专利名称：隐孢子虫快速检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种对食品中寄生虫进行检测的检测装置，特别涉及一种 快速检测食品中隐孢子虫的试剂盒。
背景技术：
隐孢子虫(Cryptosporidium)为顶端复合体门、孢子虫纲、球虫亚纲、真球 虫目、艾美球虫亚目、隐孢子虫科、隐孢子虫属。是直径在3.2pm 5.1 pmX 8.(^m 8.5 pm的极微小的，无法以肉眼辨识的单细胞肠道寄生虫。隐孢子虫 寄生于人或动物的胃肠道上皮和呼吸道上皮微绒毛，其隐孢子虫病是一种重要的 人畜共患寄生虫病。至目前为止，已公认的隐孢子虫有效种为13个种。20世纪70 年代以前，人类仅知道隐孢子虫是一种肠道寄生虫，可能感染牛、马、羊、鸭、 鹅等数十种动物，自1976年起才有隐孢子虫引起人感染患病的报道，1984年证实 隐孢子虫病可经水传播。1993年美国发生了该病介水传播的暴发流行，病例达40 万人。在我国韩范等1987年报道两例因孢子虫病'。在发达国家和发展中国家的 腹泻患者中，隐孢子虫感染率分别是2.2% 14%和6.1% 24% 。
隐孢子虫病是一种重要的人畜共患原虫病。隐孢子虫主要感染包括人在内的 多种脊椎动物的胃肠上皮细胞，感染呈现多种临床症状，这与不同的隐孢子虫种 及宿主的种类、年龄、免疫状态有关；发病也有一定的季节性，在温暖、雨季和 湿润的月份容易出现感染高峰。隐孢子虫可感染免疫功能正常者和免疫功能受损 者，在其中婴幼儿、艾滋病患者感染后症状比较严重。有人统计57例艾滋病病 人感染者，42例死于本病，为艾滋病患者主要致死病因之一，故国外艾滋病病 人检査隐孢子虫已被列为常规项目。隐孢子虫病已被列为世界最常见的六种腹泻 病之一，儿童、免疫缺陷者如(HIV+)病人易感染。儿童感染多发生于不到5 岁的，易染高峰为不到2岁的婴幼儿。成人感染多经过食源性或水源性传播途径 感染。
中国专利申请CN200510126411.6提供了一种安氏隐孢子虫PCR检测试剂 盒，用于隐孢子虫病的诊断和检测。该试剂盒是根据安氏隐孢子虫ITS-1基因序 列设计种特异性引物、建立了 PCR检测方法、优化了 PCR反应条件而制备得到，但是该发明是针对奶牛等动物源性隐孢子虫进行的诊断和检测。
目前我国还没有相应的方法对进出口食品中隐孢子虫进行检测。也就是说， 我国进出口食品中隐孢子虫检测仍处于空白状态，这在一定程度上制约着我国进 出口贸易的发展，影响人民的身体健康。因此，迫切需要对进出口食品中隐孢子 虫开展快速检测研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测食品样品中隐孢子虫的试剂盒和检 测方法，主要解决现在国内外食品样品中无检测标准方法及存在检测时间过长且 繁琐的技术问题。采用FTA/PCR可以快速、特异地筛选标本中的隐孢子虫，以
便可以快速、灵敏、准确地检出食品中隐孢子虫，该试剂盒适合于各种饮料和贝 类样品的检测。
本发明的试剂盒主要由以下几种试剂配方组成
试剂A:固定DNA的FTA卡(美国Whatman公司的专利产品)；
试剂B: PCR反应液，其中含有特定两对引物CryoutL和CryoutR，其序列 分别为5'-TTCTAGAGCTAATACATGCG-3'和5'-CCCACTTCTTCGAAGCAGGA-3'。
试剂C: PCR反应液，其中含有特定两对引物CryinL和CryinR，其序列分 另lj 为 5'-GGAAGGGTTGTATTTA丁TAGATAAAG-3， 禾口 5'-
CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA-3，。
试剂B、 C中所含的特定引物CryoutL和CryoutR、 CryinL和CryinR,每种 含量应不少于5pm。
对于试剂B: PCR反应液，每管组成为每管隐孢子虫的100pL扩增反应 体系组成中含2XTaq PCR Master Mix 50uL; 1%BSA 4uL; 10 u mol/L引物 各2.5yL; ddH20 41 uL;试剂C:每管组成为每管隐孢子虫的50pL扩增反应 体系组成中含DNA模板(第一轮PCR产物)lu L 、 2XTaq PCR Master Mix 25 uL; 10 Mmol引物各2. 5uL; ddH20 19 uL。
本发明所提供的快速检测样品中隐孢子虫的试剂盒的使用方法如下-一、 样品中DNA的提取
1.点样将分离纯化好的样品液20pL滴加到FTA卡上，室温干燥至少lh 至完全干燥；2. 取样用直径为6 mm的打孔器从样品卡上钻取6咖的小圆片，并将其 放入1.5mL的PCR管中；
3. 纯化加入40(VLFTA纯化buffer,室温培养5rain，吸出洗涤纯化后的 buffer,此步骤重复操作一次；
4. 洗涤加入400nLTE buffer [ (10 mmol/LTris-HCl、 0. 1 mmol/LEDTA(乙 二胺四乙酸)、pH 8.0),室温下培养5min后吸出弃去。此步骤重复操作一次；
5. 将处理过的圆片室温下至少干燥lh，或56-C干燥10min至完全干燥；
6. 干燥后的FTA圆片可常温下储存，也可直接放入PCR管中进行后续反应。 二、 PCR反应
第一轮PCR反应
将干燥后的FTA圆片加入反应管B中，混匀后在PCR仪中进行以下反应
94 。C4分钟
94 °Cl分钟
54 °C45秒—循环35次
72 °Cl分钟
72°C8分钟
第二轮PCR反应
取第一轮PCR产物l|aL加入反应管C中，混匀后在PCR仪中进行以下反应 94 °C 4分钟 94 °C 1分钟 58°C 45秒」 循环35次 72'C 1分钟
72°C 8分钟
反应结束后，取10iaL第二轮PCR产物，进行确定扩增产物。如出现830bp 的反应产物片断，说明待检食品样品中存在隐孢子虫。
