专利名称：一种茎-环型寡聚核苷酸探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种核苷酸结构，具体涉及作为探针的核苷酸的结构。
背景技术：
茎-环状寡核苷酸(stem-loop oligonucleotides)是分子生物学和生物技术 领域的常用工具之一。与线性寡核苷酸相比，茎-环状寡核苷酸与靶分子的杂交 或结合具有更高的特异性，并可以根据不同的应用需求灵活设计不同形式的茎-环状寡核苷酸，例如分子信标(molecular beacons)、抑制性聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) 、 LiJX(light upon extension)弓|物等。巨 前，茎-环状寡核苷酸已经以不同的形式应用于多种分子生物学技术，主要包括 单核苷酸多态性检测、基因突变分析、实时荧光定量PCR和生物芯片等，充分展 示和体现了茎-环状寡核苷酸在分子生物学和生物技术领域的应用前景。对于茎-环状寡核苷酸而言，它的茎部热力学稳定性是维持其自身二级结构稳定性的关键 因素，因此，只要合理设计茎-环状寡核苷酸的碱基组成，就可以使靶分子能够 在适当的反应条件下破坏茎-环状寡核苷酸的茎部稳定性，并使其二级结构解体， 然后，就可以通过检测与其二级结构解体相关的可检测信号来达到对靶向子的检 测。
目前常规应用的茎-环状寡聚核苷酸探针以分子信标最为常见。分子信标的序 列组成包括环部和茎部序列，并通常在茎部末端的对称碱基标记上一对符合荧光 共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)规则的报告基 团和淬灭基团。分子信标的环部是耙分子识别区，环部则是维持热力学稳定性的 结构。当反应体系中存在靶分子时，分子信标的环部与靶分子发生杂交反应，并 且，这种杂交反应能使茎部解体成单链分子，从而使标记在茎部末端的报告基团 和淬灭基团的空间距离增大，导致报告基团不再受淬灭基团的影响而发出荧光。但是，由于这种茎-环状寡聚核苷酸的靶分子识别区的初始状态为单链形式，因 此，它与靶分子结合的特异性有待进一步提高；此外，由于茎部序列较短，从而 使它的热力学亚稳定性较低，因此，设计难度很高，对靶分子的序列组成也有一 定的特殊要求，从而在一定程度上限制了应用范畴。
发明内容
本发明要解决的技术问题是进一步提高茎-环状寡聚核苷酸探针的特异性和 设计的简便性。本发明解决上述技术问题的技术方案是，
一种茎-环状寡聚核苷酸探针，该探针具有茎-环状二级结构的初始状态，由 环部和茎部构成，茎部是两段互补的碱基序列通过氢键结合形成的发卡结构，与 靶分子特异性结合的识别区主要由探针的茎部序列组成；当反应体系中没有靶分 子存在时，所述的识别区以初始状态的发夹结构存在；当反应体系中有靶分子存 在时，靶分子与所述的识别区特异性结合时，茎部的发卡结构解体，同时探针或 靶分子产生可检测的信号差异。
本发明探针还可以在茎部的中间或自由端对称地标记有能产生可检测信号的 标记物，当茎部的发卡结构解体时能产生信号的差异。
本发明探针还可以在本发明探针的部分或全部碱基标记有能产生可检测信号 的标记物，从而可以检测本发明探针-靶分子复合体在形成前后产生信号的差异。
本发明探针可以有多种实现方式本发明探针既可以由一条单链寡核苷酸通 过内部碱基互补结合形成，即单体探针；也可以是存在一定碱基互补关系的两条 单链寡核苷酸结合形成茎-环结构，即双体探针；本发明探针的茎部末端可以是 平端，也可以是粘性末端。
本发明探针中的靶分子识别区可以全部由茎部序列组成，也可以由茎部和环 部序列组成，还可以由茎部和粘性末端序列组成。
构成本发明探针的核酸分子根据不同靶分子的需要，可以全部或部分是核酸、 肽核酸(p印tide nucleic acid, PNA)、锁核酸(locked nucleic acid, 固)或 其它类似物，核酸分子上的碱基可以是天然碱基或其类似物；探针的5'-和/或3'-末端可以进行磷酸基团、羟基基团或其它类似基团的修饰或标记。
在本发明中，对所述粘性末端的长度没有特别限制，通常其长度为3 20 bp, 最佳是4 6 bp。
