用于测定胸苷激酶活性的方法和试剂盒及其用途的制作方法

专利名称：用于测定胸苷激酶活性的方法和试剂盒及其用途的制作方法
专利说明用于测定胸苷激酶活性的方法和试剂盒及其用途 本发明涉及用于测定生物学样品中的胸苷激酶(TK)活性的非放射性方法和试剂盒。本发明在细胞增殖病症或疾病例如癌症和某些病毒感染的诊断、监控和预后中，以及在影响酶促途径的化合物例如新药候选物的筛选中有用，所述化合物可以阻碍胸苷一磷酸的形成和/或干扰磷酸化后的核酸合成。
背景 细胞分裂前，携带遗传信息的DNA必须通过DNA聚合酶复制。这需要在其他必需组分中大量底物的存在，即，所有4种脱氧核糖核苷酸(deoxyribonuclotides)的存在，例如脱氧胸苷三磷酸(TTP，图2C)。TTP根据

图1中说明的途径从头合成。此外，哺乳动物和许多其他物种编码TK，它专有地在G1-S细胞周期阶段中表达并且通过将胸苷(T，图2A)磷酸化为胸苷一磷酸(TMP，图2B)将其补救到新陈代谢中(图1)(1，综述)。掺入到培养物细胞DNA中的放射性T的测定因此已传统地用作细胞分裂速率的测量。在1980年代期间显示了来自健康的个体和患有各种肿瘤疾病的患者的人血浆或血清中的TK活性(2，3)。在健康个体的脊髓液中发现不存在TK活性，而在脑肿瘤患者中发现各种水平的TK活性(4)。从那时起TK分析在临床医学中已变得更普遍，特别是关于不同血液恶性肿瘤(5-10)。
存在2种编码TK的细胞基因，细胞分裂中的主要形式TK1作为s-TK释放到血清中。这是在肿瘤疾病的血清中超表达的形式，并且使用大多数目前的测定进行测量，包括根据本发明的测定。TK2形式完全存在于线粒体中。除了定位于线粒体中外，TK2还具有与TK1不同的底物谱和动力学参数(1)。
在迄今只商购可得的费力的血清TK(s-TK)测定方法中包括的放射性阻碍其在临床医学中的普及和使用(2)。由于与体内肿瘤细胞分裂程度正相关，s-TK是许多肿瘤标记的补充物，所述肿瘤标记只通过分化细胞特异性产生的胎儿抗原或产物的超表达指示肿瘤的存在。例如，前列腺特异性抗原(PSA)是过量前列腺细胞的早期标记，并且在TK活性升高很早以前就检测到抗原水平的升高。然而，当肿瘤开始去分化并且开始更快速地生长时，PSA抗原(激肽释放酶3)消失，同时发现s-TK活性增加(11)。因此，除了用于伴随或不伴随治疗监控患者中肿瘤细胞复制外，s-TK活性及其动力学的改变还挑选出需要改变治疗性治疗的患者。对于患者结果给定s-TK水平的重要性在不同肿瘤类型之间有所不同并且天然地涉及设定的治疗类型、患者年龄及其他因素，所述因素使得s-TK成为包括在用于临床医学的多变量模型中的重要标记(12)。
如所提及的，在现有技术中，TK已通过其活性或通过检测TK1蛋白质(24kd基因表达的大小)的自然存在的方法进行检测(13)。后面的方法获得活性和无活性酶。因此，这些蛋白质检测测定与s-TK活性的关联性差。这不是意外的现象，因为TK1只在细胞周期的G1-S阶段，即在细胞分裂时有活性，而TK1蛋白质或其降解产物可能具有不同的半衰期。因此，本文只专注于测量TK活性的现有技术。
一般而言，所有TK活性测定都由在磷酸供体(例如，腺苷三磷酸，ATP)和Mg2+(或Mn2+)的存在下，待分析的样品与T或其类似物一起温育组成。其后产物，即TMP或任何T类似物一磷酸的量测定如下 A)在早期描述的TK活性测定中，将3H标记的胸苷(T)用作底物。使TMP与二乙氨乙基(DEAE)带电的滤纸结合，随后洗涤所述滤纸以去除未使用的T底物。干燥滤纸后，在β计数器中测量3H放射性。然而，还开发了放射性测试，它指出了使用s-TK作为细胞增殖标记的持久兴趣(14)。
B)在商购可得的ProlifigenTK-REA(DiaSorin S.p.A.Saluggia，意大利)测定中，将放射性碘脱氧尿苷(125IdU)用作TK的底物。一磷酸化产物；碘脱氧尿苷一磷酸(125IdUMP)通过使其与自我沉降的氢氧化铝(Al(OH)3)结合来分离，这随后进行洗涤以去除未使用的125IdU。与Al(OH)3粉末结合的125I放射性随后在γ计数器中计数(2，3)。
C)近期公开的非放射性TK测定(15，16)公开了定量TK1活性的类似技术。在这些测定中，叠氮胸苷(AZT，图2D)或溴脱氧尿苷(BrdU，图2A)用作底物，并且各自形成的一磷酸盐(AZTMP或BrdUMP，图2B)通过分析反应溶液与酶标记的AZTMP或BrdUMP竞争结合固定在第二块96孔微量滴定板孔底部的抗-AZTMP或抗-BrdUMP抗体的能力进行定量(即，通过竞争性ELISA检测)。
