专利名称：Hiv－1感染cd4的制作方法
技术领域：
本发明涉及了一种HIV-1感染CD4+细胞体外细胞培养模型与方法。它涉及生命科学领域、及医药领域。为能够综合科学论证、模拟分析揭示可以根治早期HIV-1感染者、有效治疗无症状期HIV-1感染者延长生存期的综合治疗机制，设计在理论上可以根治早期艾滋病的新抗HIV-1药，制定检测治疗HIV-1感染者用药物的新检测机制、方法、标准的，人类艾滋病基础/临床/药物综合科学研究，提供相关综合科学研究实验依据。能够被应用于筛选在理论上可以根治早期艾滋病的抗HIV-1药。
背景技术：
自1983年人免疫缺陷病毒——艾滋病被发现以来，人类在HIV科学研究领域，HIV病毒生物学基础科学研究、HIV病毒感染传播流行病学科学研究、HIV病毒传染病综合防治与临床治疗医药科学研究等方面，取得了众多举世瞩目重大科学研究成果。但是，客观的讲，人类在根治、预防艾滋病科学研究方面，至今没有取得解决根本问题的科学研究突破。没有科学研究迹象表明抗HIV治疗可以彻底清除患者机体病毒、治愈HIV感染者；HIV疫苗可能会有效预防HIV感染。严酷的科学现实，使当今从事HIV科学研究的众多学者，似乎要放弃了治愈HIV感染者的科学研究梦想！虽然抗逆转录病毒药物的联合应用可能对急性期、中期、到晚期的HIV感染者的治疗效果显著，但对早期无症状HIV感染者治疗效果并不确切。因此，这些患者长期应用抗逆转录病毒药，可能引发各种毒性反应……，是否利大于弊，尚不清楚。美国DHHS 2005年4月颁布的，成人青少年HIV-1感染抗病毒指南推荐的抗病毒治疗指征对CD4+T细胞数＞350/μl、病毒载量＞100000cp/ml的患者多数医生不赞成治疗，但也有一些医生倾向于治疗。对CD4+T细胞数＞350/μl、病毒载量＜100000cp/ml的患者可暂不治疗。
高效联合抗病毒疗法是当今实施艾滋病治疗的标准疗法。该疗法通过作用于病毒的不同复制阶段、或不同复制机制的抗病毒药物联合使用，可以显著降低HIV/AIDS相关疾病的感染发病率和死亡率、能够显著延长感染者的生存期。但是，由于HIV耐药性毒株的产生，最终导致联合抗病毒药物治疗失败；由于HIV感染者机体存在1％或更多的，难以被或不能被细胞免疫清除的，长期慢性HIV病毒感染细胞、或静止潜伏HIV病毒感染细胞储库，最终导致联合抗病毒药物治疗失败；是现有抗HIV治疗不能达到彻底清除患者机体病毒的目的，不可治愈HIV感染者的两个主要原因。
发明者认为1.应用逆转录酶抑制剂NRTIs/NNRTIs、或与其它抗HIV-I药联合治疗HIV感染者，逆转录酶抑制剂干扰病毒RNA逆转录复制互补cDNA链，会极大增加病毒RNA逆转录复制DNA碱基的错配、或丢失等的发生率，产生更多的HIV-I基因变异突变毒株，是应用逆转录酶抑制剂NRTIs/NNRTIs治疗HIV-I感染者，增加产生HIV-I突变毒株、耐药突变毒株，尚未被揭示的重要分子生物发生机制。2.在HIV-I感染者机体存在、在应用逆转录酶抑制剂NRTIs/NNRTIs治疗HIV-I感染者机体存在，难以被或不能被细胞免疫有效清除的，长期慢性HIV-I病毒感染细胞、静止潜伏HIV-I病毒感染细胞-病毒储库，其中某些细胞是HIV-I基因变异缺陷病毒所感染的细胞。某些整合在感染宿主细胞染色体上的HIV-I前缺陷病毒DNA，在感染细胞被激活启动染色体复制时、带动整合在染色体上的HIV-I前缺陷病毒DNA链一同复制，宿主细胞的DNA修复酶，可以修复HIV-I前缺陷病毒DNA链中缺失核苷酸部位，使HIV-I前缺陷病毒缺失核苷酸的变异基因得到修复，进而能够转录复制HIV-I病毒、致死被感染宿主细胞，再感染、致死其它宿主细胞；是HIV-I感染者机体存在长期慢性HIV-I病毒感染细胞、静止潜伏HIV-I病毒感染细胞-病毒储库，其中某些细胞可以被激活启动、转录复制HIV-I病毒，一种极重要的分子生物激活发生机制。3.模拟抗HIV-I药治疗HIV-I感染者病毒和CD4+细胞动力学机制，体外传代培养HIV-I感染细胞，实施相关科学研究实验，能够为上述1./2.HIV综合科学论证，提供相关科学研究实验依据。4.上述1./2./3.HIV科学研究的可行性科学分析理论依据是现代分子遗传学不需要科学论证的基本科学常识；不存在不可实施的现代生物科学技术难点。5.设计在理论上可以根治早期艾滋病的抗HIV-1药。
