专利名称：浓缩果汁中耐热耐酸菌的快速纳米pcr检测方法
技术领域：
本发明属于分子生物技术领域，尤其是一种应用快速纳米PCR方法检测浓缩果汁中耐热嗜酸菌的方法。
背景技术：
我国是目前世界上果汁的最大生产国之一，浓缩果汁每天都有大量出口。然而，果汁中存在的一种新型污染菌——耐热嗜酸菌在国外时有报道。耐热耐酸菌学名酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)，是一种嗜热、嗜酸、好氧的杆菌。它的芽孢能经受果汁加工中的巴氏杀菌而存活。由于巴氏灭菌不能除去此菌以及原料果清洗不足等，耐热耐酸菌在浓缩果汁生产中被带到最终产品中。在浓缩果汁中该菌虽然不繁殖代谢、不产生危害，但一旦稀释成低浓度的商品果汁时，在常温下即代谢产生一种不愉快风味的化合物——2，6-二溴苯酚，即使有万亿分之一浓度就会使果汁口感风味变差，甚至产生浊度升高乃至在包装物底部形成白色沉淀的危害。因此，国际贸易中对果汁中耐热嗜酸菌的含量有严格要求。
目前国内对浓缩果汁中耐热嗜酸菌的检测方法采用的是传统的微生物培养的方法。这些传统的培养计数检测法耗时长，一般需要3天甚至一星期才能出检测报告，无法及时反馈至生产线，从而成为浓缩果汁安全质量控制的难题，严重制约了我国浓缩果汁的出口。因此，建立浓缩果汁中耐热嗜酸菌的快速检测方法，已成为当务之急。
聚合酶链式反应(PCR)，又称体外酶促基因扩增，是一种在体外模拟DNA体内复制的基因扩增技术，该技术由K.Mullis于1985年发明，能在耐热DNA聚合酶的作用及特异性引物的引导下，在很短的时间里就能在一个试管内实现只有在生物体细胞分裂增殖时才出现的基因的大量复制，一般来说，在数小时内就可以将目的基因扩增至百万倍。
近年来，纳米技术与生物技术的结合越来越紧密，纳米颗粒作为一种具有特殊物理和化学特性的纳米材料，其在生物技术领域的应用也越来越广。
发明内容
本发明的目的在于提供一种浓缩果汁中耐热耐酸菌的快速纳米PCR检测方法，该检测方法可有效缩短浓缩果汁中耐热嗜酸菌的检测时间，提高浓缩果汁中污染菌检测的灵敏度，从而解决制约我国浓缩果汁的出口的检测难题。
本发明是通过以下技术方案来实现的 一种浓缩果汁中耐热耐酸菌的快速纳米PCR检测方法，其特征在于检测浓缩果汁中耐热嗜酸菌的方法步骤是 (1).从浓缩果汁中分离耐热嗜酸菌； (2).耐热嗜酸菌全基因组的提取； (3).依赖纳米银的快速PCR体系的配置； (4).快速PCR条件的设定与运行； (5).PCR产物检测。
而且，从浓缩果汁中分离耐热嗜酸菌的方法是取浓缩果汁100ml用无菌水稀释10倍，稀释果汁于80℃水浴热休克10min，再用冷水冷却至室温后用0.45μm无菌滤膜抽滤，抽滤后滤膜用无菌医用镊子取下放入装25ml液体培养基的小三角瓶中摇床培养6小时后备用。
而且，耐热嗜酸菌全基因组的提取方法是用15ml的锥形离心管5000rpm离心10min，弃上清，细菌沉淀中加5％Chelex100 20μl，涡旋振荡混匀，100℃水浴10min，立即冰浴1min，室温12000g/min离心10min，上清作为DNA模板。
而且，依赖纳米银的快速PCR体系的配置是(体积) ddH2O 6μl 10×Buffer(KOD-Dash DNA聚合酶的Buffer) 1.5μl dNTP(2.5mM)1.2μl Mg2+(25mM )0.5μl P1(2μM) 1.5μl P2(2μM) 1.5μl 模板DNA2μl KOD-Dash DNA聚合酶(2.5U/μl) 0.25μl 无色纳米银胶体(8μg/μl) 0.6μl。