虽然避免了放射性，但迄今已知的非放射性测定看起来对于分析包含低水平TK的生物学样品不足够有效，因为它测量结合的示踪物的减少，这要求分析的样品中存在相当大量的TK产物(15，16)。这阻碍了正常范围内TK活性的良好分辨，所述TK活性在年轻和年老的个体中可以相差超过3倍，并且特别是当TK测定对缺乏可测量的参考水平的生物学样品使用时，所述生物学样品例如脊髓液、胸膜液(plural fluid)、腹水及其他体液。
近来公开了利用单独的或与TK组合的TMPK、NdK的互补活性的一种新重组宿主细胞系，其中TMPK、NdK或TK基因被缺失。那个发明涉及产生重组细胞系和包括该细胞系的用于筛选影响激酶途径的化合物的试剂盒(17)。
发明描述 本发明提供了灵敏的非放射计胸苷激酶测定，需要时，所述测定可以容易地自动化。将TK产物直接处理以固定在固体表面上，并且无需将样品转移用于次级测量即可例如使用ELISA方法(18)直接定量TK活性水平。
新方法定量生物学样品例如体液样品中的胸苷激酶(TK)(ATP胸苷-5’-磷酸转移酶E.C.2.7.1.21)活性。该方法使得能够简单、便宜、精确和高度灵敏地测定生物学样品例如体液或组织或细胞样品中的TK活性，以及纯重组TK同工酶。
因此，本发明涉及用于测定生物学样品中的胸苷激酶(TK)活性的方法，其包括下列步骤在包含附着至固体表面的单链多核苷酸作为引物或模板的容器中，使溶于缓冲液的基本反应混合物与生物学样品接触，所述基本反应混合物包括下列组分未附着的单链多核苷酸作为模板和/或引物、修饰的脱氧核苷作为激酶底物、磷酸供体、核苷酸聚合酶和缺乏TK活性的激酶来源， 温育混合物， 任选地洗涤温育的混合物以去除未附着的反应组分， 测定已掺入固体表面附着的引物或模板的修饰的脱氧核苷的量，和 由掺入的修饰的脱氧核苷的量测定生物学样品中存在的TK活性。
在本说明书和附加的权利要求中的表述“缺乏TK活性”意指存在如此少量的TK活性，如果存在的话，以致于其不能干扰本发明方法的执行。
此外，应当理解测定的TK活性与掺入的修饰的核苷的量成比例。
在目前优选的实施方案中，洗涤温育的混合物，并且掺入的修饰的脱氧核苷的量的测定通过下述进行向温育混合物中加入对修饰的脱氧核苷有亲和力的标记的亲和分子，并通过借助于标记测定附着的标记的亲和分子的量来测定已掺入的修饰的脱氧核苷的量。
在本发明方法的实施方案中，激酶来源选自缺乏TK活性的哺乳动物细胞系提取物、缺乏TK活性的真菌细胞系提取物，缺乏TK活性的细菌细胞系提取物、来自纯化的哺乳动物细胞提取物的TMPK和二磷酸核苷激酶(NdK)的组合、来自纯化的真菌细胞提取物的TMPK和NdK的组合、来自纯化的细菌细胞提取物的TMPK和NdK的组合、重组哺乳动物TMPK和重组哺乳动物NdK的组合、重组真菌TMPK和重组真菌NdK的组合、以及重组细菌TMPK和重组细菌NdK的组合。应当理解激酶可以来自上述组合中的不同来源。优选地，酶来源是酵母细胞提取物，例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)提取物。
在另一实施方案中，掺入的修饰的核苷来源于相应的修饰的脱氧核苷。
在再一实施方案中，修饰的脱氧核苷激酶底物选自溴脱氧尿苷、碘脱氧尿苷、氟脱氧尿苷和乙烯基脱氧胸苷，并优选溴脱氧尿苷。
在优选实施方案中，固体表面是塑料表面，例如塑料微量滴定板。然而，固体表面可以是其上可以附着亲和分子的另一种材料，例如塑料珠、磁珠以及作为芯片或珠的琼脂糖或硅石表面。
在再一实施方案中，固体表面附着的单链多核苷酸经由其5’末端附着或在活化板中使用咪唑进行固定。
优选地，通过本发明方法分析的生物学样品选自血液、血清、血浆、脑脊液(CSF)(4)、胸膜液、腹水、组织、细胞及其提取物。组织和细胞样品指胞质或核提取物样品。
本发明还涉及用于测定生物学样品中的胸苷激酶(TK)活性的测定试剂盒，其在几个分开的容器中包括固体表面附着的单链多核苷酸作为引物和/或模板、未附着的单链多核苷酸作为模板和/或引物、修饰的脱氧核苷作为激酶底物、磷酸供体、核苷酸聚合酶、和缺乏胸苷激酶(TK)的激酶来源以及缓冲液。
