专利名称：一种具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及应用于肿瘤治疗的一种具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，属生命科学、生物医学领域。
背景技术：
恶性肿瘤是以细胞异常增殖及转移为特点的一大类疾病。2000年全球新发肿瘤病例约1000万，死亡620万，现患病例2200万。我国肿瘤发病及死亡率一直呈上升趋势，2000年肿瘤发病人数约180-200万，死亡140-150万，在城镇居民中，肿瘤已占死因的首位。然而随着社会经济的发展，肿瘤的主要危险因素并未得到有效控制。目前对恶性肿瘤的治疗仍以常规的手术、放疗、化疗为主，这种常规治疗对绝大多数肿瘤来说，难以收到预期的疗效。特别是对于化疗药物而言，其治疗指数低，毒副作用大。近几年，分子生物学有了突飞猛进的发展，基因治疗日益成为继放疗、化疗、手术治疗之后综合治疗中不可或缺的一部分。根据2004年12月的统计，全世界共1020个基因治疗方案进入临床，主要集中在美国，其次是欧洲，63.4％用于癌症的治疗。癌症的基因治疗目前主要是用复制缺陷型载体转运抗癌基因，以复制缺陷型腺病毒携带p53基因的临床进展最为迅速，全球至少有5个进入III期临床试验，其中我国的重组腺病毒p53注射液“Ad-p53”已于2004年上市，成为世界上第一个上市的癌症基因治疗药物。
腺病毒是目前肿瘤基因治疗的最常见病毒载体，已广泛地应用于人体基因治疗方案中，具有以下优点基因组完全清楚，易于操作；能感染的人类细胞广泛，可高效地转导不同类型的人组织细胞，包括静止期细胞；病毒滴度较高，在细胞培养物中有高滴度的重组病毒产量；基因组大，因而可插入大片段外源基因；进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，因而安全性较高，无致癌性。腺病毒载体多采用缺少E1区的复制缺陷型腺病毒，可在表达E1基因的工程细胞中生长传代，目前使用的大部分腺病毒基因载体多为去除部分E1a、E1b和E3的病毒基因组并整合外源基因而成。虽然复制缺陷型腺病毒在体内外显示了一定的安全性，然而至今在临床试验中应用的大多数此类腺病毒载体尚存在许多缺点，如表达外源基因的时间短、免疫原性较强、高滴度时有明显的细胞毒性等，因此临床疗效不佳。目前，溶瘤腺病毒治疗肿瘤发展迅速，这种溶瘤腺病毒治疗一般不引起严重的毒副作用，无限毒剂量。国内外进展较快的溶瘤腺病毒项目包括美国Geron公司和Introgen公司的多个临床前项目，美国ONYX公司的ONYX-015项目(E1B-55kDa缺失的腺病毒)；国内上海三维公司的H101项目(类似于ONYX-015，已经完成III期临床，2005年底被批准上市)。越来越多的数据证明，溶瘤腺病毒有希望成为新一代的肿瘤治疗药物。
人类实体肿瘤具有无限增殖的特性，这就需要细胞端粒来维持染色体的稳定性。端粒是真核细胞保护染色体末端的结构，正常细胞分裂一次，端粒就会丧失50～200个核苷酸，最终引起细胞死亡。细胞发生恶变时，端粒酶激活，补充由于细胞分裂所造成的端粒的丢失，维持染色体的稳定，使细胞逃逸死亡而获得永生，最终导致肿瘤细胞增殖失控。研究表明，人类肿瘤90％以上具有很高的端粒酶活性，而正常体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶活性是阴性的。因此，以端粒酶作为靶点进行肿瘤基因治疗可能具有广阔的前景。其次，表皮生长因子受体家族(EGFRs，包括EGFR、Her-2、Her-3、Her-4)是一类糖蛋白受体，定位于细胞膜上，属于I型跨膜酪氨酸激酶生长因子受体，包括膜外区、跨膜区、膜内区三个部分。当配体与受体的膜外部分结合后，受体胞内部分的酪氨酸残基磷酸化，形成酪氨酸底物结合位点，使EGFRs激活，再通过Ras、Raf、MAPK等核转录因子参与的一系列信号转导通路，将细胞信号由细胞表面转至细胞核内，介导DNA合成及细胞增殖效应。EGFRs过度表达与多种肿瘤的发生、发展及预后有密切关系，已发现包括非小细胞肺癌、直结肠癌、乳腺癌、肾癌和前列腺癌等在内的多数肿瘤细胞可高表达EGFRs，EGFRs高表达的肿瘤患者易发生转移，复发时间短，复发率高，存活期短。由于EGFRs的酪氨酸激酶是信号转导的必要条件，因而成为肿瘤治疗的重要靶分子，以EGFRs为靶向的肿瘤治疗很有可能是一种特异且有效的治疗方案。
人类实体肿瘤的另一大特性，就是肿瘤新生血管的形成。当肿瘤细胞数达到106，体积在2-3mm3时，必须有新生血管形成以提供肿瘤组织的氧气和营养成分。在肿瘤的发生及转移灶形成过程中，诱导及促进新生血管形成的因子很多并且占据优势，如血管内皮细胞生长因子(VECF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、纤溶酶原激活因子(PA)及基质金属蛋白酶(MMPs)等，促进肿瘤新生血管的形成，进而输送营养以满足肿瘤细胞快速增殖及远距离转移的需要。自从上世纪70年代Folkman提出肿瘤的新生血管生成(angiogenesis)假说被证实后，逐渐形成了肿瘤的抗新生血管生成的治疗观点。采用抑制新生血管形成的因子如内皮抑素(endostatin)、血管抑素(angiostatin)、干扰素(IFN-α、β、γ)、血小板反应蛋白、纤溶酶原激活因子抑制剂(PAI)及Canstatin等，抑制肿瘤新生血管的形成，可阻断肿瘤细胞的营养供应，引起肿瘤因营养不足而萎缩乃至完全消褪。目前已经有数十种血管形成抑制剂进入临床试验，其中1997年由O’Reilly发现内皮抑素备受关注，该分子是内源性XVIII型胶原的裂解片断，针对内皮细胞发生作用，可以抑制内皮细胞的增生和迁移，阻断肿瘤的血液供应，从而使肿瘤细胞凋亡或消褪。内皮抑素具有强效、无毒、无免疫原性、无耐药性等优点。但是，其蛋白分子半衰期短，治疗剂量大，需长期反复注射应用，目前尚不能大规模的生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有良好的临床应用前景、可用于多种肿瘤治疗的具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，该溶瘤病毒与抗癌基因重组体克服当前复制缺陷型腺病毒载体(如Ad-p53)转运及表达抗癌基因效率低下、无靶向性的缺点，克服增殖复制型腺病毒载体(如H101、ONYX-015)仅具有单一抗肿瘤机制、安全性不佳等缺点，其抗肿瘤疗效得以提高，安全性得以改善。
人类腺病毒有A、B、C、D、E、F 6个不同亚属，它们对宿主细胞的亲嗜性、致瘤性及疾病史各不相同，本发明涉及腺病毒C亚属中的5型。
本发明具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体是在人类5型腺病毒基因组的基础上，同时完全缺失E1b-55kDa和E1b-19kDa蛋白基因，其增殖必需基因E1a突变为mE1a289R和mE1a243R序列，并在mE1a289R和mE1a243R序列之前插入一种肿瘤特异性嵌合启动子，所说的病毒基因组中还插入了血管内皮抑素基因表达盒。
上述嵌合启动子由人类端粒酶逆转录酶启动子核心序列和人类肿瘤表皮生长因子受体增强子组成，可控制病毒在恶性肿瘤细胞内特异性增殖，发挥病毒溶瘤作用以及mE1a病毒蛋白的抗肿瘤作用，并且还可增加放、化疗对肿瘤细胞的敏感性，而对正常细胞没有影响。同时病毒基因组中插入的血管内皮抑素基因表达盒，使内皮抑素基因随着病毒在肿瘤细胞内复制而扩增，并在肿瘤内高效表达血管内皮抑素，抑制肿瘤新生血管形成，达到抑制肿瘤细胞增殖及转移、诱导肿瘤细胞凋亡的作用。
本发明溶瘤腺病毒突变体的增殖必需基因mE1a289R和mE1a243R序列分别为mE1a289RatgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgattgatcttacctgctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccctggacacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagggaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataamE1a243Ratgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacg
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本发明溶瘤腺病毒突变体以一种肿瘤特异性嵌合启动子的顺式作用元件控制病毒增殖必需基因，该嵌合启动子由敲除了沉默子的人端粒酶逆转录酶启动子-304～+48bp核心序列和人肿瘤表皮生长因子受体增强子组成，该顺式作用元件插入增殖必需基因序列的转录起始位点与翻译起始位点ATG之间，其嵌合启动子的序列为gcagggtgcgagacccaggcagaaacattttgctggatgaggaggaaagatgtaaggttgctccccttcagagacagcaaagggcaggtctgtagcttcacttacttcaggattgtgatttttgacagagccgagagatcagggttgttgaaccaggcctgaaggtcctagtgaatctcgtgaagagaggaggggtctggctgtaacatggacctagaggacatttttactgcaggagaaggaacagtggggatggggtggacttgccaaaggaatatagctcaagttcctgcagcccaaaaaagctcagtttcttttggccaaagcttcgcgcgggcggggaagcgcggcccagaccccgcggtccgcccggagcagctgcgctgtcggggccaggccgggctcccagtggattcgcgggatctcacagacgcccaggaccgcgcttcccacgtggcggagggactggggacccgggcacccgtcctgccccttcaccttccagctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtcccgacccctcccgggtccccggcccagccccctccgggccctcccagcccctccccttcctttccgcggccccgccctctcctcgcggcgcgagtttcag
gcagcgctgcgtcctgctgcgcacgtgggaagccctggccccggccac本发明病毒突变体通过对病毒增殖必需基因实行选择性有效控制，能在肿瘤细胞内特异性复制增殖发挥溶瘤作用，而对正常细胞没有影响。