而且，快速PCR条件的设定与运行方式是 按以下循环条件在快速PCR仪上进行PCR循环 预变性 95℃2min
完全延伸74℃2min。
而且，PCR产物的检测方法是电泳检测采用1％琼脂糖凝胶，跑胶后用EB液染色，然后用紫外分光透射仪观察即可判定在浓缩果汁中是否含有耐热耐酸菌。
而且，所述的液体培养基制备方法为(重量比)将酵母浸粉0.25％、蛋白胨0.5％、葡萄糖0.1％、吐温-80 0.1％采用250g/L无菌苹果酸调其pH值为3.7，在培养温度为43℃、摇床转速为120转/分钟即可。
而且，PCR技术扩增的引物序列为 上游序列P 1(5′---3′)CGAGCAAGTCTGGAGTGAAAGTC 下游序列 P2(5′---3′)GCTGGTAACACAGGTCAAGGGT。
本发明的优点和有益效果是 1.本发明做为纳米技术与生物技术结合的新成果，与已有方法相比，它展现了纳米胶体银在PCR反应中的新功效。本检测方法采用可提高PCR效率的KOD-Dash DNA聚合酶，然后加入纳米胶体银，并且使用SpeedCycler(快速PCR仪)，可以极大地提高果汁中耐热耐酸菌检测的灵敏度，能够在仅有2pgDNA模板的PCR体系中很较好的扩增出目的片断，并且通过了测序鉴定。
2.本发明整个PCR检测过程仅需40分钟(常规PCR需时2小时)，比常规PCR时间缩短3倍多，极大地节省了该菌检测的时间。
3.本发明不仅可以大大提高果汁中污染菌检测的灵敏度，而且极大地缩短了检测的时间，从而解决制约我国浓缩果汁的出口的检测难题，为我国果汁的出口提供了保障。
4.本发明可直接应用于浓缩果汁工业化生产中对耐热嗜酸菌的有效监控，这对提高果汁质量与安全水平、扩大出口贸易产生巨大的直接经济效益，并具有重要的社会意义。
图1为本发明在耐热耐酸菌基因组DNA模板浓度为2pg时尝试在快速PCR体系中加入不同纳米材料的扩增结果电泳图。
由该电泳图可以看出采用KOD-Dash DNA聚合酶，加入纳米银，并且使用SpeedCycler(快速PCR仪)，可以极大地提高苹果汁中耐热耐酸菌检测的灵敏度，能够在仅有2pgDNA模板的PCR体系中很较好的扩增出目的片段。
下表为在图1中加入不同纳米材料的对比电泳图。
0.空白对照 1.纳米Au(5nm) 2.纳米Au(10nm) 3.单壁纳米碳管(10mg/mL) 4.多壁纳米碳管(10mg/mL) 5.纳米碳粉(10mg/mL) 6.纳米Pt(0.14μg/μL) 7.纳米Ag-Pt(0.3μg/μL) 8.纳米Ag-Cu(0.3μg/μL) 9.纳米Rhenium(4μg/μL) 10.纳米Tantalum(2.4μg/μL) 11.纳米ruthenium(4μg/μL) 12.纳米Ag粉(1μg/μL) 13.有色纳米银(0.24μg/μL) 14.无色纳米银(8μg/μL) MDL2000Marker 以上14种物质(购买自Sigma)均在15μL的快速PCR体系中加0.6μL
具体实施例方式 本发明通过以下实施例进一步详述，但本实施例所叙述的技术内容是说明性的，而不是限定性的，不应依此来局限本发明的保护范围。
本浓缩果汁中耐热耐酸菌的快速纳米PCR检测方法的步骤是 (1).从浓缩果汁中分离耐热嗜酸菌； (2).耐热嗜酸菌全基因组的提取； (3).依赖纳米银的快速PCR体系的配置； (4).快速PCR条件的设定与运行； (5).PCR产物检测。