在本发明测定试剂盒的优选实施方案中，试剂盒包括用于标准化测定的参考TK。适当参考的实例是来自具有肿瘤疾病并且使细胞悬浮生长在动物血清中的哺乳动物的血清。
在本发明测定试剂盒的进一步优选的实施方案中，试剂盒另外包括一块或几块微量滴定板，其在一个或几个孔中包含表面附着的单链多核苷酸(18)。
在本发明试剂盒的另一实施方案中，测定试剂盒另外包括对修饰的脱氧核苷有亲和力的标记的亲和分子，优选酶标记的亲和-缀合物，例如用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的抗体。
同样在本发明测定试剂盒的实施方案中，激酶来源选自缺乏TK活性的哺乳动物细胞系提取物、缺乏TK活性的真菌细胞系提取物、缺乏TK活性的细菌细胞系提取物、来自纯化的哺乳动物细胞提取物的胸苷酸激酶(TMPK)和二磷酸核苷激酶(NdK)的组合、来自纯化的真菌细胞提取物的TMPK和NdK的组合、来自纯化的细菌细胞提取物的TMPK和NdK的组合、重组哺乳动物TMPK和重组哺乳动物NdK的组合、重组真菌TMPK和重组真菌NdK的组合、以及重组细菌TMPK和重组细菌NdK的组合。应当理解激酶可以来自上述组合中的不同来源。优选地，酶来源是酵母细胞提取物，例如啤酒糖酵母提取物。
本发明进一步涉及本发明方法和/或测定试剂盒在哺乳动物特别是人细胞增殖病症或疾病例如癌症或某些病毒感染的诊断、监控和/或预后中的用途。
本发明另外涉及本发明方法和/或测定试剂盒在影响酶促途径的化合物例如新药候选物的筛选中的用途，所述化合物可以阻碍胸苷磷酸的形成。
本发明最后提及的2个方面可以以可替代的方式叙述，即叙述为在哺乳动物特别是人细胞增殖病症或疾病例如癌症或某些病毒感染的诊断、监控和/或预后中使用的方法，包括根据本发明的方法和/或根据本发明的测定试剂盒，以及在影响酶促途径的化合物例如新药候选物的筛选中使用的方法，所述化合物可以阻碍胸苷磷酸的形成或干扰核酸合成，包括根据本发明的方法和/或根据本发明的测定试剂盒。
本发明方法的重要特征是通过使用缺乏TK活性的细胞提取物完成体液样品中TK活性的测定。这与BrdUMP掺入的优选固相免疫检测组合，允服了与目前的放射性方法(ProlifigenTK-REA，DiaSorinS.p.a.Saluggia，意大利)(2，3)和描述的非放射性方法(15，16)相关的问题。本发明不仅提供用于检测血清TK活性的非放射性方法和试剂盒，该方法还易于执行、耐用并提供对于诊断目的分析上有用的方法。
对于本发明方法中发生的磷酸化步骤，在溶于缓冲液的基本反应混合物中绝对需要存在磷酸供体。可以使用几种核苷酸三磷酸，特别是ATP作为磷酸供体。优选地，选择是不掺入固体表面上的引物/模板系统生长链中的核苷酸。特别优选使用核糖三磷酸核苷酸作为磷酸供体。
在本发明的一个实施方案中，提供了通过在缓冲液中使样品与基本反应混合物接触用于测定生物学样品中的TK活性的方法，所述基本反应混合物包含附着至固体表面的单链多核苷酸作为模板和/或引物，未附着的单链多核苷酸作为模板和/或引物，和缺乏TK活性的细胞提取物，从而使得生物学样品提供TK的唯一来源。生物学样品中的TK活性的测定随后通过测定已通过聚合酶掺入附着至固体表面的新合成的双链核酸中的修饰的核苷的量进行，例如聚合酶指导的BrdUMP固相掺入，它随后通过使用针对掺入的BrdU的酶-抗体缀合物进行检测。
在优选实施方案中，缺乏TK活性的提取物来源于真核细胞提取物。在甚至更优选的实施方案中，提取物来源于哺乳动物细胞提取物。在进一步优选的实施方案中，缺乏TK活性的提取物来源于纯化的哺乳动物细胞提取物，其中例如使用但不限于，亲和纯化。在另一优选实施方案中，缺乏TK活性的提取物通过组合来自重组细胞的重组酶TMPK(胸苷酸激酶；EC 2.7.4.9；ATPdTMP磷酸转移酶)和NdK(EC 2.7.4.6；二磷酸核苷(NDP)激酶)来构建，示例为但不限于，在适当的细菌宿主菌株例如大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的克隆的酵母TMPK和NdK基因。在再一优选实施方案中，提取物来自真菌。在特别优选的实施方案中，缺乏TK活性的细胞提取物来源于面包酵母，啤酒糖酵母。
本发明揭示通过使用缺乏TK活性的细胞提取物作为激酶来源与聚合酶指导的修饰的核苷掺入组合可以检测并测定生物学样品中存在的TK活性。
