专利名称：一种蒜氨酸酶的一步分离纯化方法
技术领域：
本发明属于新鲜大蒜中所含成分的分离纯化方法，尤其涉及新鲜大蒜中的 蒜氨酸酶的分离纯化方法。
背景技术：
1948年Arthur Stoll和Ewald Seebeck发现大蒜中存在一种酶，并把它命名 为蒜氨酸酶。之后对蒜氨酸酶的研究一直没有中断，后来研究发现蒜氨酸酶 (EC.4 4 1 4)是存在于大蒜中的一种内源酶，全称为S-烷基-L-半胱氨酸 亚砜酶，其是一种均一的二聚体糖蛋白，大约占蒜中可溶性蛋白质的10-12%。 完整无损的大蒜中，蒜氨酸酶和它的天然底物S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜(蒜 氨酸)等存在于大蒜的不同部位，蒜氨酸酶存在于液泡组织中，而底物则存在 于细胞质中，只有当大蒜破损，两者才能相互接触，蒜氨酸酶通过氨酰基中间 体与其辅助因子5，-磷酸吡哆醛结合在一起，经受-消除-去氨基作用裂解底物 成硫代亚磺酸酯。硫代亚磺酸酯类(R-S-S(O)-R)决定了大蒜的绝大部分特性， 是大蒜特有的风味物质，是大蒜产生的各种含硫化合物的前体物质，也是大蒜 具有许多生物活性功能的原因。故在大蒜加工过程中，蒜氨酸酶对于能否生产 出硫代亚磺酸酯保留率较高的优质干燥大蒜制品至关重要，所以对大蒜中蒜氨 酸酶进行分离纯化，以便对其性质进行研究，将具有非常重要的理论意义和实 践意义。但直到80年代后才将此酶纯化为均一的酶，且纯化步骤较为烦琐。
-般要对蒜氨酸酶粗酶液采用亲和层析的方法进行初步纯化，后采用 S叩herdex200凝胶柱层析才能得到纯度很高的蒜氨酸酶(如Kuettner Bartholomeus E.的制备方法)。有人采用Sephadex G-200柱层析分离纯化了蒜 氨酸酶，但此方法仅限于实验室分析，不能用于产业化生产。Rabinkov曾采用 克降技术将蒜氨酸酶克隆出来，这种方法较复杂。
发明内容
本发明目的是提供一种操作较简单的蒜氨酸酶的一步分离纯化方法，并且 使分离纯化制得的蒜氨酸酶可达到电泳纯；而且这种方法可以使用于产业化生产。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的这种蒜氨酸酶的一步分离纯化 方法是，在温度为0-4"C的条件下，按以下步骤完成
a、均浆把新鲜的大蒜粉碎，按每千克新鲜大蒜加入800—1200mLpH6-8
的缓冲液的量计算，在粉碎后的新鲜大蒜内加入缓冲液，同时进行搅拌使 它们混合均匀；
b、提取上清液将经步骤a所得物质进行冷冻离心处理，而后提取上清
液；
c、盐析在步骤b中提取的上清液内加入饱和硫酸胺溶液，加入同时进 行搅拌；
d、 溶解把经过盐析后得到的上清液做冷冻离心处理，而后去掉上清液，
留—1、'滤饼，再把滤饼重新溶于pH7的缓冲液内；
e、 超滤把溶解后的滤饼用截留分子量为1万-5万的滤膜过滤，得到截 留物，即为新鲜大蒜的蒜氨酸粗液；
f、 分离纯化把制得的新鲜大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryl S-200凝胶 柱进行分离并用pH6-8的缓冲液以10-60mL/h流速进行梯度洗脱，同时用紫 外检测仪在280nm进行检测，收集洗脱液组分；再把它透析得到纯化的蒜氨酸 酶。
在步骤a中所加入的缓冲液为磷酸缓冲液，它由NaH2P04、 Na2HP04、甘 油、NaCl、 EDTA，和磷酸吡哆醛配制而成；在粉碎后的新鲜大蒜中加入缓冲 液时，搅拌速度为每分鐘5000—10000转；
在歩骤b中，均浆后的物质冷冻离心3 — 57分钟；
在步骤d中，把经过盐析后的物质，做冷冻离心的时间为10—50分钟； 滤饼重新溶入的缓冲液为磷酸缓冲液，它由NaH2P04、 Na2HP04、蔗糖、NaCl 和磷酸吡够醛制成；
在步骤e中，应将溶解后的滤饼先做冷冻离心处理，而后再进行超滤，超 滤是在压力为0.25MPa的情况下操作的；
在步骤f中，缓冲液由NaH2P04、 Na2HP04、 NaC1、、磷酸吡哆醛制成。
在步骤a中所加入的磷酸缓冲液，其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液由 50-80mM jNaH2P04、 50-80 mM的Na2HP04、 8-12Q/。v/v的甘油、4-6%w/v 的NaCl、 4-6mM的EDTA、 4-6pM的磷酸吡哆醛配制而成；
