专利名称：一种利用限制性内切酶处理dna模板以增进dna扩增效率的方法
技术领域：
本发明涉及属于分子生物学技术领域，尤其是一种利用限制性内 切酶处理DNA模板以增进DNA扩增效率的方法。
技术背景聚合酶链式反应(PCR)，又称体外酶促基因扩增，是一种在体外 模拟DNA体内复制的基因扩增技术，该技术由K. Mullis于1985年 发明，能在耐热DNA聚合酶的作用及特异性引物的引导下，在很短的 时间里就能在一个试管内实现只有在生物体细胞分裂增殖时才出现 的基因的大量复制， 一般来说，在数小时内就可以将目的基因扩增至 百万倍。在过去的20多年的时间里，PCR技术在不断进步和发展中逐渐 成熟，形成了一整套完整的技术体系。常规PCR技术操作简便，成功 率很高，因而其在遗传学、微生物学、乃至整个生命科学领域的研究 中都得到了广泛应用。但是PCR技术仍存在着一些不可避免的缺点， 如，扩增产物的产量少甚至不能成功扩增等。虽然近年来一个又一个 功能强大的引物设计软件被开发出来，但高特异性引物只是提高PCR 反应效率的一个方面，对反应体系及反应条件进行优化组合则是解决 这一问题的一个方面。根据多年来各国科学家的研究成果我们发现， 通过向PCR反应体系中添加一定量的添加剂可以在不同程度上提高 扩增产物的产量，这些添加剂包括DMS0、Betain、BSA、甘油、Tween-20、 NP-40、 NaOH、甲酰胺等。但这些添加剂都各有其局限性，在各种不 同的情况下效果差异很大，给应用带来不便，尤其是对某些通常无法 成功扩增的PCR反应无能为力。因此解决经添加各种添加剂仍不能成 功扩增的PCR技术是PCR技术发展过程中一项十分重要的研究课题。近年来，生物技术的发展日新月异，文献调研及专利检索发现， 至今还没有对应用限制性内切酶处理DNA模板提高聚合酶链式反应 (PCR)扩增效率的方法做相应的研究。发明内容本发明的目的在于解决现有技术中的关键性问题而提供一种利 用限制性内切酶处理DNA模板以增进DNA扩增效率的方法，本方 法通过对待扩增DNA模板的酶切实现对难以扩增的DNA片段的有效扩 增，从而提高目的DNA片段的扩增特别是高GC含量片段的扩增，且 效果明显，使用简便，易于掌握。本发明是通过以下技术方案来实现的一种利用限制性内切酶处理DNA模板以增进DNA扩增效率的 方法，其特征在于增进DNA扩增效率的方法是(1) .DNA模板的酶切分析将待扩增区间的模板序列输入内切酶分析软件中，进行对本区间 序列没有酶切位点的限制性内切酶分析，从而找出对该区间序列没有 酶切位点的限制性内切酶名单；(2) .DNA模板的酶切从上述限制性内切酶名单中选择限制性内切酶处理DNA模板， 实施单酶切或组合酶切。(3) . PCR体系的配置；(4) . PCR条件的设定与运行；(5) . PCR产物检测对扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳， 检査扩增片段在凝胶中的位置，并与相应的分子量标准做对照。而且，所述的限制性内切酶是指已知所有限制性内切酶且一般为市售产品。而且，所述的PCR扩增包括常规PCR、长片段PCR、高GC含 量的DNA片段的扩增。本发明的优点和有益效果是1. 本发明是生物技术发展的新成果，与已有方法相比，它较好地 解决了 PCR扩增效率不高，特别是高GC含量的DNA片段难以扩增的 难题，使得扩增效果明显，有一定的应用范围。2. 本发明中应用的提高PCR扩增效率的方法——限制性内切酶 酶切DNA模板，与已有的PCR扩增增效剂相比，它从根本上解决了 某些PCR反应扩增效率低及难以扩增的问题。
图1为基因组模板经Bamffl、 BglII、 EcoRI、 EcoRV酶切后扩增 片段为754bp且GC含量为61%的DNA片段的电泳图；图2为基因组模板分别经Bamffl、 Xhol单酶切后扩增片段为 790bp且GC含量为78%的DNA片段的电泳图；图3为基因组模板分别经Xbal、 EcoRI、 EcoRI+Xho1酶切后扩 增片段为1541bp且GC含量为75%的DNA片段的电泳图。
具体实施例方式
本发明通过以下实例进一步详述，但本实例所叙述的技术内容是 说明性的，而不是限定性的，不应依此来局限本发明的保护范围。
本发明所涉及的提高PCR扩增效率的方法是通过对待扩增DNA模 板进行限制性内切酶酶切来实现的，其具体操作方法如下
1. DNA模板的酶切分析 将待扩增的DNA模板进行酶切分析，具体为