掺入的修饰的核苷的量的测定可以以众多不同方式进行，例如通过检测核苷的修饰，例如BrdUMP中的Br。本发明通过使用免疫方法即酶联免疫吸附测定(ELISA)举例说明。
因此，酶标记的亲和缀合物用于测定掺入的修饰的核苷，所述修饰的核苷涉及生物学样品中的细胞增殖水平。亲和分子的实例包括抗体，例如单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明通过使用目前优选的修饰的核苷BrdU和针对BrdU的抗体举例说明，但可以通过TK磷酸化的几种其他的修饰的核苷是本领域已知的，并且因此可以在本发明方法中使用。这些包括，但不限于乙烯基脱氧胸苷、FdU和IdU(图2A)。事实上，最后提及的2种修饰的核苷已在本发明方法中使用并且给出了比得上BrdU的结果，尽管它们要求更长的温育时间，这可能归因于缺少理想的单克隆抗体，因为这些实验中还使用了可得到的抗BrdU抗体缀合物。
在优选实施方案中，用于将BrdUMP掺入固体表面引物模板结构中的聚合酶是RNA指导的DNA聚合酶(RNA模板依赖性DNA聚合酶＝逆转录酶)(RT)，并且固体表面附着的核酸模板是聚-rA(聚核糖腺苷酸)。在另一同样优选的实施方案中，聚合酶是DNA指导的DNA聚合酶，并且固体表面附着的核酸模板是寡-dA，并且引物是与引物互补的较短的寡-dT。在进一步的实施方案中，聚合酶是现有技术中已知的任何聚合酶，并且固相附着的模板是含或不含同聚区的可变DNA，并且较短的引物与模板的可变区或同聚部分互补。取决于核酸如何附着至表面，将模板或引物附着至表面。规定是不能有形成起始引物/模板系统的2条核糖核酸链。
众多天然和修饰的DNA指导的DNA聚合酶是本领域已知的；这些通过下列示例，但不限于下列，来自各种来源的真核DNA聚合酶α、大肠杆菌DNA聚合酶I、来自大肠杆菌DNA聚合酶I的修饰的克列诺片段、天然或修饰的噬菌体T4聚合酶、来自水生嗜热菌(Thermophilus aquaticus)的天然或修饰的Taq聚合酶、来自Thermococcus litoralis的Vent聚合酶和来自Pneumococcus furiousus的Pfu聚合酶。
几种天然的和修饰的RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶＝RT)(EC2.7.7.49)是本领域已知的；这些通过下列示例，但不限于下列，苜蓿花叶病毒RT AMV-RT)、莫洛尼鼠白血病病毒RT(M-MuLV-RT)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV RT)和人免疫缺陷病毒(HIV)，这些是这种类型聚合酶的一般实例。
模板的长度优选为30-300个核苷酸长，并且引物优选为10-30个核苷酸长。用于将蛋白质共价附着至聚苯乙烯塑料96孔微孔板的固体表面的方法是本领域众所周知的。通过使用咪唑可以促进与聚苯乙烯表面的结合，这从而被包括以作为这项技术的实例，但不限于此。使用光偶联利用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDCC)活化的表面偶联5’-胺修饰的寡核苷酸引物是本领域众所周知的。
采用测量样品中存在的生物分子的技术的许多不同方法，其中使用酶联免疫吸附测定(ELISA)技术，是本领域已知的。在优选实施方案中，针对半抗原BrdU的单克隆抗体与碱性磷酸酶(AP)(碱性磷酸酶正磷酸单酯磷酸水解酶)(碱性最佳)，EC 3.1.3.1.)缀合。然而，现有技术已知对于ELISA方法有用的任何其他酶可以在本发明中使用，例如与抗BrdU抗体缀合的酶，例如辣根过氧化物酶(过氧化氢氧化还原酶EC1.11.17)(HRP)。在另一方法中，现有技术已知的任何载色体、荧光团、发光团可以缀合至示踪抗体、例如抗BrdU抗体。
关于AP或HRP的几种合适底物是本领域众所周知的。通过AP切割底物对硝基苯磷酸(pNPP)，使底物颜色从无色变为黄色。使用分光光度计可以在405nm波长处阅读吸光度。化学发光的AP底物包括，但不限于，金刚烷基1，2-二氧杂环丁烷(dioxethane)(例如AMPPD、CSPD、CDP和CDP-Star底物，都由Tropix(Bedford，MA，US)出售)，通过AP脱磷酸化以及剩余分子随后分解后它发出在477nm处的稳定状态的辉光。AP的荧光底物的实例是，但不限于，4-甲基伞形酮酰(umbelliferyl)磷酸(4-MUP)。MUP脱磷酸后，剩余的甲基伞形酮酰(MU)在370nm波长处激发。发出的荧光使用荧光计在430nm处检测。