在歩骤c中，所加入饱和硫酸胺溶液为30-60%的饱和硫酸胺溶液；
在步骤d中，滤饼重新溶入的磷酸缓冲液其配制比例为lOOOmL磷酸缓 冲液由55 —65mM的NaH2POj[1 55—65mM的Na2HP04、 8-12%v/v的蔗糖， 1-5%wZv的NaCJ、 l-10pM的磷酸吡眵醛配制而成；
在歩骤f中所采用的缓冲液其配制比例为1000mL的缓冲液由50-80 mM WNaH2P04、 50-80 mM的Na2HP04、 l-5%w/v的NaCl、 10-40 uM的磷酸妣眵醛配制而成。
在歩骤a中所加入的磷酸缓冲液，其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液由 50-60 mM的NaH2P04、 60-65 mM的Na2HP04、 10-12%v/v的甘油、4-6%w/v 的NaCl、 4-6mM的EDTA、 5pM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤d中滤饼重新溶入的磷酸缓冲液其配制比例为1000mL磷酸缓冲 液由60 — 65mM的NaH2P04、 55 —60mM的Na2HP04、10%v/v的蔗糖， l-5%w/v的NaCl、 5-10|iM的磷酸吡哆醛配制而成；
在歩骤f中所采用的缓冲液其配制比例为lOOOmL的缓冲液由55-70 mM 的NaH2P04、 60-70 mM的Na2HP04、 l-2%w/v的NaCl、 20-30 U M的磷酸吡 眵醛配制而成。
在歩骤f中，如若对3-15mL经处理好的新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液进行分 离纯化时，应将处理好的Sephacryl S-200凝胶柱填料装成1-2x100-200cm的柱； 缓冲液应以20-40mL/h流速进行梯度洗脱，洗脱体积在128-250mL的范围内收
J本;明用来分离纯化蒜氨酸酶的操作简便易行，仅采用一步凝胶柱层析就 可以得到纯化的蒜氨酸酶，且此纯化出来的蒜氨酸酶纯度高，反相HPLC图谱 测定结果表明蒜氨酸酶保留时间为3.458min，经过Sephacryl S-200凝胶柱一歩 分离蒜氨酸酶可达到很好的纯化效果。SDS-PAGE电泳显示经Sephacryl S-200 分离纯化后新鲜大蒜的蒜氨酸酶达到电泳纯，显示单带，蒜氨酸酶亚基相对分 子质量为53.8kDa，可作为一种新的蒜氨酸酶的分离纯化技术手段来对蒜氨酸 酶进行分离纯化，具有很大的应用前景。使用本发明中的方法，可以根据需要 分离纯化量的多少装成不同大小的凝胶柱，因此满足了产业化生产的需要。
图1为测定蒜氨酸酶纯度的反相HPLC图谱； 图2为分离纯化的蒜氨酸酶SDS-PAGE结果。
ft体实施方式
实施例1:以新鲜大蒜为原料按照下述方法和工艺条件制取蒜氨酸酶
a、把新鲜大蒜粉碎，而后按照1千克新鲜大蒜加入800mLpH6的缓冲液 A的量，在其内加入缓冲液A，并以5000转/分的速度搅拌0.5分钟。
b、提取上清液将经步骤a所得物质进行冷冻离心5 — 10分钟，而后提
取上清液；
C、盐析把由步骤b中提取的上清液内加入30%饱和硫酸胺溶液，同时
进行搅拌；d、 溶解把经过盐析后的上清液做冷冻离心处理10 —20分钟，而后去掉
丄〔:上清液，留下滤饼，再把滤饼重新溶于pH7的缓冲液B内；缓冲液B所用 的量为从10000克盐析后的上清液中得到的滤饼应溶于600mL的缓冲液B内。
e、 超滤把滤饼溶解后的物质，用截留分子量为1万的滤膜过滤，得到 截留物，即为新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液；
f、 把制得的新鲜大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryl S-200凝胶柱进行分离 纯化取经处理好的新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液3mL上柱，将处理好的Sephacryi S-200凝胶柱填料装成1xl00cm的柱，用pH6的缓冲液C以10mL/h流速进行 梯度洗脱，同时用紫外检测仪在280nm进行检测，在洗脱体积100mL — 200mL 的范围内收集洗脱液组分，而后将其透析，得到纯化的蒜氨酸酶。
本实施例的所有步骤均在0°C的温度条件下操作。