在本发明中，对本发明探针所述环部的长度没有特别限制，通常其长度为3 20 bp，最佳是4 6 bp。
在本发明中，对本发明探针所述识别区的长度没有特别限制，通常其长度为 8 50 bp,最佳是15 30 bp。
在本发明中，对本发明探针所述茎部的长度没有特别限制，通常其长度为8 50 bp，较佳为10 40 bp，最佳是15 30 bp。
在本发明中，为了提高检测的特异性，本发明探针中的互补区可以引入人工 错配碱基，所述人工错配碱基是天然的A、 T、 C、 G四种碱基或其类似物。
本发明探针还可以在任意一个部位引入支链寡核苷酸，引入寡核苷酸序列不 影响亚稳定寡核苷酸探针特异性识别结合或互补杂交靶分子的生物学活性，同时 又有利于将亚稳定寡核苷酸探针固定于固相基质的表面。
本发明还可在固相基质表面和/或本发明探针(或靶分子)标记、修饰或合成有 手臂分子，并通过二者之间的手臂分子，或手臂分子与其它分子的相互作用将本 发明探针(或靶分子)固定于固相基质表面。
本发明探针的茎部发卡结构解体时产生可检测信号可以通过(但并不限于) 以下方式实现
(1)在本发明探针的末端和/或茎部的中间标记上符合荧光共振能量转移 (fluorescence resonance energy transfer, FRET)的两个或多个适合鉴另U的基 团分子，包括荧光基团、稀有元素或非荧光发色基团、淬灭基团或其它类似基团， 靶向不同靶分子的本发明探针可以标记上不同或相同的基团分子，探针与耙分子 反应的前后，基团分子产生的可检测信号被淬灭或释放，从而存在可检测信号的 差异。例如，在探针茎部两条互补链的对称末端碱基标记上荧光基团(如FAM) 和淬灭基团(如Dabcyl)，当反应体系中不存在耙分子时，荧光基团(如FAM)发射的荧光能量被淬灭基团(如Dabcyl)吸收，从而在反应体系中检测不到荧光 信号，或者荧光信号弱，但是，当反应体系中存在靶分子时，靶分子与本发明探 针的识别区特异性结合或互补杂交，使本发明探针在初始状态的茎-环状二级结 构解体，荧光基团(如FAM)发射的荧光能量不再被淬灭基团(如Dabcyl)吸收， 从而在反应体系中检测能够检测到荧光信号，或者荧光信号增强，并且，可以通 过荧光信号有无和/或强度的变化达到对耙分子的定性和/或定量检测。
(2) 在本发明探针的部分或全部碱基上标记有荧光分子、发光基团、生物素、 地高辛分子、同位素或其它类似发光分子或适合鉴别的标记分子，其特征是通过 检测反应体系中本发明探针-耙分子复合体中的本发明探针标记分子的信号达到 对靶分子的定性或定量检测。例如，将靶分子经物理吸附和/或化学耦联方法固 定于固相基质(包括生物芯片、微阵列、其它类似阵列或微珠等)的表面，当本 发明探针与靶分子作用后，本发明探针-靶分子复合体就被固定于生物芯片等的 表面，通过检测上述标记分子的信号，即可达到对靶分子的定性和/或定量检测。
(3) 靶分子采用适当方法在一个或多个碱基标记有荧光分子、发光基团、生物 素、地高辛分子、同位素或其它类似发光分子或适合鉴别的标记分子，其特征是 通过检测反应体系中本发明探针-靶分子复合体中与上述标记分子对应的可检测 信号的变化情况达到对靶分子的定性和/或定量检测。例如，将本发明探针固定 于生物芯片、微阵列、其它类似阵列或微珠的表面，当液相中的耙分子与本发明 探针作用后，本发明探针-靶分子复合体就被固定于生物芯片等的表面，通过检 测上述表面的标记分子信号，即可达到对靶分子的定性和/或定量检测。
本发明探针检测靶分子的原理是当含有本发明探针的反应体系中不存在耙 分子时，本发明探针保持其亚稳定茎-环状二级结构的初始状态；但是，当含有 本发明探针的反应体系中存在靶分子时，靶分子与本发明探针的识别区相互作 用，并且，这种作用能够使本发明探针的二级结构解体，并产生可检测信号的差 异(包括可检测信号的有无和/或强度的变化)，最后，通过上述可检测信号的有 无和/或强度的变化实现对待检测物中靶分子的定性和/或定量检测。本发明探针
