专利名称：：太空诱变高效粪肠球菌的筛选制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及空间诱变优良微生物菌种，具体说是一种太空诱变高效粪肠球菌的筛选制备方法及其应用。
背景技术：
：微生物是与人类关系密切的一类微小生物体，具有种类的多样性和功能的复杂性.在药物的研发中某些微生物发挥了十分重要的作用，微生物药物的研发主要环节包括菌种的选育，发酵工艺优化，提取与精制工艺的研究等。早在十九世纪人们就发现被溶血性链球菌感染的癌症患者肿块自然消退的现象，人们先后发现很多微生物及其制剂有一定的药理活性。浩瀚的太空疆域无垠，有着地面上难以想像的环境条件，在太空环境里，生物的变异与进化要比地面快成千上万倍。因此，太空为发展新物种、新医药等提供了理想的实验场所和生产基地。微生物空间诱变育种是制药工业培育新菌种的一种有效方法。一个优良的菌种可以在不增加或很少增加成本情况下大幅度提高产品的产量和质量。长期以来，我国采取自然选择和理化因素进行微生物育种，得到的育种方法远远不能满足制药工业生产的需要，目前与国际上同类高产菌种相比，其生产效价有很大的差距。该菌种生产周期及发酵周期长，用于工业化生产的产量低，价格昂贵，使用范围小，有效成份含量低。运用空间技术进行微生物诱变育种是培育新生物菌种的一种有效方法，其原理是通过外层空间特殊的物理化学环境，即微重力、强辐射、高能粒子、交变磁场及高真空的环境中，引起菌种DNA分子的变异和重组，菌种遗传性状发生改变，从而获得生命力旺盛、生长速度快、代谢产物得率高、品质优良并可稳定遗传的高产高效菌种。
发明内容本发明的目的是提供一种太空诱变高效粪肠球菌的筛选制备方法，它利用太空特殊环境，将粪肠球菌菌林送入太空，遨游一定时间后安全返回，淘汰负向变异菌抹，选出性质优良的正向变异菌林进行复篩，最终得到生命力旺盛、生长速度快、发酵单位高、发酵周期短、多肽含量高、遗传性质稳定、生产适应性强、具有空间累加效应的优良微生物菌种太空诱变高效粪肠球菌。本发明的另一目的是提供一种采用太空诱变高效粪肠球菌的发酵液在医药领域的应用，其应用于工业化生产的生产菌种，具有产量高、用途广、成本低、有效成份含量高等特点。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为本发明的技术方案是筛选一种经过空间搭载，运用空间技术进行微生物诱变育种，通过外层空间特殊的物理化学环境，即微重力、强辐射、高能粒子、交变磁场及高真空的环境中，导致粪肠球菌菌林遗传性质发生变异，引起菌种DNA分子的变异和重组，从而获得生命力旺盛、生长速度快、品质优良的菌种，优选出其中的正变异、遗传性质稳定的太空诱变高效粪肠球菌作为生产菌种，以及它的制备与应用。该菌种已于2007年10月19曰由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.2221。一、太空诱变高效粪肠球菌的筛选1.经太空搭栽的菌林返回地面后，立即对搭栽菌抹和对照菌林同时进行分离，避免太空诱变菌抹优良性状的丢失。菌林培养过程中严格控制培养温度、湿度、通气量与培养时间等条件，保证搭栽菌株与对照菌抹在同一条件下生长，仔细观察菌落长出的时间，对于最先长出的菌落进行标记。为了增加菌种初筛量，每次分离需使用300400套平板，控制每个平板上的有效菌落数在60~70个。通过观察，我们发现搭栽菌林的生长速度明显快于对照菌抹，而且菌落成熟较早，菌落生长饱满，形态更规则，菌落平均直径也大于对照菌抹。我们根据经验挑选20003000个生长良好的菌落，通过对其菌落特征、细胞形态的比较与鉴定，再挑选20%~30%接入斜面培养。斜面培养成熟后，接入液体发酵培养基内进行深层静置培养。每隔四小时取样检测发酵液PH、生物量、总糖含量、还原糖含量、活性物质含量以及菌抹生长情况等，发现搭载菌抹在发酵液中的生长速度也明显快于对照菌株，而且具有对原材料利用速度快、目的产物出现早等特点。根据测定结果筛选出高产菌株进行小试与中试，并且经过对其遗传稳定性考察，确定了用于生产的太空诱变高效粪肠球菌。2.培养特征的研究通过培养，研究了太空诱变高效粪肠球菌对培养基在碳氮比、营养成分、pH、温度、氧需求、发酵周期等方面的适应情况变化，并根据变化及时进行相关生长参数的调整。确定太空诱变高效粪肠球菌的培养基成分、运行参数、pH、发酵周期等。3.生理生化反应对经航天搭载、太空诱变、地面筛选出的菌抹进行细胞形态特征观察及其与地面对照菌林相关生理生化指标的对比观察。