本发明中所涉及的PCR技术扩增的引物序列为 上游序列P1(5′---3′)CGAGCAAGTCTGGAGTGAAAGTC 下游序列P2(5′---3′)GCTGGTAACACAGGTCAAGGGT。
实施例1 浓缩苹果汁中耐热耐酸菌的快速PCR检测 1.从浓缩苹果汁中分离耐热嗜酸菌 取浓缩苹果汁100ml用无菌水稀释10倍，稀释果汁于80℃水浴热休克10min，再用冷水冷却至室温后用0.45μm无菌滤膜抽滤，抽滤后滤膜用无菌医用镊子取下放入装25ml液体培养基的小三角瓶中摇床培养6小时后备用。
该液体培养基制备方法为(重量比)将酵母浸粉0.25％、蛋白胨0.5％、葡萄糖0.1％、吐温-80 0.1％采用250g/L无菌苹果酸调其pH值为3.7，在培养温度为43℃、摇床转速为120转/分钟即可。
2.耐热嗜酸菌全基因组的提取 用15ml的锥形离心管5000rpm离心10min，弃上清，细菌沉淀中加5％Chelex100 20μl，涡旋振荡混匀，100℃水浴10min，立即冰浴1min，室温12000g/min离心10min，上清作为DNA模板。
3.依赖纳米银的快速PCR体系的配置 向快速PCR小板中加入下表的各种物质； 4.快速PCR条件的设定与运行 预变性 95℃2min
完全延伸74℃2min。
5.PCR产物的检测 (1).制备1％浓度的琼脂糖凝胶 (2).吸取5μl的PCR产物上电泳槽点样，同时点上5μl的DL2000Marker作为参照。
(3).加上4V/cm的电压进行电泳。
(4).待指示剂到合适位置时，取出胶板于凝胶成象系统下观察并照相记录。
若PCR产物在541bp处出现目的条带，则说明该浓缩苹果汁中含有耐热耐酸菌，反之则没有。
实施例2 1.从浓缩橘子汁中分离耐热嗜酸菌 取浓缩橘子汁100ml用无菌水稀释10倍，稀释果汁于80℃水浴热休克10min，再用冷水冷却至室温后用0.45μm无菌滤膜抽滤，抽滤后滤膜用无菌医用镊子取下放入装25ml培养液的小三角瓶中摇床培养6小时后备用。(液体培养基组成为酵母浸粉0.25％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.1％，吐温-80 0.1％，用250g/L无菌苹果酸调其pH值为3.7。) 2.耐热嗜酸菌全基因组的提取 用15ml的锥形离心管5000rpm离心10min，弃上清，细菌沉淀中加5％Chelex100 20μl，涡旋振荡混匀，100℃水浴10min，立即冰浴1min，室温12000g/min离心10min，上清作为DNA模板。
3.依赖纳米银的快速PCR体系的配置 向快速PCR小板中加入下表的各种物质； 4.快速PCR条件的设定与运行 预变性 95℃2min
完全延伸74℃2min 5.PCR产物的检测 (1).制备1％浓度的琼脂糖凝胶 (2).吸取5μl的PCR产物上电泳槽点样，同时点上5μl的DL2000Marker作为参照。
(3).加上4V/cm的电压进行电泳。
(4).待指示剂到合适位置时，取出胶板于凝胶成象系统下观察并照相记录。
若PCR产物在541bp处出现目的条带，则说明该浓缩苹果汁中含有耐热耐酸菌，反之则没有。
权利要求
1.一种浓缩果汁中耐热耐酸菌的快速纳米PCR检测方法，其特征在于检测浓缩果汁中耐热嗜酸菌的方法步骤是
(1).从浓缩果汁中分离耐热嗜酸菌；
