专利名称：转基因油菜t45事件外源插入载体左边界旁侧序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域中转基因油菜的检测，具体地说，涉及一种转基因油菜外源基因整合事件T45的外源插入载体左边界旁侧序列及其应用。
背景技术：
近年来，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等转基因作物已在很多国家获准种植和生产，有的被加工成食品、饲料或用作食品添加剂。由于转基因产品的生态安全和食用安全一直备受争议，30多个国家和地区相继实施转基因产品标识制度。
根据转基因产品中外源基因的序列信息，外源基因在转基因构建体上的组合方式，以及构建体在基因组上的整合位点，可以采用基因特异性、载体特异性和事件特异性的检测方法。
1、基因特异性检测方法由于大量的转基因载体使用了相同的外源基因，因此基因特异性检测方法并不适合当前转基因产品不断涌现的现实。
2、载体特异性检测方法载体特异性检测方法利用基因元件之间的边界序列特征，能够有效鉴定使用类似基因元件的不同构建体，而且存在序列信息容易获得的特点，因此被很多研究者所使用。但是，由同一构建体可能获得不止一个不同特性的转化株，甚至可能被转化到不同的物种中，而这些转化株未必全部经过了安全评估。因此载体特异性检测方法不能识别不同的转基因品系，也不能判别该转基因品系是否已经过安全评估。
3、事件特异性的检测方法事件特异性检测的基础是转基因构建体在基因组DNA序列上的整合位点具有高度特异性，即使是相同的载体多次转化，整合的位置和整合位点特征也是不可重复的。因此，根据不可重复的整合位点特征序列，开发出了事件特异性的检测方法。与前两种方法相比，事件特异性检测具有最高的特异性，最适合做转基因产品的定性和定量检测。但转基因构建体的完整信息通常难以获得，而已知序列基因元件可能距边界有相当的距离，而且在整合的过程中，载体和基因组之间可能发生复杂的重组，因此，分离旁侧序列成为事件特异性检测的关键。2000年2月，欧盟为此资助了Qpcrgmofood European Project项目，该项目现已成功分离获得多个品种旁侧序列并用于建立事件特异性检测方法。当前，事件特异性检测方法已经被用于转基因Roundup Ready soybean，Mon810 maize等一系列转基因商品化品种的检测。
经对现有专利和其他文献的检索，尚未发现任何关于转基因油菜T45事件外源插入载体左边界旁侧序列和利用此序列建立事件特异性定性、定量PCR(聚合酶链式反应)检测的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术在检测转基因油菜T45事件和转基因油菜品种T45中存在的不足，提供一种转基因油菜T45事件外源插入载体左边界旁侧序列及其应用。
本发明的目的是这样实现的本发明以转基因油菜品种T45为材料，利用Invitrogen公司GenomeWalker试剂盒构建基因组文库，并利用引物T45LB-15’CACTGTCGGCAGAGGCATCTTCAACG3’和T45LB-25’AGCTGGGCAATGGAATCCGAGGAGGT 3’与试剂盒提供的接头引物，以PCR技术(聚合酶链式反应)扩增获得T45事件外源插入载体左边界旁侧序列SEQ NO.1。
转基因油菜T45事件外源插入载体左边界旁侧序列的特征是(1)第1至255个碱基来源于外源插入载体序列；(2)第256至2154个碱基来源于油菜基因组序列；(3)由来源于外源插入载体的第1至255个碱基和来源于油菜基因组序列的第256至2154个碱基共同组成油菜T45事件外源插入载体左边界旁侧序列。
上述转基因油菜T45事件外源插入载体左边界旁侧序列的应用研究(1)利用该序列特征设计转基因油菜外源基因整合事件T45的事件特异性定性PCR检测方法；(2)利用该序列特征设计转基因油菜外源基因整合事件T45的事件特异性定量PCR检测方法；(3)利用该序列特征设计转基因油菜品种T45的品系特异性定性PCR检测方法；(4)利用该序列特征设计转基因油菜品种T45的品系特异性定量PCR检测方法。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下1、本发明首次测序公布转基因油菜T45事件外源插入载体左边界旁侧序列。
2、本发明首次分析并确认转基因油菜T45事件外源插入载体左边界旁侧序列中不同碱基的来源，并确定外源插入载体序列和油菜基因组序列的接合位点。
3、利用本发明发现的序列特征，建立转基因油菜T45事件以及转基因油菜品种T45的事件特异性定性、定量PCR检测方法。
4、本发明适用于建立转基因油菜T45事件以及转基因油菜品种T45的其他事件特异性PCR检测方法等方面。
图1-转基因油菜T45事件左边界结合位点，其结合位点特征序列。
图2-转基因油菜T45事件特异性定性PCR扩增，其中M-分子量Marker；1-转基因油菜Ms8Rf3基因组DNA模板；2-转基因油菜Ms1Rf1基因组DNA模板；3-转基因油菜Ms1Rf2基因组DNA模板；4-转基因油菜Oxy-235基因组DNA模板；5-转基因油菜T45基因组DNA模板；