生产菌林通过太空搭载，细胞的活性物质增加，细胞生长丰茂饱满，利用糖产酸现象比地面对照菌株有所改变，而地面对照菌林在某些糖的发酵中已失去产酸的能力。4.代谢产物的测定用化学法和仪器测试它的主要化学组分及结构有无变化。通过实验检测:发现太空诱变高效粪肠球菌不仅发酵周期大大缩短，而且其发酵产物比对照组产物含量平均高出三倍以上。5.遗传性状及蛋白表达的研究DNA是决定遗传的主要物质，基因是遗传的基本单位。由于基因突变会致使蛋白质的结构改变，最后导致个体性状的差异。因此，我们进行了菌抹的全细胞蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和菌抹的基因组DNA限制性酶切分析。菌抹培养后，用超声波、溶菌酶、化学试剂等进行破壁，全细胞蛋白提取并制备DNA。通过聚丙烯酰胺凝胶分析得到的蛋白指紋图镨可见太空诱变高效粪肠球菌和地面对照菌株培养72h的蛋白图谱存在差异，①在97KD分子量附近有三条带有差异；②在66KD分子量附近有一条带有差异；③在2031KD分子量之间有一条带有差异。基因组DNA限制性酶切/PFGE图谱，其中SmaI的酶切指紋图谙比较有一备带的差异。6.对选出的太空诱变高效粪肠球菌进行稳定性分析连续传代试验，发现该菌林发酵周期缩短及发酵产物含量提高两项指标稳定，是可稳定遗传的变异。7.在培养的基础上，进行小试和中试在统计的十批实验测定中，太空诱变高效粪肠球菌对数生长期大都提前至24小时左右，而地面对照菌的对数生长期则仍在48小时左右。发酵产物含量比对照组高出3-5倍(表l)。表1太空诱变高效粪肠球菌发酵周期及多肽含量情况<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>筛选出的太空诱变高效粪肠球菌与地面对照菌的对比特征是1、革兰氏染色地面对照菌菌抹革兰氏染色呈阳性"G+"，太空诱变高效粪肠球菌菌抹革兰氏染色呈阳性"G+"2、形态特征太空诱变高效粪肠球菌菌株细胞呈球形或卵圓形，细胞大小为0.7~1.8inm，在液体培养基中以成对或链状出现，无鞭毛，不生芽孢，细胞生长饱满丰茂；地面对照菌菌林细胞呈球形或卵圓形，细胞大小为0.6~0.7inmx1.6~1.8ym,细胞生长中度，不太饱满。3、培养特征太空诱变高效粪肠球菌菌抹在血平板或有机物平板上生长饱满丰茂，菌落圆形，有突起，表面光滑，杏仁黄色，有光泽，略有粘性，半透明，菌膜生长有厚度，无色素产生；地面对照菌菌林在血平板或有机物平板上菌落有圆形，也有小颗粒状，有突起，有光泽，略有粘性，半透明，生长中度，菌膜较薄，乳脂色，无色素产生。4、生理生化特征见下图表_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>45TC生长354NaCL生长5%NaCL生长6.5WaCL生长接触酶反应牛奶凝固牛奶胨化明胶液化胆盐V-P反应吲味反应七叶灵反应精氨酸水解酶产生B-葡萄糖酸苷酸酶产生表3太空诱变高效粪肠球菌与地面对照菌菌林的糖利用试验太空诱变高效粪肠球菌地面对照"5_糖类4长产酸生长产酸甘露糖++++甘露醇+++-麦*糖++++果糖++++_纤维二糖++++苦杏仁+++++鼠李糖++++_棉子糖+-+-密二糖+++-松三糖+_+_木糖+-++乳糖++++水杨苷++++阿拉伯糖++_+_海藻糖++++山梨醇++++核糖+++-<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>5.太空诱变高效粪肠球菌与地面对照菌菌林的全细胞蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析和基因组DM限制性酶切分析结果全细胞蛋白SDS-PAGE分析SDS-PAGE得到的蛋白指紋图谱(10%分离胶)。两个测定菌林培养72h的蛋白图谱存在差异，①在97KD分子量附近有三条带有差异；②在66KD分子量附近有一条带有差异；③在2031KD分子量之间有一条带有差异。基因组DM限制性酶切分析Smal的酶切指紋图语T-F与D-F比较有一条带的差异。(二)太空诱变高效粪肠球菌的发酵制备工艺l.发酵过程所述发酵过程的发酵培养基是牛肉膏0.2-0.8%，酵母膏0.2-0.8蛋白胨0.3-0.8%，葡萄糖0.1-0.9°/。，氯化钠0.2-0.6%;经灭菌温度105-125。C，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.13Mpa灭菌后备用。