人类肿瘤90％以上具有很高的端粒酶活性，而正常体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶活性是阴性的，并且绝大多数人类恶性肿瘤过度表达EGFRs。本发明以端粒酶和EGFRs为肿瘤治疗的靶分子，设计以EGFRs增强子和端粒酶逆转录酶启动子核心序列组成嵌合启动子作为顺式作用元件，插入增殖必需基因序列的转录起始位点与翻译起始位点ATG之间，调控腺病毒增殖必需基因转录激活，使病毒增殖必需基因只能特异性地在肿瘤细胞内表达，从而控制病毒只能在肿瘤细胞内增殖，而在正常细胞内不增殖或增殖能力极弱。端粒酶逆转录酶启动子全长3996bp，敲除了沉默子(Silencer)的核心序列以-304～+48bp活性最高，-255～+40bp活性次之。本发明提供的溶瘤腺病毒突变体的端粒酶逆转录酶启动子为-304～+48bp剪接体，能够调控腺病毒突变体在大多数类型的人类肿瘤细胞中增殖并破坏细胞，在EGFRs增强子的作用下，其调控具有更好的可靠性和安全性。
本发明溶瘤腺病毒突变体的增殖必需基因完整表达序列上游预置了基因克隆位点BglII，下游预置了基因克隆位点SalI和AccI，便于携带各种抗肿瘤基因表达盒。
本发明溶瘤腺病毒突变体的编码血管内皮抑素的核苷酸序列直接插入该溶瘤腺病毒突变体基因组中的外源基因克隆位点BglII；血管内皮抑素的核苷酸序列前插入了M-成瘤蛋白信号肽编码序列，其完整序列为atgggggtacttgctcacacagaggacgctgctcagtctggtccttgcactcctgtttccaagcatggcgagccagcagccaccgcgacttccagccggtgctccacctggttgctgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgcggggccgacttccagtgcttccagcaggcgcgggccgtggggctggcgggcaccttccgcgccttcctgtcctcgcgcctgcaggacctgtacagcatcgtgcgccgtgccgaccgcgcacgcgtgcccatcgtcaacctcaaggacgagctgctgtttcccagctgggaggctctgttctcaggctctgagggtccgctgaagcccggggcacgcatcttctcctttaacggcaaggacgtcctgaggcaccccacctggccccagaagagcgtgtggcatggctcggaccccaacggcgcaggctgaccgagagctactgtgagacgtggcggacggaggctccctcggccacgggcaggcctcctcgctgctgggggcaggctcctggggcagagtgccgcgagctgccatcacgcctacatcgtgctatgcattgagaacagcttcatgactgcctccaagtaatag本发明溶瘤腺病毒突变体将编码血管内皮抑素的核苷酸序列插入该病毒的外源基因克隆位点BglII，可发挥多重抗肿瘤效能。随着病毒在肿瘤内的特异性增殖复制，其携带的内皮抑素基因的拷贝数和表达量也呈几何倍数增长，从而抑制肿瘤新生血管的形成，阻断肿瘤细胞的营养供应，导致肿瘤生长抑制乃至完全消褪。
本发明的溶瘤腺病毒突变体的抗肿瘤基因表达盒中编码血管内皮抑素的核苷酸序列受人类巨细胞病毒(CMV)启动子的控制，该启动子插入内皮抑素的核苷酸序列的转录起始位点与翻译起始位点之间，保证该基因蛋白在病毒感染的肿瘤内部高效表达，发挥生物学活性。
本发明溶瘤腺病毒突变体的抗肿瘤基因表达盒中编码血管内皮抑素的核苷酸的加尾序列为SV40 Poly A，该顺式作用元件插入内皮抑素的核苷酸序列的翻译终止密码子之后。
本发明溶瘤腺病毒突变体的增殖必需基因mE1a289R和mE1a243R突变序列由多核糖体进入位点(IRES)序列连接，使两者的表达共同受肿瘤特异性嵌合启动子调控。
本发明的溶瘤腺病毒突变体的增殖必需基因mE1a289R和mE1a243R突变序列中CR2保守区引入缺失突变，第125-128位氨基酸残基的编码序列(CACGAGGCTGGC)缺失。
腺病毒野生型E1a共有3个功能区，即CR1、CR2、CR3区，CR1区通过与转录调节因子P300/CBP结合能抑制Her-2/neu基因的表达；CR2区与Rb蛋白家族结合；CR3区是转录活化区。E1a蛋白通过CR2区能直接与低磷酸化的Rb蛋白结合，形成稳定的复合物而使Rb蛋白失活，丧失对细胞生长的正常抑制作用。本发明对E1a的CR2区引入缺失突变，第125-128位氨基酸残基的编码序列(CACGAGGCTGGC)缺失，目的在于灭活病毒蛋白结合Rb蛋白的功能，保证去磷酸化的Rb蛋白与转录因子E2F形成复合物，阻断E2F的转录活性，对肿瘤起到治疗作用。
本发明的溶瘤腺病毒突变体的增殖必需基因mE1a289R和mE1a243R突变序列第120位氨基酸残基的密码子突变(ATC-ATT)，146、147位氨基酸残基的密码子突变(CCCGGG-CCTGGA)，219位氨基酸残基的密码子突变(AGA-AGG)。
本发明溶瘤腺病毒突变体由人类5型腺病毒载体、一种肿瘤特异性嵌合启动子的顺式作用元件和人血管内皮抑素基因表达盒构建而成。该溶瘤腺病毒突变体由含5型腺病毒基因组的骨架质粒pBHGloxdeltaE1，3Cre与携带血管内皮抑素的腺病毒穿梭质粒在293细胞内通过Cre-loxP重组酶切割系统定点重组而产生。以下显示溶瘤腺病毒突变体ITR-LoxP重组区内的序列，其余腺病毒5型基因组序列与pBHGloxdeltaE1，3Cre腺病毒载体ITR-LoxP重组区以外的序列一致，其融合序列为腺病毒5型基因组序列—ttcatcaataatataccttattttggattgaagccaatatgataatgagggggtggagtttgtgacgtggcgcggggcgtgggaacggggcgggtgacgtagtagtgtggcggaagtgtgatgttgcaagtgtggcggaacacatgtaagcgacggatgtggcaaaagtgacgtttttggtgtgcgccggtgtacacaggaagtgacaattttcgcgcggttttaggcggatgttgtagtaaatttgggcgtaaccgagtaagatttggccattttcgcgggaaaactgaataagaggaagtgaaatctgaataattttgtgttactcatagcgcgtaatatttgtctagggccgcggggactttgaccgtttacgtggagactcgcccaggtgtttttctcaggtgttttccgcgttccgggtcaaagttggcgttttattattatagtcagttctagcagatctaattccctggcattatgcccagtacatgaccttat
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本发明溶瘤腺病毒突变体的mE1a289R和mE1a243R突变序列在肿瘤细胞中的特异性表达，其肿瘤特异性嵌合启动子可以由以下任何两组肿瘤特异性启动子和增强子组成(a)癌胚抗原启动子、增强子及其突变体序列；(b)甲胎蛋白启动子、增强子及其突变体序列；(c)人表皮生长因子受体家族(EGFRs)的受体酪氨酸激酶(包括EGFR、Her-2、Her-3和Her-4)启动子、增强子及其突变体序列；(d)乳腺癌相关抗原DF3/MUC1启动子、增强子及其突变体序列；(e)血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR的启动子、增强子及其突变体序列；(f)L-plastin启动子、增强子及其突变体序列；(g)凋亡抑制蛋白家族(IAP)成员的启动子、增强子及其突变体序列；(h)前列腺素特异性抗原的启动子、增强子及其突变体序列；(i)缺氧诱导因子-1(HIF-1)调控的缺氧反应元件保守序列；(j)转录因子E2F启动子、增强子及其突变体序列。
本发明溶瘤腺病毒突变体，其E1b-55kDa蛋白基因缺失，通过对编码E1b-55kDa蛋白的基因序列点突变、完全或部分缺失、插入突变或者插入终止密码子的方式实现。
该病毒突变体缺失E1b-55kDa编码基因序列，使其在肿瘤细胞内特异性复制增殖，发挥溶瘤作用，而对正常细胞没有影响。正常细胞与肿瘤存在着某些基因表达上的差异，如正常细胞能表达野生型P53蛋白，而绝大多数肿瘤细胞不表达野生型P53蛋白或表达突变型P53蛋白，因此一些病毒在正常细胞内复制所必需的基因，而在肿瘤细胞内并不需要。E1b-55kDa是腺病毒在正常细胞增殖复制必需的而在肿瘤细胞中不必需的蛋白，E1b-55kDa编码基因的选择性缺失可以使腺病毒在肿瘤细胞内保持增殖复制的能力，而在正常细胞中失去复制能力。E1b-55kDa蛋白能够灭活并降解P53蛋白，E1b-55kDa编码基因的选择性缺失有利于细胞保持P53的抗肿瘤活性，同时提高病毒载体的靶向性。
本发明提供溶瘤腺病毒突变体，其E1b-19kDa蛋白基因缺失，通过对编码E1b-19kDa蛋白的基因序列点突变、完全或部分缺失、插入突变或者插入终止密码子的方式实现。
该病毒突变体通过缺失E1b-19kDa编码基因序列，在肿瘤细胞内特异性复制增殖发挥溶瘤作用，而对正常细胞没有影响。腺病毒感染可以阻断细胞的凋亡程序，腺病毒E1b-19kDa基因与凋亡抑制基因Bcl-2同源，编码的E1b-19kDa蛋白能够结合Bax或/和Bak启动下游的凋亡抑制程序，E1b-19kDa还可以破坏Fas介导的凋亡过程，保护感染的细胞免受TNF-α介导的杀伤作用。本发明肿瘤特异性溶瘤腺病毒，其E1b-19kDa基因缺失，因而该病毒突变体在肿瘤细胞内增殖的特异性得以提高，而在正常细胞内的增殖活性被削弱。E1b-19kDa蛋白功能的丧失，不但能够促进肿瘤细胞凋亡通路的恢复，而且有利于病毒在正常细胞内的快速清除以及在肿瘤细胞内的快速释放和播散，使该溶瘤腺病毒治疗肿瘤的特异性更好，效能更强。
本发明的肿瘤特异性溶瘤腺病毒突变体还可以通过对编码E1b-19kDa蛋白的基因序列进行点突变、部分缺失、插入突变或者插入终止密码子等方式，使E1b-19kDa蛋白功能丧失。
本发明的溶瘤腺病毒突变体，其抗肿瘤基因的选择还可以是下列任意一种(a)干扰素系列免疫调节因子基因；(b)白细胞介素系列免疫调节因子基因；(c)细胞集落刺激因子基因；(d)抑癌基因；(e)原癌基因反义序列；(f)人肿瘤表皮生长因子受体家族(EGFRs)的抗体基因；(g)具有抗血管生成的内皮抑素、血管抑素及其片段、纤溶酶原激活因子抑制剂、Canstatin、血小板反应蛋白等核苷酸序列；(h)细胞凋亡诱导因子家族基因；(i)血管内皮生长因子抗体基因；(j)药物前提转化基因(又称自杀基因)；(k)肿瘤坏死因子基因。
本发明提供一种具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，其编码血管内皮抑素的核苷酸序列的启动子还可以是以下任意一种(a)癌胚抗原启动子；(b)甲胎蛋白启动子；(c)人表皮生长因子受体家族(EGFRs)的受体酪氨酸激酶(包括EGFR、Her-2、Her-3和Her-4)启动子；(d)乳腺癌相关抗原DF3/MUC1启动子；(e)血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR的启动子；(f)单纯疱疹病毒启动子；(g)E2F启动子；(h)前列腺素特异性抗原的启动子。
