专利名称：可修复仔猪胰岛细胞的生产方法
技术领域：
本发明涉及生物细胞技术领域，特别是一种可修复仔猪胰岛细胞的生产方法，利用该细胞可临床应用于糖尿病患者的胰岛移植。
背景技术：
糖尿病是危害人类健康的全球性疾病。发病率为3-5％；死亡率仅次于心血管病和肿瘤。预测到2025年全世界糖尿病患者将达到3亿人。其中I型糖尿病患者(IDDM)将占到5-10％；这些人群将终生依赖外源性胰岛素。长期注射胰岛素可使局部皮肤红肿、发痒、硬结、感染、皮下脂肪萎缩或纤维化增生。每天注射胰岛素不仅给患者带来不便及痛苦，更重要的是胰岛素的应用仅能控制高血糖，无法预防其慢性并发症的发生。多年来大量实验证明异种胰岛素细胞移植，不仅能逆转(IDDM)I型糖尿病患者的高血糖症状，而且还能防止慢性并发症的发生及发展。但，胰岛细胞的移植应用到临床需解决几个关键性技术问题。一是胰岛细胞供体的来源。二是胰岛细胞的分离及纯化。三是胰岛细胞培养、训化、诱导。四是移植部位的选择。这些环节关键技术必须应用现代生物高新技术给予解决，否则缺少那一部分，都会导致胰岛细胞移植治疗I型糖尿病的失败，造成糖尿病复发。
胰岛细胞移植治疗I型糖尿病的现况二十世纪九十年代胰岛移植的临床应用研究已成为移植界研究的热点。据有关资料报导，1989年至2003年已有三个国家七十多例I型糖尿病患者接受了猪胰岛移植。初期，国内外研究者采用人胚胎胰岛进行移植，而I型糖尿病发病的机理是自身免疫损伤造成的，虽然同种移植不产生排斥反应，但自身免疫性对移植的胰岛的破坏是避免不了的。再加上人胚胎供体缺乏、伦理道德等因素限制了此项工作的推广及开展。后来人们发现猪的胰岛素在临床上应用十多年，安全性、有效性得到充分证明，从分子生物学及组织学分析人与猪的胰岛素结构极为相似，都有A链、B链、51个氨基酸组成；A链都含21个氨基酸、B链30个氨基酸。不同的是人B链第30位氨基酸是苏氨酸；猪B链第30位丙氨酸。氨基酸的差异未影响特定立体结构，所以生物功能活性没有发生改变。这样猪胰岛作为供体引起研究者极大兴趣。为了得到纯化胰岛，在对胰腺分离时采用了胶原酶消化法，此方法在实验室可得到纯化胰岛，但忽略了胰岛和胶原酶接触后产生不可修复的副作用。胶原酶在消化过程中易产生胶状物。此物不易洗脱，易粘附在生物膜上影响胰岛细胞在生长、更新过程中对营养物质的吸收，同时也影响着细胞新陈代谢产物的排出。另外胶原酶是一种较强的趋化剂、黏附到胰岛细胞膜上对巨噬细胞有较强趋化性，这样不仅没有减少排斥作用，而又加大了免疫系统的排斥反应。胶原酶的消化易产生大量的凝血因子，会增加移植后血管内凝血的危险性，不利于胰岛移植后在血液内长期生存。在细胞培养方面，各实验室都采用RPMI1640培养液，另加入小牛血清或胎牛血清。但血清的成分复杂，易造成不良的培养效果。
发明内容
本发明的目的正是针对上述现有技术中所存在的问题而研制的一种可修复仔猪胰岛细胞的生产方法。
本发明的目的是通过以下方案来实现的本发明的可修复仔猪胰岛细胞的生产方法包括以下工艺步骤(1)、胰岛细胞供体的选择供体选择刚出生、未哺乳健康仔猪，无菌下开腹取胰腺，去除包膜、血管、结缔组织并置4℃Hank｀s液中；(2)、胰岛细胞的分离及纯化通过机械研磨使胰岛与外分泌组织分离。再通过Dextran(葡聚糖-上海试剂二厂产品)不连续密度梯度离心，得到胰岛细胞，取样镜检形态、活性纯度、数量、收集，从分离到纯化结束应控制在4-6小时；(3)、胰岛细胞的培养应用无血清微球载体进行CO2培养，采用RPMI-1640培养液，并加入纤维连接蛋白，在培养过程中，将胰岛细胞包于A-P-A生物膜内形成微球，适时检测微囊形态、活性、计数，在恒温37℃含CO2培养箱内培养，48小时换一次培养液，定期取培养液测定胰岛素含量。观察记录胰岛细胞在微囊内分化、生长、分泌胰岛素功能来判定终止培养时间，最终可获得大量具有活性和纯度较大的微囊新生仔猪胰岛细胞。
在本发明中，所述仔猪为刚出生24小时内且系杂交后代。
胰岛细胞的分离及纯化的具体步骤为