(1)一级发酵罐将优良的摇瓶菌种在无菌条件下按1-10%接种量接入灭菌后的一级发酵罐。罐压不超过O.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌，在25-40。C恒温培养10-50小时；(2)二级发酵罐将一级发酵培养液在无菌条件下按2-20%接种量接入灭菌后的二级发酵罐，罐压不超过0.02Mpa,通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌；在25-35。C恒温培养50-100小时。灭活采用加温使发酵液温度达到70-120°C,保温20-60分钟，冷却静置后放罐。2.提纯过程(l)发酵液浓缩将发酵后的发酵液用浓缩器进行浓缩，使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1:15-25，控制pH7.0-7.4制成发酵浓缩液。(2)浓缩液的精制提纯浓缩液按珍珠岩1-2.0%及活性炭2-4.0%加入进行精制提纯，搅拌10-20分钟，过滤后再抽滤提纯，制成发酵精制液。(3)浓缩液加入80-99%乙醇，体积量比控制在1:1.5-1:5.5或酌情而定。充分搅拌静置后，离心去除上清液，沉淀用蒸馏水溶解，调pH5,0,得到溶解液并将溶解液静置。再将溶解液离心去除杂质得到上清液，准确量取上清液体积，按上清液体积计算出所需乙醇量，调pH值，将乙醇緩慢加入到上清液中，并充分搅拌，静置后离心去除上清液得到沉淀物。沉淀物再用蒸馏水溶解，调pH,离心，上清液再加乙醇沉淀。这样的工艺反复操作至中间检测合格为止，得到的沉淀物真空干燥3-8小时，即得到太空诱变高效粪肠球菌生产的发酵物。所述的菌种是太空诱变高效粪肠球菌。所述的发酵液的制备方法是优选普通粪肠球菌进行太空搭载，经过空间诱变精心筛选培育出太空诱变高效粪肠球菌作为生产菌种，经一级发酵和二级发酵，将发酵液精制提純得到的。所述的发酵液具有调节免疫力功能、抗肿瘤的功能、抗炎功能、刺激骨髓造血干细胞的功能、降血脂功能、降血糖功能、抗氧化功能、改善记忆功能、緩解视疲劳功能、促进排铅功能、清咽功能、降血压功能、改善睡眠功能、促进泌乳功能、緩解体力疲劳功能、提高缺氧耐受力功能、对辐射危害有保护功能、减肥功能、改善生长发育功能、增加骨密度功能、改善营养性贫血功能、对化学性肝损伤有保护功能、祛痤疮功能、祛黄褐斑功能、改善皮肤水分功能、改善皮肤油份功能、调节肠道菌群功能、促进消化功能、通便功能、对胃粘膜损伤有保护功能等多方面的作用。本发明的特点是将普通粪肠球菌菌林进行太空搭载，利用航天器的工艺余量及它在太空中处于微重力、宇宙射线、交变磁场、高真空、高热深冷、剧烈温差、超洁净等太空独有的特殊环境的综合作用，使菌株的DNA双链结构断裂，基因组发生重排，其变异幅度较大，有益变异增多，并可以获得在地面诱变中较难得到的有效的微生物变异。返回地面后，对经过太空搭载的菌株进行培养和筛选，通过研究其形态特征、培养特征、生理生化反应、代谢产物、遗传性状及蛋白表达、遗传稳定性、中试生产指标等内容，优选出其中的正变异、遗传特性稳定的太空诱变高效粪肠球菌菌抹，并形成规模化生产。附件材料l:2份中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏菌种保藏受理通知书复印件。保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2007年10月19日，保藏编号2221,分类命名粪肠球菌Enterococcusfaecalis。附件材料2:搭载菌及地面菌的检测鉴定报告；具体实施方案一、空间搭栽菌林的准备及搭载采用滤纸条、浸入介质、砂土管等方法，将粪肠球菌进行了封装，遨游太空一定时间后安全返回。返地后对搭载菌种进行了反复的培养和篩选，优选出极少量的正变异菌抹。为使这种正向变异更加稳定的遗传，并且能够出现累加优化效应，我们连续多次将该菌种进行太空搭载。在外层空间飞行的菌抹被置于一个与地球上生态环境完全不同的特殊环境中(微重力、高真空、高辐射、交变磁场等)，诱发菌林发生变异。变异后产生的新菌抹，其形态特征、培养特征、生理生化反应、代谢产物、遗传性状及蛋白表达等均发生明显的变化。二、菌种选育1.经太空搭栽的菌抹返回地面后，立即对搭载菌林和对照菌抹同时进行分离，避免太空诱变菌株优良性状的丟失。菌林培养过程中严格控制培养温度、湿度、通气量与培养时间等条件，保证搭载菌株与对照菌株在同一条件下生长，仔细观察菌落长出的时间，对于最先长出的菌落进行标记。