本发明提供一种具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，其mE1a289R和mE1a243R突变序列在肿瘤细胞中的特异性表达还可以分别受两种不同的肿瘤特异性启动子的控制，肿瘤特异性启动子的选择可以是以下任意两组的组合(a)癌胚抗原启动子、增强子及其突变体序列；(b)甲胎蛋白启动子、增强子及其突变体序列；(c)人表皮生长因子受体家族(EGFRs)的受体酪氨酸激酶(包括EGFR、Her-2、Her-3和Her-4)启动子、增强子及其突变体序列；(d)乳腺癌相关抗原DF3/MUC1启动子、增强子及其突变体序列；(e)血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR的启动子、增强子及其突变体序列；(f)L-plastin启动子、增强子及其突变体序列；(g)凋亡抑制蛋白家族(IAP)成员的启动子、增强子及其突变体序列；(h)前列腺素特异性抗原的启动子、增强子及其突变体序列；(i)缺氧诱导因子-1(HIF-1)调控的缺氧反应元件保守序列；(j)转录因子E2F启动子、增强子及其突变体序列。
本发明提供一种具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，其mE1a289R和mE1a243R的突变方式还可以是对CR2区第120-140位氨基酸残基的编码序列进行的点突变和部分缺失突变。
综上所述，本发明提供的具有多重特异性抗癌机制的新型溶瘤腺病毒突变体具有以下重要意义1.可用于构建多种抗肿瘤基因治疗的腺病毒产品，为肿瘤的基因治疗建立一种疗效可靠的技术平台。
2.具有多重抗肿瘤机制1)以端粒酶逆转录酶启动子调控腺病毒突变体在大多数类型的人类肿瘤细胞中增殖并破坏肿瘤细胞，在EGFRs增强子的作用下，其调控具有更好的可靠性和安全性；2)E1b-55kDa编码基因的完全缺失，使腺病毒在肿瘤细胞内保持增殖复制的能力而在正常细胞中失去复制能力，并且有利于细胞保持P53的抗肿瘤活性，提高了病毒载体的靶向性；3)E1b-19kDa基因完全缺失，不但能够促进肿瘤细胞凋亡通路的恢复，而且有利于病毒在正常细胞内的快速清除以及在肿瘤细胞内的快速释放和播散，使该溶瘤腺病毒治疗肿瘤的特异性更好，效能更强；4)mE1a289R和mE1a243R突变序列的CR2区第125-128位氨基酸残基的编码序列(CACGAGGCTGGC)缺失，其灭活病毒蛋白结合Rb蛋白的功能，保证去磷酸化的Rb蛋白与转录因子E2F形成复合物，阻断E2F的转录活性，对肿瘤起到治疗作用；5)在肿瘤细胞内高效而特异性表达的mE1a289R和mE1a243R，通过抑制Her-2/neu基因的转录、阻断NF-κB的活性、提高p53的表达、抑制IV型胶原酶、纤溶酶原激活剂、间质胶原酶、尿激酶及溶基质素等蛋白酶基因表达、提高CTL细胞、NK细胞、巨噬细胞的杀伤效应、增强转移抑制基因nm23的表达等多种途径，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤侵袭转移，提高肿瘤细胞对化疗、放疗的敏感性；6)将编码血管内皮抑素的核苷酸序列插入该病毒突变体的基因组中，随着病毒在肿瘤内的特异性增殖复制，其携带的内皮抑素基因的拷贝数和表达量也呈几何倍数增长，从而抑制肿瘤新生血管的形成，阻断肿瘤细胞的营养供应，导致肿瘤生长抑制乃至完全消褪。
3.本发明提供的溶瘤腺病毒突变体，比国内目前已上市的基因治疗产品重组p53腺病毒注射液“Ad-p53”具有更好的疗效，比国内目前已上市的增殖腺病毒产品H101具有更好的疗效和更高的安全性，适应于人类绝大多数类型恶性肿瘤的治疗。
具体实施例方式
实施例1肿瘤特异性嵌合启动子控制mE1a289R和mE1a243R的腺病毒载体的构建第一步克隆获得肿瘤特异性嵌合启动子，插入质粒pIRES的NheI+XhoI位点，构建成含肿瘤特异性嵌合启动子的载体pSu-1。pIRES购于美国ClontechLaboratories公司。设计的肿瘤特异性嵌合启动子全长696bp，序列如下ctagcagatctgcagggtgcgagacccaggcagaaacattttgctggatgaggaggaaagatgtaaggttgctccccttcagagacagcaaagggcaggtctgtagcttcacttacttcaggattgtgatttttgacagagccgagagatcagggttgttgaaccaggcctgaaggtcctagtgaatctcgtgaagagaggaggggtctggctgtaacatggacctagaggacatttttactgcaggagaaggaacagtggggatggggtggacttgccaaaggaatatagctcaagttcctgcagcccaaaaaagctcagtttcttttggccaaagcttcgcgcgggcggggaagcgcggcccagaccccgcggtccgcccggagcagctgcgctgtcggggccaggccgggctcccagtggattcgcgggatctcacagacgcccaggaccgcgcttcccacgtggcggagggactggggacccgggcacccgtcctgccccttcaccttccagctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtcccgacccctcccgggtccccggcccagccccctccgggccctcccagcccctccccttcctttccgcggccccgccctctcctcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcgtcctgctgcgcacgtgggaagccctggccccggccac第二步克隆获得腺病毒mE1a289R突变体序列，插入pSu-1的EcoRI+MluI位点，构建成肿瘤特异性嵌合启动子控制mE1a289R表达的载体pSu-2。mE1a289R突变体序列全长866bp，序列如下aattcaccatgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgattgatcttacctgctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccctggacacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtcctgtgtctgaacctgagcctgagccc
gagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagggaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataa第三步设计引物，以上述克隆获得的mE1a289R为模板，扩增mE1a243R，构建肿瘤特异性嵌合启动子控制mE1a289R和mE1a243R表达的载体pSu-3。引物序列如下Ad0015’-gctctagaaccatgagacatattatc-3’，含XbaI位点Ad0025’-aggttcagacacaggaccctcttcatcctc-3’Ad0035’-gaggatgaagagggtcctgtgtctgaacct-3’Ad0045’-gcgtcgacttatggcctggggcg-3’，含SalI位点先以Ad001和Ad002扩增片段431bp，再以Ad003和Ad004扩增片段338bp，扩增的两个产物混合做模板，以Ad001和Ad004扩增，扩增片段739bp，序列如下gctctagaaccatgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgattgatcttacctgctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagggaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataagtcgacgcAd001和Ad004扩增的产物经XbaI+SalI酶切后，回收729bp的片段，插入pUC19/XbaI+SalI位点，构建成pUC19-mE1a243R。pUC19-mE1a243R测序正确后，XbaI+SalI酶切回收729bp的片段，插入pSu-2/XbaI+SalI位点，构建成肿瘤特异性嵌合启动子控制mE1a289R和mE1a243R表达的载体pSu-3，其中mE1a289R和mE1a243R序列由IRES连接。
第四步NheI+SalI酶切pSu-3，获得2927bp的pSu-3/NheI+SalI片段，插入腺病毒载体质粒pDC315/XbaI+SalI位点，构建成肿瘤特异性嵌合启动子控制mE1a289R和mE1a243R的腺病毒载体pSu-4。pDC315购于加拿大MicrobixBiosystems公司。pSu-3/NheI+SalI片段含有肿瘤特异性嵌合启动子、mE1a289R、IRES和mE1a243R，全长2926bp，序列如下ctagcagatctgcagggtgcgagacccaggcagaaacattttgctggatgaggaggaaagatgtaaggttgctccccttcagagacagcaaagggcaggtctgtagcttcacttacttcaggattgtgatttttgacagagccgagagatcagggttgttgaac