附图描述 关于TK活性固体表面ELISA测定的图。
图1.在哺乳动物细胞中产生TTP的不同途径。
*途径I.从头合成途径，II.补救途径。
*相关的酶1.胸苷激酶(TK)，2.胸苷酸合酶(TS)，3.核糖核苷酸还原酶(RR)，4.胸苷酸激酶(dTMPK)，5.脱氧核糖核苷一磷酸激酶(dNMPK)，6.二磷酸核苷激酶(NDPK)，7.末端转移酶(TT)，8.依赖于RNA的DNA聚合酶(RT)，9.依赖于DNA的DNA聚合酶(DNA Pol) *重要的调节因素A.反馈抑制，B.通过脱氧尿苷三磷酸酶(dUTPase)的脱磷酸。
图2.关于胸苷核苷和核苷酸类似物的修饰 A.核苷 B.核苷酸一磷酸 C.核苷酸三磷酸 D.叠氮胸苷 图3.不同酵母提取物浓度与RT一起检测各种BrdUMP浓度的能力。
图4.使用2天提取物温育和分别为5和1微升的2种不同量的每种血清，并且与ProlifigenTK-REA(TK U)关联，根据本发明的测定的S-TK测量能力(A405)。
缩写 4-MUP 4-甲基伞形酮酰磷酸 Al(OH)3 氢氧化铝 AMPPD 金刚烷基1，2-二氧杂环丁烷芳基磷酸 AP碱性磷酸酶EC 3.1.3.1；正磷酸单酯磷酸水解酶 (碱性最佳) ATP 腺苷5’-三磷酸 AZT 3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷 BrdU 溴脱氧尿苷 BrdUMP溴脱氧尿苷一磷酸 BrdUTP溴脱氧尿苷三磷酸 CSF 脑脊液 DEAE 二乙氨乙基 DTT 二硫苏糖醇 EDCC 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺 EDTA 乙二胺四乙酸 EGTA 乙二醇-双[β-氨乙基醚]-N，N，N′N′-四乙酸 ELISA 酶联免疫吸附测定 FdU 氟脱氧尿苷 HIV 人免疫缺陷病毒 HRP 过氧化氢氧化还原酶EC 1.11.1.7 IdU 碘脱氧尿苷 NdK 二磷酸核苷激酶EC 2.7.4.6 pNPP 对硝基苯磷酸 PSA 前列腺特异性抗原 RT逆转录酶；RNA指导的DNA聚合酶EC2.7.7.49 SIV RT猿猴免疫缺陷病毒逆转录酶 TK胸苷激酶E.C.2.7.1.21；ATP胸苷-5’-磷酸转移酶 TMPK 胸苷酸激酶EC 2.7.4.9；ATPdTMP磷酸转移酶 TMP 脱氧胸苷一磷酸 TTP 脱氧胸苷三磷酸 dUTP 2′-脱氧尿苷5′-三磷酸 实施例1补充TK活性的夹自啤酒糖酵母的激酶提取物的制备 包含互补/拯救激酶活性的酵母提取物与UPpsala Yeast Resourcecompetence centre(www.yeastlab.vbiol.slu.se)合作制备。简言之； 酵母细胞提取物的制备 用新鲜啤酒糖酵母菌株Gl16(基因型MATa ura3-52 his3leu2∷pLEU-lexAop6)接种200mL Gal-培养基(1％酵母提取物；BactoTMYeast Extract.DIFCO；2％蛋白胨，BactoTM Peptone，BD；2％半乳糖(Sigma)和2％琼脂(BactoTM Agar；DIFCO)。酵母细胞在30℃生长过夜并允许其达到大约1.2的OD600nm密度。接下来使用4个50mLFalconTM聚丙烯螺旋盖管，通过在230XG于4℃离心5分钟来收获细胞。将沉淀各自在40ml无菌冰冷的MilliQTM水中重悬浮并洗涤，并再次在230XG于4℃离心5分钟。倾出MilliQTM水并弃去。细胞然后在剩余的MilliQTM水中通过移液重悬浮。将50mL FalconTM聚丙烯螺旋盖管中的每种酵母悬浮液(大约0.8g/2.2mL微型管(microtube)，Sarstedt(Cat#72.694.006)转移至2.2mL螺旋盖微型管，所述微型管在加入酵母悬浮液前称重，并在冷室(8℃)中在230XG离心2分钟。倾出剩余的水并弃去。将剩余沉淀进行称重(大约0.4g/2.2mL微型管)。重量标记在2.2mL微型管外部。细胞随后在制备互补提取物之前贮存于-80℃。