为了增加菌种初篩量，每次分离需使用300400套平板，控制每个平板上的有效菌落数在6070个。通过观察，我们发现搭载菌林的生长速度明显快于对照菌株，而且菌落成熟较早，菌落生长饱满，形态更规则，菌落平均直径也大于对照菌林。我们根据经验挑选20003000个生长良好的菌落，通过对其菌落特征、细胞形态的比较与鉴定，再4兆选20%~30%接入斜面培养。斜面培养成熟后，接入液体发酵培养基内进行深层静置培养。每隔四小时取样检测发酵液PH、生物量、总糖含量、还原糖含量、活性物质含量以及菌抹生长情况等，发现搭载菌抹在发酵液中的生长速度也明显快于对照菌抹，而且具有对原材料利用速度快、目的产物出现早等特点。根据测定结果筛选出高产菌抹进行小试与中试，并且经过对其遗传稳定性考察，确定了用于生产的太空诱变高效粪肠球菌。2.培养特征的研究通过培养，研究了太空诱变高效粪肠球菌对培养基在碳氮比、营养成分、pH、温度、氧需求、发酵周期等方面的适应情况变化，并根据变化及时进行相关生长参数的调整。确定太空诱变高效粪肠球菌培养基成分、运行参数、pH、发酵周期等。(3)生理生化反应对经航天搭载、太空诱变、地面筛选出的太空诱变高效粪肠球菌进行细胞形态特征观察及其与地面对照菌抹相关生理生化指标的对比观察。生产菌抹通过太空搭载，细胞的活性物质增加，细胞生长丰茂饱满，利用糖产酸现象比地面对照菌林有所改变，而地面对照菌株在某些糖的发酵中已失去产酸的能力。(4)代谢产物的测定用化学法和仪器测试它的主要化学组分及结构有无变化。通过实验检测:发现太空诱变高效粪肠球菌不仅发酵周期大大缩短，而且其发酵产物比对照组产物含量平均高出三倍以上。(5)遗传性状及蛋白表达的研究DNA是决定遗传的主要物质，基因是遗传的基本单位。由于基因突变会致使蛋白质的结构改变，最后导致个体性状的差异。因此，我们进行了菌抹的全细胞蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和菌林的基因组DNA限制性酶切分析。菌林培养后，用超声波、溶菌酶、化学试剂等进行破壁，全细胞蛋白提取并制备DNA。通过聚丙烯酰胺凝胶分析得到的蛋白指纹图谱可见太空诱变高效粪肠球菌与地面对照菌抹培养72h的蛋白图谱存在差异，①在97KD分子量附近有三条带有差异；②在66KD分子量附近有一条带有差异；③在20~31KD分子量之间有一条带有差异。基因组DNA限制性酶切/PFGE图谱，其中SmaI的酶切指紋图谱太空诱变高效粪肠球菌与地面对照菌林比较有一条带的差异。(6)对选出的太空诱变高效粪肠球菌进行稳定性分析连续传代试验，发现该菌林发酵周期缩短及发酵产物含量提高两项指标稳定，是可稳定遗传的变异。(7)在培养的基础上，进行小试和中试在统计的十批实验测定中，太空诱变高效粪肠球菌对数生长期大都提前至24小时左右，而地面对照菌的对数生长期则仍在48小时左右。发酵产物含量比对照组高出3-5倍。结果表明空间诱变及地面篩选出的太空诱变高效粪肠球菌基因有变异。普通粪肠球菌菌林经太空搭栽诱变，地面上的筛选、分离和纯化后，选育出发酵单位更高、产量更高的高产、优质菌林太空诱变高效粪肠球菌。该突变菌株在遗传上稳定，有较强的生产适应性，发酵含量比对照组产物含量平均高出三倍以上。三、具体制备工艺(一)太空菌种的制备以经过空间诱变育种精心选育的太空诱变高效粪肠球菌作为生产菌种。1.斜面种子制备按配比配制斜面培养基牛肉膏0.2-0.8%，酵母膏0.2-0.8%，蛋白胨0.3-0.8%，葡萄糖0.1-0.8%,氯化钠0.2-0.6%，琼脂1-5%，绵羊血5-10%;pH7.0-7.4;斜面培养基经在温度105-125°C，时间20-30分钟，蒸汽压力0.11-0.13Mpa灭菌后待用；启封菌种冷冻管，在无菌条件下接入血斜面，接种后置25-40。C恒温培养24-30小时。2.摇瓶种子液制备按配比配制摇瓶培养基牛肉膏0.2-0.8%，酵母膏0.2-0.8%,蛋白胨0.3-0.8%,葡萄糖0.1-0.8%,氯化钠0.2-0.6%;pH7.0-7.4;摇瓶培养基经在温度105-125。C，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.13Mpa灭菌后待用；将培养好的斜面菌种在无菌条件下按1-9%接种量接入摇瓶种子培养基内，25-40。C恒温培养10-30小时。