一种用于生产冬虫夏草菌丝体的培养基的制作方法

专利名称：：一种用于生产冬虫夏草菌丝体的培养基的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种中国冬虫夏草菌(拉丁学名为Cordycepssinensis)的无性型一中国被毛孢(拉丁学名为Hirsutellasinensis)采用工业化发酵生产发酵冬虫夏草菌粉的生产方法，具体地说是涉及其在工业生产过程中的培养基的配方。
背景技术：
：冬虫夏草是一种天然存在的稀有中药材，除含糖、脂肪、粗纤维等一般成分外，还含有甘露醇、麦角甾醇、腺苷、虫草酸、冬虫夏草素、维生素B,2等活性成分。其滋补和治疗功用在人参、鹿茸之上。但天然冬虫夏草生长期长，分布在高海拨的高山草甸地带，资源紧缺，采集不易，价格十分昂贵。杭州中美华东制药有限公司以人工发酵方法获得冬虫夏草菌丝体及其制剂"百令胶囊"(内含发酵冬虫夏草菌丝体粉末)，并已收载在《中华人民共和国药典2005年版二部》中。此外，在中国专利《中国冬虫夏草真菌的发酵生产方法》(专利号ZL97110448.4,公告日2001年3月28日)中公开了一种中国冬虫夏草真菌的发酵生产方法，该方法是将菌种植入液体培养基置于摇床上，温度2(TC以下，培养8天，然后植入一级种子罐，温度2(TC以下，发酵5-8天，然后以培养基量的IO倍扩大，逐级培养，直至达到所需要的量，出罐过滤而成。这一发酵过程均在液体培养基中进行，培养基为碳源0.5-5%，氮源0.2-5%，微量元素，维生素少许，其余为水份。该专利只是公开了液体培养基的配方，没有公开菌种的斜面培养基，而菌种的斜面培养是整个生产过程的起点，没有菌种的斜面培养就不能为发酵生产提供种子，从而无法进行发酵冬虫夏草菌粉的生产；而且，天然冬虫夏草作为严寒高原物种，要使其在平原环境下生长，是比较困难的，只有选择适合冬虫夏草菌生长的斜面培养基才能保证新采集菌种的成功分离及纯正冬虫夏草菌种的不断传代，并保持其优良性状，从而为后续的发酵生产提供优质种子，因此，冬虫夏草的斜面培养在整个生产过程中是至关重要的。斜面培养属固体培养，其生长环境与营养要求都与液体培养不同，在中国专利ZL97110448.4中没有公开斜面培养基的组成，如果用此专利中的液体培养基进行斜面培养，斜面生长会出现不良现象，无法为发酵提供有利保障；此外在目前的文献中均没有对斜面培养基的报导。此外，采用中国专利ZL97110448.4中的液体培养基进行工业生产，发现其存在着产量低、成本大的缺陷，并且此专利培养基配方中的牛肉汤等受原材料影响较大，质量难以控制等，不适合工业化大生产的需要。发明的内容本发明目的在于解决现有技术中无固体培养基及液体培养基质量难以控制不适应工业化生产等不足，提供一种用于发酵冬虫夏草菌丝的斜面培养方法，为发酵提供保障；同时也提供一种原材料营养丰富，价格低廉，生产容易控制，从而能够生产出高品质、质量稳定的冬虫夏草菌粉的发酵培养基。本发明公开了一种用于微生物发酵生产冬虫夏草菌丝体的培养基，包括斜面培养基与发酵培养基，其特征是斜面及发酵阶段采用不同的培养基。本发明公开的斜面培养基，按重量体积比(g/ml)计，包括碳源1.08.0%，氮源1.68.0%，无机盐00.1%,琼脂粉0.5.5%，其余为水；优选碳源3.05.0%，氮源2.56.0%,无机盐0.020.06%，琼脂粉0.51.0%，其余为水；其中所述的碳源选自葡萄糖、玉米粉、土豆汁和糊精中的几种氮源选自酵母粉、麸皮、蚕蛹粉，或再加蛋白胨；无机盐选自氯化钠、氯化镁、硫酸镁、氯化锰、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、硫酸锰中的几种。更优选的斜面培养基为葡萄糖1.03.0%,玉米粉02.0%，土豆汁01.0%，糊精01.0%;酵母粉0.11.0%，麸皮0.52.0%，蚕蛹粉1.03.0%,蛋白胨02.0%;硫酸镁00.05%,磷酸二氢钾00.05%;琼脂粉0.51.0%，其余为水。本发明公开的发酵培养基，按重量体积比(g/ml)计，碳源2.04.0%，氮源2.04.0%，无机盐00.1%;其余为水；其中所述的碳源为葡萄糖、玉米浆、糖蜜中的几种；氮源为蚕蛹粉、黄豆饼粉、酵母膏中的几种；无机盐为氯化钠、氯化镁、硫酸镁、氯化锰、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、硫酸锰中的一种或多种。