotech，1999.7(4)363-367)。2005年，王逸群等分别将从四棱豆中克隆出来的富含赖氨酸蛋白的基因导入烟草和谷秆两用水稻中，分别获得了蛋白质品质得到改良的烟草和水稻(王逸群，郑金贵等.农杆菌介导将高赖氨酸蛋白基因导入谷秆两用水稻.Chin J Appl Environ Biol，2005，11(3)276-278；王逸群，郑金贵等.转基因烟草中赖氨酸含量的提高.Chin J Appl Environ Biol，2005.11(1)32-35)。上述提高植物赖氨酸含量的方法的局限性是不能得到游离的赖氨酸，而游离的氨基酸易于被人体吸收。

发明内容
本发明的目的是提供一种用于提高水稻种子中赖氨酸含量的专用载体。
本发明所提供的专用载体，是含有水稻种子特异启动子，细菌二氢吡啶羧酸合酶基因(DHPS)和水稻赖氨酸-酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氢酶基因(OsLKR/SDH)干扰RNA编码序列的植物表达载体；所述二氢吡啶羧酸合酶基因位于水稻种子特异启动子下游，水稻赖氨酸-酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氢酶基因干扰RNA编码序列位于组成型表达启动子下游。
上述载体中的水稻种子特异启动子可为水稻胚乳特异性启动子GluA-3；组成型表达启动子的选择是多种多样的，如CaMV35S启动子、Actin启动子或Ubiquitin等。
细菌二氢吡啶羧酸合酶基因可为大肠杆菌的二氢吡啶羧酸合酶基因。
水稻赖氨酸-酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氢酶基因干扰RNA编码序列的正义链(不做模板的DNA链)可具有序列表中序列1的核苷酸序列。
序列表中序列1由300个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。
用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pHOS(购于Invitrogen公司，原名为GatewayTWvector pH2GW7载体，此处简称为pHOS)、pHDR1(植物RNAi表达载体，购于Invitrogen公司，原名为GatewayTWvector pH7GW1WG2(I)载体，此处简称为pHDR1)、pCAMBIA系列载体(购于CAMBIA公司)或其它衍生植物表达载体。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
以pHOS为出发载体，构建的植物表达载体为cDHPS-pHOS和RiLKR×sDHPS-pHOS。
以pHDR1为出发载体，构建的植物表达载体为RiLKR-pHDR1。
本发明的第二个目的是提供一种提高水稻种子中赖氨酸含量的方法。
本发明所提供的方法，是将上述专用载体导入水稻组织或细胞，得到种子中游离赖氨酸含量得到提高的转基因植株。
本发明的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。
本发明提供了一种提高水稻种子中赖氨酸含量的方法及其专用载体。该方法从水稻的赖氨酸代谢途径出发，采用如下技术路线(见图11)在水稻种子中特异性表达对赖氨酸反馈抑制不敏感的细菌DHPS基因，同时干扰抑制水稻赖氨酸分解关键酶OsLKR/SDH。转基因实验表明，将DHPS在种子中过量表达且OsLKR/SDH获得干扰的转基因株系中，叶片中的游离赖氨酸含量和野生型相比并没有明显提高，而种子中的游离赖氨酸含量提高了18倍；此外，转入的外源基因对水稻的生长发育没有任何影响。基于上述优点，本发明的方法及其专用载体将在水稻种子赖氨酸含量的提高中发挥巨大作用，并为水稻及其它植物的品种改良提供了一条新的途径。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。