发明内容
本发明公开了一种HIV-1感染CD4+细胞体外细胞培养模型与方法。是分别应用取自HIV-I感染者最初急性期的人PBMC细胞、长期无症状期的人PBMC细胞、终末期的人PBMC细胞，取自未感染HIV-I者的正常健康人PBMC细胞、同性恋者的人PBMC细胞、静脉吸毒者的人PBMC细胞；传代人CD4+细胞系，例如人T淋巴细胞系MT4；分别应用胎牛血清，HIV-I感染者最初急性期的人AB血清、长期无症状期的人AB血清、终末期的人AB血清，未感染HIV-I者的正常健康人AB血清、同性恋者的人AB血清、静脉吸毒者的人AB血清；分别设计分别针对未感染HIV-1者的不同群体最初感染病毒的生命个体、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人体，能够做HIV-I感染者病毒和CD4+细胞动力学、分子生物调控网络分析的体外传代细胞培养系统。建立能够被HIV-1科学研究应用于综合模拟揭示未感染HIV-1者的不同群体最初感染病毒的生命个体、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人体，拥有不同的病毒感染复制、致病、治疗免疫应答细胞活性与细胞因子网络微环境的改变，和不同的病毒感染复制、致病、治疗免疫应答细胞活性与细胞因子网络微环境/CD4+细胞动力学机制的，综合科学研究实验平台。为综合科学论证、模拟分析揭示可以根治早期HIV-1感染者、有效治疗无症状期HIV-1感染者延长生存期的综合治疗机制，设计在理论上可以根治早期艾滋病的新抗HIV-1药，制定检测治疗HIV-1感染者用药物的新检测机制、方法、标准的，人类艾滋病基础/临床/药物综合科学研究，提供相关综合科学研究实验依据。
本发明的目的是，提供一种HIV-1感染CD4+细胞体外细胞培养模型与方法。建立能够被HIV-1科学研究应用于综合模拟揭示未感染HIV-1者的不同群体最初感染病毒的生命个体、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人体，拥有不同的病毒感染复制、致病、治疗免疫应答细胞活性与细胞因子网络微环境的改变，和不同的病毒感染复制、致病、治疗免疫应答细胞活性与细胞因子网络微环境/CD4+细胞动力学机制的，综合科学研究实验平台。为综合科学论证、模拟分析揭示可以根治早期HIV-1感染者、有效治疗无症状期HIV-1感染者延长生存期的综合治疗机制，设计在理论上可以根治早期艾滋病的新抗HIV-1药，制定检测治疗HIV-1感染者用药物的新检测机制、方法、标准的，人类艾滋病基础/临床/药物综合科学研究，提供相关综合科学研究实验依据。
1.1.模拟HIV-I感染者病毒和CD4+细胞动力学，实施体外传代培养HIV-I感染人PBMC细胞10代、或HIV-I感染MT4细胞10代，对最终传代培养没有被HIV-I感染致死的活细胞计数、HIV-I感染PCR检测，阳性表达的活细胞-静止病毒拷贝量计数；模拟逆转录酶抑制剂NRTIs/NNRTIs治疗HIV-I感染者病毒和CD4+细胞动力学，实施体外传代培养HIV-I感染人PBMC细胞+逆转录酶抑制剂NRTIs/NNRTIs10代、或HIV-I感染MT4细胞+逆转录酶抑制剂NRTIs/NNRTIs10代，对最终传代培养没有被HIV-I感染致死的活细胞计数、HIV-I感染PCR检测，阳性表达的活细胞-静止病毒拷贝量计数。证实应用逆转录酶抑制剂NRTIs/NNRTIs治疗HIV-I感染者，会极大增加病毒RNA逆转录复制DNA碱基的错配、或丢失等的发生率，产生更多的HIV-I基因变异突变毒株，是应用逆转录酶抑制剂NRTIs/NNRTIs治疗HIV-I感染者，增加产生HIV-I突变毒株、耐药突变毒株，尚未被揭示的重要分子生物发生机制。