①分离胰岛a、采用VI6型振动式细胞球珠研磨仪使胰岛与其它胰腺部分脱离(研磨10min)；b、将研磨浆放入4℃Hank｀s液中，过500μm金属不绣钢网；c、未过网组织再研磨，过网反复多次，使研磨浆通过500μm金属不绣钢网；d、将收集的过滤物在4℃环境中，用1500r/min离心5分钟，收集沉淀物R，弃去上清液；②纯化用葡聚糖不连续密度梯度离心，操作如下a、用15ml、27％的Dextrna(葡聚糖-上海试剂二厂产品)与沉淀物充分混匀，在此基础上缓慢加入4ml、27％的Dextran；6ml、23％的Dextran；4ml、11％的Dextran及4ml的Hank｀s；b、用4℃、600r/min离心4min；c、然后加速到2500r/min离心10min；d、收集11％-23％两层的胰岛细胞；e、用RPMI-1640液洗两次，弃去上清液，收集细胞沉淀Sf、将细胞沉淀S与10mlRPMI-1640混匀，取样镜检，观察胰岛形态、活性、纯度、数量、成活率；g、从分离到纯化结束应控制在4-6小时。
本发明的创新点如下<一>供体的选择1.刚出生不超过一天(未哺乳)仔猪。因刚离开母体，未与外界接触。只要对仔猪的父系母系认真检查，就能杜绝传染病的发生，就能保证人移植后的安全性。
2.利用杂交优势的特点，细胞易诱变，易适应新环境。
3.猪胰岛细胞在胚胎后期基本成熟。而胰腺外分泌部分，发育落后于胰岛。这样易于辨别胰岛和外分泌组织。便于胰岛的纯化。
4.刚生一天仔猪(未哺乳)和胎猪比较不用任何手术；和幼猪比较没接触外界安全性大；与成猪比较胰岛刚刚成熟，免疫抗原性低；通过培养训化、诱导可发挥杂交、不成熟胰岛的可塑性，向人类希望的方面发展而且成本低，适合产业化生产。
<二>胰岛细胞的分离纯化。
由于猪胰岛分化、发育成熟到胚胎后期，胰腺的分泌组织在分娩时还不成熟。故不宜用常规胶原酶消化分离。酶对胰岛细胞的不可修复的副作用，是导致胰岛移植后生长、更新能力低、活性、功能差、不能长期存留于人体的主要原因。因此采用VI6型振动式细胞球珠研磨机。(Johanna Otto公司产品)通过机械研磨使胰岛与外分泌组织分离。再通过Dextran(葡聚糖-上海试剂二厂产品)不连续密度梯度离心，得到胰岛细胞。
<三>应用无血清微球载体进行培养。
1.在培养基中加入纤维连结蛋白(FN)，按体积每升培养基加入FN 5-30mg，它促进了细胞的贴壁粘连生长。粘连是动物细胞完成生长的必要条件。
2.在培养过程中，将胰岛细胞包于A-P-A生物膜内形成微球，这样不仅保护了胰岛细胞免受排斥反应的攻击，同时也为胰岛细胞的融合、贴壁创造了条件。
A-P-A为海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠微囊技术的缩写。(参考文献《国外医学外科学分册》，2000年第27卷第2期。P75-77)本发明所采用的细胞分离、纯化、培养技术与现有技术相比，其优点在于由于胰岛移植物在通常的纯化过程中直接丢失胰岛数量较多，且往往由于用力振荡、高速离心、制备时间延长等容易死亡。现在证实细胞支架通过跨膜粘合素分子与细胞外基质紧密相连，形成具有结构和功能的大量网络。当细胞分离或细胞移植时，细胞支架，细胞外基质复合体破裂，粘合素分子传递细胞死亡信号。实验表明细胞与其细胞外基质断离将通过一种粘合素分子介导的死亡信号引起凋亡。专家在实验室中观察到分离过程中不完全消化时，胰岛包埋在一圈细胞外基质中，其凋亡率很低(＜10％)而高度纯化后的胰岛有极高的凋亡率(90％)，且前者持续有良好的胰岛素分泌功能。这表明分离的胰岛移植物高度无活性和功能缺失，如果在分离过程中加入了纤维连接蛋白，可减少游离胰岛的凋亡，胰岛存活率可达到90％以上，数量较多，体积较大。这些大块的胰岛细胞团植入时不易因门静脉血流或压力而丢失。
本发明的工艺线路图为