图1A为植物中的赖氨酸分解代谢途径示意1B为酵母中的赖氨酸分解代谢途径示意2为用于提高水稻种子中赖氨酸含量的专用载体RiLKR×sDHPS-pHOS的构建示意3为载体cDHPS-pHOS，RiLKR-pHDR1及RiLKR×sDHPS-pHOS的结构示意4为水稻中的KLR/SDH同源基因在野生型水稻组织中表达特异性的RT-PCR半定量检测结果图5为cDHPS T0代转基因水稻及野生型水稻叶片中的游离赖氨酸含量测定结果图6为RiLKR/sDHPS T1代转基因水稻及野生型水稻叶片中游离赖氨酸平均含量比较的直观7为cDHPS T1代转基因水稻及野生型水稻种子中游离赖氨酸平均含量比较的直观8为野生型水稻和RiLKR/sDHPS转基因水稻T1代种子中游离赖氨酸含量的HPLC检测峰9为RiLKR/sDHPS T1代转基因水稻及野生型水稻种子中游离赖氨酸平均含量比较的直观10为野生型和三种转基因水稻T1代种子外观的比较结果图11为提高水稻种子中赖氨酸含量的技术路线简图具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物及探针均由英俊和赛百盛合成。
试剂及仪器一般生化试剂购于北京化学试剂公司；反转录试剂盒和胶回收试剂盒为上海申能博彩生物科技有限公司产品；质粒小量提取试剂盒购于TIANGEN BIOTECH公司；限制性内切酶购于TAKARA公司。层析仪型号为BioLogic DuoFlow Chromatography System，购自BioRad公司。C18反向柱采用Develosil Packed Column(φ4.6×250mm)，购自Develosil公司。
实施例1、用于提高水稻种子中赖氨酸含量的专用植物转化载体的构建现参照图2，构建用于提高水稻种子中赖氨酸含量的专用植物转化载体，具体过程包括以下步骤一、构建赖氨酸合成关键酶基因-二氢吡啶羧酸合酶基因DHPS的植物转化载体根据大肠杆菌二氢吡啶羧酸合酶基因DHPS的cDNA序列(GenBank号为M12844序列表中的序列2)设计一对引物，引物序列如下P1(上游引物)5’-CACCCCAGGCGACTGTCTTCAATATTAC-3P2(下游引物)5’-GGCGCGACTTTTGAACAGAGTA-3’
提取大肠杆菌DH5α的基因组DNA并以此为模板，在引物P1和P2的引导下，PCR扩增DHPS基因的cDNA序列，反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增获得了长度约900bp的目的片段，与预期结果相符。回收并纯化该目的片段，将其克隆到中间载体pENTR/D-TOPO(Invitrogen公司)中，克隆体系和反应条件为PCR产物2.3ul、pENTR/D-TOPO 0.25ul、Salt solution 0.45ul，室温5min，冰浴5min。反应结束后，将反应产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析，获得含有正确序列的二氢吡啶羧酸合酶基因DHPS的载体，命名为pDHPS-TOPO。再通过LR交换反应将DHPS基因转入植物表达载体pHOS(来源于Invitrogen公司的GatewayTWvector pH2GW7载体，此处简称为pHOS)，LR交换反应的反应体系及反应条件为LR buffer 2ul、pDHPS-TOPO 1ul(100-300ng)、pHOS 1ul(150～300ng)、LR Clonase Enzyme mix 1ul、ddH2O 5ul，25℃反应1-3小时。将交换产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆并抽提质粒，进行测序，测序结果表明得到了插入序列正确的二氢吡啶羧酸合酶基因DHPS的植物转化载体，命名为cDHPS-pHOS，其结构示意图见图3中的图A，该载体含有烟草花叶病毒35S组成型表达启动子(CaMV35S)启动子。
二、构建赖氨酸分解关键酶基因-赖氨酸-酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氢酶基因LKR/SDH的抑制表达载体在水稻基因数据库中搜寻拟南芥LKR的同源序列(GenBank号为NM 119469)，然后通过与拟南芥、大豆和牵牛花的LKR/SDH的序列比对找到它们之间的同源保守区，即LKR/SDH的保守区，具有序列表中序列1的核苷酸序列。提取水稻品种中花11号的总RNA，反转录合成其cDNA并以此为模板，在引物P3(5’-CACCGGGAAAAGATTGCTTGCATT-3’)和P4(5’-AACAAAGCTATGGGGCAGTAAC-3’)的引导下，PCR扩增LKR/SDH保守区的cDNA序列，反应结束后，对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增获得了长度约300bp的目的片段，与预期结果相符。