歩骤a中，所用的的磷酸缓冲液A其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液由 50-55 mM的NaH2P04、 50-55 mM的Na2HP04、 8-9%v/v的甘油、4%w/v 的NaCl、 4-5mM的EDTA、 4|iM的磷酸吡眵醛配制而成；
在步骤d中，所用的的磷酸缓冲液B其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液 由55mM的NaH2P04、 55mM的Na2HP04、 8%v/v的蔗糖、l%w/v的NaCl、 l|iM的磷酸吡眵醛配制而成；
在步骤g中所用的缓冲液c其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液由50 mM 的NaH2P04、 50 mM的Na2HP04、 1。/。w/v的NaCl、 10uM的磷酸吡眵醛配制 而成。
实施例2:本实施例中的分离纯化步骤与实施例l相同，其工艺条件如下
a、均浆在粉碎的新鲜大蒜中按照1千克新鲜大蒜加入1200mLpH8的缓冲液 A的量操作，在其内加入缓冲液A时，以10000转/分的速度搅拌。
b、提取上清液将经步骤a所得物质进行冷冻离心57分钟，而后提取上 清液；
C、盐析把由步骤b中提取的上清液内加入60%饱和硫酸胺溶液，同时
进行搅拌；
d、 溶解把经过盐析后的上清液做冷冻离心处理50分钟，而后去掉其上
清液，留下滤饼，再把滤饼重新溶于pH7的缓冲液B内；缓冲液B所用的量 为从10000克盐析后的上清液中得到的滤饼应溶于1400mL的缓冲液B内。
e、 超滤把滤饼溶解后的物质，以操作压力为0.25MPa，用截留分子量 为5万的滤膜过滤，得到新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液；
f、把制得的新鲜大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryl S-200凝胶柱进行分离 纯化时取经处理好的新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液15mL上柱，将处理好的 S印hacryl S-200凝胶柱填料装成2x200cm的柱，用pH8的缓冲液C以60mL/h 流速进行梯度洗脱，同时用紫外检测仪在280nm进行检测，在洗脱体积300mL 一400mL的范围内收集洗脱液组分，而后将其透析，得到纯化的蒜氨酸酶。
本实施例的所有步骤均在4'C的温度条件下操作。
歩骤a中，所用的的磷酸缓冲液A其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液由 80 mM的NaH2P04、 80 mM的Na2HP04、 12%v/v的甘油、6%w/v的NaCl 、 6mM的EDTA、 6jiM的磷酸吡眵醛配制而成；
在歩骤d中，所用的的磷酸缓冲液B其配制比例为1000mL磷酸缓冲液 由65mM的NaH2P04、65mM的Na2HP04、 12%v/v的蔗糖、5%w/v的NaCl、 10pM的磷酸吡眵醛配制而成；
在歩骤g中所用的缓冲液c其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液由80 mM WNaH2P04、 80 mM的Na2HP04、 5。/。w/v的NaCl、 40uM的磷酸吡眵醛配制 而成。
实施例3:本实施例中的分离纯化步骤与实施例1相同，其工艺条件如下:
a、 均浆在粉碎的新鲜大蒜中按照1千克新鲜大蒜加入1000mLpH7.0的 缓冲液A的量操作，在其内加入缓冲液A时，以8000转/分的速度搅拌l分 钟；
b、 提取上清液将经步骤a所得物质进行冷冻离心30分钟，而后提取上 清液；
c、 盐析把由步骤b中提取的上清液内加入45%饱和硫酸胺溶液，同时 进行搅拌；
d、 溶解把经过盐析后的上清液做冷冻离心处理30分钟，而后去掉其上 清液，留下滤饼，再把滤饼重新溶于pH7的缓冲液B内；缓冲液B所用的量 为从10000克盐析后的上清液中得到的滤饼应溶于1000mL的缓冲液B内。
e、 超滤把滤饼溶解后的物质，以操作压力为0.25MPa，用截留分子量 为3万的滤膜过滤，得到截留物，即为新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液；