具体实施方案本发明以下结合具体步骤过程进一步描述如下一、异种胰岛的选择1.新生仔猪胰岛的特性(1)人和猪的胰岛素分子都具有A链和B链，都是由51个氨基酸组成。A链含21个氨基酸，B链含30个氨基酸。并且A、B链之间都有双硫链连接。结构极为相似，不同的只有一个氨基酸之差。人胰岛素B链第30位氨基酸为苏氨酸。猪胰岛素B链第30位氨基酸为丙氨酸。(2)猪胰岛素用于临床治疗I型糖尿病患者已有十多年历史，充分证明了猪胰岛素用于人后的安全性和有效性。(3)新生猪胰岛免疫原性弱，产生排斥反应小。(4)猪胰岛细胞在含有人新鲜血清培养基里能很好地存活及增值。表明人的血清对猪胰岛无细胞毒作用，有利于移植后的训化、诱导及生长。(5)刚出生小猪特别是胰腺细胞还未分化完成。在异境环境培养，发挥新生猪的可塑性。(6)新生猪与外界接触少，只要母系、父系没有人、畜共患传染病，新生猪就不会有传染病，但新生仔猪的母、父系要有系谱、病历、体检、防疫档案。有法定有关部门认可后，方可应用。
2.生物安全性措施(1)动物细胞从离体到培养必须在短时间内完成，但为了人类安全，新生仔猪在取胰、处死前还要作病毒抗体检查(肝炎病毒、免疫缺陷病毒、巨细胞病毒)。(2)胰岛细胞在培养过程中要跟踪检测、注意异常情况发生。(3)在胰岛移植前对微囊的机械性能，生物膜对大分子的控制性；营养物质、胰岛细胞本身代谢产物的通透性；细胞的形态、纯度、数量、胰岛素的释放量等都要认真检测，作出记录。
二、新生仔猪解剖前处理1.体检、编号、称重、来源、性别、身体状况、器官、四肢是否异常、体温、病毒抗体检查。
2.用自来水洗去体表污染物。
3.用酒精在体表消毒。
4.用灭菌的纱布包裹。
5.通过传递窗进入无菌解剖室。
三、新生仔猪解剖取胰腺1.在无菌状态下，用氯胺酮将仔猪麻醉，腹腔内注射(每公斤体重用量17mg)。
2.将新生仔猪固定在解剖台上(宽*深*高)1200×750×860mm。
3.剖腹首先检查仔猪麻醉程度，体温、心跳、呼吸是否正常，然后按手术常规进行消毒、剖腹。沿十二指肠系膜，找出胰腺。<1>称重作记录。<2>去掉胰头(粗大端)收集胰体和胰尾(狭窄部分)，称重，用4℃Hank｀s液洗两次。
4.在无菌托盘中，用手术剪除去肉眼可看到的胰岛膜、血管、结缔组织。
四、分离胰岛1.采用VI6型振动式细胞球珠研磨仪使胰岛与其它胰腺部分脱离(研磨10min)。
2.将研磨浆放入Hank｀s液中，过500μm金属不绣钢网。
3.未过网组织再研磨，过网反复多次，使研磨浆通过500μm金属不绣钢网。
4.将收集的过滤物再4℃，用1500r/min离心5分钟，收集沉淀物R，弃去上清液。
五、纯化用葡聚糖不连续密度梯度离心，操作如下1、用15ml、27％的Dextrna与沉淀物R充分混匀，在此基础上缓慢加入4ml、27％的Dextran；6ml、23％的Dextran；4ml、11％的Dextran及4ml的Hank｀s；2、用4℃、600r/min离心4min；3、然后加速到2500r/min离心10min；4、收集11％-23％两层的胰岛细胞；5、用RPMI-1640液洗两次，弃去上清液，收集细胞沉淀S6、将细胞沉淀S与10mlRPMI-1640混匀，取样镜检，观察胰岛形态、活性、纯度、数量、成活率；7、从分离到纯化结束应控制在4-6小时。
六、胰岛计数1.将梯度离心收集的胰岛细胞沉淀用双硫腙(DTZ)溶液双硫腙10mg；99.5％二甲基亚枫3ml；25％氨水50μl进行染色，在显微镜下计数(镜下胰岛细胞呈红色或腥红色，形状呈圆形，胞浆丰满桔黄色，半透明，边缘清晰，其它组织和细胞不着色，对比非常鲜明)胰岛细胞直径50-300μm，大小不等，重复取样三次计数，求平均值。
2.用台盼兰染色判别胰岛死活，活细胞不着色，死细胞呈兰色。(镜下观察)。
3.一个患者一次移植需要36-40万个胰岛。(约有20-25头新生仔猪胰腺提供)。
七、胰岛微囊技术
将36-40万个活胰岛细胞用静电高压微囊发生仪采用A-P-A微囊技术制成微囊胰岛细胞(参考文献《(国外医学外科学分册》，2000年第27卷第2期P75-77)。