2.应用加IL-2、PHA培养液，体外培养实验1.最终传代培养没有被HIV-I感染致死的活细胞，直至出现某个感染细胞内的HIV-I缺陷病毒基因发生回复-修复突变、可以复制病毒致死培养细胞，再感染、致死其它培养细胞；证实HIV-I感染者机体存在，某些难以被或不能被细胞免疫有效清除的，长期慢性HIV-I病毒感染细胞、静止潜伏HIV-I病毒感染细胞，是HIV-I基因变异缺陷病毒所感染细胞。进而证实应用逆转录酶抑制剂NRTIs/NNRTIs、或与其它抗HIV-I药联合治疗HIV-I感染者，能够增加机体存在的HIV-I基因变异缺陷病毒长期慢性感染细胞、静止潜伏感染细胞-病毒储库，是其不可治愈HIV-1感染者，尚未被揭示的重要原因。
3.分别采用未感染HIV-1正常健康者的人血清、同性恋者的人血清、静脉吸毒者的人血清，分别实施实验1./2.体外细胞培养模型实验；分别采用感染HIV-1者的最初急性期的人血清、长期无症状期的人血清、终末期的人血清，分别实施实验1./2.体外细胞培养模型实验；建立能够被HIV-1科学研究应用于综合模拟揭示未感染HIV-1者的不同群体最初感染病毒的生命个体、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人体，拥有不同的病毒感染复制、致病、治疗免疫应答细胞活性与细胞因子网络微环境的改变，和不同的病毒感染复制、致病、治疗免疫应答细胞活性与细胞因子网络微环境/CD4+细胞动力学机制的，综合科学研究实验平台。
具体实施例方式
为达到上述目的，实施本发明采用的方案1实验材料与方法1.1实验材料1.1.1体外培养CD4+细胞取自HIV-I感染者最初急性期的人PBMC细胞，长期无症状期的人PBMC细胞，终末期的人PBMC细胞；取自未感染HIV-I者的正常健康人PBMC细胞，同性恋者的人PBMC细胞，静脉吸毒者的人PBMC细胞；传代人CD4+细胞系，例如人T淋巴细胞系MT4。
1.1.2感染培养CD4+细胞的HIV-I病毒来自HIV-I感染者血浆与CD4+细胞共同培养；来自HIV-I感染者PBMC细胞与CD4+细胞共同培养；来自传代培养被HIV-I感染CD4+细胞；HIV-I毒株，例如HIV-I CNHN24毒株。
1.2药物和试剂1.2.1胎牛血清，未感染HIV-I者的正常健康人AB血清、同性恋者的人AB血清、静脉吸毒者的人AB血清，HIV-I感染者最初急性期的人AB血清、长期无症状期的人AB血清、终末期的人AB血清；RPMI-2加人AB血清或胎牛血清培养液，RPMI1640加人AB血清或胎牛血清培养液含青霉素-G100U/ml、庆大霉素50μg/ml；Ficoll-Hystopaque密度梯度溶液d＝1.077g/ml Pharmacia，把5ml Ficoll液预先内置于25ml离心管内；EDTA钠盐、用生理盐水配制7.5％抗凝液，把0.1ml抗凝EDTA钠盐溶液预先内置于10ml注射器内；天然非重组人白细胞介素IL-2；植物凝集素PHA。
1.2.2抗HIV-I药，例如核苷类逆转录酶抑制剂3TC，为葛兰素史克制药公司生产的贺普丁拉米夫定片，每片含100mg3TC。将100mg拉米夫定溶解于50mlRPMI1640培养液中，离心、过滤获得3TC浓度为8.7mmol溶液，使用前应用RPMI1640培养液稀释成所需要浓度。
1.3制备生物实验材料1.3.1制取人PBMC细胞应用预先内置有0.1ml抗凝EDTA钠盐溶液的10ml注射器，无菌抽取未感染HIV-I者静脉血5ml、或感染HIV-I者静脉血5ml，加2倍RPMI-2培养液混匀；将其仔细缓慢加入预先内置有Ficoll液5ml的25ml离心管上层；20℃、400g离心30min；用吸管小心把离心管Ficoll液和血液分界层间的PBMC细胞吸出，置入新离心管加5倍RPMI-2培养液混匀；20℃、300g离心10min，弃上清液，加5倍RPMI-2培养液混匀；20℃、200g离心5min，弃上清液，用含有10％人AB血清或胎牛血清的RPMI1640培养液，配制细胞悬液1×107/ml、并进行活细胞计数。