f、 把制得的新鲜大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryl S-200凝胶柱进行分离 纯化时每次取经处理好的新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液9mL上柱，应将处理好 的Sephacryl S-200凝胶柱填料装成1.6x150cm的柱，用pH7.0的缓冲液C以 30mL/h流速进行梯度洗脱，同时用紫外检测仪在280nm进行检测，在洗脱体 积128mL—143mL的范围内收集洗脱液组分，而后将其透析，得到纯化的蒜氨酸酶。
本实施例的所有步骤均在2C的温度条件下操作。
步骤a中，所用的的磷酸缓冲液A其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液由 60 mM的NaH2P04、 60 mM的Na2HP04、10%v/v的甘油、5%w/v的NaCi、 5mM的EDTA、 5pM的磷酸吡眵醛配制而成；
在歩骤d中，所用的的磷酸缓冲液B其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液 由60mM的NaH2PO4、60mM的Na2HP04、 10%v/v的蔗糖、l%w/v的NaCl、 5pM的磷酸吡眵醛配制而成；
在歩骤g中所用的缓冲液c其配制比例为1000mL磷酸缓冲液由60 mM 的NaH，—P04、 60 mM的Na2HP04、 P/。w/v的NaCl、 25 u M的磷酸吡哆醛配制 而成。
实施例4:本实施例中的分离纯化步骤与实施例1相同，其工艺条件如下
a、 均浆在粉碎的新鲜大蒜中按照1千克新鲜大蒜加入900mLpH7.0的缓 冲液A的量操作，在其内加入缓冲液A时，以7000转/分的速度搅拌1.5分 钟；
b、 提取上清液将经步骤a所得物质先采用3000转/分的速度进行冷冻 离心3分钟，再采用10000转/分的速度冷冻离心10分钟，而后提取上清液；
c、 盐析把由步骤b中提取的上清液内加入35%饱和硫酸胺溶液，同时 进行20分钟搅拌；
d、 溶解把经过盐析后的上清液做冷冻离心处理20分钟，而后去掉其上 清液，留下滤饼，再把滤饼重新溶于pH7的缓冲液B内；缓冲液B所用的量 为从10000克盐析后的上清液中得到的滤饼应溶于700mL的缓冲液B内
e、 超滤把滤饼溶解后的物质，以操作压力为0.25MPa，用截留分子量 为2万的滤膜过滤，得到新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液；
i'、把制得的新鲜大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryi S-200凝胶柱进行分离 纯化时每次取经处理好的新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液5mL上柱，并把处理好 的Sephacryi S-200凝胶柱填料装成1.5x160cm的柱，用pH6的缓冲液C以 20mL/h流速进行梯度洗脱，同时用紫外检测仪在280nm进行检测，在洗脱体 积llOmL—120mL的范围内收集洗脱液组分，而后将其透析，得到纯化的蒜氨 酸酶。
本实施例的所有步骤均在rc的温度条件下操作。
歩骤a中，所用的的磷酸缓冲液A其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液由 55mM的NaH2P04、 55 mM的Na2HP04、 9%v/v的甘油、5%w/v的NaCl、 4mM
的EDTA、 6pM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤d中，所用的的磷酸缓冲液B其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液 由58mM的NaH2P04、 62mM的Na2HP04、 9%v/v的蔗糖、2%w/v的NaCl、
2(lM的磷酸吡P多醛配制而成；
在步骤g中所用的缓冲液c其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液由55 mM 的NaH2P()4、 55 mM的Na2HP04、 3%w/v的NaCl、 15 u M的磷酸吡眵醛配制而成。
实施例5:本实施例中蒜氨酸酶的分离纯化步骤与实施例1相同，其工艺条