将待扩增区间的模板序列输入酶切分析软件中，进行对本区间序 列没有酶切位点的限制性内切酶分析，从而找出对该区间序列没有酶 切位点的限制性内切酶名单。另外，由于SNP可能会引起该段序列的 酶切信息发生变化，所以在进行酶切分析及选择内切酶时要考虑这一 现象，以达到所选的内切酶在该段序列绝对没有酶切位点。
2. DNA模板的酶切
从限制性内切酶名单中选择限制性内切酶处理DNA模板，实施 单酶切或组合酶切。限制性内切酶可以用市售产品，而酶切技术也属 于现有技术，不再详细叙述。以Hind III酶切为例。
按以下顺序和添加量配置体系于薄壁PCR管中。ddH20 10 uL10 XR buffer 1.5uLHind III(10U/uL) 0. 5 u LDNA 3 u L37°C， 3h; 72。C，5min
其中，模板为自制人类Genomic DNA， Hind III酶购自Fermentas。
3. PCR体系的配置
PCR体系根据现有的技术，由待扩增DNA片断的不同而各不相同。 具体表现在dNTP，模板，Mg2+，引物的添加量应根据不同的模板和 不同的扩增片段长度来选择；
PCR反应体系中的模板为经前面酶切后的模板；PCR反应体系中 的H20为双蒸水及以上级别水，体系中水的添加量应根据反应体系的 体积进行调整，即总体积扣除各添加组分的体积。
4. PCR条件的设定与运行
PCR反应条件中的预变性，变性及退火各阶段的温度和对应时间 应根据不同模板和引物融解温度来选择；其中的延伸温度根据所用聚
合酶的合适温度来选择；其中的延伸时间根据所扩增片段的长度来选 择；其中的循环次数根据个人试验目的和需要进行选择。 5. PCR产物的检测一般用琼脂糖凝胶电泳技术进行检测，琼脂糖凝胶的浓度及PCR 产物的上样体积需根据具体情况而定。所述的琼脂糖凝胶电泳技术依照已有方法概括如下(1) .制备所需要浓度的琼脂糖凝胶，具体浓度大小应根据扩增DNA 片段的大小来确定。(2) .吸取一定体积的PCR产物上电泳槽点样，同时点上合适分子 量标记作为参照。(3) .加上3—4V/cm的电压进行电泳。(4) .待指示剂到合适位置时，取出胶板于凝胶成象系统下观察并 照相记录。所述的限制性内切酶为所有限制性内切酶，可以根据酶切分析 结果配置不同的内切酶。所述的PCR扩增是指包括常规PCR、长片段PCR、复杂模板 PCR、高GC含量的PCR等等。实施例l经BamHI、 BglII、 EcoRI、 EcoRV酶切后扩增片段为754bp， GC 含量为61%的DNA片段。 l.PCR反应体系的配置按以下顺序和添加量配置体系于薄壁PCR管中。10XPCR缓冲液(含Mg20 2.5uLdNTP底物(2. 5mM) 2. 5 u L引l(2.0ixM) 2uL引物2(2.0ixM) 2uL模板 2uLTaq酶(5U/uL) 0. 5uLH20 up to 25 uL其中，人类Genomic DNA模板为分别为经上述各种内切酶酶切过， 其中内切酶购自加拿大BBI公司，Taq酶购自北京三博远志生物工程 公司。共配置PCR体系5管，且从0到4编号。2.从第0到第4管分别依次加入的模板为未经酶切，经BamHI、BglII、 EcoRI、 EcoRV酶切。3.按以下条件在PCR仪上设定循环条件进行PCR热循环。 预变性 93°C 4min93 °C 57 °C 72 °C30s 40s 60s—35循环完全延伸 72°C lOmin4.对扩增完成后的PCR产物进行琼酯糖凝胶电泳检测。具体扩增结果如图1所示，在图中标记M代表分子量标准带的位 置，此图中分子量标准为DL2000 (从上至下依次分别为2kb， lkb， 750bp， 500bp， 250bp， 100bp)。从图中可以看出，未经酶切组没有成功扩增，而经各种内切酶酶 切后均成功扩增出特异性条带，尽管同时也出来了非特异条带。这表 明模板经内切酶酶切后能显著的提高目的DNA片段扩增的效率。实施例2分别经Bamffl、Xho1单酶切后扩增片段为790bp， GC含量为78% 的DNA片段。l.PCR反应体系的配置按以下顺序和添加量配置体系于薄壁PCR管中。 10XPCR缓冲液(含Mg20 2.5uL dNTP底物(2. 5mM) 2. 5uL引物l(2.0uM) 2pL 引物2(2.0uM) 2uL 模板 2 u LTaq酶(5U/uL) 0. 5 u LH20 up to 25"其中，人类GenomicDNA模板为分别为经上述各种内切酶酶切， 其中内切酶购自加拿大BBI公司，Taq酶购自北京三博远志生物工程公司共配置PCR体系2管，且从1到2编号。注模板未经酶切，通过各种措施(优化各条件，添加增效剂等 等)仍不能成功扩增，因相关电泳图太多，所以未在本图及本说明书性火伸变i延
中--列出。2. 第1管到第2管分别依次加入的模板为分别经BamHI、 Xhol 酶切。3. 按以下条件在PCR仪上设定循环条件进行PCR热循环。 预变性 93°C 4min93 。C 57 °C 72 °C30s 40s 60s"35循环完全延伸 72°C lOmin4.对扩增完成后的PCR产物进行琼酯糖凝胶电泳检测。具体扩增结果如图2所示，在图中标记M代表分子量标准带的位 置，此图中分子量标准为DL2000 (从上至下依次分别为2kb， lkb, 750bp， 500bp， 250bp， lOObp)。从图中可以看出，经内切酶酶切后均成功扩增出特异性条带，尽 管也出来了非特异条带；另外，经不同的内切酶酶切后的扩增效率是 不同的，内切酶选择的技术前提是不能切断目的DNA片段本身。结果 表明模板经内切酶酶切后能显著的提高目的DM片段扩增效率，特别 是高GC含量片段的扩增。实施例3模板分别经Xbal、EcoRI、EcoRI+XhoI酶切后扩增片段为1541bp， GC含量为75%的DNA片段。 l.PCR反应体系的配置按以下顺序和添加量配置体系于薄壁PCR管中。10 X PCR缓冲液(含Mg dNTP底物(2. 5mM) 引物1(2.0uM) 引物2(2.0"M) 模板Taq酶(5U/uL) Pfu酶(2. 5U/uL) H202+) 2.5uL2. 5uL 2. 5u L 2" 0. 5iiL 0. 5uL up to 25 ]i L其中，人类Genomic DNA模板模板为分别为经上述各种内切酶酶性火伸变l延 切，其中内切酶购自加拿大BBI公司，Taq酶及Pfu酶购自北京三博 远志生物工程公司。共配置PCR体系4管，且从0到3编号。注模板未经酶切，通过各种措施(优化各条件，添加增效剂等 等)仍不能成功扩增，因相关电泳图太多，所以未在本图及本说明书中一一列出。2. 从第0管到第3管加入的模板为分别经Xbal、 EcoRI、 EcoRI+Xho1酶切。3. 按以下条件在PCR仪上设定循环条件进行PCR热循环。 预变性 93 °C 4min93 。C 63 。C 72 。C30s 50s 2min一35循环完全延伸 72°C 15min4.对扩增完成后的PCR产物进行琼酯糖凝胶电泳检测。具体扩增结果如图3所示，在图中标记M代表分子量标准带的位 置，此图中分子量标准为DL2000 (从上至下依次分别为2kb， lkb， 750bp， 500bp， 250bp， 100bp)。从图中可以看出，经内切酶酶切后均成功扩增出特异性条带，尽 管也出来了非特异条带；另外，经不同的内切酶酶切后的扩增效率是 不同的，内切酶选择的技术前提是不能切断目的DNA片段本身。结果 表明模板经内切酶酶切后能显著的提高目的DNA片段扩增效率，特别 是高GC含量片段的扩增。性火伸变1延
权利要求
1.一种利用限制性内切酶处理DNA模板以增进DNA扩增效率的方法，其特征在于增进DNA扩增效率的方法是(1).DNA模板的酶切分析将待扩增区间的模板序列输入任意内切酶分析软件中，进行对本区间序列没有酶切位点的限制性内切酶分析，从而找出对该区间序列没有酶切位点的限制性内切酶名单；(2).DNA模板的酶切从上述限制性内切酶名单中选择限制性内切酶处理DNA模板，实施单酶切或组合酶切。(3).PCR体系的配置；(4).PCR条件的设定与运行；(5).PCR产物检测对扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检查扩增片段在凝胶中的位置，并与相应的分子量标准做对照。
2. 根据权利要求1所述的一种利用限制性内切酶处理DNA模板 以增进DNA扩增效率的方法，其特征在于所述的限制性内切酶是 指所有已知的限制性内切酶。
3. 根据权利要求1所述的一种利用限制性内切酶处理DNA模板 以增进DNA扩增效率的方法，其特征在于所述的PCR扩增包括常 规PCR、长片段PCR、高GC含量的DNA片段的扩增。
全文摘要
本发明涉及一种应用限制性内切酶处理DNA模板以增进聚合酶链式反应扩增效率的方法，该方法采用限制性内切酶处理DNA模板，通过对待扩增DNA模板的酶切实现对难以扩增的DNA片段的有效扩增，从而提高目的DNA片段的扩增特别是高GC含量片段的扩增，且效果明显，使用简便，易于掌握，较好地解决了某些目的DNA片段扩增效率不高或不易扩增的关键问题。
文档编号C12Q1/68GK101113435SQ20071005792
公开日2008年1月30日 申请日期2007年7月3日 优先权日2007年7月3日
发明者孟良玉, 张治洲, 静 李, 阎大伟 申请人:天津科技大学