1.3.1制取人血清无菌抽取未感染HIV-I者静脉血200ml、或感染HIV-I者静脉血200ml；分置4只100ml离心管内，2000g离心10min，离心后4℃低温静置60min；然后用血管钳挤压血凝块，挤出内含的血清；弃去血凝块，再分置2只100ml离心管内，5~10000g离心60min；用一系列过滤器进行过滤，最后用0.1μm孔径无菌过滤器进行过滤后；分置于多个小无菌高密度聚丙烯容器，放置-70℃冰箱保存备用。如有特殊实验要求需要，可在实验前复温4℃应用亲和层析法除去血清中的抗体。
1.4体外传代细胞培养系统实验方法1.4.1建立不含有核苷类逆转录酶抑制剂3TC的、MT4-CNHN24毒株体外传代细胞培养系统；建立含有核苷类逆转录酶抑制剂3TC的、MT4-CNHN24毒株体外传代细胞培养系统用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养液，调整MT4细胞浓度为1×106/ml培养细胞悬液，每个50ml细胞培养瓶中加入12ml该培养MT4细胞浓度悬液，仅在第一代细胞培养瓶中接种浓度为1000TCID50的HIV-I CNHN24毒株；在含有3TC的体外细胞培养系统，加入3TC溶液第1代第2代培养液3TC浓度为0.01umol、第3代第4代培养液3TC浓度为0.02umol、第5代第6代培养液3TC浓度为0.04umol、第7代第8代培养液3TC浓度为0.08umol、第9代第10代培养液3TC浓度为0.16umol。将细胞培养瓶放置37℃，5％CO2的培养箱中培养不含有核苷类逆转录酶抑制剂3TC的、MT4-CNHN24毒株体外传代细胞培养系统，每培养4d为1个培养世代，取出培养MT4细胞悬液，先用15~20μm孔径的筛网滤除被HIV-I感染致死细胞融合体，再用10μm孔径的筛网过滤除去被HIV-I感染致死细胞碎片、陈旧培养液，注意用培养液冲洗回收留在筛网中的所有活细胞，离心浓缩为2ml、补充10ml含MT4细胞的新鲜培养液，继续培养下一个世代；第4d后每天在倒置显微镜观察培养细胞病变。培养10代后，每4天一次取出培养MT4细胞悬液，先用15~20μm孔径的筛网滤除被HIV-I感染致死细胞融合体，再用10μm孔径的筛网过滤除去被HIV-I感染致死细胞碎片、陈旧培养液，注意用培养液冲洗回收留在筛网中的所有活细胞，离心浓缩为1ml、补充不含MT4细胞的新鲜培养液，调整MT4细胞浓度为5~8×105/ml后继续培养；直至倒置显微镜观察培养细胞不再出现被HIV-I感染致死细胞病变。对最终传代培养没有被HIV-I感染致死的活细胞计数、HIV-I感染PCR定量检测，对活细胞的病毒拷贝量计数-A-。应用不含MT4细胞的新鲜培养液中加10μg/ml白细胞介素IL-2、10μg/ml植物凝集素PHA，继续培养没有HIV-I感染致死的活细胞，直至再出现被HIV-I感染致死细胞病变。
含有核苷类逆转录酶抑制剂3TC的、MT4-CNHN24毒株体外传代细胞培养系统，每3d吸取6ml培养上清液，补充6ml不含MT4细胞的新鲜培养液，每培养6d为1个培养世代，取出培养MT4细胞悬液，先用15~20μm孔径的筛网滤除被HIV-I感染致死细胞融合体，再用10μm孔径的筛网过滤除去被HIV-I感染致死细胞碎片、陈旧培养液，注意用培养液冲洗回收留在筛网中的所有活细胞，离心浓缩为2ml、补充10ml含MT4细胞的新鲜培养液，继续培养下一个世代；第4d后每天在倒置显微镜观察培养细胞病变。