6-转基因油菜Topas 19/2基因组DNA模板；7-转基因油菜RT45基因组DNA模板8-非转基因油菜中油821模板。
图3-转基因油菜T45事件特异性定量PCR扩增。
具体实施例方式
1、转基因油菜T45事件外源插入载体左边界旁侧序列的PCR扩增先将20％SDS预热到65℃，取15ml SDS抽提buffer(0.1TrisHCl，0.05MEDTA，1M NaCl pH8.0)加入到50ml离心管，再加入2.5μl β-巯基乙醇，混匀；液氮研磨3g左右的叶片，将粉末转至50ml含抽提buffer的50ml离心管中，在振荡器上振荡混匀，加入2ml预热的20％SDS，混匀，65℃水浴至少30分钟，其间要轻轻摇动试管；水浴后，迅速将离心管置于冰上，加入3ml 3M KAc，混匀，在冰上放置30分钟；4℃ 5000g离心5min；将上清转移到新的50ml离心管中，加入2/3体积的异丙醇，混匀，-20℃放置30min以上；6000g，4℃离心15min，倒掉上清，用75％乙醇洗一遍，真空干燥，用超纯水溶解DNA，溶解后，将溶液转移到15ml的离心管中；按DNA溶解体积的1％加蛋白酶K，55℃水浴30min；加入等体积苯酚，混匀，轻摇30min，8000g离心10min；转移上清至新的tube中，加等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，轻摇20min，8000g离心15min；转移上清至新的tube中，加等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，轻摇20min，8000g离心15min；吸取上清，每管加入5μl RNase，混匀，37℃水浴1hr降解RNA；用等体积的苯酚抽提一次，轻摇20min，8000g离心15min；转移上清至新的离心管中，加等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，轻摇20min，8000g离心15min；吸上清加入1/10体积3M NaAC，混匀，加入等体积异丙醇，-20℃C放置30min，沉淀DNA；6000g，4℃离心15min，倒掉上清，用75％乙醇洗2遍，离心去掉75％乙醇，真空干燥；干燥后，用超纯水溶解DNA备用。
利用Invitogen公司GenomeWalker试剂盒，以油菜T45基因组DNA为材料，根据试剂盒提供的方法构建油菜T45基因组文库。
合成引物序列如下T45LB-15’CACTGTCGGCAGAGGCATCTTCAACG 3’和T45LB-25’AGCTGGGCAATGGAATCCGAGGAGGT 3’。
以Oxy-235基因组文库为模板，利用试剂盒提供的接头引物AP1和T45LB-1进行PCR扩增。在50ul反应体系中，取T45基因组文库DNA 1ul，其他各组分终浓度为，KOD Plus Buffer 1x，dNTPs每种200uM，MgSO41mM，引物各100nM，KOD Plus酶1u。反应条件为，94℃ 2分钟预变性，94℃ 15秒，68℃ 3分钟，循环45次，68℃保温7分钟。取1ul PCR产物，用水稀释50倍，从中取1ul作为第二轮PCR的模板。第二轮反应以试剂盒提供的AP2和T45LB-2为引物，反应体系与第一轮相同。反应条件为，94℃ 2分钟预变性，94℃ 15秒，68℃ 3分钟，循环25次，68℃保温7分钟。琼脂糖电泳分离DNA，EB染色鉴定。
以QIAGEN公司QIAquick PCR Purification Kit纯化PCR产物。
将PCR产物与EcoRV酶切的pZero2(Invitrogen)载体连接。连接体系DNA mixture 22μl；2.5μl 10×T4 DNA Ligase Buffer with 1mM ATP；0.5μlT4 DNA Ligase(NEB)。22℃连接至少1hr。
根据《分子克隆实验指南》提供的方法制备大肠杆菌TOP10(Invitrogen)感受态细胞，并以连接产物转化。挑取单克隆，以突变位点特异引物进行菌落PCR检测重组子。将筛选出的克隆扩大培养，小量制备质粒，酶切验证。
将筛选出的克隆送测序公司测序。将获得的序列信息，利用NCBI提供的Blastn软件，分析不同部分序列的来源，从而判断基因组和载体的结合位点。
2、应用方法1)利用本发明中所提供序列设计转基因油菜T45事件和转基因油菜品种T45的事件特异性定性PCR检测方法合成引物序列如下T45LG5’GTAAAATCAATGGACACATGAATTATG 3’和T45LV5’GTCTTTACGGCGAGTTCTGTTAGG 3’。