caggcctgaaggtcctagtgaatctcgtgaagagaggaggggtctggctgtaacatggacctagaggacatttttactgcaggagaaggaacagtggggatggggtggacttgccaaaggaatatagctcaagttcctgcagcccaaaaaagctcagtttcttttggccaaagcttcgcgcgggcggggaagcgcggcccagaccccgcggtccgcccggagcagctgcgctgtcggggccaggccgggctcccagtggattcgcgggatctcacagacgcccaggaccgcgcttcccacgtggcggagggactggggacccgggcacccgtcctgccccttcaccttccagctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtcccgacccctcccgggtccccggcccagccccctccgggccctcccagcccctccccttcctttccgcggccccgccctctcctcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcgtcctgctgcgcacgtgggaagccctggccccggccactcgagaattcaccatgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgattgatcttacctgctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccctggacacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagggaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataacgcgtcgagcatgcatctagggcggccaattccgcccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgtgattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataagcttgccacaacccgggatcctctagaaccatgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgattgatcttacctgctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagggaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataag实施例2携带人内皮抑素(endostatin)基因的E1区缺失的腺病毒载体的构建第一步克隆获得人内皮抑素(endostatin)基因序列，前面加入M-成瘤蛋白信号肽编码序列，其作用是使表达的内皮抑素蛋白具有外分泌作用。基因片段全长636bp，序列如下aattcaccatgggggtactgctcacacagaggacgctgctcagtctggtccttgcactcctgtttccaagcatggcgagccacagccaccgcgacttccagccggtgctccacctggttgcgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgcggggccgacttccagtgcttccagcaggcgcgggccgtggggctggcgggcaccttccgcgccttcctgtcctcgcgcctgcaggacctgtacagcatcgtgcgccgtgccgaccgcgcagccgtgcccatcgtcaacctcaaggacgagctgctgtttcccagctgggaggctctgttctcaggctctgagggtccgctgaagcccggggcacgcatcttctcctttaacggcaaggacgtcctgaggcaccccacctggccccagaagagcgtgtggcatggctcggaccccaacgggcgcaggctgaccgagagctactgtgagacgtggcggacggaggctccctcggccacgggccaggcctcctcgctgctggggggcaggctcctggggcagagtgccgcgagctgccatcacgcctacatcgtgctatgcattgagaacagcttcatgactgcctccaagtaatagt第二步将636bp人内皮抑素基因插入腺病毒载体pCA13/EcoRI+XbaI位点，构建成携带人内皮抑素基因的E1区缺失的腺病毒载体pCA13-hE。pCAl3载体购于加拿大Microbix Biosystems公司，含有5型腺病毒22-5790bp序列并缺失E1区342-3523bp片段，其多克隆位点之前为人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299-+72)，多克隆位点之后为SV40poly(A)加尾信号。
实施例3携带人内皮抑素(endostatin)基因的溶瘤腺病毒载体的构建pCA13-hE经过BglII酶切，回收含有的人内皮抑素基因完整表达盒的片段，插入pSu-4/BglII位点，构建成携带人内皮抑素基因的溶瘤腺病毒载体pSu-hE。
pCA13-hE含有的人内皮抑素基因完整表达盒全长1217bp，序列如下gatctaattccctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctggggatcagtcttcgagtcgacaagcttgaattcaccatgggggtactgctcacacagaggacgctgctcagtctggtccttgcactcctgtttccaagcatggcgagccacagccaccgcgacttccagccggtgctccacctggttgcgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgcggggccgacttccagtgcttccagcaggcgcgggccgtggggctggcgggcaccttccgcgccttcctgtcctcgcgcctgcaggacctgtacagcatcgtgcgccgtgccgaccgcgcagccgtgcccatcgtcaacctcaaggacgagctgctgtttcccagctgggaggctctgttctcaggctctgagggtccgctgaagcccggggcacgcatcttctcctttaacggcaaggacgtcctgaggcaccccacctggccccagaagagcgtgtggcatggctcggaccccaacgggcgcaggctgaccgagagctactgtgagacgtggcggacggaggctccctcggccacgggccaggcctcctcgctgctggggggcaggctcctggggcagagtgccgcgagctgccatcacgcctacatcgtgctatgcattgagaacagcttcatgactgcctccaagtaatagtctagactcgagggatccatcgagcaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatcgtctagcatcgaa
实施例4腺病毒的细胞内重组及扩增纯化本发明提供的增殖型溶瘤腺病毒以及作为对照的增殖缺陷型腺病毒，是在HEK293人胚胎肾细胞内重组完成的。HEK293细胞株购于加拿大MicrobixBiosystems公司，该细胞由剪切的5型腺病毒DNA转化，含5型腺病毒E1区，腺病毒DNA对其具有高转染率。将含有5型腺病毒左臂的质粒与含有5型腺病毒右臂的质粒共转染HEK293细胞，通过细胞内重组产生具有感染力的腺病毒。
将上述构建好的5型腺病毒左臂的质粒pSu-4、pSu-hE，分别与含有5型腺病毒右臂的质粒pBHGloxdelE13cre通过LipoFectamine2000共同转染293细胞。同样，将上述构建好的5型腺病毒左臂的质粒pCA13-hE，与含有5型腺病毒右臂的质粒pBHGE3通过LipoFectamine2000共同转染293细胞。转染具体方法步骤参见Invitrogen公司的LipoFectamine2000试剂盒操作说明书。pBHGloxdelE13cre和pBHGE3购于加拿大Microbix Biosystems公司，pBHGloxdelE13cre含有5型腺病毒右臂，缺失E1、E3区，其重组酶系统Cre/LoxP可以保证病毒的高效重组；pBHGE3含有5型腺病毒右臂，保留E3区。在载体共转染后的9-14天，陆续出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化(具体方法参见GeneTransfer and ExpressionProtocols，Murray EJ主编，Humana Press，Clifton，New Jersey)，重组出腺病毒TIDE 100(重组溶瘤腺病毒)、TIDE 101(重组抗血管溶瘤腺病毒)以及Ad-hE(重组抗血管非增殖腺病毒)。
重组腺病毒TIDE 100、TIDE 101、Ad-hE鉴定以Ad001和Ad004为引物PCR扩增病毒基因组DNA，扩增片段739bp，以pSu-3为阳性对照质粒，TIDE 100、TIDE 101为阳性，Ad-hE为阴性。
合成引物Ad0055’-ttgaattcaccatgggggtacttgctca-3’(Human EndostatinUpstream Primer)；Ad0065’-atggatccctcgagtctagactattact-3’(Human EndostatinDownstream Primer)，以Ad005和Ad006为引物PCR扩增病毒基因组DNA，扩增片段658bp，以pAd-hE为阳性对照质粒。TIDE 101、Ad-hE为阳性，TIDE 100为阴性。
重组腺病毒命名及鉴定
腺病毒在HEK293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒(具体方法参见GeneTransfer and Expression Protocols，Murray EJ主编，Humana Press，Clifton，New Jersey)。重组腺病毒的突变序列和插入序列通过测序证实。TIDE 100、TIDE 101为5型腺病毒突变体，其E1b-55kDa和E1b-19kDa基因完全缺失，腺病毒E1a基因以CR2区突变为主的突变序列mE1a289R和mE1a243R受人类端粒酶逆转录酶启动子核心序列和人类肿瘤表皮生长因子受体增强子组成的嵌合启动子的有效控制，mE1a289R和mE1a243R基因由IRES连接，并伴有E3区部分序列(28132-30813bp)缺失，TIDE 101在其嵌合启动子序列之前的多克隆位点区还插入了人内皮抑素的表达盒，其他DNA序列与5型腺病毒相同。Ad-hE为5型腺病毒，缺失E1区，保留E3区，并在缺失的E1区域插入了人内皮抑素的表达盒，其他DNA序列与5型腺病毒相同。