的热力学亚稳定性的维持依靠其自身内部核酸互补序列形成的茎部稳定性维持， 该稳定性使本发明探针可以在一定条件下保持其自身茎-环状二级结构的稳定性，例如，将本发明探针于适当离子强度(例如0.5MNa+)高温变性(例如95 °C 5min)，并随后缓慢降至室温后，本发明探针即可形成亚稳定的茎-环状二级 结构。但是，当反应体系中存在靶分子时，本发明探针的识别区与靶分子特异性 结合或互补杂交，使本发明探针茎部的双链核酸区解体，并最终破坏本发明探针 原有的茎-环状二级结构。
本发明探针检测靶分子方法可以通过(但并不限于)以下方式实现
(1) 使用本发明所述本发明探针的核酸扩增方法，例如聚合酶链反应(PCR)、实时荧光PCR、实时荧光定量PCR、实时荧光RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR、连 接酶链反应(LCR)、链取代反应(LCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导 的扩增和滚环扩增(RCA)或其它类似扩增方法。
(2) 使用本发明所述本发明探针的核酸杂交方法，例如Southern杂交、 Northern杂交、Western杂交或其它类似杂交方法。
(3)使用本发明所述本发明探针的生物芯片，例如微阵列、流式生物芯片、 微珠技术或者其它类似生物芯片。
当本发明探针用于实时荧光定量PCR时，本发明探针与引物的数量关系没有 特别限制。通常，探针分子与引物之比介于1:10 10:1，更佳为1.5:1 5:1， 这样，在反应体系中，所述本发明探针基本上熊与引物的全部扩增片段特异性杂 交。不同的引物可使用相同的本发明探针，也可使用不同的本发明探针(例如 带有发不同荧光的报告基团和相应淬灭基团的探针，序列相同或不同的本发明探 针)。对引物的扩增产物长度没有特别限制。其主要步骤包括将本发明探针、 引物与待检测物置于反应体系中，然后，在合适的条件下，发生退火(或杂交)， 本发明探针与扩增片段结合，使荧光信号或发色基团的荧光信号增强或降低；经 过若干循环后，与PCR原理相同，因扩增产物与探针杂交形成的可检测信号也是 成指数级(或近似于指数关系)增加的，在可检测信号是荧光的情况下，这些信号
可用于实时荧光阅读仪，如Roche' s LightCycler，或者ABI GeneAmp 5700或 GeneAmp 7700等进行实时测定；也可使用静态荧光阅读仪，在PCR反应结束后 进行荧光测定。信号的采集可以在核酸扩增过程中的变性阶段，也可以在核酸扩 增过程中的延伸阶段。由于本发明中可检测信号产生机制依赖于核酸扩增过程中 本发明单体探针与核酸扩增物之间的结合可破坏其发夹结构，使检测的特异性和 灵敏度均有所增加。
当本发明探针用于杂交反应，其主要步骤是
(1) 将靶分子采用物理吸附和/或化学耦联方式固定于固相基质的表面；
(2) 本发明探针与固定于固相基质表面的耙分子进行杂交；
(3) 通过检测本发明探针二级结构解体前后可检测信号的差异达到对耙分子 的定性和/或定量检测；或者，通过检测固相基质表面本发明探针-耙分子复合体 可检测信号的有无和/或强度的变化来达到对耙分子的定性和/或定量检测。
本发明探针用于微阵列检测的方法是
(1) 采用物理吸附和/或化学耦联方式将本发明探针固定于固相基质的表面；
(2) 靶分子与固定于固相基质表面的本发明探针进行杂交；
(3) 通过检测本发明探针二级结构解体前后可检测信号的差异达到对耙分子 的定性和/或定量检测；或者，检测固相基质表面本发明探针-靶分子复合体可检 测信号的有无和/或强度的变化来达到对耙分子的定性和/或定量检测。
本发明探针用于检测蛋白质的方法是
(1) 本发明探针的识别区由可特异性地识别并结合某种蛋白的适配子 (aptamer)序列组成。
(2) 靶分子与本发明探针在适当条件下反应。
(3) 通过检测本发明探针二级结构解体前后可检测信号的差异达到对对靶分 子的定性和/或定量检测；或者，检测本发明探针-靶分子复合体可检测信号的有 无和/或强度的变化来达到对靶分子的定性和/或定量检测。
在本发明中，除另外特别说明外，下列词语/术语具有以下含义