回收并纯化该目的片段，将其克隆到中间载体pENTR/D-TOPO中，进行测序，测序结果表明得到了插入序列正确的LKR/SDH的TOPO中间载体，命名为pLKR/SDH-TOPO，再通过与步骤一相同的LR交换反应分别转入植物RNAi表达载体pHDR1(购于Invitrogen公司，原名为GatewayTWvector pH7GW1WG2(I)载体，此处简称为pHDR1)中的两个互为反向的attR1/attR2和attR2/attR1位点之间，将交换产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆并抽提质粒，进行测序，测序结果表明得到了插入序列正确的LKR/SDH的抑制表达载体，命名为RiLKR-pHDR1，其结构示意图见图3中的图B。pHDR1表达载体的启动子后面是两个互为反向的克隆重组位点，中间间隔一段内含子序列。通过LR交换反应将水稻LKR/SDH的保守序列同时克隆到此载体的两个重组位点，所转录出的RNA会形成茎环结构，从而对水稻中LKR/SDH的表达产生干扰，使LKR/SDH得到抑制。
三、用于提高水稻种子中赖氨酸含量的专用植物转化载体的获得用限制性内切酶Sac I和Spe I对步骤一构建的载体cDHPS-pHOS进行双酶切，将载体中的CaMV35S切除，连入5’端添加有限制性内切酶Apa I识别位点的水稻胚乳特异性启动子GluA-3(Toshihiro Yoshihara a，b，Haruhiko Washida a，c，Fumio Takaiwa.A 45-bp proximal region containing AACA and GCN4 motif is sufficient to conferendosperm-specific expression of the rice storage protein glutelin gene，GluA-3.Yoshihara et al./FEBS Letters，1996.383213-218)，得到载体sDHPS-pHOS。然后用限制性内切酶Sac I和Apa I分别对连接有GluA-3的载体sDHPS-pHOS和步骤二构建的LKR/SDH抑制表达载体RiLKR-pHDR1进行双酶切，将两种双酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收约3100bp的RiLKR-pHDR1表达区片段，将其与经相同酶双酶切的具有GluA-3启动子的sDHPS-pHOS载体片段连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆并抽提质粒，进行测序，测序结果表明得到了插入序列正确的用于提高水稻种子中赖氨酸含量的专用植物转化载体，命名为RiLKR×sDHPS-pHOS，其结构示意图见图3中的图C(P-osLKR/SDH(Re)LKR/SDH基因保守区反向序列(Part of osLKR/SDH reverse sequence)；p-osKLRLKR/SDH基因保守区序列(part of osLKR/SDH sequence)；T35S，35S终止子(35s terminator)；attRLR重组交换反应臂；DHPS二氢吡啶羧酸合酶基因(dihydrodipicolinatesynthase gene)；HygHygromysin gene)。
实施例2、转基因水稻的获得及检测一、检测水稻LKR/SDH在水稻组织中的表达情况据报道，多数植物的LKR/SDH在种子中特异性表达，而且其表达是受赖氨酸含量的提高而激活的，从而使植物种子中的赖氨酸含量达到一种平衡。为验证实施例1获得的LKR/SDH的水稻同源基因(命名为OsLKR/SDH)的表达特性，现分别提取野生型水稻幼胚、种子、愈伤、根、花和叶片的总RNA，以反转录获得的cDNA为模板，在引物P3和P4的引导下进行半定量RT-PCR检测，以Actin为参照，检测结果如图4所示，该基因在野生型水稻的种子和愈伤组织中有较高的表达量，在叶片和花中有少量表达，而在根和胚中微量表达。