件为
a、 均浆在粉碎的新鲜大蒜中按照l千克新鲜大蒜加入1100mLpH7.0的 缓冲液A的量操作，在其内加入缓冲液A时，以9000转/分的速度搅拌2分 钟；
b、 提取上清液将经步骤a所得物质先采用4000转/分的速度进行冷冻 离心7分钟，再采用20000转/分的速度冷冻离心30分钟，而后提取上清液；
c、 盐析把由步骤b中提取的上清液内加入50%饱和硫酸胺溶液，同时
进行30分钟搅拌；
d、 溶解把经过盐析后的上清液做冷冻离心处理40分钟，而后去掉其上
清液，留下滤饼，再把滤饼重新溶于pH7的缓冲液B内；缓冲液B所用的量 为从10000克盐析后的上清液中得到的滤饼应溶于1100mL的缓冲液B内。
e、 超滤把滤饼溶解后的物质，先做冷冻离心处理15分钟，而后以操作 压力为0.25MPa，用截留分子量为4万的滤膜过滤，得到新鲜大蒜的蒜氨酸粗 酶液；
f、 把制得的新鲜大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryl S-200凝胶柱进行分离 纯化时每次取经处理好的新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液10mL上柱，并把处理好 的Sephacryl S-200凝胶柱填料装成1.5x180cm的柱，用pH7的缓冲液C以 40mL/h流速进行梯度洗脱，同时用紫外检测仪在280nm进行检测，在洗脱体 积130mL—150mL的范围内收集洗脱液组分，而后将其透析，得到纯化的蒜氨
"本实施例的所有步骤均在3"C的温度条件下操作。
步骤a中，所用的的磷酸缓冲液A其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液由 65mM的NaH2P04、 70 mM的Na2HP04、 1P/。v/v的甘油、6y。w/v的NaCl、 5mM的EDTA、 6|iM的磷酸吡眵醛配制而成；
在歩骤d中，所用的的磷酸缓冲液B其配制比例为1000mL磷酸缓冲液
由62mM的NaH2P04、 57mM的Na2HP04、 11。/。v/v的蔗糖、4。/ow/v的NaCJ、 8fiM的磷酸吡眵醛配制而成；
在歩骤g中所用的缓冲液c其配制比例为1000mL磷酸缓冲液由65mM的 NaH2P04、 65 mM WNa2HP04、 4。/。w/v的NaCl、 30 P M的磷酸吡眵醛配制而成。
实施例6:本实施例中蒜氨酸酶的分离纯化步骤与实施例1相同，其工艺条
a、 均浆在粉碎的新鲜大蒜中按照1千克新鲜大蒜加入1050mLpH7.0的 缓冲液A的量操作，在其内加入缓冲液A时，以9500转/分的速度搅拌2分
钟；
b、 提取上清液将经步骤a所得物质先采用3500转/分的速度进行冷冻 离心5分钟，再采用18000转/分的速度冷冻离心35分钟，而后提取上清液；
c、 盐析把由步骤b中提取的上清液内加入55%饱和硫酸胺溶液，同时 进行40分钟搅拌；
d、 溶解把经过盐析后的上清液做冷冻离心处理30分钟，而后去掉其上
清液，留下滤饼，再把滤饼重新溶于pH7的缓冲液B内；缓冲液B所用的量 为从10000克盐析后的上清液中得到的滤饼应溶于800mL的缓冲液B内。
e、 超滤把滤饼溶解后的物质，先做冷冻离心处理15分钟，而后以操作 Hi力为0.25MPa，用截留分子量为3万的滤膜过滤，得到新鲜大蒜的蒜氨酸粗 酶液；
f、 把制得的新鲜大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryl S-200凝胶柱进行分离 纯化时每次取经处理好的新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液12mL上柱，并把处理好 的Sephacryl S-200凝胶柱填料装成1.8x160cm的柱，用pH7的缓冲液C以 50mL/h流速进行梯度洗脱，同时用紫外检测仪在280nm进行检测，在洗脱体 积330mL—350mL的范围内收集洗脱液组分，而后将其透析，得到纯化的蒜氨
本实施例的所有步骤均在4i:的温度条件下操作。
歩骤a中，所用的的磷酸缓冲液A其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液由 70mM的NaH2P04、 75mM的Na2HP04、 8%v/v的甘油、5%w/v的NaCl、 5mM 的EDTA、 5pM的磷酸吡哆醛配制而成；