分别取转基因油菜品种Ms8Rf3，Ms1Rf1，Ms1Rf2，Oxy-235，T45，Topas 19/2，GT73；非转基因油菜品种中油821，以及拟南芥，白菜，甘蓝，芥菜，大豆，水稻、玉米、棉花基因组DNA为模板，分别利用T45LG/T45LV引物组合进行PCR扩增。在25ul反应体系中，以100ng不同来源基因组DNA为模板，其他各组分终浓度为，PCR Buffer 1x(含10mM Tris·HCl pH8.3，KCl 50mM)，dNTPs每种200uM，MgCl22.5mM，引物各250nM，Hot Start Taq酶1u。反应条件为，94℃ 2分钟预变性，94℃ 15秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒，循环35次，72℃保温2分钟。PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物。
2)利用本发明中所提供序列设计转基因油菜T45事件和转基因油菜品种T45的事件特异性定量PCR检测方法合成TaqMan探针序列如下T45LP5’FAM-CTCCATGGGAATTCATTTACAACTGTATTCC-TAMRA 3’。
针对T45事件外源插入载体左边界旁侧序列的引物、探针组合被用于荧光定量PCR分析。荧光定量PCR分析在一台MJR DNA Engine Opticon 2 ContinuousFluorescence Detector上进行，检测及分析软件为Opticon Monitor 2 Version2.02。
T45事件定量检测反应体积20ul，含模板DNA 100ng，其他组分含量为TaqMan Buffer 1x(50mM KCl，10mM.Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.3)，MgCl24.5mM，引物T45LG和T45LV 400uM，探针OXYLP 200uM，dATP dCTP dGTP各400uM，dUTP 800uM，Amperase Uracil N-glycosylase(UNG)0.2u，AmpliTaq Gold1.25u。
TaqMan反应条件为50℃ 2分钟和95℃ 10分钟预变性以后，进行50次PCR循环95℃ 15秒变性，60℃ 1分钟退火及延伸，读板。
转基因油菜T45基因组DNA被相同浓度非转基因油菜821 DNA稀释至不同含量，以100ng的混和油菜基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应。不同稀释倍数，分别含100，13，1.3，0.13，0.013ng T45基因组DNA的混和DNA样品被用于建立标准曲线。所有的荧光定量反应都重复3次。
根据标准曲线优化的结果，利用与建立标准曲线相同的PCR反应条件，以标准曲线为参照测定含有T45基因组DNA的混和油菜DNA样品中T45基因组DNA的量。取100ng基因组DNA为模板，利用不同含量标准样品做标准曲线，根据获得的标准曲线和转基因样品的Ct值，计算T45基因组DNA的质量，从而计算出T45在样品中的含量。所有荧光定量反应都重复3次。
3、实验结果1)转基因油菜T45事件外源插入载体左边界旁侧序列的PCR扩增和测序分析利用AP1/T45LB-1和AP2/T45LB-2引物组合，以T45基因组DNA构建的GenomeWa1ker文库为模板，成功扩增获得2154bp扩增产物。对PCR产物测序，并经Blastn分析，发现其中255个碱基对与不同来源载体序列同源，其左边界重复序列丢失，而其余1899个碱基对与白菜基因组序列同源被认为是油菜基因组序列。具体转基因油菜T45事件外源插入载体左边界旁侧序列见SEQ NO.1。
根据以上分析，本发明分离获得的序列包含转基因油菜T45事件外源插入载体左边界结合位点，其结合位点特征序列如图1所示。
2)利用本发明中所提供序列设计转基因油菜T45事件和转基因油菜品种T45的事件特异性定性PCR检测方法以不同来源转基因油菜、非转基因油菜基因组DNA为模板，利用T45事件外源插入载体左边界旁侧序列特异性引物组合T45LG/T45LV，进行PCR扩增，结果如图2。只有T45基因组DNA可以扩增出特异的PCR产物，而其他转基因和非转基因油菜DNA做模板时都没有扩增产物可观察到。同时以其他非油菜植物基因组DNA为模板，也没有可见的PCR扩增产物。因此，我们认为，该引物组合具有良好的特异性，适合用于事件特异性的检测。
3)利用本发明中所提供序列设计转基因油菜T45事件和转基因油菜品种T45的事件特异性定量PCR检测方法根据梯度稀释模板，3次重复获得的荧光曲线信息，针对T45事件的特异性荧光定量PCR反应标准曲线被建立起来，如图3所示，其R2值为0.996，表明外源基因的拷贝数与荧光强度都具有良好的对应关系，适合用于外源基因的精确定量。
为了验证本研究中建立的定量方法的精确性，我们使用了从标准转基因油菜T45产品中提取的基因组DNA用非转基因油菜基因组DNA稀释至一定含量，并以不含转基因油菜T45基因组DNA的相同量基因组DNA做对照，作为实时荧光定量PCR反应的模板，并根据相同条件下获得的标准曲线，计算不同样品中转基因油菜T45基因组DNA的含量。