本发明所述"核酸"是指核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、 RNA或DNA 的多聚核苷酸类似物、RNA或DNA的寡核苷酸类似物、聚合酶链反应(PCR)或其 它技术制备的核酸产物、mRNA、 cDNA、经过修饰的核酸(例如重亚硫酸盐修饰 的基因组DNA)、各种限制酶或其它酶消化或酶切的核酸产物(例如甲基化敏感 限制性内切酶(methylation-sensitive restriction endonuclease， MSRE)的消 化产物)、其它类似核酸片段。
本发明所述"寡核苷酸"是指小分子核酸，由核苷酸残基(片段)通过磷酸二 酯键连接(聚合)而成，分子量介于核酸与核苷酸之间，并倾向于核苷酸。本发明 对核苷酸残基的数目并无严格界限。
本发明所述"靶分子"是指采用本发明所述方法直接或间接检测的物质，主 要包括(但并不限于)核酸、蛋白质、抗原、抗体、糖类、肽类、病原体或其它分 子。
本发明所述"定性检测"是指直接或间接检测靶分子是否存在，或者直接或 间接检测靶分子是否存在于待检测物。
本发明所述"定量检测"是指直接或间接检测靶分子的浓度，或者直接或间 接检测待检测物中耙分子的浓度，例如，检测待检测物中耙核酸的拷贝数，或者 是检测待检测物中抗体的滴度。
本发明所述"初始状态"是指本发明探针在无靶分子存在的情况下，于适当 条件下以茎-环状二级结构形式存在的亚稳定状态，例如，将本发明探针于适当 离子强度(例如0.5MNa+)高温变性(例如95°C， 5 min)，并随后缓慢降至室 温后，本发明探针即可形成亚稳定的茎-环状二级结构。
本发明所述"亚稳定"描述了本发明探针的热力学稳定性特征，它是指本发 明探针在反应体系中缺乏靶分子的情况下均保持其初始状态的茎-环状二级结 构，但是，当反应休系中存在靶分子时，靶分子与本发明探针的识别区特异性结 合或互补杂交，从而破坏本发明探针在初始状态的亚稳定二级结构，并且，通过 检测与此二级结构解体相关的一系列可检测信号来达到对靶分子的定性和/或定
量检测。
本发明所述"解体"是指本发明探针在特定条件下，其茎-环状二级结构被破 坏，其初始状态的茎区双链核酸不再是本发明探针的双链互补区。
本发明所述"单体"是指由一条寡核苷酸单链构成的本发明探针。
本发明所述"双休"是指由两条寡核苷酸单链构成的本发明探针。
本发明所述"粘性末端区"或"粘性末端"或"粘端"是指在本发明探针茎 区的5'-或3'-末端的摆动寡核苷酸，其特征是粘性末端区自身与其它分子的结 合或互补杂交并不能影响本发明探针的亚稳定特性，但是，当存在与粘性末端区 及其毗邻的茎区核酸特异性结合或互补杂交的靶分子(例如核酸)时，上述特异 性结合或互补杂交可破坏亚稳定寡核苷酸探的茎-环状二级结构。本发明所述"茎 部"是指在本发明探针在初始状态时存在的双链核酸区。
本发明所述"环部"是指在本发明探针初始状态二级结构中在其中部或侧部 存在的单链核酸区。
本文所述"识别区"是指本发明探针特异性识别并结合靶分子，或者与靶分 子互补的核酸序列，识别区的作用在于当识别区的核酸序列与靶分子特异性结合 或互补杂交后，可以破坏本发明探针在初始状态的茎-环状二级结构。
本发明所述"本发明探针-靶分子复合体"是指本发明探针通过其识别区特异 性结合或互补杂交靶分子后形成的复合体。
本发明所述"荣光共振會b量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)"是利用不同发光物质的激发光波长和发射光波长之间的相互作用而达到 对某些特定波长光进行检测的一种信号检测原理，例如，TaqMan探针和分子信 标等均是基于FRET原理。 ，
本发明所述"可检测信号的差异"是指可检测信号的有无和/或强度的差异。
本发明所述"固相基质"包括多种方法处理的玻璃片、硅片、陶瓷片、塑料、 硝酸纤维、尼龙膜或橡胶等。
本发明所述"固定"是指通过物理吸附和/或化学耦联方式将寡核苷酸探针或
耙分子连接于固相基质的表面。
本发明所述"物理吸附"是指寡核苷酸探针或靶分子通过次级键(例如离子 键)与固相基质表面相连并固定，或者是以非共价键作用将寡核苷酸探针或靶分 子直接或恒电位吸附到固相基质的表面，或者由本发明探针中的磷酸根负离子与 固相基质表面带正电荷的修饰层通过静电作用而固定。