(二)发酵过程所述发酵过程的发酵培养基是牛肉膏0.2-0.8%，酵母膏0.2-0.8%，蛋白胨0.3-0.8%,葡萄糖0.1-0.9%,氯化钠0.2-0.6%;经灭菌温度105-125°C，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.13Mpa灭菌后备用。l.一级发酵罐将优良的摇瓶菌种在无菌条件下按1-10%接种量接入灭菌后的一级发酵罐。罐压不超过0.02Mpa,通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌，在25-40。C恒温培养10-50小时；2.二级发酵罐将一级发酵培养液在无菌条件下按2-20%接种量接入灭菌后的二级发酵罐，罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌；在25-35。C恒温培养50-100小时。灭活采用加温使发酵液温度达到70-120°C,保温20-60分钟，冷却静置后放罐。(三)提纯过程1.发酵液浓缩将发酵后的发酵液用浓缩器进行浓缩，使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1:15-25，控制pH7.0-7.4制成发酵浓缩液。2.浓缩液的精制提纯浓缩液按珍珠岩1-2.0%及活性炭2-4.0%加入进行精制提纯，搅拌10-20分钟，过滤后再抽滤提纯，制成发酵精制液。3.浓缩液加入80-99%乙醇，体积量比控制在1:1.5-1:5.5或酌情而定。充分搅拌静置后，离心去除上清液,沉淀用蒸馏水溶解，调pH5.0，得到溶解液并将溶解液静置。再将溶解液离心去除杂质得到上清液，准确量取清液体积，按上清液体积计算出所需乙醇量，调pH值，将乙醇緩慢加入到上清液中，并充分搅拌，静置后离心去除上清液得到沉淀物。沉淀物再用蒸馏水溶解，调pH，离心，上清液再加乙醇沉淀。这样的工艺反复操作至中间检测合格为止，得到的沉淀物真空干燥3-8小时，即得到太空诱变高效粪肠球菌生产的发酵物。四、上述方法得到的太空诱变高效粪肠球菌发酵物的检验[性状]本品为白色或微黄色无定形粉末；无臭、无味。本品在水中易溶，在乙醇、氯仿及丙酮中不溶。比旋度取本品，精密称定，加水溶解并稀释成每lml中约含lOmg的溶液，依法测定(中国药典2000年版二部附录vlE)，比旋度为+70。C至+80°C。1、取本品10mg，加水0.5ml使溶解，加a—萘酚乙醇溶液(5-100)lml，摇匀，沿管壁緩緩加硫酸0.5ml,数分钟后，界面呈紫红色。2.取本品，加水制成每lml中含lmg的溶液，取约lOul点于滤纸上，晾干，用无水乙醇固定，置高硝酸溶液(取高碘酸1.2g，加水30ml溶解后.加0.2mol/L醋酸钠溶液1.5ml与乙醇100ml，混匀即得。置暗处保存，可使用数月)中浸泡5分钟，取出，用70%乙醇溶液冲洗，置还原液(取碘化钾5g，硫代硫酸钠5g，加水lOOml使溶解，再加乙醇150ml、2mol/L盐酸液2.5ml，随加随搅拌，临用时配)中浸泡5分钟，取出，用70%乙醇溶液冲洗，置品红亚疏酸试液中浸泡约30分钟，取出，用焦亚碌u酸钠溶液(取焦亚硫酸钠0.4g，加盐酸lml，加水溶解使成lOOml，即得)，沖洗，晾干，在滤纸片点样处应呈紫红色。3、取供试品和对照品适量，分别加氯化钠注射液制成每lml中含lmg的溶液作为供试品溶液和对照品溶液，按免疫原性测定法试验，供试品和对照品管应均无溶血发生。l、酸度取本品，加水制成每lml中含IOmg的溶液，依法测定(中国药典2000年版二部附录VIH),pH值应为3.0-5.0。2、吸收度取本品，加水制成每lml中含0.4mg的溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录VIA)，在260nm的波长处，其吸收度不得大于0.25，在280nm的波长处，其吸收度不得大于0.20。3、总氮量取本品，照氮测定法(中国药典2000年版二部附录WD第二法)测定.按干燥品计算，含总氮量应为0.8-2.0%。4、免疫原性取供试品和对照品适量，分别加氯化钠注射液制成每lml中含lOmg的溶液，再分别用磷酸盐緩冲液制成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256的稀释液作为供;式品溶液和对照品溶液，依法检查(附免疫原性测定法)，供试品不溶血管的最低浓度应不得高于对照品相应浓度的一倍以上。5、干燥失重取本品，在105。C干燥至恒重，减失重量不得过5.0%(中国药典2000年版二部附录VEIL)。