在步骤d中，所用的的磷酸缓冲液B其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液 由58mM的NaH2P04、61mM的Na2HP04、 10%v/v的蔗糖、2。/。w/v的NaCl、 6pM的磷酸吡眵醛配制而成；
在歩骤g中所用的缓冲液c其配制比例为1000mL磷酸缓冲液由70mM的 NaH2P04、 75 mM的Na2HP04、 2%w/v的NaCl、 20 y M的磷酸卩比眵醛配制而成。
实施例7:本实施例中
在步骤a中，所用的的磷酸缓冲液A其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液 由52mM的NaH2P04、 78mM的Na2HP04、 9%v/v的甘油、5%w/v的NaCl、 6mM的EDTA、 2.5pM的磷酸吡卩多醛配制而成；
在歩骤d中，所用的的磷酸缓冲液B其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液 山63mM的NaH2P04、 54mM的Na2HP04、 9%v/v的蔗糖、3%w/v的NaCJ、 4jiM的磷酸吡n多醛配制而成；
在歩骤g中所用的缓冲液c其配制比例为1000mL磷酸缓冲液由76mM的 NaH2P04、 52 mM的Na2HP04、 3。/。w/v的NaCl、 35 u M的磷酸吡眵醛配制而 成。本实施例中的分离纯化步骤，及其他工艺条件均与实施例1相同。
实施例8:本实施例中
在步骤a中，所用的的磷酸缓冲液A其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液 由50mM WNaH2P04、 60mM的Na2HP04、 10。/ov/v的甘油、4。/。w/v的NaCl、 4mM的EDTA、 5pM的磷酸吡哆醛配制而成；
在歩骤d中，所用的的磷酸缓冲液B其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液 由65mM的NaH2P04、 55mM的Na2HP04、 10%v/v的蔗糖、5%w/v的NaCl、
l(VM的磷酸吡眵醛配制而成；
在歩骤g中所用的缓冲液c其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液由70mM的 NaH2P04、 70mM的Na2HP04、 2%w/v的NaCl、 30 U M的磷酸吡眵醛配制而 成。本实施例中的分离纯化步骤，及其他工艺条件均与实施例3相同。
实施例9:本实施例中
在步骤a中，所用的的磷酸缓冲液A其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液 由60mM WNaH2P04、 65mM的Na2HP04、 12。/。v/v的甘油、6%w/v的NaCI 、 6mM的EDTA、 5pM的磷酸吡哆醛配制而成；
在歩骤d中，所用的的磷酸缓冲液B其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液 由60mM的NaH2P04、 60mM的Na2HP04、 10%v/v的蔗糖、l%w/v的NaC畫、
5pM的磷酸吡眵醛配制而成；
在歩骤g中所用的缓冲液c其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液由55mM的 NaH2P04、 60mM的Na2HP04、 l%w/v的NaCl、 20 y M的磷酸吡卩多醛配制而 成。本实施例中的分离纯化步骤及其他工艺条件均与实施例6相同。
权利要求
1、一种蒜氨酸酶的一步分离纯化方法，其特征是，在温度为0-4℃的条件下，按以下步骤完成a、均浆把新鲜的大蒜粉碎，按每千克新鲜大蒜加入800-1200mL pH6-8的缓冲液的量计算，在粉碎后的新鲜大蒜内加入缓冲液，同时进行搅拌使它们混合均匀；b、提取上清液将经步骤a所得物质进行冷冻离心处理，而后提取上清液；c、盐析在步骤b中提取的上清液内加入饱和硫酸胺溶液，加入同时进行搅拌；d、溶解把经过盐析后得到的上清液做冷冻离心处理，而后去掉上清液，留下滤饼，再把滤饼重新溶于pH7的缓冲液内；e、超滤把溶解后的滤饼用截留分子量为1万-5万的滤膜过滤，得到截留物，即为新鲜大蒜的蒜氨酸粗液；f、分离纯化把制得的新鲜大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryl S-200凝胶柱进行分离并用pH6-8的缓冲液以10-60mL/h流速进行梯度洗脱，同时用紫外检测仪在280nm进行检测，收集洗脱液组分；再把它透析得到纯化的蒜氨酸酶。