培养10代后，每4天一次取出培养MT4细胞悬液，先用15~20μm孔径的筛网滤除被HIV-I感染致死细胞融合体，再用10μm孔径的筛网过滤除去被HIV-I感染致死细胞碎片、陈旧培养液，注意用培养液冲洗回收留在筛网中的所有活细胞，离心浓缩为1ml、补充不含MT4细胞的新鲜培养液，调整MT4细胞浓度为5~8×105/ml后继续培养；直至倒置显微镜观察培养细胞不再出现被HIV-I感染致死细胞病变。对最终传代培养没有被HIV-I感染致死的活细胞计数、HIV-I感染PCR定量检测，对活细胞的病毒拷贝量计数-A+。应用不含MT4细胞的新鲜培养液中加10μg/ml白细胞介素IL-2、10μg/ml植物凝集素PHA，继续培养没有HIV-I感染致死的活细胞，直至再出现被HIV-I感染致死细胞病变。
1.4.1体外系统，能够综合模拟表达抗HIV-I药治疗HIV-I感染者病毒和CD4+细胞动力学机制A-，模拟表达HIV-I感染者病毒和CD4+细胞动力学，机体存在的HIV-I基因变异缺陷病毒长期慢性感染细胞、静止潜伏感染细胞-病毒储库。
A+，模拟表达逆转录酶抑制剂NRTIs/NNRTIs、或与其它抗HIV-I药联合，治疗HIV-I感染者病毒和CD4+细胞动力学，机体存在的HIV-I基因变异缺陷病毒长期慢性感染细胞、静止潜伏感染细胞-病毒储库。
A+/A-＝a抗HIV-I药致变异系数，模拟表达抗HIV-I药治疗HIV-I感染者病毒和CD4+细胞动力学致变异机制a＞1，抗HIV-I药增加病毒变异发生率，增加机体存在的HIV-I基因变异缺陷病毒长期慢性感染细胞、静止潜伏感染细胞-病毒储库；a＜1，抗HIV-I药抑制病毒变异发生率，减少机体存在的HIV-I基因变异缺陷病毒长期慢性感染细胞、静止潜伏感染细胞-病毒储库。
能够被应用于筛选在理论上可以根治早期艾滋病的抗HIV-1药。
1.4.2参照1.4.1体外系统，应用取自抗HIV-I药治疗HIV-I感染者PBMC细胞，应用含有20％HIV-I感染者长期无症状期的人AB血清的RPMI1640培养液，分别建立几个应用几种不同的逆转录酶抑制剂NRTIs/NNRTIs、或与其它抗HIV-I药联合用药，培养HIV-I感染者PBMC细胞的体外传代细胞培养系统1、2、3对比分别应用几种不同的逆转录酶抑制剂NRTIs/NNRTIs、或与其它抗HIV-I药联合用药，培养取自HIV-I感染者PBMC细胞的体外传代细胞培养系统1、2、3的模拟表达机体存在的HIV-I基因变异缺陷病毒长期慢性感染细胞、静止潜伏感染细胞-病毒储库1A+、2A+、3A+。为HIV-I感染者，选定一个应用抗HIV-I药致变异相对最小、病毒储库A+最小的个体优化治疗方案。
1.4.3参照1.4.1/1.4.2体外系统，博采众长、广泛参照国际众多好的体外系统。分别应用取自HIV-I感染者最初急性期的人PBMC细胞、长期无症状期的人PBMC细胞、终末期的人PBMC细胞，取自未感染HIV-I者的正常健康人PBMC细胞、同性恋者的人PBMC细胞、静脉吸毒者的人PBMC细胞；分别应用HIV-I感染者最初急性期的人AB血清、长期无症状期的人AB血清、终末期的人AB血清，未感染HIV-I者的正常健康人AB血清、同性恋者的人AB血清、静脉吸毒者的人AB血清；分别设计分别针对未感染HIV-1者的不同群体最初感染病毒的生命个体、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人体，能够做HIV-I感染者病毒和CD4+细胞动力学、分子生物调控网络分析的体外传代细胞培养系统。建立能够被HIV-1科学研究应用于综合模拟揭示未感染HIV-1者的不同群体最初感染病毒的生命个体、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人体，拥有不同的病毒感染复制、致病、治疗免疫应答细胞活性与细胞因子网络微环境的改变，和不同的病毒感染复制、致病、治疗免疫应答细胞活性与细胞因子网络微环境/CD4+细胞动力学机制的，综合科学研究实验平台。