其中优选的发酵培养基为葡萄糖1.01.5%，玉米浆01.0%，糖蜜1.01.5%;蚕蛹粉0.51.0%，黄豆饼粉1.02.0%，酵母膏0.51.0%;硫酸镁00.05°/0，磷酸二氢钾00.05%,其余为水。更优选的发酵培养基为葡萄糖1.0%，糖蜜1.0%,蚕蛹粉0.5%，黄豆饼粉1.0%，酵母膏0.5%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.02%，其余为水。在工业生产中，先将菌种接种于斜面培养基，在1216'C培养2535天，然后将菌种接种于发酵培养基于摇床上，温度1216。C培养810天，然后接种于一级种子罐，温度12-16'C培养810天，然后以培养基量的810倍扩大，逐级发酵，直至达到所需的量，出罐后进行固液分离，将固体烘干、粉碎而成。本发明所提供的培养基，在不同的培养阶段采用不同的培养基，既保证了冬虫夏草菌能够在平原生长，又确保了发酵冬虫夏草菌丝体粉末具有与天然冬虫夏草相当的质量。本发明采用不同培养基带来的主要优势是斜面培养基不同于发酵培养基的最主要一点是氮源中含有麸皮，同时采用酵母粉和蚕蛹粉，这三种原材料的组合，经试验证明保证了新采集的冬虫夏草菌能够在斜面上生长，并保证了传代的稳定，不易退化，为生产提供了保障。本发明对中国专利ZL97110448.4中的液体培养基进行了优化，通过大量的小试和中试，确定了最适宜工业化的培养基，并且在改善产品质量和提高产量方面都有一定的效果，既保障了其具有与天然冬虫夏草营养相当的特点，又使其适合于工业化大生产的需要。本发明的发酵培养基与中国专利ZL97110448.4上的培养基相比，根据天然冬虫夏草所生长的环境，为了更适合工业化大生产的需要，通过大量的实验所进行的工艺改进，其不同之处在于碳源的选择上由蔗糖改为葡萄糖，这更有利于菌体的吸收；而且在氮源上又增加了酵母膏这一原材料，更有利于包括氨基酸、腺苷、甘露醇等主要代谢产物的生成；另外，培养基中的原材料基本上都是粮食原料，简单易得，营养丰富，价格低廉，而且经过培养基的精心组合后，可以大大地减少培养基的总量，从而进一歩地降低生产成本，更适宜工业化生产的需要。所以，用本发明生产冬虫夏草菌丝体不但成本低，适合于工业化生产的需要，而且质量优，具有与天然冬虫夏草相当的营养价值。具体实施方式-本发明所述的1.0%的土豆汁是指取10g土豆，用1000ml水，煮烂过滤，取其滤液，定容至1000ml。实施例I.将菌种接种于斜面，培养基配方为葡萄糖1.5%，玉米粉1.0%，糊精0.5%，麸皮1.5%,酵母粉0.5%，蚕蛹粉1.5%，蛋白胨1.0%;硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.02%;琼脂粉0.8%，其余为水，在12i:培养25天；然后将菌种接种于发酵培养基，培养基配方为葡萄糖1.0%，糖蜜1.0%;蚕蛹粉0.5%，黄豆饼粉1.0%，酵母膏0.5%;硫酸镁0.01%,磷酸二氢钾0.02%,其余为水，置于摇床上，温度14'C培养8天；然后接种于一级发酵罐，温度14'C培养8天，然后以培养基量的IO倍扩大，逐级发酵，直至30吨罐。出罐后进行固液分离，将固体烘千、粉碎而成。实施例2:发酵培养基的配方为葡萄糖1.5%，玉米浆1.0%,糖蜜1.5%;蚕蛹粉1.0%，2.0%，酵母膏1.0%;硫酸锰0.0125%,氯化钾0.01%，其余为水，通气量为5:1。斜面培养基及其余步骤及条件与实施例1相同。实施例3:将菌种接种于斜面，培养基配方为葡萄糖1.0%，玉米粉2.0%,土豆汁1.0%，糊精1.0%;麸皮1.5%，酵母粉0.1%,蚕蛹粉3.0%-，硫酸镁0.01%，氯化钾0.01%;琼脂粉0.8%，其余为水，发酵培养基及其余步骤及条件与实施例1相同。实施例4:对比实验将实施例1、2和3所获得的产品与按ZL97110448.4公开的实施例生产的产品进行对比(具体数据见下表。除培养基配方及其所加的量不同外，其他生产条件等同)，发现本发明所生产的发酵冬虫夏草菌丝体的产量高于"中国专利ZL97110448.4"所生产的冬虫夏草菌丝体的产量。并按《中华人民共和国药典2005年版》中所收载的"百令胶囊"的测定方法对其进行检测，本发明所生产-的全部符合药典标准，而"中国专利ZL97110448.4"所生产的冬虫夏草菌丝体粉末与药典标准有一定的偏差。本发明经过对原材料的精心筛选，既便发酵培养基所加的量很少，比如碳源与氮源都只用2%，如实施例1与实施例3所公开的技术方案，其产量与"ZL97110448.4专利"中各实施例相当，而工业成本却降低了许多。