2、 根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征是，在步骤a中所加入 的缓冲液为磷酸缓冲液，它由NaH2P04、 Na2HP04、甘油、NaCl、 EDTA，和 磷酸吡哆醛配制而成；在粉碎后的新鲜大蒜中加入缓冲液时，搅拌速度为每 分鐘5000—10000转；在歩骤b中，均浆后的物质冷冻离心3 — 57分钟；在步骤d中，把经过盐析后的物质，做冷冻离心的时间为10—50分钟 滤饼重新溶入的缓冲液为磷酸缓冲液，它由NaH2P04、 Na2HP04、蔗糖、NaC! 和磷酸吡眵醛制成；在歩骤e中，应将溶解后的滤饼先做冷冻离心处理，而后再进行超滤，超 滤是在压力为0.25MPa的情况下操作的；在步骤f中，缓冲液由NaH2P04、 Na2HP04、 NaC1、、磷酸吡哆醛制成。
3、 根据权利要求2所述的分离纯化方法，其特征是，在步骤a中所加入 的磷酸缓冲液，其配制比例为1000mL磷酸缓冲液由50-80 mM的NaH2PC^、50-80 mM的Na2HP04、 8隱12。/。v/v的甘油、4-6%w/v的NaCl、4-6mM的EDTA、4-6pM的磷酸吡眵醛配制而成；在歩骤c中，所加入饱和硫酸胺溶液为30-60%的饱和硫酸胺溶液； 在歩骤d中，滤饼重新溶入的磷酸缓冲液其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液山55 —65mM的NaH2POjD 55 — 65mM的Na2HP04、 8-12%v/v的蔗糖，1-5%w/v的NaCl、 l-10(iM的磷酸吡哆醛配制而成；在歩骤f中所采用的缓冲液其配制比例为lOOOmL的缓冲液由50-80 mM的NaH2P04、 50-80 mM的Na2HP04、 l-5%w/v的NaCl、 10-40U M的磷酸吡哆醛配制而成。
4、 根据权利要求3所述的分离纯化方法，其特征是，在步骤a中所加入 的磷酸缓冲液，其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲液由50-60 mM的NaH2P04、 60-65 mM的Na2HP04、 10-12%v/v的甘油、4-6%w/v的NaCl、4-6mM的EDTA 、 5pM的磷酸吡卩多醛配制而成；在歩骤d中滤饼重新溶入的磷酸缓冲液其配制比例为lOOOmL磷酸缓冲 液山60 — 65mM的NaH2P04、 55 —60mM的Na2HP04、10%v/v的蔗糖， 卜5。/。w/v的NaCl、 5-10}iM的磷酸吡哆醛配制而成；在歩骤f中所采用的缓冲液其配制比例为lOOOmL的缓冲液由55-70mM 的NaH2P04、 60-70 mM的Na2HP04、 l-2%w/v的NaCl、 20-30 M的磷酸吡 哆醛配制而成。
5、 根据权利要求1、 2、 3、 4所述的分离纯化方法，其特征是，在步骤f 中，如若对3-15mL经处理好的新鲜大蒜的蒜氨酸粗酶液进行分离纯化时，应 将处理好的Sephacryl S-200凝胶柱填料装成l-2xl00-200cm的柱；缓冲液应以 20-40mL/h流速进行梯度洗脱，洗脱体积在128-250mL的范围内收集洗脱液组分。
全文摘要
一种蒜氨酸酶的一步分离纯化方法是，在温度为0-4℃的条件下，进行均浆、提取上清液、盐析、溶解、超滤而后制成新鲜大蒜的蒜氨酸粗液，把大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryl S-200凝胶柱进行分离并用pH6-8的缓冲液以10-60mL/h流速进行梯度洗脱，同时用紫外检测仪在280nm进行检测，收集洗脱液组分，再把它透析得到纯化的蒜氨酸酶。本发明用来分离纯化蒜氨酸酶的操作简便易行，使用本发明中的方法，可以根据需要分离纯化蒜氨酸酶量的多少装成不同大小的凝胶柱，以满足产业化生产的需要。
文档编号C12N9/00GK101191126SQ20061012829
公开日2008年6月4日 申请日期2006年11月28日 优先权日2006年11月28日
发明者坤 吴, 瑜 李, 许时婴 申请人:河南农业大学