互补酵母提取物的制备 将酵母细胞沉淀置于25-28℃直至完全解冻(15-20分钟)并随后在酵母提取物制备操作之前维持在冰浴中。所有后续工作都在冷室设备(8℃)中进行。向每个包含0.4g酵母细胞沉淀的2.2mL微型管加入大约0.5沉淀体积的3X破裂缓冲液，使用微型管体积表面指示器进行调整(1X破裂缓冲液参见表1)。接下来加入1mL Zirkonium珠(珠平均直径1mm；Biospec Products，Inc.，Bartlesville PO Box 788，OK 74005，美国)。接下来将管装满(几乎溢出)1X破裂缓冲液(3X破裂缓冲液＝用MilliQTM水3倍稀释的破裂缓冲液)并小心且紧紧地盖上盖子。将管加载到Mini-BeadBeater-8TM机器中(Biospec Products，Inc.，Bartlesville PO Box 788，OK 74005，美国)。珠击打酵母细胞悬浮液在每次击打时运行5X1分钟，在击打之间在冰浴(0℃)中冷却1-2分钟。细胞碎片和珠随后通过在微型管离心机中在10000XG离心2分钟去除。将上清液转移至新2.2mL微型管并在10000XG离心5分钟。包含酶的酵母提取物上清液以10μL等分试样到2.2mL微型管中，并随后在使用前贮存于-80℃。
表1.1X破裂缓冲液 完全蛋白酶抑制剂片剂(Roche Inc.) 一个片剂至75mL-1 MilliQTM水至所需体积 实施例2制备的酵母提取物与RT一起检测通过磷酸化并掺入固相模板/引物复合物中的BrdUMP的能力 在这个实验中，使用包含表2中列出的试剂的溶于缓冲液的基本反应混合物。
表2.关于BrdUMP测定的基本反应混合物和缓冲液。
溶于缓冲液的基本反应混合物由每种成分的贮存液制备，随之向容纳固定的聚-rA的96孔板的每个孔中加入100μL(设定3块板)。
酵母提取物在22-25℃下解冻并随后在使用前置于冰浴中。提取物以5倍的梯级进行系列稀释，并将25μL最高的浓度加入A行，而次一级的浓度加入B行，等等。BrdUMP以10倍进行系列稀释，以1.3×10-5M开始并以1.3×10-11M结束。最高的浓度对应于实施例1中描述的制剂的1/250的浓度。将最高的浓度加入96孔板的第1列孔中,并且次一级的浓度加入第2列中，等等。在每块板中还包括不含BrdUMP的列，所述板随后用塑料粘合带(Fasson S695，目录号SH236269，Nunc丹麦)包被并密封。随后所有3块板在33℃下温育。第一块板在温育3小时后洗涤并随后置于-20℃。第二块板在24小时后洗涤并置于-20℃，并且第三块板在温育48小时后洗涤并置于-20℃。板从-20℃取出并通过连续4次浸没到4X 1L pH 8.6的洗涤缓冲液(3mM Tris-HCl，0.01％Tween-20，0.5％Triton X-100，0.25％EtOHCavidiTech AB，Uppsala瑞典)中进行洗涤。为了使掺入固体面的BrdUMP可视化，将100ml示踪物(AP，即与抗BrdUMP单克隆抗体缀合的碱性磷酸酶，RT产物Tracer HS，CavidiTech AB，Uppsala，瑞典)加入每个孔中并于33℃温育90分钟。板随后通过连续4次浸没到4X 1L pH 8.6的洗涤缓冲液(3mM Tris-HCl，0.01％Tween-20，0.5％Triton X-100，0.25％EtOH CavidiTech AB，Uppsala瑞典)中再次进行洗涤。洗涤后，向每个孔中加入溶于200mM pH 9.8的Tris-HCL中的包含pNPP底物0.5mgmL-1，1mM MgCl2的125微升溶液。板随后在室温温育。使用双重波长设定为w1＝405和w2＝630nm的滤色片，使用Syva Micro TrakEIA阅读器记录在5分钟后以及在最高达24小时的不同时间间隔后OD405处的吸光度。
从关于每个孔的任何随后阅读时间点的每个吸光度减去5分钟阅读后的吸光度。随后针对使用的酵母提取物的量并针对BrdUMP浓度给出存在的吸光度。从图3可以看出使用的酵母越多信号增加得越多。检测到下降至1.3×10-11M的BrdUMP浓度，参见图3。
实施例4呈现的BrdUMP检测系统测量s-TK活性的能力及其与放射性TK测定的关联。