实施例5重组抗血管溶瘤腺病毒的体外增殖、表达及杀伤试验mE1a和Endostatin表达的Western blot分析人肝癌细胞株(Hep3B、HepGII)、人胰腺癌细胞株(PANC-1)、人肺癌细胞株(A549)、人肠癌细胞株(HT29)、人乳腺癌细胞株(MBD-231)、人正常成纤维细胞株(MRC-5、IMR-90、BJ)购自ATCC(American Type Culture Collection)，人胃癌细胞株SGC-7901来源于中科院细胞所，人原代正常肝细胞取自临床流产的胎儿肝组织。细胞计数，铺24孔板，5×104/孔，培养24h；换用无血清培养液，MOI＝1分别加入重组抗血管溶瘤腺病毒TIDE101以及对照腺病毒TIDE100、Ad-hE、野生型5型腺病毒(WAd5)，轻摇2h；吸除上清，换用2％血清培养液，培养48h；收集细胞，以M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent(PIERCE)裂解细胞，回收蛋白，对蛋白定量后，以10％聚丙烯酰胺凝胶溶液，70V恒压电泳，分离蛋白质；以电转移仪(Continental Lab Products，Inc.)3V 90mA将蛋白质转移到PROTRANNitrocellulose Transfer Membrane(Schleicher & Schuell Inc.)；封闭液(0.5％FBS，50mmol/L Tris-HCl pH7.5，150mmol/L NaCl，0.1％Tween-20，0.02％NaN3)封闭1h，1×TBST(50mmol/L Tris-HCl pH7.5，150mmol/L NaCl，0.1％Tween-20)洗膜3次，每次5min；4℃条件下与第一抗体小鼠抗腺病毒E1a单克隆抗体(Santa CruzBiotechnology，Inc.)或者大鼠抗人Endostatin单克隆抗体(R&D Systems)孵育过夜，1×TBST洗膜三次，每次5min；室温条件下与第二抗体HRP-羊抗小鼠IgG抗体或者HRP-羊抗大鼠IgG抗体(Cell Signaling Technology，Inc.)反应1h，1×TBST洗膜三次，每次5min；加入显色液LumiGLO chemiluminescent reagent andperoxide(Cell Signaling Technology，Inc.)，曝光X-ray胶片。结果显示TIDE100、TIDE 101特异性地在肿瘤细胞系中高表达mE1a289及mE1a243蛋白，而在正常细胞中不表达，但WAd5在肿瘤细胞和正常细胞系中均表达E1a蛋白，Ad-hE在肿瘤细胞和正常细胞系中均不表达。TIDE 101特异性地在肿瘤细胞系中高表达人Endostatin，而在正常细胞中不表达或表达很弱，但Ad-hE在肿瘤细胞和正常细胞系中均显示弱表达Endostatin。
重组抗血管溶瘤腺病毒的特异性增殖收集对数生长期的肿瘤细胞和正常细胞，计数，铺6孔板，1×106/孔，癌细胞培养至孔底长满，正常细胞培养至长满并出现接触抑制，换用无血清培养液；以MOI＝1分别加入重组抗血管溶瘤腺病毒TIDE101以及对照腺病毒TIDE100、Ad-hE、WAd5，2h后调节至5％血清培养液；收集病毒感染0h和48h的细胞及上清液，-80℃冻存；TCID50方法检测病毒滴度。结果显示TIDE101、TIDE100特异性地在肿瘤细胞系中增殖复制，而在正常细胞中不增殖。但Ad-hE在肿瘤细胞和正常细胞系中均不增殖，WAd5在肿瘤细胞和正常细胞系中均有增殖。
Endostatin表达的定量检测和活性实验将对数生长期的肿瘤细胞和正常细胞以5×104/孔铺24孔板，24h后以MOI＝1感染重组抗血管溶瘤腺病毒TIDE101及其对照腺病毒Ad-hE，方法同上。分别在感染后第1、3、7天收集细胞培养上清，-80℃冻存备测。Human Endostatin的ELISA试验盒购自美国ChemiconInternational Inc.，具体操作参考该试剂盒说明书。Endostatin活性检测以人脐静脉内皮细胞株ECV304为靶细胞，ECV-304购于美国ATCC细胞库。接种细胞至6孔板中培养，105细胞/孔，培养24h，加入不同浓度的上述TIDE101和Ad-hE感染后收集的细胞培养上清，继续培养3天，用10％结晶紫福尔马林溶液固定10min，龙胆紫染色。结果显示TIDE101能够在肿瘤细胞系中介导Endostatin特异性高效表达，其表达量比Ad-hE明显增多，但在正常细胞系中TIDE101表达Endostatin的量极低，低于Ad-hE或等同于Ad-hE。TIDE101感染后收集的细胞培养上清能够明显抑制人脐静脉内皮细胞株ECV304的生长，并且其抑制效应与Endostatin的含量相关。
重组抗血管溶瘤腺病毒对肿瘤细胞的特异性杀伤通过四唑盐比色实验(MTT)检测病毒TIDE101和TIDE100对肿瘤细胞和正常细胞的作用，并与WAd5、Ad-hE作对照。Cell Proliferation Kit I(MTT)购于Roche DiagnosticsGmbH。首先确定最佳细胞浓度的实验，收集对数生长期的细胞，计数，用10％血清培养液配制成由2×104至2×105/ml共11个浓度梯度的单个细胞悬液，100μl/孔传至96孔板，每个细胞浓度值设8个复孔，孵箱内24h；加入无血清培养液100μl/孔，培养7天；弃去培养液，加入0.1mol/L PBS溶液100μl/孔，再加MTTlabeling reagent 10μl/孔至终浓度0.5mg/ml，置孵箱内4h；加Solubilization solution(10％SDS in 0.01mol/L HCl)100μl/孔，置孵箱内过夜；采用Model 550MicroplateReader(BIO-RAD)测定570nm波长光吸收值，校正波长为655nm；绘制曲线，确定三种细胞共同的最适细胞浓度。其次按不同的MOI值进行MTT试验，收集对数生长期的细胞，计数，用10％血清培养液，按上述实验所确定的最适细胞浓度，配制成单个细胞悬液，100μl/孔传至96孔板，置孵箱内24h；无血清培养液稀释病毒，按MOI＝0.0001～500不同浓度加入病毒100μl，对应于每个MOI值设8个复孔，培养7天后按上述方法进行MTT实验。结果显示TIDE101和TIDE100能够特异性杀伤肿瘤细胞，在很低的MOI值下即可显示明显的杀伤效应，而对正常细胞的杀伤则需要在很高的MOI值下才出现。
实施例6重组抗血管溶瘤腺病毒对裸鼠移植瘤的治疗效应疗效学实验健康纯种BALB/c裸鼠或SCID鼠，4～6周龄，中科院上海实验动物中心提供，雌雄各半，清洁级动物实验室饲养，随机分组(TIDE101组、TIDE100组、Ad-hE组、空白对照组)，称重，编号。取对数生长期的肿瘤细胞，用PBS液调整细胞数至1×108/ml，消毒裸鼠侧腹部近腋下皮肤，取100μl细胞悬液注射于皮下，恒温、通风、无菌条件下饲养；每日定时观察瘤体生长情况，接种区皮下出现米粒大小红润硬结，即为种植成功。至瘤体平均直径生长至5～7mm时开始治疗；以2×108pfu/100μl的重组病毒直接瘤内多点注射，隔日一次，共5次，空白对照组以病毒保存液Ad Buffer(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，2mmol/LMgCl2，4％Sucrose)代替重组病毒注射，100μl×5次；定时测量瘤体生长情况，游标卡尺测量瘤体大小，以“a×b2×0.5”公式计算瘤体体积(a最大径，b最小径)；择时断颈处死小鼠，取血清及瘤体标本。血清备测Endostatin含量，标本备作病理检查。Human Endostatin的ELISA试验盒购自美国Chemicon International Inc.，具体操作参考该试剂盒说明书。病理免疫组化检查所用的鼠抗腺病毒Hexon单克隆抗体购自Biodesign International公司，大鼠抗小鼠CD31单克隆抗体购自美国BD Biosciences Pharmingen公司，HRP-羊抗鼠IgG购自ZYMED Laboratories公司。结果显示与对照组相比，TIDE101和TIDE100治疗组疗效明显，且明显优于Ad-hE。小鼠血清中Endostatin含量检测，TIDE101治疗组各个时间点均明显高于Ad-hE。取瘤组织进行病理切片，常规HE染色可见对照组瘤细胞生长旺盛，异型明显，病理核分裂相多见，而TIDE101和TIDE100治疗组瘤组织中可见大片坏死或较多的灶性坏死区，坏死区周边癌细胞退变，细胞变小变圆，核染色质浓缩深染，胞浆嗜酸性变，出现细胞凋亡的改变。对病理切片进行免疫组化检查，可见TIDE101和TIDE100治疗组癌组织中很多癌细胞呈现病毒壳蛋白Hexon阳性表达。肿瘤组织内微血管计数发现，与对照组比较，TIDE101治疗组瘤组织内微血管数量明显减少，Ad-hE组微血管数量减少程度不如TIDE101治疗组。
急性毒性试验健康BALB/c小鼠，4～6周龄，中科院上海实验动物中心提供，雌雄各半，清洁级动物实验室饲养，随机分组(TIDE101高剂量组、TIDE101低剂量组、TIDE100高剂量组、TIDE100低剂量组、WAd5高剂量组、WAd5低剂量组、空白对照组)，称重，编号。尾静脉注射重组病毒，每天1次，连续5天，低剂量组每次每只1×1010pfu/kg(等同于裸鼠治疗剂量)，高剂量组每次每只2.5×1011pfu/kg(裸鼠治疗剂量的25倍)，对照组每次注射100μl病毒保存液。连续观察小鼠的死亡及可能出现的病态改变，治疗结束后2天，抽取静脉血检测肝转氨酶ALT和AST。断颈处死小鼠，取各脏器进行病理检查。结果显示WAd5在高剂量组引起小鼠的高死亡率，在低剂量组引起小鼠的低死亡率，并且导致剂量相关的肝转氨酶ALT和AST明显升高，肝细胞不同程度的水肿和灶性坏死，甚至肝板破坏。相比之下，TIDE101和TIDE100处理组小鼠生存状态良好，无死亡，肝转氨酶ALT和AST未升高，各脏器未见其质性病变，高剂量组少数小鼠的肝细胞有轻度水肿。免疫组化检测发现WAd5组肝细胞内有不同程度的E1a蛋白的表达，而TIDE101和TIDE100处理组未见E1a的表达。
序列表<110>江苏舜唐生物工程有限公司<120>一种具有多重抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体<160>7<210>1<211>4798<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>CDS<222>(710)...(1567)<220>
<221>misc_signal<222>(1579)...(2183)<220>
<221>CDS<222>(2206)...(2925)<400>5ctagcagatc tgcagggtgc gagacccagg cagaaacatt ttgctggatg aggaggaaag 60atgtaaggtt gctccccttc agagacagca aagggcaggt ctgtagcttc acttacttca 120ggattgtgat ttttgacaga gccgagagat cagggttgtt gaaccaggcc tgaaggtcct 180agtgaatctc gtgaagagag gaggggtctg gctgtaacat ggacctagag gacattttta 240ctgcaggaga aggaacagtg gggatggggt ggacttgcca aaggaatata gctcaagttc 300ctgcagccca aaaaagctca gtttcttttg gccaaagctt cgcgcgggcg gggaagcgcg 360gcccagaccc cgcggtccgc ccggagcagc tgcgctgtcg gggccaggcc gggctcccag 420tggattcgcg ggatctcaca gacgcccagg accgcgcttc ccacgtggcg gagggactgg 480ggacccgggc acccgtcctg ccccttcacc ttccagctcc gcctcctccg cgcggacccc 540gccccgtccc gacccctccc gggtccccgg cccagccccc tccgggccct cccagcccct 600ccccttcctt tccgcggccc cgccctctcc tcgcggcgcg agtttcaggc agcgctgcgt 660cctgctgcgc acgtgggaag ccctggcccc ggccactcga gaattcacca tgagacatat 720tatctgccac ggaggtgtta ttaccgaaga aatggccgcc agtcttttgg accagctgat 780cgaagaggta ctggctgata atcttccacc tcctagccat tttgaaccac ctacccttca 840cgaactgtat gatttagacg tgacggcccc cgaagatccc aacgaggagg cggtttcgca 900gatttttccc gactctgtaa tgttggcggt gcaggaaggg attgacttac tcacttttcc 960gccggcgccc ggttctccgg agccgcctca cctttcccgg cagcccgagc agccggagca 1020