1.5发明创新讨论1.5.1现有抗HIV治疗不能达到彻底清除患者机体病毒的目的，不可治愈HIV感染者。是当今HIV科学研究设计、研制，逆转录酶抑制剂NRTIs/NNRTIs、或与其它抗HIV-I药联合，治疗HIV-I感染者病毒和CD4+细胞动力学机制，逆转录酶抑制剂干扰病毒RNA逆转录复制互补cDNA链，会极大增加病毒RNA逆转录复制DNA碱基的错配、或丢失等的发生率，产生更多的HIV-I基因变异突变毒株、耐药突变毒株；使a抗HIV-I药致变异系数＞1，抗HIV-I药增加病毒变异发生率，增加机体存在的HIV-I基因变异缺陷病毒长期慢性感染细胞、静止潜伏感染细胞-病毒储库，导致联合抗病毒药物治疗失败。是被HIV科学界疏漏的一个极重要的科学研究盲区。1.4体外系统，建立能够被HIV-1科学研究应用于综合模拟揭示未感染HIV-1者的不同群体最初感染病毒的生命个体、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人体，拥有不同的病毒感染复制、致病、治疗免疫应答细胞活性与细胞因子网络微环境的改变，和不同的病毒感染复制、致病、治疗免疫应答细胞活性与细胞因子网络微环境/CD4+细胞动力学机制的，综合科学研究实验平台。将能够为综合科学论证、模拟分析揭示可以根治早期HIV-1感染者、有效治疗无症状期HIV-1感染者延长生存期的综合治疗机制，设计在理论上可以根治早期艾滋病的新抗HIV-1药，制定检测治疗HIV-1感染者用药物的新检测机制、方法、标准的，人类艾滋病基础/临床/药物综合科学研究，提供相关综合科学研究实验依据。可行性科学分析理论依据是现代分子遗传学不需要科学论证的基本科学常识；不存在不可实施的现代生物科学技术难点。
1.5.2HIV科学界，把不能根治、预防艾滋病，归咎于HIV复制速度快、HIV基因具有高度变异性病毒的产量平均约为1010/天，HIV在体内的平均复制产生周期时间约为2.6天；体外测定每6000个核甘酸在逆转录过程中有一次错误的概率，体内测试显示每轮复制过程可能产生一次突变。可以产生大量具有各种不同基因变异型或表型的毒株，对药物抑制压力、机体免疫抑制压力，不断衍生出新的耐药毒株、免疫逃逸毒株优势病毒种株。病毒通过特异性突变所获得的选择性优点将对病毒基因组产生有力的影响。没有科学研究迹象表明HIV疫苗可能会有效预防HIV感染。最近针对艾滋病病毒提出一种退而求其次、再退而求其更次的新观点，以预防病毒的传播为目的的疫苗三级预防，即通过使用疫苗刺激起机体的抗HIV免疫力来抑制体内HIV复制，降低血液中病毒含量。如能够保护健康人不被HIV感染当然是最理想的疫苗，但如能阻止感染后发病或阻断已感染的人发生艾滋病亦是很好的治疗疫苗，而如可以通过疫苗降低感染者体内的病毒量，减少对他人传播也不失为具有很好公共卫生价值的疫苗。HIV科学界在此相关科学研究方面，有众多科学研究发现，不能一一综述。发明者仅针对在此相关科学研究方面，被HIV科学界疏漏的另一个极重要的科学研究“盲区”，HIV-I感染是首先通过表达膜蛋白gp120与CD4+T淋巴细胞受体特异结合，触发免疫耐受机制，能够比HIV具有高度变异性免疫逃逸机制，更为有效对抗机体免疫抑制压力，作如下综述出现高滴度的HIV的特有的抗体是HIV原发性免疫反应的特征，它出现在病毒血症的高峰或稍晚时间。有趣的是，这最初的抗体反应不包括中和抗体。有趣的是，抗逆转录病毒药和IL-2治疗虽然可以使CD4+T细胞计数增加，却未能使解体Vβ库恢复。应用IL-2治疗期间CD4+T细胞的增加来源于CD4+T细胞库在胸腺外的扩增，因为T细胞Vβ库的PCR分析证明缺失的克隆不能再生。用IL-2和抗逆转录病毒药试图重建T细胞Vβ库的失败，暗示免疫系统的损伤可能存在阈值，若超过该阈值，免疫功能便不能重建。间接感染或各种疫苗免疫的HIV感染个体都有血浆病毒血症暂时增加，并且与诱导产生免疫活性程度相关；类似的发现也可见于SIV感染的恒河猴中。