以不含转基因油菜T45的非转基因油菜基因组DNA为模板，没有扩增产物被检测到。对于混和实验样品，用本研究中建立T45事件特异性荧光定量检测方法来检测，都和理论值非常接近，误差小于15％。
以上结果可以看出，本发明为转基因油菜事件T45以及转基因油菜T45的定量检测分析提供了基于简单、可靠的测定方法，可以用于不同来源、不同含量的混和产品中转基因油菜T45事件以及转基因油菜品种T45的定量。本发明为转基因标识提供了一种有用的参考，对转基因产品的控制提供了必要的手段。
序列表<110>中国农业科学院油料作物研究所<120>转基因油菜T45事件外源插入载体左边界旁侧序列及其应用<160>1<210>1<211>2154<212>DNA<213>油菜(Brassica napus cv.T45)<400>
gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccg gatattaccc tttgttgaaa agtctcaatt 60gccctttggt cttctgagac tgtatctttg atatttttgg agtagacaag cgtgtcgtgc 120tccaccatgt tgacgaagat tttcttcttg tcattgagtc gtaagagact ctgtatgaac 180tgttcgccag tctttacggc gagttctgtt aggtcctcta tttgaatctt tgactccatg 240ggaattcatt tacaactgta ttccatatgc ataattcatg tgtccattga ttttaccctt 300tattttatca ttcaaaatac ttcaagatat ttagatttca tgtaatgtag agaataaacc 360gatttgctta tggtttcttt atcttttctc taatccatat tgtcgtgttg tcatatatat 420ctctgtagtg actagtgaag aatttatagt gaccgtaaat aaatgggaga ctcgatctat 480gttctatgac ataaacctac atagagaatt ttcactattg aaattccaca ttagaccatt 540aatactctac atatgtgtat caatatatac attatagctt gttaattttt tcttataaac 600tgaaattgct agttgtagtc ttctactctc catcatcact taatttcaca ccactttcgc 660gattgcatct tgaaaaattt catctaattt atacaacatc ttatgtgaat ttagtatatt 720tttaattttt gaacagcgaa tttttatata taaataagta caataagaat gcagggtgaa 780tgcaatgtat tttaaaagaa aaagggtgaa aagacagttt ggttttggat ccggcgtacg 840gccgacgcgt gagcgtccgt gccgtcgccg gagcccattt tcttttggtt agaaacgttt 900
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1.一种转基因油菜T45事件外源插入载体左边界旁侧序列，其特征是(1)第1至255个碱基来源于外源插入载体序列，SEQ NO.1；(2)第256至2154个碱基来源于油菜基因组序列，SEQ NO.1；(3)由来源于外源插入载体的第1至255个碱基和来源于油菜基因组序列的第256至2154个碱基共同组成的DNA序列，转基因油菜T45事件外源插入载体左边界旁侧序列；
2.转基因油菜T45事件外源插入载体左边界旁侧序列的应用，其特征是(1)利用该序列特征设计转基因油菜外源基因整合事件T45的事件特异性定性PCR检测方法；(2)利用该序列特征设计转基因油菜外源基因整合事件T45的事件特异性定量PCR检测方法；(3)利用该序列特征设计转基因油菜品种T45的品系特异性定性PCR检测方法；(4)利用该序列特征设计转基因油菜品种T45的品系特异性定量PCR检测方法。
全文摘要
本发明公开了一种转基因油菜T45事件外源插入载体左边界旁侧序列及其应用。本发明以转基因油菜品种T45为材料，获得T45事件外源插入载体左边界旁侧序列，序列为SEQ NO.1。其中第1－255位碱基与插入载体序列相同，第256－2154位碱基与插入载体无同源性，为油菜基因组序列。本发明建立了转基因油菜外源基因整合事件T45的事件特异性定性、定量检测方法，可以进一步用于建立转基因油菜T45的其他事件特异性PCR检测方法研究。
文档编号C12Q1/68GK101020908SQ200710051358
公开日2007年8月22日 申请日期2007年1月24日 优先权日2007年1月24日
发明者卢长明, 吴刚, 武玉花, 肖玲 申请人:中国农业科学院油料作物研究所