gagagccttg ggtccggttt ctatgccaaa ccttgtaccg gaggtgattg atcttacctg 1080ctttccaccc agtgacgacg aggatgaaga gggtgaggag tttgtgttag attatgtgga 1140gcaccctgga cacggttgca ggtcttgtca ttatcaccgg aggaatacgg gggacccaga 1200tattatgtgt tcgctttgct atatgaggac ctgtggcatg tttgtctaca gtcctgtgtc 1260tgaacctgag cctgagcccg agccagaacc ggagcctgca agacctaccc gccgtcctaa 1320aatggcgcct gctatcctga gacgcccgac atcacctgtg tctagggaat gcaatagtag 1380tacggatagc tgtgactccg gtccttctaa cacacctcct gagatacacc cggtggtccc 1440gctgtgcccc attaaaccag ttgccgtgag agttggtggg cgtcgccagg ctgtggaatg 1500tatcgaggac ttgcttaacg agcctgggca acctttggac ttgagctgta aacgccccag 1560gccataacgc gtcgagcatg catctagggc ggccaattcc gcccctctcc ctcccccccc 1620cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtga 1680ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc 1740ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat 1800gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc 1860ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt 1920gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt 1980gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag 2040aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt gcacatgctt tacatgtgtt 2100tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga 2160aaaacacgat gataagcttg ccacaacccg ggatcctcta gaaccatgag acatattatc 2220tgccacggag gtgttattac cgaagaaatg gccgccagtc ttttggacca gctgatcgaa 2280gaggtactgg ctgataatct tccacctcct agccattttg aaccacctac ccttcacgaa 2340ctgtatgatt tagacgtgac ggcccccgaa gatcccaacg aggaggcggt ttcgcagatt 2400tttcccgact ctgtaatgtt ggcggtgcag gaagggattg acttactcac ttttccgccg 2460gcgcccggtt ctccggagcc gcctcacctt tcccggcagc ccgagcagcc ggagcagaga 2520gccttgggtc cggtttctat gccaaacctt gtaccggagg tgattgatct tacctgcttt 2580ccacccagtg acgacgagga tgaagagggt cctgtgtctg aacctgagcc tgagcccgag 2640ccagaaccgg agcctgcaag acctacccgc cgtcctaaaa tggcgcctgc tatcctgaga 2700cgcccgacat cacctgtgtc tagggaatgc aatagtagta cggatagctg tgactccggt 2760
ccttctaaca cacctcctga gatacacccg gtggtcccgc tgtgccccat taaaccagtt 2820gccgtgagag ttggtgggcg tcgccaggct gtggaatgta tcgaggactt gcttaacgag 2880cctgggcaac ctttggactt gagctgtaaa cgccccaggc cataag2926<210>6<211>636<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>sig_peptide<222>(9)...(80)<220>
<221>CDS<222>(81)...(632)<400>6aattcaccat gggggtactg ctcacacaga ggacgctgct cagtctggtc cttgcactcc 60tgtttccaag catggcgagc cacagccacc gcgacttcca gccggtgctc cacctggttg 120cgctcaacag ccccctgtca ggcggcatgc ggggcatccg cggggccgac ttccagtgct 180tccagcaggc gcgggccgtg gggctggcgg gcaccttccg cgccttcctg tcctcgcgcc 240tgcaggacct gtacagcatc gtgcgccgtg ccgaccgcgc agccgtgccc atcgtcaacc 300tcaaggacga gctgctgttt cccagctggg aggctctgtt ctcaggctct gagggtccgc 360tgaagcccgg ggcacgcatc ttctccttta acggcaagga cgtcctgagg caccccacct 420ggccccagaa gagcgtgtgg catggctcgg accccaacgg gcgcaggctg accgagagct 480actgtgagac gtggcggacg gaggctccct cggccacggg ccaggcctcc tcgctgctgg 540ggggcaggct cctggggcag agtgccgcga gctgccatca cgcctacatc gtgctatgca 600ttgagaacag cttcatgact gcctccaagt aatagt 636
<210>7<211>1217<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>Promoter<222>(6)...(408)<220>
<221>sig_peptide<222>(418)...(489)<220>
<221>CDS<222>(490)...(1041)<220>
<221>PolyA_signal<222>(1063)...(1216)<400>7gatctaattc cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag 60tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat 120gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat 180gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc 240ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt 300ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga 360caccgggacc gatccagcct ggggatcagt cttcgagtcg acaagcttga attcaccatg 420
ggggtactgc tcacacagag gacgctgctc agtctggtcc ttgcactcct gtttccaagc 480atggcgagcc acagccaccg cgacttccag ccggtgctcc acctggttgc gctcaacagc 540cccctgtcag gcggcatgcg gggcatccgc ggggccgact tccagtgctt ccagcaggcg 600cgggccgtgg ggctggcggg caccttccgc gccttcctgt cctcgcgcct gcaggacctg 660tacagcatcg tgcgccgtgc cgaccgcgca gccgtgccca tcgtcaacct caaggacgag 720ctgctgtttc ccagctggga ggctctgttc tcaggctctg agggtccgct gaagcccggg 780gcacgcatct tctcctttaa cggcaaggac gtcctgaggc accccacctg gccccagaag 840agcgtgtggc atggctcgga ccccaacggg cgcaggctga ccgagagcta ctgtgagacg 900tggcggacgg aggctccctc ggccacgggc caggcctcct cgctgctggg gggcaggctc 960ctggggcaga gtgccgcgag ctgccatcac gcctacatcg tgctatgcat tgagaacagc 1020ttcatgactg cctccaagta atagtctaga ctcgagggat ccatcgagca acttgtttat 1080tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt 1140tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg 1200gatcgtctag catcgaa121权利要求