本发明的有益效果与中国专利申请CN200510126411.6不同是，本发明针对隐孢子虫的SSUrRNA基因序列设计引物，利用美国Whatman公司的专利产品 FTA卡快速抽提DNA，再用巢氏PCR方法对食品中隐孢子虫进行检测，可以快 速对食源性隐孢子虫病爆发的风险因子作出科学的评估。使用本发明的试剂盒， 采用巢式PCR可以快速、特异地筛选标本中的隐孢子虫，从加样到DNA模板干 燥整个程序所花费时间至多也不超过3h，可快速、灵敏、准确地检出样品中的 隐孢子虫，灵敏度可达1 CFU/mL 。
图1为本发明灵敏度试验效果图
图中M: 100bpDNA标志物，1:阳性对照，'2:阴性对照，3 10:隐孢子虫
卵囊浓度分别为L0X10—'个/mL、 1.0X10。个/mL、 1.0X10'个/mL、 1.0乂102个 /mL、 L0X103个/mL、 1.0Xl(y个/mL、 1.0X105个/mL、 L0Xl()6个/mL。 图2为本发明特异性试验效果图
图中M: 100bpDNA标志物，1:阴性对照，2:.微小隐孢子虫，3:贝氏隐孢
子虫，4:安氏隐孢子虫，5:犬隐孢子虫。
具体实施例方式
饮料样品用快速检测样品中隐孢子虫的试剂盒检测。试剂盒组成为
试剂A:其组成为固定DNA的FTA卡(美国Whatman公司的专利产品)；FTA 纯化试剂(Whatman公司产品分装)；FTA洗涤试剂(TE buffer: 0. 01 mol/L Tris, pH 8.0; 0.1 mmol/L EDTA )。试剂A涉及美国专利为US5496562、 US5756126、 US5807527、 US5972386、 US5985327。
试剂B: PCR反应液，其中含有特定两对引物CryoutL和CryoutR，其序列 分别为5'-TTCTAGAGCTAATACATGCG-3'和5'-CCCACTTCTTCGAAGCAGGA-3，。
试剂C: PCR反应液，其中含有特定两对引物CryinL和CryinR，其序列分 另廿 为 5'-GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG-3' 和 5'-
CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA-3'。
按本发明技术方案所提供的快速检测样品中隐孢子虫试剂盒的使用方法，先 用试剂A提取样品中的DNA，之后进行PCR反应，反应结束后取10^L第二轮PCR 反应产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳，即可发现样品中是否含有隐孢子虫。
方法的灵敏度实验
采用上述模拟样品，将标准隐孢子虫卵囊稀释后，1. 1 mL稀释卵囊添加到饮
权利要求
1.一种隐孢子虫快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒由以下试剂组成试剂A固定DNA的FTA卡；试剂BPCR反应液，其中含有特定两对引物CryoutL和CryoutR，其序列分别为5’-TTCTAGAGCTAATACATGCG-3’和5’-CCCACTT CTTCGAAGCAGGA-3’。试剂CPCR反应液，其中含有特定两对引物CryinL和CryinR，其序列分别为5’-GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG-3’和5’-CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA-3’。
2. 根据权利要求1所述的隐孢子虫快速检测试剂盒，其特征在于所说的试 剂B和试剂C中所含的特定引物CryoutL和CryoutR、 CryinL和CryinR，每种 含量应不少于5pm。
3. 根据权利要求1所述的隐孢子虫快速检测试剂盒，其特征在于所说的试 剂B: PCR反应液，每管组成为每管隐孢子虫的100pL扩增反应体系组成中 含2XTaq PCR Master Mix 50jxL; 1%BSA 4yL; 10 u mol/L引物各2. 5"L; ddH20 41 uL;试剂C:每管组成为每管隐孢子虫的50pL扩增反应体系组成 中含DNA模板luL 、 2XTaq PCR Master Mix 25uL; 10 Mmol引物各2. 5ti L; ddH20 19yL。
全文摘要
本发明涉及一种快速检测食品中隐孢子虫的试剂盒。主要解决现在国内外没有检测方法及存在的检测时间过长且繁琐的技术问题，一种快速检测食品中隐孢子虫的试剂盒，由以下试剂组成试剂A固定DNA的FTA卡；其组成为FTA卡；FTA纯化试剂；FTA洗涤试剂(TE buffer0.01mol/L Tris，pH 8.0；0.1mmol/L EDTA)。试剂BPCR反应液，其中含有特定两对引物CryoutL和CryoutR，其序列分别为5’-TTCTAGAGCTAATACATGCG-3’和5’-CCCACTTCTTCGAAGCAGGA-3’。试剂CPCR反应液，其中含有特定两对引物CryinL和CryinR，其序列分别为5’-GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG-3’和5’-CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA-3’。用于对样品中隐孢子虫检测。
文档编号C12Q1/68GK101289689SQ20071009410
公开日2008年10月22日 申请日期2007年9月27日 优先权日2007年9月27日
发明者李晓虹, 阎东丽 申请人:中华人民共和国上海出入境检验检疫局