6、重金属取本品，在l.Og，依法检查(中国药典2000年版VIH)含重金属不得过百万分之二十。7、异常毒性取本品，加氯化钠注射液制成每lml中含0.5mg的溶液，依法检查(中国药典2000年版附录XIC).按静脉注射法给药，应符合规定(供注射用)。五、发酵物中有效成分含量测定1.对照品溶液的制备精密称取经105"C干燥至恒重的D""甘露糖对照品O.lg置lOOml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度.摇匀；精密量取5ml，置100ml的量瓶中，加水至刻度，摇匀.每lml中含甘露糖50ug。2.供试品溶液备取本品适量，精密称定，加水溶解制成每lml中含40ug的溶液。3.标准曲线的制备精密称取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、l.Oml，分别置具塞试管中，各加水至l.Oml，再加3%苯酚溶液l.Oml，摇匀，沖入硫酸4.5ml，摇匀，放置于室温，以O管为空白.照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IVA)在490nm的波长处测定吸收度。以甘露糖ug数对相应的吸收度，计算回归方程。3.测定法精密量取供试品溶液1.Oml,照标准曲线制备项下自"再加3%苯酚溶液l.Oml"起，依法操作，测定吸收度，由回归方程计算甘露糖的含量。六、免疫原性测定法(补体结合法)；1、试液A.酸盐緩沖液(pH7.2)取氯化钠8.5g、磷酸氢二钠0.565g及磷酸二氢钾0.135g，加水至1000ml使其溶解，加10%硫酸镁溶液lml，摇匀。8.1%羊红细胞悬液羊血红细胞的制备由绵羊颈静脉无菌采血于盛有等量阿氏液(取葡萄糖20.5g、枸椽酸钠8.0g、氯化钠4.2g,枸椽酸5.5g,加水至1000ml使溶解，100。C灭菌30分钟)的无菌容器中，4""C保存。1%羊血红细胞悬液的制备取上述羊血红细胞适量，用氯化钠注射液洗涤三次，每次离心5分钟(2000转/分)，取压积羊血红细胞，用氯化钠注射液制成1%羊血红细胞悬液。取悬液，用氯化钠注射液稀释20倍制成供试品溶液，另取等量悬液加水稀释20倍作为空白溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IVA)，在541nm的波长处测定，其吸收度应为0.65-0.70，如超出限度应调节1%羊红细胞悬液的浓度。C.溶血素及致敏羊血红细胞溶血素的制备取上述压积羊血红细胞，用氯化钠注射液制成25%羊血红细胞悬液.取家兔1只，静脉注射上述羊血红细胞悬液，每日一次，共七次，前三次3ml，后三次5ml，末次注射后七日采血。分离血清，56°C.30分钟灭活，分装，0。C以下保存。溶血素单位的测定取溶血素适量，加磷酸盐緩冲液分别制成1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:10000的稀释液，各取0.1ml置试管中，力卩1%羊血细胞悬液0.1ml,摇匀，加稀释度为1:30的豚鼠血清(补体)0.2ml及磷酸盐緩冲液0.2ml，摇匀，37。C保温30分钟，完全溶血管的最高稀释度为1单位溶血素。致敏羊血红细胞的制备临用前，将2%的羊血红细胞悬液与2单位溶血索等体积混合，37。C保温15分钟即得。补体:取三只以上的豚鼠，心脏采血，离心分离血清，0。C以下保存。补体单位的测定取补体适量，加磷酸盐緩冲液，分别制成1:40、1:60、1:80、1:100、1:120、1:140、1:160、1:180的稀释液，各取0.2ml置试管中，加0.2ml磷酸盐緩冲液，摇匀，37。C保温30分钟后，分别加致敏羊血红细胞0.2ml,摇匀，37。C再保温30分钟.完全溶血管的最高稀释度为1单位的补体。抗体取对照品适量，加氯化钠注射液制成每lml中含10mg的对照品溶液免疫家兔，隔日采用耳静脉注射对照品溶液一次。第一次注射0.2ml，第二次至第五次各注射0.5ml，第六次至第十次各注射l.Oml，第十一次至第十五次各注射2.0ml，末次注射后三日采血，离心分离血清，56。C下30分钟灭活，分装，0。C以下保存(临用前，需56。C30分钟再次灭活)。抗体单位的测定取抗体适量，加磷酸盐緩冲液分别制成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32.1:64、1:128的稀释液，各取0.1ml置试管中，加对照品溶液0.1ml及2单位补体O.2m]，摇匀，于4-8。