本发明所述"化学耦联"是通过形成共价键(例如酰胺键、酯键、醚键等) 使寡核苷酸探针或靶分子与固相基质表面的活性基团相互作用，从而将寡核苷酸 探针或靶分子固定到固相基质的表面，例如首先活化预处理固相基质的表面， 引入各种所需活性基团，如氨基、羧基、巯基、羟基、卤素基(包括氟、氯、溴、 碘等)等，或者衍生核苷酸，使其带上合适的功能基因，随后用双官能试剂或偶 联活化剂联络将寡核苷酸探针或靶分子固定到固相基质的表面，常用的双官能基 团有戊二醛(GA)、对硝基苯氯甲酸酯(NPC)、马来酰亚胺(MA)、 二异硫氰酸酯等。
本发明所述"支链寡核苷酸"是指在本发明所述本发明探针的末端或内部的 部分或全部碱基中增加一部分其它碱基或寡核苷酸序列，其特征是引入的碱基或 寡核苷酸序列不影响本发明探针特异性识别结合或互补杂交靶分子的生物学活 性，同时又有利于将本发明探针固定于固相基质的表面。
所谓"手臂分子"是指具有一个或多个活性基团的长链有机化合物。
本发明不同于已有的茎-环状寡核苷酸，以分子信标为例分子信标与靶分子 互补杂交的寡核苷酸序列在初始状态时是单链形式(即环区)，当其单链环状结 构的寡核苷酸序列与靶分子作用的情况下，双链茎区结构被打开，并利用标记在 分子信标两末端的荧光基团和淬灭基团的相互作用使分子信标在茎部结构被打 开后存在可检测信号的差异；而在本发明中，本发明探针特异性识别结合或互补 杂交靶分子的识别区则主要或完全以茎部结构的寡核苷酸序列为主，并且，本发 明探针分子内部存在与靶分子竞争的寡核苷酸序列。
本发明与现有的寡核苷酸探针技术相比，主要具有以下优点
l)更髙的特异性——由于本发明探针分子内部存在与靶分子竞争的核酸序
列，因此，只有当本发明探针的识别区与靶分子完全互补时才能使本发明探针的 二级结构解体，从而产生可检测信号的差异。
(2) 易于复合式检测——由于本发明探针的热力学稳定性，不同本发明探针之 间，以及本发明探针与非靶分子之间存在相互作用的可能性极小，从而提高了在 同一反应体系中使用靶向不同靶分子的多种本发明探针，从而能极大地提高耙分 子的检测种类。
(3) 设计的简便性——由于本发明探针的识别区部分或全部位于茎部，因此，
简化了本发明探针的设计难度，降低了对靶分子序列的特殊要求。
图1是带有粘性末端的本发明单体探针及其检测原理示意图。
图2是无粘性末端的本发明单体探针及其检测原理示意图。
图3是带有粘性末端的本发明双体探针及其检测原理示意图。
图4是无粘性末端的本发明双体探针及其检测原理示意图。
图5是本发明探针固定于固相基质表面的原理示意图。
图6是基于双体探针的生物芯片检测原理示意图
图7是基于单体探针检测蛋白分子的原理示意图
图8是本发明探针用于hMLHl基因的实时荧光定量RT-PCR的标准曲线图。
图9是本发明探针用于hMLHl基因的实时荧光定量PCR的实时荧光曲线图。
具体实施例方式
下面将通过具体的实施例进一步阐述本发明探针的结构和效果，但本发明 并不仅限于下面实施例，本领域技术人员可以根据说明书的内容和实际的需要对 本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
实施例一、带有粘性末端的单体探针
一种茎-环结构的单体寡聚核苷酸探针P，该探针由一条寡聚核苷酸链组成， 其初始状态有序列c形成的环部、互补序列b和一结合形成的茎部，以及粘端a
13构成，在b*末端标记有荧光基团，在b和a连接处标记有淬灭基团，识别区由 茎部b和粘端a组成。耙分子T由序列M和肿连接而成，与探针P的茎部序列 b和粘端a完全互补。当反应体系中不存在靶分子T时，探针P维持初始状态，荧光基团的荧光信号被相邻的淬灭基团所吸收，体系中没有可检测的荧光信号； 当反应体系中存在靶分子T时，靶分子T与探针的识别区b、 a互补结合，导致探针发卡结构解体，荧光基团和淬火基团分离，荧光基团即发出可检测的荧光信 号，如图1所示。
实施例二、无粘性末端的单体探针