二、转基因水稻的获得将实施例1中构建的三种载体cDHPS-pHOS、RiLKR-pHDR1和RiLKR×sDHPS-pHOS分别转化农杆菌AGLO，筛选阳性重组子，然后将分别转化有上述三种外源质粒的农杆菌培养液与水稻中花11的愈伤组织共培养，经过筛选、分化(具体方法参见文献Tian WZ，Iann R，Elunialai S，Claude F，Roger NB.Improvement of plan tregeneration frequency vitro in indica rice.Acta Genet Sin，1994.21(3)215-221；JQ，Wei ZM，An HL，Xu SP，Zhang B.High efficiency ofgenetictransformation of rice using.Agrobncterium mediated procedure.ActaBot Sin，2000.42(11)1172-1178)，得到转基因水稻幼苗，将cDHPS-pHOS转基因植株命名为cDHPS(constitutive expressing DHPS plant)，RiLKR-pHDR转基因植株命名为RiLKR(RNA interfere expressing of LKR/SDH plant)，RiLKR×sDHPS-pHOS转基因植株命名为RiLKR/sDHPS(RNA interfere expressing of LKR/SDH andseed-specific expressing DHPS plant)。经温室土壤栽培约30-40天后，送至海南863基地培养，收获转基因水稻种子。
三、转基因水稻的游离赖氨酸含量检测1、转基因水稻叶片中的游离赖氨酸含量检测1)cDHPS转基因水稻TO代植株叶片中的游离赖氨酸含量检测参照《生物化学实验操作指南》，用茚三酮测定法检测cDHPS转基因水稻TO代植株叶片中的游离赖氨酸含量。先随机抽取分属于10个转基因阳性株系的植株和2个野生型植株(对照，wt)，每个植株取2份样品进行检测，其中游离赖氨酸的提取方法包括以下步骤a)脱脂将材料研磨成粉后，加入60-90℃的石油醚浸泡8小时，浸泡过程中不断搅动，然后用石油醚淋洗沉淀3次，干燥粉末；b)取脱脂后的叶片粉末0.05g，加入无水乙醇500μl，超声提取半小时；c)8000g离心5分钟，收集上清，将残渣用500μl无水乙醇再提取一次；d)合并两次提取上清，用旋转蒸发干燥仪(或60℃水浴)蒸干；e)蒸干产物用200μ1的0.1M pH10.4的硼酸盐缓冲液溶解。将相同株系的游离赖氨酸含量测定结果取平均值，结果如表1所示，然后对各株系叶片中的游离赖氨酸含量进行比较，比较结果如图5所示，上述结果表明cDHPS转基因植株叶片中的游离赖氨酸含量相对于野生型植株明显提高，含量最高可达野生型的2倍，平均提高幅度为44.59％。
表1 cDHPS TO代不同转基因植株叶片中的游离赖氨酸含量


2)RiLKR转基因水稻TO代植株叶片中的游离赖氨酸含量检测现用与步骤1)中相同的方法检测RiLKR转基因水稻TO代植株叶片中的游离赖氨酸含量，结果游离赖氨酸含量没有明显提高，原因是水稻叶片中LKR/SDH的表达量很低，因此，在RiLKR转基因水稻叶片中对赖氨酸表达的抑制作用不明显，与预期结果相符。
3)RiLKR/sDHPS转基因水稻T1代植株叶片中的游离赖氨酸含量检测为使实验数据更加准确，现采用精度更高的高压液相层析仪(HPLC)对RiLKR/sDHPS转基因水稻T1代植株叶片中的游离赖氨酸含量进行检测，以野生型植株为对照(wt)，采取OPA柱前衍生的HPLC方法(牟德海.OPA柱前衍生反相高效液相色谱法测定氨基酸含量.色谱，1997.15(4)319-321)，参数如下流动相(A)10mmol Na2HPO4-NaH2PO4pH7.2(PB)，含0.3％THF(四氢呋喃)；(B)PB-甲醇-乙腈(50∶35∶15)。梯度在40min内，B液的含量逐渐从0上升到100％。流速1mL/min；柱温40℃监测波长340nm。检测结果如图6所示，与野生型植株相比，RiLKR/sDHPS转基因水稻叶片中的游离赖氨酸含量仍未见明显提高，原因是在RiLKR/sDHPS转基因水稻中，DHPS的表达是受种子特异性启动子GluA-3启动的，该基因在叶片中没有表达，因此游离赖氨酸含量没有提高，与预期结果相符。