微囊胰岛形态学鉴定(1)光镜检查，微囊直径应为0.25-0.35mm(2)在37℃恒温水浴振荡仪中以150次/min经振荡24小时观察微囊破损率(3)荧光染色用等渗磷酸盐缓冲液配制啶橙(AO)670μmol/L和碘丙啶(PI)750μmol/L储存液置4℃储存，临用前配成(AO)浓度为0.67μmol/L和(PI)浓度为57μmol/的混合液进行染色，活细胞呈绿色且看到荧光，死细胞呈红色，之间区别很明显。
(4)胰岛计数的公式N＝用微量加样器定量吸取悬液的微升数(5)纯化后胰岛回收公式回收率＝纯化后镜检胰岛数/纯化前镜检胰岛数×100％(6)胰岛纯度估计以倒置显微镜下胰岛数与外分泌组织细胞数量之比来估算纯度。
八、微囊胰岛细胞培养1.在恒温37℃、CO2培养箱内培养，48小时换一次培养液，定期取培养液测定胰岛素含量。观察胰岛细胞在微囊内分化、生长、分泌胰岛素功能来判定终止培养时间。
2.RPMI-1640培养液，加入纤维连接蛋白进行无血清培养，诱导细胞贴壁结团生长、分化。
九、培养好的胰岛，最好要当天移植，冷藏对细胞生长、移植有一定影响。
权利要求
1.一种可修复仔猪胰岛细胞的生产方法，其特征在于它包括以下工艺步骤(1)、胰岛细胞供体的选择供体选择刚出生、未哺乳健康仔猪，无菌下开腹取胰腺，去除包膜、血管、结缔组织并置4℃ Hank`s液中；(2)、胰岛细胞的分离及纯化通过机械研磨使胰岛与外分泌组织分离。再通过Dextran不连续密度梯度离心，得到胰岛细胞，取样镜检形态、活性纯度、数量、成活率，从分离到纯化结束时间控制在4-6小时；(3)、胰岛细胞的培养应用无血清微球载体进行培养，采用RPMI-1640培养液，培养液中不含牛血清，并加入纤维连接蛋白(FN)，加入量按培养基体积每升加FN 5---30mg，在培养过程中，将胰岛细胞包于A-P-A生物膜内形成微球，适时检测微囊形态、活性、计数，在恒温37℃CO2培养箱内培养，48小时换一次培养液，定期取培养液测定胰岛素含量；观察记录胰岛细胞在微囊内分化、生长、分泌胰岛素功能来判定终止培养时间，最终得到活性好、纯度高的微囊新生仔猪胰岛细胞。
2.根据权利要求1所述的可修复仔猪胰岛细胞的生产方法，其特征在于所述仔猪为刚出生24小时内且系杂交后代。
3.根据权利要求1所述的可修复仔猪胰岛细胞的生产方法，其特征在于胰岛细胞的分离及纯化的具体步骤为①分离胰岛a、采用VI6型振动式细胞球珠研磨仪使胰岛与其它胰腺部分脱离，研磨10min；b、将研磨浆放入4℃Hank`s液中，过500μm金属不绣钢网；c、未过网组织再研磨，过网反复多次，使研磨浆通过500μm金属不绣钢网；d、将收集的过滤物在4℃环境中，用1500r/min离心5分钟，收集沉淀物R，弃去上清液；②纯化用葡聚糖不连续密度梯度离心，操作如下a、用15ml、27％的Dextrna与沉淀物R充分混匀，在此基础上缓慢加入4ml、27％的Dextran；6ml、23％的Dextran；4ml、11％的Dextran及4ml的Hank`s；b、用4℃600r/min离心4min；c、然后加速到2500r/min离心10min；d、收集11％-23％两层的胰岛细胞；e、用RPMI1640液洗两次，弃去上清液，收集细胞沉淀S；f、将细胞沉淀S与10mlRPMI1640混匀，取样镜检，观察胰岛形态、活性、纯度、数量、成活率；g、从分离到纯化结束时间控制在4-6小时。
全文摘要
一种可修复仔猪胰岛细胞的生产方法，其特征在于包括以下工艺步骤(1).供体的选择供体选择刚出生、未哺乳健康仔猪，无菌下开腹取胰腺，去除包膜、血管、结缔组织并置4℃ Hank`s液中；(2).胰岛细胞分离及纯化通过机械研磨使胰岛与外分泌组织分离。再通过Dextran不连续密度梯度离心，得到胰岛细胞；(3).胰岛细胞培养应用无血清微球载体进行CO
文档编号C12N5/071GK1920009SQ200610107058
公开日2007年2月28日 申请日期2006年9月18日 优先权日2006年9月18日
发明者张俊英, 王斌, 王章存, 范清堂 申请人:郑州福恩生物工程技术有限公司