一种茎-环结构的单体寡聚核苷酸探针P，该探针由一条寡聚核苷酸链组成， 其初始状态有序列c形成的环部、互补序列b和bK结合形成的茎部构成，茎部 的末端为平端，两末端分别标记有荧光基团和淬灭基团，识别区由的茎部序列b 和环部序列c组成。靶分子T由序列b+和W连接而成，与探针P的茎部序列b 和环部序列c完全互补。当反应体系中不存在靶分子T时，探针P维持初始状态， 荧光基团的荧光信号被相邻的淬灭基团所吸收，体系中没有可检测的荧光信号； 当反应体系中存在靶分子T时，靶分子T与识别区b、 c互补结合，导致发卡结 构解体，荧光基团和淬灭基团分离，荧光基团即发出可检测的荧光信号，如图2 所示。
实施例三、带有粘性末端的双体探针
一种茎-环结构的双体寡聚核苷酸探针P1*P2，该探针由两条寡聚核苷酸链互 补结合组成，其中，寡核苷酸链P1由茎部序列b和粘端序列a连接而成；寡核 苷酸链P2由序列bW、 c、 b2求组成，其中，bl宋和b2求分别与Pl的b两端互补， 并且，bW和b2》在整体上与b完全互补，c则形成双体探针的环部；在P2末端 标记有荧光基团，在Pl与P2末端对称处(即在b和a连接处)标记有淬灭基团， 识别区由茎部b和粘末端a组成。靶分子T由序列b*和a*连接而成，与探针Pl *P2的茎部序列b和粘端a完全互补。当反应体系中不存在靶分子T时，探针P1 "P2维持初始状态，荧光基团的荧光信号被相邻的淬灭基团所吸收，体系中没有可检测的荧光信号；当反应体系中存在耙分子T时，靶分子T与探针的识别区b、 a互补结合，导致探针发卡结构解体，荧光基团和淬灭基团分离，荧光基团即发 出可检测的荧光信号，如图3所示。实施例四、无粘性末端的双体探针
一种茎-环结构的双体寡聚核苷酸探针P1，P2，该探针由两条寡聚核苷酸链互 补结合组成，其中，寡核苷酸链P1由茎部序列b组成；寡核苷酸链P2由与序列 bl*、 c*、 b24且成，其中，1)1*和b2伞分别与Pl的b两端互补，并且，bl碎口b2承 在整体上与b完全互补，W则形成双体探针的环部；在P1末端标记有荧光基团， 在P2与Pl末端对称处标记有淬灭基团，识别区由P2组成。靶分子T由序列bl、 c、 b2组成，与探针P2的序列完全互补。当反应体系中不存在靶分子T时，探 针P1'P2维持初始状态，荧光基团的荧光信号被相邻的淬灭基团所吸收，体系中 没有可检测的荧光信号；当反应体系中存在靶分子T时，靶分子T与探针的识别 区P2互补结合，导致探针发卡结构解体，荧光基团和淬灭基团分离，荧光基团 即发出可检测的荧光信号，如图4所示。
实施例五、探针在固相基质表面的固定
本发明探针通过物理吸附和/或化学耦联方法固定于固相基质(包括生物芯 片、微阵列、其它类似阵列或微珠等)的表面
(1) 采用物理吸附方式将本发明探针固定或连接于固相基质的表面，例如以 非共价键作用将本发明探针直接或恒电位吸附到固相基质的表面，或者由本发明 探针中的磷酸根负离子与固相基质表面带正电荷的修饰层通过静电作用而固定。
(2) 本发明探针的末端和/或部分(或全部)内部碱基经标记、修饰、衍生化或其它类似方法引入各种所需活性基团，包括生物素、半抗原、氨基、羧基、巯基、 羟基、卤素基(包括氟、氯、溴、碘等)或其它类似活性基团，然后使用双官能试 剂或偶联活化剂以化学耦联方式将本发明探针固定在固相基质表面。常用的双宫能基团有戊二醛(GA)、对硝基苯氯甲酸酯(NPC)、马来酰亚胺(MA)、 二异硫氰酸 酯等。
(3) 本发明探针的末端和/或内部的部分(或全部)碱基经标记、修饰、衍生化或其它类似方法弓I入支链寡核苷酸或手臂分子，并可同时对支链寡核苷酸的部分 或全部碱基进行标记、修饰、衍生化或其它类似方法引入各种所需活性基团，包 括生物素、半抗原、氨基、羧基、巯基、羟基、卤素基(包括氟、氯、溴、碘等) 或其它类似活性基团，然后使用双官能试剂或偶联活化剂以化学耦联方式将本发明探针固定在固相基质表面。常用的双官能基团有戊二醛(GA)、对硝基苯氯甲酸 酯(NPC)、马来酰亚胺(MA)、 二异硫氰酸酯等。
本发明探针在固相基质上的固定方式如图5所示。
实施例六、基于粘性末端单体探针的Northern杂交
(1) 探针的构建探针的序列组成及初始状态的二级结构与实施例一所述探针 相同，并且，探针的部分或全部碱基标记有放射性同位素。
(2) 待检测物的制备
采用适当的电泳方式(如四醛-琼脂糖凝胶电泳)分享RNA样本，然后在适当 条件下将其凝胶上的RNA样本转移至尼龙膜(或硝酸纤维膜)，将尼龙膜进行干燥 处理后，经紫外线透照仪照射合适的时间，使RNA充分固定于尼龙膜表面。