上述众多不可被一一综述HIV科学研究发现，明确显示HIV-I是在感染人体复制的最初期、还没有激发机体免疫系统应答反应之前，会首先通过表达膜蛋白gp120与CD4+T淋巴细胞受体特异结合，触发免疫耐受机制，导致感染机体免疫系统针对HIV感染复制应答延迟，尤其是体液免疫应答反应延迟、不能首先产生针对gp120的中和抗体、抑制gp120与CD4+T淋巴细胞受体特异结合；进而使HIV-I能够在机体免疫系统形成针对gp120的中和抗体免疫抑制应答之前，还没有被CTL细胞免疫有效抑制时、能够过度复制HIV-I最终会达到病毒血症峰值。发明者认为可能是在此期间由于HIV过度表达所编码的超抗原，能够与某些特定的T淋巴细胞受体Vβ克隆反应，诱导抑制性T淋巴细胞，建立进一步的免疫耐受机制；并且诱导传染性免疫耐，与导致某些特定的T淋巴细胞受体Vβ克隆损伤、渐至枯竭，从而使T细胞Vβ库不可被再生恢复；因而确实存在HIV感染者免疫系统的损伤阈值，若超过该阈值，HIV感染者的免疫功能便不可被恢复重建。发明者认为HIV-I感染者急性期达到病毒血症峰值期，可能是使T淋巴细胞受体Vβ克隆损伤、转向渐至枯竭不可被重建损伤，至无症状期达到免疫系统的损伤不可被重建阈值。因而发明者认为在HIV-I感染者急性期、至达到免疫系统的损伤不可被重建阈值之前，可能会存在一个可以被抗HIV-I药有效根治、能够重建HIV-I感染者受损免疫系统的，很暂短的效治根治HIV-I感染者的窗口期。
1.4体外系统，建立能够被HIV-1科学研究应用于综合模拟揭示未感染HIV-1者的不同群体最初感染病毒的生命个体、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人体，拥有不同的病毒感染复制、致病、治疗免疫应答细胞活性与细胞因子网络微环境的改变，和不同的病毒感染复制、致病、治疗免疫应答细胞活性与细胞因子网络微环境/CD4+细胞动力学机制的，综合科学研究实验平台。可以被应用于综合模拟揭示上述HIV-1感染首先通过表达gp120与CD4+T淋巴细胞受体特异结合，触发免疫耐受机制的，相关综合分子生物调控网络机制。
gp160疫苗通常需用较高剂量接种4次以上才能使少数受试者产生较低滴度的同源中和抗体。Vaxgene公司的gp120疫苗在北美和泰国进行大规模的III临床试验。2003年2月23日，Vaxgene公司公布了北美地区的试验结果，其中接种疫苗人群HIV感染率为5.7％，未接种疫苗人群HIV感染率为5.8％。结果表明该疫苗不能有效预防HIV感染。众多不可被——综述与各种gp160、gp120疫苗实验失败相关的HIV科学研究发现，可以为证实，HIV-I感染首先通过表达gp120与CD4+T淋巴细胞受体特异结合，触发免疫耐受机制，提供相关综合科学研究实验依据。
可以利用现有的SIV、HIV-II恒河猴动物模型，SIV-mac239Δnef减毒株疫苗、SIV膜蛋白疫苗、HIV-II膜蛋白疫苗，实施揭示SIV膜蛋白、HIV-II膜蛋白与CD4+T淋巴细胞受体特异结合，触发免疫耐受机制相关的器官移植实验，为模拟证实HIV-1感染是首先通过表达gp120与CD4+T淋巴细胞受体特异结合，触发免疫耐受机制，能够比HIV-1具有高度变异性免疫逃逸机制，更为有效应对机体免疫抑制压力，提供可令人信服的，足够充分的科学研究实验依据。并且可以把表达膜蛋白gp120的HIV-1减毒活疫苗，应用于触发免疫耐受机制的器官移植实验，在器官移植科学研究方面取得重大科学研究突破。但是它将会不幸的证实HIV科学研究在过去20多年里，在没有揭示HIV-1感染首先通过表达gp120与CD4+T淋巴细胞受体特异结合，触发免疫耐受机制，寻找到能够解决它触发免疫耐受机制问题的方法前，曾徒劳无益花费上百亿美元研制HIV疫苗；现有的疫苗科学研究思维、科学研究方法，不能研制出可能会有效预防HIV感染的HIV疫苗，是客观存在的必然科学现实。它极有可能是HIV科学研究在应用HIV疫苗预防艾滋病科学研究方面，所难以逾越的科学障碍！