对于这个实验，选择根据ProlifigenTK-REA(Cat#324250/50片剂，Diasorin S.p.A，Saluggia，意大利)从正常血清TK活性(例如＜5U)最高到非常高的TK活性(＞800U)的20种不同血清。根据表2制备溶于缓冲液的基本反应混合物，不过，另外BrdU给出2.5×10-5M的最终浓度，并且酵母提取物加至实施例2中给出的最高浓度的1/12的浓度。向容纳固定的聚-rA的96孔板的每个孔中加入125μL溶于缓冲液的这种基本反应混合物。
血清以5倍的梯级进行系列稀释，以溶于缓冲液的基本反应混合物中的1∶5开始并以1∶625结束。向容纳溶于缓冲液的基本反应混合物的微量滴定板孔中加入25μL每种血清稀释物，即分析对应于5、1、0.2、0.04μL每种患者血清的体积。
板随后用塑料粘合带(Fasson S695，目录号SH 236269，Nunc丹麦)密封，并在33℃温育2天。板随后通过连续4次浸没到4X 1L pH8.6的洗涤缓冲液(3mM Tris-HCl，0.01％Tween-20，0.5％Triton X-100，和0.25％EtOH，CavidiTech AB，Uppsala瑞典)中进行洗涤。为了使掺入固体面的BrdUMP可视化，将100μL示踪物(AP，即与抗BrdUMP单克隆抗体缀合的碱性磷酸酶，RT产物Tracer HS，CavidiTech AB，Uppsala，瑞典)加入每个孔中并于33℃温育板90分钟。板随后通过另外连续4次浸没到4X 1L pH 8.6的洗涤缓冲液(3mM Tris-HCl，0.0l％Tween-20，0.5％Triton X-100，和0.25％EtOH，CavidiTech AB，Uppsala瑞典)中进行洗涤。洗涤后，向每个孔中加入溶于1mM MgCl2、200mM pH 9.8的Tris-HCL中的包含pNPP底物05mgmL-1的125uL溶液。板随后在室温温育。使用双重波长设定为w1＝405和w2＝630nm的滤色片，使用Syva Micro TrakEIA阅读器记录在5分钟后以及在最高达24小时的不同时间间隔后OD405处的吸光度。
从关于每个孔的任何随后阅读时间点的每个吸光度减去5分钟阅读的吸收率。使用在ELISA阅读器的阅读范围内的读数将A405值重新计算为每小时的A405。在图4中举例说明了关于分别使用1μL和5μL患者血清的结果，其中吸光度与根据现有的放射性ProlifigenTK-REA(Cat#324250/50片剂，Diasorin S.p.A，Saluggia，意大利)血清中存在的TK活性相关。结果显示根据本发明的测定和现有的放射性ProlifigenTK-REA之间的强烈关联。
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权利要求
1.一种用于测定生物学样品中的胸苷激酶(TK)活性的方法，其包括下列步骤在包含附着至固体表面的单链多核苷酸作为引物或模板的容器中，使溶于缓冲液的基本反应混合物与所述生物学样品接触，所述基本反应混合物包括下列组分未附着的单链多核苷酸作为模板和/或引物、修饰的脱氧核苷作为激酶底物、磷酸供体、核苷酸聚合酶和缺乏TK活性的激酶来源，温育所述混合物，
任选地洗涤所述温育的混合物以去除未附着的反应组分，
测定已掺入所述固体表面附着的引物或模板的所述修饰的脱氧核苷的量，和
由所述掺入的修饰的脱氧核苷的量测定所述生物学样品中存在的所述TK活性。
2.根据权利要求1的方法，其中洗涤所述温育的混合物，并且其中掺入的所述修饰的脱氧核苷的量的测定通过下述进行向所述温育的混合物中加入对所述修饰的脱氧核苷有亲和力的标记的亲和分子，并通过借助于所述标记测定附着的所述标记的亲和分子的量来测定已掺入的所述修饰的脱氧核苷的量。
3.根据权利要求1的方法，其中所述激酶来源选自缺乏TK活性的哺乳动物细胞系提取物、缺乏TK活性的真菌细胞系提取物、缺乏TK活性的细菌细胞系提取物、来自纯化的哺乳动物细胞提取物的胸苷酸激酶(TMPK)和二磷酸核苷激酶(NdK)的组合、来自纯化的真菌细胞提取物的TMPK和NdK的组合、来自纯化的细菌细胞提取物的TMPK和NdK的组合、重组哺乳动物TMPK和重组哺乳动物NdK的组合、重组真菌TMPK和重组真菌NdK的组合、和重组细菌TMPK和重组细菌NdK的组合，以及来自所述提及的来源的任何TMPK和NdK的组合。
4.根据权利要求3的方法，其中所述激酶来源是酵母细胞提取物。
5.根据权利要求4的方法，其中所述酵母细胞提取物的所述酵母是啤酒糖酵母。