(3) 杂交反应
将步骤(2)制备的固定有RNA的尼龙膜放置于杂交管中，加入适量的杂交液和 步骤(l)制备的探针，经变性(例如沸水浴10 min)后，于适当温度下(例如 65℃)过夜杂交。
(4) 结果判断
杂交反应完毕后，经过适当的洗涤步骤将末与靶分子杂交的多余探针洗脱， 然后，在尼龙膜上盖上可透过紫外线的塑料保鲜膜，进行放射自显影，并根据是 否存在自显影条带及条带的光密度值对待检测物中的靶分子进行定性和/定量检 测。
实施例七、基于双体探针的生物芯片检测 如图6所示，其具体实施步骤示例如下
(l)构建双体探针
如图6A所示，双体探针由单体探针B和b构成，其中，探针b的全部序列分 别与探针B的两端部分序列互补，因此，当探针B与b形成状双体探针时，B在 双体探针的中间部分存在一个所图6A所示的环状结构。双体探针中，单体探针 B与靶分子完全互补。图6A所示Bl/bl、 B2/b2、 B3/b3和B4/b4是分别靶向不 同耙分子的不同探针。
(2) 探针的固定
将探针B通过分子手臂X以物理吸附和/或化学耦联方式固定于固相基质表面 (图6A)。
(3) 靶分子的制备
提取待检测物的总RNA，经逆转录方法将其转换成cDNA分子，在逆转录步骤 中，使用荧光标记的dUTP(图6B)，其中，B1沐、B2求和B辑是分别与双体探针Bl/bl、 B2/b2、 B3/b3和B4/b4中的B1、 B2和B4互补的耙分子。
(4) 杂交反应
将步骤(l)构建的单体探针bl b4和步骤(3)制备的靶分子按照一定比例制 备成混合液，在适当反应条件下与步骤(2)制备的生物芯片进行杂交反应(图6C); 反应完毕后，经洗涤步骤去除末与探针杂交的cDNA片段。
(5)结果判断
当制备的待检测物中存在与探针互补的靶分子时，则靶分子与生物芯片上固 定的探针B结合，因靶分子标记有荧光分子而杂交点出现荧光信号，如图6C-D 所示的B1、 B2和B4探针出现荧光信号或强度的变化；当待检测物中不存在靶分 子时，则单体探针b与生物芯片上固定的探针B结合，此时，检测点不存在荧光 信号，如图6C-D中的B3探针。因此，最终可根据各探针固定点的荧光信号的有 无和/或强度的变化，可以对待检测物中的耙分子进行定量和/或定性检测。
实施例八含有适配序列的单体探针检测蛋白分子的方法
如图7所示，其具体实施步骤示例如下
(l)构建探针
探针的序列组成及初始状态的二级结构与实施例一所述探针相同，并在探针P茎部对称末端分别标记上如图7所示的报告基团(图8中的灰色圆点；如FAM) 和淬灭基团(图8中的黑色圆点；如Dabcyl)。探针P序列中，a和b序列是与靶蛋白分子T特异性结合的适配子序列。
(2) 杂交反应
将探针P和靶分子T在适当的反应休系中进行杂交反应，在反应过程中，探针P的适配子序列(即a+b序列)与靶分子T结合，形成探针-靶分子复合体， 在此复合体中，探针P的c和M部分变成摆动端，此时，b*末端的报告基团因 不再受淬灭基团的影响而发出可见荧光。
(3) 结果判断
根据探针P在杂交反应前后的荧光信号有无和/或荧光强度的差异达到对耙分子T的定性和/或定量检测。
实施例九、hMLHl基因的实时荧光定量RT-PCR
在该实施例中，设计了一对耙向hMLHl基因的一对RT-PCR引物和一个在茎区末端对称碱基分别标记上荧光基团FAM和淬灭基团Dabcyl的亚稳定寡核苷酸单体探针
RT-PCR上游引物
5' -AAGCAGTACATATCTGAGGAGTCG-3，
RT-PCR下游引物
5， -TGTTCCACAGTCCACTTCCAG-3，
本发明探针5， -TGGAGCCAGGCACTTCACTCTGCTCAAAGTAGCAGAGTGAAGTGCCT-3’
该探针是具有粘性末端的单体寡核苷酸探针，其中5'-端25-30bp处为探针的环部，下划部分是亚稳定寡核苷酸单体探针的茎部，并且，在5’-端8bp处的 碱基A和3’-末端碱基T分别标记上了荧光基团FAM和淬灭基团Dabcyl。
步骤
(1) 利用随机引物总RNA进行反转录50℃， 20 min， 95℃， 5 min。