(2).耐热嗜酸菌全基因组的提取；
(3).依赖纳米银的快速PCR体系的配置；
(4).快速PCR条件的设定与运行；
(5).PCR产物检测。
2.根据权利要求1所述的浓缩果汁中耐热耐酸菌的快速纳米PCR检测方法，其特征在于
从浓缩果汁中分离耐热嗜酸菌的方法是取浓缩果汁100ml用无菌水稀释10倍，稀释果汁于80℃水浴热休克10min，再用冷水冷却至室温后用0.45μm无菌滤膜抽滤，抽滤后滤膜用无菌医用镊子取下放入装25ml液体培养基的小三角瓶中摇床培养6小时后备用。
3.根据权利要求1所述的浓缩果汁中耐热耐酸菌的快速纳米PCR检测方法，其特征在于
耐热嗜酸菌全基因组的提取方法是用15ml的锥形离心管5000rpm离心10min，弃上清，细菌沉淀中加5％Chelex100 20μl，涡旋振荡混匀，100℃水浴10min，立即冰浴1min，室温12000g/min离心10min，上清作为DNA模板。
4.根据权利要求1所述的浓缩果汁中耐热耐酸菌的快速纳米PCR检测方法，其特征在于
依赖纳米银的快速PCR体系的配置是(体积)
ddH2O 6μl
10×Buffer(KOD-Dash DNA聚合酶的Buffer) 1.5μl
dNTP(2.5mM) 1.2μl
Mg2+(25mM) 0.5μl
P1(2μM)1.5μl
P2(2μM)1.5μl
模板DNA 2μl
KOD-Dash DNA聚合酶(2.5U/μl)0.25μl
无色纳米银胶体(8μg/μl)0.6μl。
5.根据权利要求1所述的浓缩果汁中耐热耐酸菌的快速纳米PCR检测方法，其特征在于
快速PCR条件的设定与运行方式是
按以下循环条件在快速PCR仪上进行PCR循环
预变性 95℃2min
完全延伸74℃2min。
6.根据权利要求1所述的浓缩果汁中耐热耐酸菌的快速纳米PCR检测方法，其特征在于
PCR产物的检测方法是电泳检测采用1％琼脂糖凝胶，跑胶后用EB液染色，然后用紫外分光透射仪观察即可判定在浓缩果汁中是否含有耐热耐酸菌。
7.根据权利要求2所述的浓缩果汁中耐热耐酸菌的快速纳米PCR检测方法，其特征在于所述的液体培养基制备方法为(重量比)将酵母浸粉0.25％、蛋白胨0.5％、葡萄糖0.1％、吐温-80 0.1％采用250g/L无菌苹果酸调其pH值为3.7，在培养温度为43℃、摇床转速为120转/分钟即可。
8.根据权利要求4所述的浓缩果汁中耐热耐酸菌的快速纳米PCR检测方法，其特征在于
PCR技术扩增的引物序列为
上游序列P1(5′---3′)CGAGCAAGTCTGGAGTGAAAGTC
下游序列P2(5′---3′)GCTGGTAACACAGGTCAAGGGT。
全文摘要
本发明涉及一种浓缩果汁中耐热耐酸菌的快速纳米PCR检测方法，其方法是(1)从浓缩果汁中分离耐热嗜酸菌；(2)耐热嗜酸菌全基因组的提取；(3)依赖纳米银的快速PCR体系的配置；(4)快速PCR条件的设定与运行；(5)PCR产物检测。采用本发明检测方法，其总检测时间约为7.5个小时，与传统的培养计数检测法相比在时间上大大缩短。本发明可直接应用于浓缩果汁工业化生产中对耐热嗜酸菌的有效监控，这对提高果汁质量与安全水平、扩大出口贸易产生巨大的直接经济效益，并具有重要的社会意义。
文档编号C12Q1/04GK101096707SQ200710057800
公开日2008年1月2日 申请日期2007年7月3日 优先权日2007年7月3日
发明者张治洲, 沈涔超, 刘常金 申请人:天津科技大学