而如果采用与"ZL97110448.4专利"中各实施例相当的培养基的量，如实施例2所公开的技术方案，则产量大大地优于它。本发明与采用中国专利ZL97U0448.4技术方案生产的发酵冬虫夏草菌丝体质量比较<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>其中，样品1为采用"ZL97110448.4专利实施例1"生产的发酵冬虫夏草菌丝体粉末，样品2为采用"ZL97110448.4专利实施例2"生产的发酵冬虫夏草菌丝体粉末，样品3为采用"ZL97110448.4专利实施例3"生产的发酵冬虫夏草菌丝体粉末，样品4为采用本专利实施例1生产的发酵冬虫夏草菌丝体粉末，样品5为采用本专利实施例2生产的发酵冬虫夏草菌丝体粉末，样品6为采用本专利实施例3生产的发酵冬虫夏草菌丝体粉末。其中，总氨基酸、腺苷、甘露醇的含量为每0.2§发酵冬虫夏草菌丝体粉末中所含的量。从以上表格可以得出，本发明用于生产中，得率高，同时质量优于ZL97U0448.4，并符合药典标准。权利要求1.一种用于微生物发酵生产冬虫夏草菌丝体的培养基，包括斜面培养基和发酵培养基。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，按重量体积比计，所述的斜面培养基包括碳源1.08.0%，氮源1.68.0%，无机盐00.1%，琼脂粉0.51.5%，其余为水；其中所述的碳源选自葡萄糖、玉米粉、土豆汁或糊精中的几种；氮源选自酵母粉、蚕蛹粉、蛋白胨或麸皮中的几种；无机盐选自氯化钠、氯化镁、硫酸镁、氯化锰、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸亚铁或硫酸锰中的几种。3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，按重量体积比计，碳源3.05.0%，氮源2.56.0%，无机盐0.020.06%，琼脂粉0.51.0%，其余为水；其中所述的碳源选自葡萄糖、玉米粉、土豆汁和糊精中的几种；氮源选自酵母粉、蚕蛹粉、蛋白胨和麸皮中的几种；无机盐选自氯化钠、氯化镁、硫酸镁、氯化锰、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、硫酸锰中的几种。4.根据权利要求3所述培养基，其特征在于，按重量体积比计，葡萄糖1.03.0%，玉米粉02.0%,土豆汁01.0%，糊精01.0%;酵母粉0.11.0%，麸皮0.52.0%，蚕蛹粉1.03.0%，蛋白胨02.0%;硫酸镁00.05%，磷酸二氢钾00.05%;琼脂粉0.51.0%，其余为水。5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，按重量体积比计，所述的发酵培养基包括碳源2.04.0%，氮源2.04.0%，无机盐00.1%，其余为水；其中所述的碳源为葡萄糖、玉米浆、糖蜜中的几种；氮源为蚕蛹粉、黄豆饼粉、酵母膏中的几种；无机盐为氯化钠、氯化镁、硫酸镁、氯化锰、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、硫酸锰中的一种或多种。6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，按重量体积比计，所述的葡萄糖1.01.5%，玉米浆01.0%，糖蜜1.01.5%;蚕蛹粉0.51.0%，黄豆饼粉1.02.0%，酵母膏0.51.0%;硫酸镁00.05%，磷酸二氢钾00.05%，其余为水。7.根据权利要求6所述的培养基，其特征在于，按重量体积比计，所述的葡萄糖1.0%，糖蜜1.0%，蚕蛹粉0.5%，黄豆饼粉1.0%，酵母膏0.5%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.02%，其余为水。全文摘要本发明公开了一种用于微生物发酵生产冬虫夏草菌丝体的培养基，包括斜面培养基和发酵培养基。本发明所提供的培养基，在不同的培养阶段采用不同的培养基，既保证了冬虫夏草菌能够在平原生长，又确保了发酵冬虫夏草菌丝体粉末具有与天然冬虫夏草相当的质量。并且在改善产品质量和提高产量方面都有一定的效果，既保障了其具有与天然冬虫夏草营养相当的特点，又使其适合于工业化大生产的需要。文档编号C12N1/14GK101096641SQ20071002432公开日2008年1月2日申请日期2007年6月13日优先权日2007年6月13日发明者李邦良,珍王,袁水金,静许申请人:杭州中美华东制药有限公司