C放置4小时以上，置37°C保温30分钟，不溶血管的最高稀释度为1单位抗体。同时设抗原(不加抗体，以O.lml磷酸盐緩沖液代替)、抗体(不加抗原，以0.1ml磷酸盐緩冲液代替)、补体(不加抗原，抗体，以0.2ml磷酸盐緩沖液代替)对照管，以上三种对照管应全溶血；另设的致敏羊血红细胞(不加抗原、抗体和补体，以0.4ml磷酸盐緩沖液代替)对照管应不溶血。2、免疫原性测定法取对照品与供试品适量，照药品项下的规定制成不同浓度的对照品溶液和供试品溶液，各取0.1ml置试管中，加入2单位抗体0.1ml及2单位补体0.2ml.摇匀，于4-8。C放置4小时以上，置37。C保温30分钟，加入致敏羊血红细胞0.2ml，摇匀，37。C再保温30分钟。观察各管的溶血情况，不溶血管的最低浓度代表对照品的免疫原性。同时设抗原(不加抗体，以O.lml磷酸盐緩冲液代替)、抗体(不加抗原，以O.lml磷酸盐緩冲液代替)、补体(不加抗原、抗体、以0.2ml磷酸盐緩冲液代替)对照管，以上三种对照管应全溶血另设的致敏羊血红细胞(不加抗原、抗体和补体，以o.4ml磷酸盐緩沖液代替)对照管应不溶血。权利要求1、太空诱变高效粪肠球菌的筛选制备方法，其特征在于筛选一种经过空间搭载，运用空间技术进行微生物诱变育种，通过外层空间特殊的物理化学环境，即微重力、强辐射、高能粒子、交变磁场及高真空的环境中，导致于2007年10月19日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.2220的粪肠球菌的遗传性质发生变异，引起菌种DNA分子的变异和重组，从而获得生命力旺盛、生长速度快、品质优良的菌种，优选出其中的正变异、遗传性质稳定的太空诱变高效粪肠球菌作为生产菌种；该菌种已于2007年10月19日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.2221；(一)太空诱变高效粪肠球菌的筛选如下经太空搭载的菌株返回地面后，立即对搭载菌株和对照菌株同时进行分离，避免太空诱变菌株优良性状的丢失；菌株培养过程中严格控制培养温度、湿度、通气量与培养时间等条件，保证搭载菌株与对照菌株在同一条件下生长，仔细观察菌落长出的时间，对于最先长出的菌落进行标记。为了增加菌种初筛量，每次分离需使用300～400套平板，控制每个平板上的有效菌落数在60～70个；通过观察，发现搭载菌株的生长速度明显快于对照菌株，而且菌落成熟较早，菌落生长饱满，形态更规则，菌落平均直径也大于对照菌株；验挑选2000～3000个生长良好的菌落，通过对其菌落特征、细胞形态的比较与鉴定，再挑选20％～30％接入斜面培养；斜面培养成熟后，接入液体发酵培养基内进行深层静置培养；每隔四小时取样检测发酵液PH、生物量、总糖含量、还原糖含量、活性物质含量以及菌株生长情况等，发现搭载菌株在发酵液中的生长速度也明显快于对照菌株，而且具有对原材料利用速度快、目的产物出现早等特点；根据测定结果筛选出高产菌株进行小试与中试，并且经过对其遗传稳定性考察，确定了用于生产的太空诱变高效粪肠球菌；(二)太空诱变高效粪肠球菌的发酵制备工艺1.发酵过程所述发酵过程的发酵培养基是牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.9％，氯化钠0.2-0.6％；经灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.13Mpa灭菌后备用；(1)一级发酵罐将优良的摇瓶菌种在无菌条件下按1-10％接种量接入灭菌后的一级发酵罐。罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌，在25-40℃恒温培养10-50小时；(2)二级发酵罐将一级发酵培养液在无菌条件下按2-20％接种量接入灭菌后的二级发酵罐，罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌；在25-35℃恒温培养50-100小时。灭活采用加温使发酵液温度达到70-120℃，保温20-60分钟，冷却静置后放罐；2.提纯过程(1)发酵液浓缩将发酵后的发酵液用浓缩器进行浓缩，使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1∶15-25，控制pH7.0-7.4制成发酵浓缩液；(2)浓缩液的精制提纯浓缩液按珍珠岩1-2.0％及活性炭2-4.0％加入进行精制提纯，搅拌10-20分钟，过滤后再抽滤提纯，制成发酵精制液；(3)浓缩液加入80-99％乙醇，体积量比控制在1∶1.5-1∶5.5或酌情而定。