2、转基因水稻种子中的游离赖氨酸含量检测1)cDHPS转基因水稻T1代种子中的游离赖氨酸含量检测现用与步骤1中相同的茚三酮法测定cDHPS转基因T0代水稻的种子(称为T1代种子)的游离赖氨酸含量。由于T1代种子中转入的外源基因呈1∶2∶1比例分离，理论上有3/4的种子含有外源基因。为更准确地表示选取样品中的转基因种子的比例，随机选取50粒T1代种子发芽培养，然后在检测hygromycin引物P5(5’-TTCCTTTGCCCTCGGACG-3’和P6(5’-ACTCACCGCGACGTCTGT-3’)的引导下，对这些水稻苗中的外源基因进行PCR检测，可扩增出1000bp条带的为转基因阳性植株，计算转基因阳性种子在全部种子中所占的比例，结果转基因种子的阳性率为0.82；另外随机选取同一株系的50粒种子，用与步骤1中相同的茚三酮法测定游离赖氨酸含量，结果取平均值，然后将所得的平均值除以转基因种子阳性率，获得的校正值可代表50粒T1代转基因阳性种子的游离赖氨酸含量，同时用同样的方法测定50粒野生型水稻种子的游离赖氨酸含量(wt)，结果如表2所示，测定结果的直观图见图7，同野生型相比，cDHPS转基因水稻的游离赖氨酸含量平均提高了60％。
表2 cDHPS转基因水稻T1代种子的游离赖氨酸含量

2)RiLKR/sDHPS转基因水稻T1代植株种子中的游离赖氨酸含量检测从10个RiLKR/sDHPS转基因株系和2个野生型植株中分别随机选取50粒种子测定阳性率，并用与步骤1相同的液相色谱法测定游离赖氨酸含量，同时测定转基因水稻种子的千粒重。游离赖氨酸含量的色谱图如图8所示(A图为野生型种子的游离赖氨酸含量，B图为RiLKR/sDHPS转基因种子的游离赖氨酸含量，C为A图和B图的叠加)，具体数据见表3，游离赖氨酸平均含量比较的直观图见图9，RiLKR/sDHPS转基因水稻10个株系的游离赖氨酸平均含量为19.47μg/g，是野生型游离赖氨酸平均含量的9.14倍，最高可达野生型游离赖氨酸含量的18倍。RiLKR/sDHPS转基因水稻T1代种子的千粒重统计结果见表3，同野生型植株相比，整体上有所下降，而且游离赖氨酸含量越高，千粒重越低，但种子的饱满度和大小并无明显变化(野生型和上述三种转基因水稻T1代种子外观的比较见图10)，原因可能是在转基因种子成熟过程中，淀粉的含量降低而蛋白质的含量相对增高，使得种子的比重略有降低，从而导致千粒重下降。
表3 RiLKR/sDHPS转基因T1代种子游离赖氨酸含量及千粒重


序列表<160>2<210>1<211>300<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<400>1gggaaaagat tgcttgcatt tgggaaattt gctgggagag ctggactgat agacttctta60cacggtctcg gacaacggta cttgagcctt ggatactcga ccccatttct ctctctaggg120caatcacata tgtatccttc actcgctgca gccaaggctg cagtcattgc cattggtgaa180gagatagcaa catttggact tccatctgga atttgcccaa tagtatttgt attcactgga240actggaaatg tttctcaggg tgcgcaagag atattcaagt tactgcccca tagctttgtt300<210>2<211>879<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>2atgttcacgg gaagtattgt cgcgattgtt actccgatgg atgaaaaagg taatgtctgt60cgggctagct tgaaaaaact gattgattat catgtcgcca gcggtacttc ggcgatcgtt120tctgttggca ccactggcga gtccgctacc ttaaatcatg acgaacatgc tgatgtggtg180atgatgacgc tggatctggc tgatgggcgc attccggtaa ttgccgggac cggcgctaac240gctactgcgg aagccattag cctgacgcag cgcttcaatg acagtggtat cgtcggctgc300ctgacggtaa ccccttacta caatcgtccg tcgcaagaag gtttgtatca gcatttcaaa360gccatcgctg agcatactga cctgccgcaa attctgtata atgtgccgtc ccgtactggc420tgcgatctgc tcccggaaac ggtgggccgt ctggcgaaag taaaaaatat tatcggaatc480aaagaggcaa cagggaactt aacgcgtgta aaccagatca aagagctggt ttcagatgat540tttgttctgc tgagcggcga tgatgcgagc gcgctggact tcatgcaatt gggcggtcat600