因此，HIV科学研究需要设计、研制a抗HIV-I药致变异系数＜1，抗HIV-I药抑制病毒变异发生率，减少机体存在的HIV-I基因变异缺陷病毒长期慢性感染细胞、静止潜伏感染细胞-病毒储库的，新的抗HIV-I药或抗HIV-I药联合。争取在HIV-I感染急性期，HIV-I感染者的免疫系统所受到的损伤还没有超过阈值，免疫功能还可以被重建、有可能效治根治HIV-I感染者的窗口期，尽早对HIV-I感染者实施a抗HIV-I药致变异系数＜1，抗HIV-I药抑制病毒变异发生率，减少机体存在的HIV-I基因变异缺陷病毒长期慢性感染细胞、静止潜伏感染细胞-病毒储库的，新的抗HIV-I药或抗HIV-I药联合早期抗HIV感染治疗。是未来人类有可能通过尽早对HIV-I感染者实施早期抗HIV-I感染治疗，实现抗HIV-I治疗达到彻底清除患者机体病毒的目的，治愈HIV-I感染者的，唯一希望，最基本的保障。
发明者知道有一种药，在多种不同体外系统实验中显示抑制HIV-I病毒；综合科学论证它有希望被应用于在早期HIV-1感染者的窗口期，根治早期HIV-I感染者；还没有做过继续深入的相关实验。如果能够利用SIV、HIV-II恒河猴动物模型，证实在SIV、HIV-II感染猴的免疫系统所受到的损伤还没有超过阈值，免疫功能还可以被恢复重建时，可以通过实施它早期抗SIV、HIV-II治疗，达到彻底清除SIV、HIV-II感染猴机体病毒的目的，治愈SIV、HIV-II感染猴。它将是一种有希望被应用于在HIV-I感染急性期，早期治愈HIV-I感染者的新抗HIV-I药。
权利要求
1.一种HIV-1感染CD4+细胞体外细胞培养模型与方法，其特征在于应用加血清(1)培养液(2)、感染培养CD4+细胞的HIV-I病毒(3)实施CD4+细胞(4)体外细胞培养(5)，对最终培养没有被HIV-I感染致死的活细胞实施HIV-I感染PCR定量检测(6)，对HIV-I感染活细胞的病毒拷贝量计数(7)。
2.一种HIV-1感染CD4+细胞体外细胞培养模型与方法，其特征在于应用加血清(1)培养液(2)、感染培养CD4+细胞的HIV-I病毒(3)、抗HIV-I药(8)实施CD4+细胞(4)体外细胞培养(5)，对最终培养没有被HIV-I感染致死的活细胞实施HIV-I感染PCR定量检测(6)，对HIV-I感染活细胞的病毒拷贝量计数(7)。
3.根据权利要求1、2中所述的HIV-1感染CD4+细胞体外细胞培养模型与方法，其特征在于体外细胞培养(5)是传代补充CD4+细胞(4)的体外传代细胞培养(9)。
4.根据权利要求1至3中所述的HIV-1感染CD4+细胞体外细胞培养模型与方法，其特征在于血清(1)是胎牛血清(10)。
5.根据权利要求1至3中所述的HIV-1感染CD4+细胞体外细胞培养模型与方法，其特征在于血清(1)是未感染HIV-I者的人血清(11)。
6.根据权利要求1至3中所述的HIV-1感染CD4+细胞体外细胞培养模型与方法，其特征在于血清(1)是感染HIV-I者的人血清(12)。
7.根据权利要求1至7中所述的HIV-1感染CD4+细胞体外细胞培养模型与方法，其特征在于CD4+细胞(4)是感染HIV-I者的人PBMC细胞(13)。
8.根据权利要求1至7中所述的HIV-1感染CD4+细胞体外细胞培养模型与方法，其特征在于CD4+细胞(4)是未感染HIV-I者的人PBMC细胞(14)。
9.根据权利要求1至7中所述的HIV-1感染CD4+细胞体外细胞培养模型与方法，其特征在于CD4+细胞(4)是传代人CD4+细胞系(15)。
10.根据权利要求2至10中所述的HIV-1感染CD4+细胞体外细胞培养模型与方法，其特征在于抗HIV-I药(8)是有逆转录酶抑制剂(16)的抗HIV-I药。
全文摘要
本发明名称为HIV－1感染CD文档编号C12N5/08GK1932009SQ20061013775
公开日2007年3月21日 申请日期2006年10月30日 优先权日2006年10月30日
发明者叶新新 申请人:叶新新