充分搅拌静置后，离心去除上清液，沉淀用蒸馏水溶解，调pH5.0，得到溶解液并将溶解液静置。再将溶解液离心去除杂质得到上清液，准确量取上清液体积，按上清液体积计算出所需乙醇量，调pH值，将乙醇缓慢加入到上清液中，并充分搅拌，静置后离心去除上清液得到沉淀物。沉淀物再用蒸馏水溶解，调pH，离心，上清液再加乙醇沉淀。这样的工艺反复操作至中间检测合格为止，得到的沉淀物真空干燥3-8小时，即得到太空诱变高效粪肠球菌生产的发酵物。2.太空诱变高效粪肠球菌的发酵制备工艺1.发酵过程所述发酵过程的发酵培养基是牛肉膏0.2-0.8%,酵母膏0.2-0.8%，蛋白胨0.3-0.8%,葡萄糖0.1-0.9%,氯化钠0.2-0.6%;经灭菌温度105-125°C，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.13Mpa灭菌后备用;(1)一级发酵罐将优良的摇瓶菌种在无菌条件下按1-10%接种量接入灭菌后的一级发酵罐。罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌，在25-40。C恒温培养10-50小时；(2)二级发酵罐将一级发酵培养液在无菌条件下按2-20°/。接种量接入灭菌后的二级发酵罐，罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌；在25-35。C恒温培养50-100小时。灭活采用加温使发酵液温度达到70-120°C,保温20-60分钟，冷却静置后放罐；2.提纯过程(l)发酵液浓縮将发酵后的发酵液用浓缩器进行浓缩，使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1:15-25,控制pH7.0-7.4制成发酵浓缩液；(2)浓縮液的精制提纯浓缩液按珍珠岩1-2.0%及活性炭2-4.0%加入进行精制提纯，搅拌10-20分钟，过滤后再抽滤提纯，制成发酵精制液;(3)浓缩液加入80-99%乙醇，体积量比控制在l:1.5-1:5.5或酌情而定。充分搅拌静置后，离心去除上清液，沉淀用蒸馏水溶解，调pH5.0，得到溶解液并将溶解液静置。再将溶解液离心去除杂质得到上清液，准确量取上清液体积，按上清液体积计算出所需乙醇量，调pH值，将乙醇緩慢加入到上清液中，并充分搅拌，静置后离心去除上清液得到沉淀物。沉淀物再用蒸馏水溶解，调pH,离心，上清液再加乙醇沉淀。这样的工艺反复操作至中间检测合格为止，得到的沉淀物真空干燥3-8小时，即得到太空诱变高效粪肠球菌生产的发酵物。2、太空诱变高效粪肠球菌的应用，其特征在于根据太空诱变高效粪肠球菌发酵制备的发酵液，是将优选普通粪肠球菌进行太空搭载，经过空间诱变精心筛选培育出太空诱变高效粪肠球菌作为生产菌种，经一级发酵和二级发酵，将发酵液精制提纯得到的；所述的发酵液具有调节免疫力功能、抗胂瘤的功能、抗炎功能、刺激骨髓造血干细胞的功能、降血脂功能、降血糖功能、抗氧化功能、改善记忆功能、緩解视疲劳功能、促进排铅功能、清咽功能、降血压功能、改善睡眠功能、促进泌乳功能、緩解体力疲劳功能、提高缺氧耐受力功能、对辐射危害有保护功能、减肥功能、改善生长发育功能、增加骨密度功能、改善营养性贫血功能、对化学性肝损伤有保护功能、祛痤疮功能、祛黄褐斑功能、改善皮肤水分功能、改善皮肤油份功能、调节肠道菌群功能、促进消化功能、通便功能、对胃粘膜损伤有保护功能等多方面的作用。全文摘要本发明涉及空间诱变优良微生物菌种，具体说是一种太空诱变高效粪肠球菌的筛选制备方法及其应用。粪肠球菌为肠球菌属中最常见的即为代表种，粪肠球菌生活在人体肠道里，通常对人体不仅无害而且有益。但它有时也会引发严重感染，并对抗生素有抵抗力。本发明优选普通粪肠球菌进行太空搭载，经过空间诱变精心筛选培育出太空诱变高效粪肠球菌作为生产菌种，其生命力旺盛、生长速度快、发酵单位高、发酵周期短、发酵产物含量高、生产适应性强的菌株作为生产菌种，经一级发酵和二级发酵，将发酵液精制提纯，其发酵液具有调节免疫力功能、抗肿瘤等功能。文档编号C12N13/00GK101298598SQ20071001899公开日2008年11月5日申请日期2007年11月5日优先权日2007年11月5日发明者卫孙申请人:卫孙