ggggttattt ccgttacggc taacgtcgca gcgcgtgata tggcccagat gtgcaaactg660gcagcagaag ggcattttgc cgaggcacgc gttattaatc agcgtctgat gccattacac720aacaaactat ttgtcgaacc caatccaatc ccggtgaaat gggcatgtaa ggaactgggt780cttgtggcga ccgatacgct gcgcctgcca atgacaccaa tcaccgacag tggtcgtgag840acggtcagag cggcgcttaa gcatgccggt ttgctgtaa 879
权利要求
1.用于提高水稻种子中赖氨酸含量的载体，是含有水稻种子特异启动子，细菌二氢吡啶羧酸合酶基因和水稻赖氨酸-酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氢酶基因干扰RNA编码序列的植物表达载体；所述二氢吡啶羧酸合酶基因位于水稻种子特异启动子下游，所述水稻赖氨酸-酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氢酶基因干扰RNA编码序列位于组成型表达启动子下游。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于所述水稻种子特异启动子为水稻胚乳特异性启动子GluA-3。
3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于所述细菌二氢吡啶羧酸合酶基因为大肠杆菌的二氢吡啶羧酸合酶基因。
4.根据权利要求1所述的载体，其特征在于所述水稻赖氨酸-酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氢酶基因干扰RNA编码序列的正义链具有序列表中序列1的核苷酸序列。
5.根据权利要求1-4任一所述的载体，其特征在于用于构建所述植物表达载体的出发载体为pHOS、pHDR1、pCAMBIA系列载体或pBI121。
6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于所述出发载体为pHOS。
7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于所述植物表达载体为RiLKR×sDHPS-pHOS。
8.一种提高水稻种子中赖氨酸含量的方法，是将权利要求1所述的载体导入水稻组织或细胞，得到种子中游离赖氨酸含量得到提高的转基因植株。
全文摘要
本发明公开了一种提高水稻种子中赖氨酸含量的方法及其专用载体。该专用载体是含有水稻种子特异启动子，细菌二氢吡啶羧酸合酶基因和水稻赖氨酸－酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氢酶基因干扰RNA编码序列的植物表达载体；所述二氢吡啶羧酸合酶基因位于水稻种子特异启动子下游，所述水稻赖氨酸－酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氢酶基因干扰RNA编码序列位于组成型启动子下游。用本发明方法获得的转基因水稻株系中，种子中的游离赖氨酸含量和野生型相比提高了18倍；此外，转入的外源基因对水稻的生长发育没有任何影响。本发明的方法及其专用载体将在水稻种子赖氨酸含量的提高中发挥巨大作用，并为水稻及其它植物的品种改良提供了一条新的途径。
文档编号C12N15/53GK1834252SQ200610066719
公开日2006年9月20日 申请日期2006年4月5日 优先权日2006年4月5日
发明者王喜萍, 于鲲, 陈丽娜, 谢莹, 夏勉, 邓兴旺 申请人:北京未名凯拓农业生物技术有限公司