6.根据权利要求1-5中任何一项的方法，其中所述修饰的核苷来源于相应的修饰的脱氧核苷。
7.根据权利要求1-6中任何一项的方法，其中所述修饰的脱氧核苷选自溴脱氧尿苷、碘脱氧尿苷、氟脱氧尿苷和乙烯基脱氧胸苷。
8.根据权利要求7的方法，其中所述修饰的脱氧核苷是溴脱氧尿苷。
9.根据权利要求1-8中任何一项的方法，其中所述固体表面是塑料表面。
10.根据权利要求9的方法，其中所述塑料表面是塑料微量滴定板。
11.根据权利要求1的方法，其中所述固体表面附着的单链多核苷酸经由其5’末端附着或在活化板中使用咪唑进行固定。
12.根据权利要求1的方法，其中所述生物学样品选自血液、血清、血浆、脑脊液(CSF)、胸膜液、腹水、组织、细胞及其提取物。
13.一种用于测定生物学样品中的胸苷激酶(TK)活性的测定试剂盒，其在几个分开的容器中包括
固体表面附着的单链多核苷酸作为引物和/或模板，
未附着的单链多核苷酸作为模板和/或引物，
修饰的脱氧核苷作为激酶底物，
磷酸供体，
核苷酸聚合酶，
缺乏TK活性的激酶来源，和
缓冲液。
14.根据权利要求13的测定试剂盒，其另外包括用于标准化所述测定的参考TK。
15.根据权利要求13的测定试剂盒，其另外包括一块或几块微量滴定板，其在一个或几个孔中包含表面附着的单链多核苷酸。
16.根据权利要求13的测定试剂盒，其另外包括对修饰的脱氧核苷有亲和力的标记的亲和分子。
17.根据权利要求16的测定试剂盒，其中所述标记的亲和分子是酶标记的亲和-缀合物。
18.根据权利要求17的测定试剂盒，其中所述酶标记的亲和缀合物是用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的抗体。
19.根据权利要求13的测定试剂盒，其中所述缺乏TK活性的激酶来源选自缺乏TK活性的哺乳动物细胞系提取物、缺乏TK活性的真菌细胞系提取物、缺乏TK活性的细菌细胞系提取物、来自纯化的哺乳动物细胞提取物的胸苷酸激酶(TMPK)和二磷酸核苷激酶(NdK)的组合、来自纯化的真菌细胞提取物的胸苷酸激酶和NdK的组合、来自纯化的细菌细胞提取物的胸苷酸激酶和NdK的组合、重组哺乳动物胸苷酸激酶和重组哺乳动物NdK的组合、重组真菌胸苷酸激酶和重组真菌哺乳动物NdK的组合、以及重组细菌胸苷酸激酶和重组细菌NdK的组合。
20.根据权利要求19的测定试剂盒，其中所述激酶来源是酵母细胞提取物。
21.根据权利要求1-12中任何一项的方法和/或根据权利要求13-20中任何一项的测定试剂盒在哺乳动物特别是人细胞增殖病症或疾病例如癌症的诊断、监控和/或预后中的用途。
22.根据权利要求1-12中任何一项的方法和/或根据权利要求13-20中任何一项的测定试剂盒在影响酶促途径的化合物例如新药候选物的筛选中的用途，所述化合物可以阻碍胸苷磷酸的形成或干扰核酸合成。
23.一种在哺乳动物特别是人细胞增殖病症或疾病例如癌症的诊断、监控和/或预后中使用的方法，其包括根据权利要求1-12中任何一项的方法和/或根据权利要求13-20中任何一项的测定试剂盒。
24.一种在影响酶促途径的化合物例如新药候选物的筛选中使用的方法，所述化合物可以阻碍胸苷磷酸的形成或干扰核酸合成，其包括根据权利要求1-12中任何一项的方法和/或根据权利要求13-20中任何一项的测定试剂盒。
全文摘要
描述了用于测定生物学样品中的胸苷激酶(TK)活性的方法和测定试剂盒，所述生物学样品例如血液、血清、血浆、脑脊液(CSF)、胸膜液、腹水、组织、细胞及其提取物。该方法包括使溶于缓冲液的基本反应混合物与生物学样品接触，所述基本反应混合物包括固体表面附着的引物和/或模板，修饰的脱氧核苷，例如溴脱氧尿苷、碘脱氧尿苷、氟脱氧尿苷或乙烯基脱氧胸苷作为激酶底物，磷酸供体，核苷酸聚合酶，和缺乏TK活性的激酶来源，例如酵母提取物。温育后，测定已掺入固体表面附着的引物和/或模板的修饰的脱氧核苷的量，并且生物学样品中存在的TK活性与掺入的修饰的脱氧核苷的量成正比。该方法和测定试剂盒在细胞增殖病症或疾病例如癌症的诊断、疾病进展的预后监控和治疗作用中，以及在影响酶促途径的化合物例如新药候选物的筛选中有用，所述化合物可以阻碍胸苷磷酸的形成或干扰核酸合成。
文档编号C12Q1/48GK101128600SQ200680005892
公开日2008年2月20日 申请日期2006年2月24日 优先权日2005年2月25日
发明者S·格罗诺维茨 申请人:龙纳博尔控股公司