1.一种具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，其特征是在人类5型腺病毒基因组的基础上，同时完全缺失Elb-55kDa和Elb-19kDa蛋白基因，将其增殖必需基因E1a突变为mE1a289R和mE1a243R序列，并在mE1a289R和mE1a243R序列之前插入一种肿瘤特异性嵌合启动子，该病毒基因组中还插入了抗肿瘤基因表达盒如血管内皮抑素基因。
2.根据权利要求1所述的具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，其特征是增殖必需基因mE1a289R和mE1a243R的序列分别为mE1a289RatgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgattgatcttacctgctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccctggacacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagggaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataamE1a243Ratgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgattgatcttacctgctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagggaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataa
3.根据权利要求1所述的具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，其特征是以肿瘤特异性嵌合启动子的顺式作用元件控制病毒增殖必需基因，该嵌合启动子由敲除了沉默子的人端粒酶逆转录酶启动子-304～+48bp核心序列和人肿瘤表皮生长因子受体增强子组成，该顺式作用元件插入增殖必需基因序列的转录起始位点与翻译起始位点ATG之间，其序列为gcagggtgcgagacccaggcagaaacattttgctggatgaggaggaaagatgtaaggttgctccccttcagagacagcaaagggcaggtctgtagcttcacttacttcaggattgtgatttttgacagagccgagagatcagggttgttgaaccaggcctgaaggtcctagtgaatctcgtgaagagaggaggggtctggctgtaacatggacctagaggacatttttactgcaggagaaggaacagtggggatggggtggacttgccaaaggaatatagctcaagttcctgcagcccaaaaaagctcagtttcttttggccaaagcttcgcgcgggcggggaagcgcggcccagaccccgcggtccgcccggagcagctgcgctgtcggggccaggccgggctcccagtggattcgcgggatctcacagacgcccaggaccgcgcttcccacgtggcggagggactggggacccgggcacccgtcctgccccttcaccttccagctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtcccgacccctcccgggtccccggcccagccccctccgggccctcccagcccctccccttcctttccgcggccccgccctctcctcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcgtcctgctgcgcacgtgggaagccctggccccggccac
4.根据权利要求1所述的具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，其特征是增殖必需基因完整表达序列上游预置了基因克隆位点BglII，下游预置了基因克隆位点SalI和AccI。
5.根据权利要求1所述的具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，其特征是编码血管内皮抑素的核苷酸序列直接插入该溶瘤腺病毒突变体基因组中的外源基因克隆位点BglII；血管内皮抑素的核苷酸序列前插入了M-成瘤蛋白信号肽编码序列，其完整序列为atgggggtacttgctcacacagaggacgctgctcagtctggtccttgcactcctgtttccaagcatggcgagccagcagccaccgcgacttccagccggtgctccacctggttgctgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgcggggccgacttccagtgcttccagcaggcgcgggccgtggggctggcgggcaccttccgcgccttcctgtcctcgcgcctgcaggacctgtacagcatcgtgcgccgtgccgaccgcgcacgcgtgcccatcgtcaacctcaaggacgagctgctgtttcccagctgggaggctctgttctcaggctctgagggtccgctgaagcccggggcacgcatcttctcctttaacggcaaggacgtcctgaggcaccccacctggccccagaagagcgtgtggcatggctcggaccccaacggcgcaggctgaccgagagctactgtgagacgtggcggacggaggctccctcggccacgggcaggcctcctcgctgctgggggcaggctcctggggcagagtgccgcgagctgccatcacgcctacatcgtgctatgcattgagaacagcttcatgactgcctccaagtaatag
6.根据权利要求1所述的具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，其特征是抗肿瘤基因表达盒中编码血管内皮抑素的核苷酸序列受人类巨细胞病毒(CMV)启动子的控制，该启动子插入内皮抑素的核苷酸序列的转录起始位点与翻译起始位点之间。
7.根据权利要求1所述的具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，其特征是抗肿瘤基因表达盒中编码血管内皮抑素的核苷酸的加尾序列为SV40Poly A，该顺式作用元件插入内皮抑素的核苷酸序列的翻译终止密码子之后。
8.根据权利要求1所述的具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，其特征是增殖必需基因mE1a289R和mE1a243R突变序列由多核糖体进入位点(IRES)序列连接。
9.根据权利要求1所述的具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，其特征是增殖必需基因mE1a289R和mE1a243R突变序列中CR2保守区引入缺失突变，第125-128位氨基酸残基的编码序列(CACGAGGCTGGC)缺失。
10.根据权利要求1所述的具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，其特征是增殖必需基因mE1a289R和mE1a243R突变序列第120位氨基酸残基的密码子突变(ATC-ATT)，146、147位氨基酸残基的密码子突变(CCCGGG-CCTGGA)，219位氨基酸残基的密码子突变(AGA-AGG)。
11.根据权利要求1或2或3或4或5或6或7或8或9或10所述的具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，其特征在于，该病毒突变体的序列为腺病毒5型基因组序列-ttcatcaataatataccttattttggattgaagccaatatgataatgagggggtggagtttgtgacgtggcgcggggcgtgggaacggggcgggtgacgtagtagtgtggcggaagtgtgatgttgcaagtgtggcggaacacatgtaagcgacggatgtggcaaaagtgacgtttttggtgtgcgccggtgtacacaggaagtgacaattttcgcgcggttttaggcggatgttgtagtaaatttgggcgtaaccgagtaagatttggccattttcgcgggaaaactgaataagaggaagtgaaatctgaataattttgtgttactcatagcgcgtaatatttgtctagggccgcggggactttgaccgtttacgtggagactcgcccaggtgtttttctcaggtgtttccgcgttccgggtcaaagttggcgttttattattatagtcagttctagcagatctaattccctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctggggatcagtcttcgagtcgacaagcttgaattcaccatgggggtacttgctcacacagaggacgctgctcagtctggtccttgcactcctgtttccaagcatggcgagccagcagccaccgcgacttccagccggtgctccacctggttgctgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgcggggccgacttccagtgcttccagcaggcgcgggccgtggggctggcgggcaccttccgcgccttcctgtcctcgcgcctgcaggacctgtacagcatcgtgcgccgtgccgaccgcgcacgcgtgcccatcgtcaacctcaaggacgagctgctgtttcccagctgggaggctctgttctcaggctctgagggtccgctgaagcccggggcacgcatcttctcctttaacggcaaggacgtcctgaggcaccccacctggccccagaagagcgtgtggcatggctcggaccccaacggcgcaggctgaccgagagctactgtgagacgtggcggacggaggctccctcggccacgggcaggcctcctcgctgctgggggcaggctcctggggcagagtgccgcgagctgccatcacgcctacatcgtgctatgcattgagaacagcttcatgactgcctccaagtaatagtctagactcgagggatccatcgagcaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatcgtctagcatcgaagatctgcagggtgcgagacccaggcagaaacattttgctggatgaggaggaaagatgtaaggttgctccccttcagagacagcaaagggcaggtctgtagcttcacttacttcaggattgtgatttttgacagagccgagagatcagggttgttgaaccaggcctgaaggtcctagtgaatctcgtgaagagaggaggggtctggctgtaacatggacctagaggacatttttactgcaggagaaggaacagtggggatggggtggacttgccaaaggaatatagctcaagttcctgcagcccaaaaaagctcagtttcttttggccaaagcttcgcgcgggcggggaagcgcggcccagaccccgcggtccgcccggagcagctgcgctgtcggggccaggccgggctcccagtggattcgcgggatctcacagacgcccaggaccgcgcttcccacgtggcggagggactggggacccgggcacccgtcctgccccttcaccttccagctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtcccgacccctcccgggtccccggcccagccccctccgggccctcccagcccctccccttcctttccgcggccccgccctctcctcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcgtcctgctgcgcacgtgggaagccctggccccggccactcgagaattcaccatgagacatattatctgccacggaggtgtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgattgatcttacctgctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccctggacacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagggaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataacgcgtcgagcatgcatctagggcggccaattccgcccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgtgattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataagcttgccacaacccgggatcctctagaaccatgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgattgatcttacctgctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagggaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataagtcgacttcgagcaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatcgtctagcatcgaagatccaataacttcgtatagcatacattatacgaagttat-腺病毒5型基因组序列其中，(1).腺病毒5型基因组序列见Microbix Biosystems公司的pBHGloxdeltaE1，3Cre序列；(2).2-102腺病毒ITR序列；(3).103-454腺病毒5型基因组序列；(4).467-1677内皮抑素表达盒(hCMV启动子+M-成瘤蛋白信号肽和内皮抑素cDNA+SV40 PolyA)；(5).1682-2368由EGFR增强子和端粒酶逆转录酶启动子核心序列组成的肿瘤特异性嵌合启动子；(6).2382-3238mE1a289R编码序列；(7).3251-3855多核糖体进入位点(IRES)；(8).3878-4597mE1a243R编码序列；(9).4604-4764SV40 Poly A；(10).4765-4798LoxP序列。
12.根据权利要求3所述的具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，其特征是肿瘤特异性嵌合启动子由以下任何两组肿瘤特异性启动子和增强子组成(a)癌胚抗原启动子、增强子及其突变体序列；(b)甲胎蛋白启动子、增强子及其突变体序列；(c)人表皮生长因子受体家族(EGFRs)的受体酪氨酸激酶(包括EGFR、Her-2、Her-3和Her-4)启动子、增强子及其突变体序列；(d)乳腺癌相关抗原DF3/MUC1启动子、增强子及其突变体序列；(e)血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR的启动子、增强子及其突变体序列；(f)L-plastin启动子、增强子及其突变体序列；(g)凋亡抑制蛋白家族(IAP)成员的启动子、增强子及其突变体序列；(h)前列腺素特异性抗原的启动子、增强子及其突变体序列；(i)缺氧诱导因子-1(HIF-1)调控的缺氧反应元件保守序列；(j)转录因子E2F启动子、增强子及其突变体序列。
13.根据权利要求1所述的具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，其特征是Elb-55kDa蛋白基因缺失，通过对编码Elb-55kDa蛋白的基因序列点突变、完全或部分缺失、插入突变或者插入终止密码子的方式实现。
14.根据权利要求1所述的具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，其特征是Elb-19kDa蛋白基因缺失，通过对编码Elb-19kDa蛋白的基因序列点突变、完全或部分缺失、插入突变或者插入终止密码子的方式实现。
15.根据权利要求1和5所述的具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，其特征是抗肿瘤基因选自下列任意一种(a)干扰素系列免疫调节因子基因；(b)白细胞介素系列免疫调节因子基因；(c)细胞集落刺激因子基因；(d)抑癌基因；(e)原癌基因反义序列；(f)人肿瘤表皮生长因子受体家族(EGFRs)的抗体基因；(g)具有抗血管生成的内皮抑素、血管抑素及其片段、纤溶酶原激活因子抑制剂、Canstatin、血小板反应蛋白等核苷酸序列；(h)细胞凋亡诱导因子家族基因；(i)血管内皮生长因子抗体基因；(j)药物前提转化基因(又称自杀基因)；(k)肿瘤坏死因子基因。
16.根据权利要求6所述的具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，其特征是编码血管内皮抑素的核苷酸序列的启动子是以下任意一种(a)癌胚抗原启动子；(b)甲胎蛋白启动子；(c)人表皮生长因子受体家族(EGFRs)的受体酪氨酸激酶(包括EGFR、Her-2、Her-3和Her-4)启动子；(d)乳腺癌相关抗原DF3/MUC1启动子；(e)血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR的启动子；(f)单纯疱疹病毒启动子；(g)E2F启动子；(h)前列腺素特异性抗原的启动子。
17.根据权利要求8所述的具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，其特征是肿瘤特异性启动子包含以下任意两组的组合(a)癌胚抗原启动子、增强子及其突变体序列；(b)甲胎蛋白启动子、增强子及其突变体序列；(c)人表皮生长因子受体家族(EGFRs)的受体酪氨酸激酶(包括EGFR、Her-2、Her-3和Her-4)启动子、增强子及其突变体序列；(d)乳腺癌相关抗原DF3/MUC1启动子、增强子及其突变体序列；(e)血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR的启动子、增强子及其突变体序列；(f)L-plastin启动子、增强子及其突变体序列；(g)凋亡抑制蛋白家族(IAP)成员的启动子、增强子及其突变体序列；(h)前列腺素特异性抗原的启动子、增强子及其突变体序列；(i)缺氧诱导因子-1(HIF-1)调控的缺氧反应元件保守序列；(j)转录因子E2F启动子、增强子及其突变体序列。
18.根据权利要求9所述的具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，其特征是mE1a289R和mE1a243R的突变方式是对CR2区第120-140位氨基酸残基的编码序列点突变和部分缺失突变。
全文摘要
本发明涉及一种具有多重抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体，ntk生物医学领域。该腺病毒突变体Elb－55kDa和Elb－19kDa基因缺失，在其增殖必需基因Ela突变序列mEla289R和mEla243R之前插入由人端粒酶逆转录酶启动子核心序列和人肿瘤表皮生长因子受体增强子组成的嵌合启动子，使病毒能在癌细胞内特异性增殖，发挥病毒溶瘤作用以及mEla蛋白抗癌作用，同时增加癌细胞对放化疗的敏感性，而对正常细胞没有影响。该病毒突变体基因组中插入了人内皮抑素基因表达盒，随病毒在癌细胞内复制，使内皮抑素基因扩增并在肿瘤内高效表达，抑制肿瘤新生血管形成，达到抑制癌细胞增殖及转移、诱导癌细胞凋亡的作用。该新型溶瘤腺病毒突变体在基因治疗中具有良好的临床应用前景，可用于多种人体肿瘤的治疗。
文档编号C12N15/12GK1884556SQ200610085549
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月22日 优先权日2006年6月22日
发明者苏长青 申请人:江苏舜唐生物工程有限公司