(2) 将反转录产物、RT-PCR引物和亚稳定寡核苷酸单体探针置于同一反应管
中，于Roche LightCycler上进行如下条件的扩增:94°C, 2 min; 94C 10 sec, 60°C 45 sec，共40个循环；信号采集固定于60℃阶段。
结果标准品的标准曲线见图8，结果表明(图9)，不同稀释度的阳性标本在 不同循环(CT)出现荧光信号，阴性标本在扩增反应结束时(CT＝40)时未出现荧光 信号。
序列表
<110>中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
<120〉 一种茎-环型寡聚核苷酸探针
<130〉 1. Broude NE. Stem-loop oligonucleotides: a robust tool for molecular biology and biotechnology. Trends Biotechnol. 2002; 20(6): 249-256 ;
2. Mackay J， Landt〇.Real-time PCR fluorescent chemistries. Methods Mol Biol. 2007; 353: 237-262 ;
3. Mackay丄Introduction to kinetic (real-time) PCR. Methods Mol Biol. 2007; 353: 167-176 ;
4. Lee NH， Saeed AI. Microarrays: an overview. Methods Mol Biol. 2007; 353: 265_300 ;
5. Tan W， Wang K， Drake T丄Molecular beacons. Curr Opin Chem Biol. 2004; 8(5): 547-553.
<160> 3
<170> Patentln version 3.3
〈210〉 1
<211〉 24
<212〉DNA
<213〉人工序列
<400〉 1
aagcagtaca tatctgagga gtcg 24
〈210〉 2
〈211〉 20
〈212〉 DNA〈213〉人工序列
〈400〉 2
tgttccacag tccacttcca 20
〈210〉 3
〈211〉 46
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈400〉 3
tggagccagg cacttcactc tgctcaaagt agcagagtga agtgcc 4权利要求
1、一种茎-环状寡聚核苷酸探针，该探针具有茎-环状二级结构的初始状态，由环部和茎部构成，茎部是两段互补的碱基序列通过氢键结合形成的发卡结构，与靶分子特异性结合的识别区主要由探针的茎部序列组成；当反应体系中没有靶分子存在时，所述的识别区以初始状态的发夹结构存在；当反应体系中有靶分子存在时，靶分子与所述的识别区特异性结合时，茎部的发卡结构解体，同时探针或靶分子产生可检测的信号差异。
2、 根据权利要求l所述的探针，其特征在于在茎部的中间或自由端对称 地标记有能产生可检测信号的标记物，当茎部的发卡结构解体时能产生信号 的差异。
3、 根据权利要求l所述的探针，其特征在于是由一条单链寡核苷酸通过 内部碱基互补结合形成单体探针；
4、 根据权利要求1所述的探针，其特征在于是由存在一定碱基互补关系 的两条单链寡核苷酸结合形成茎-环结构的双体探针。
5、 根据权利要求l所述的探针，其特征在于构成探针的核酸分子全部或 部分是核酸、肽核酸、锁核酸或其它类似物。
6、 根据权利要求l所述的探针，其特征在于茎部末端是粘性末端。
7、 根据权利要求1所述的探针，其特征在于所述的茎部可以引入人工错 配碱基，所述人工错配碱基是天然的A、 T、 C、 G四种碱基或其类似物。
8、 根据权利要求l所述的探针，其特征在于靶分子识别区由茎部序列组成。
9、 根据权利要求1所述的探针，其特征在于靶分子识别区由茎部和部分 或全部环部序列组成。
10、 根据权利要求6所述的探针，其特征在于靶分子识别区由茎部和粘 性末端序列组成。
11、 根据权利要求1-7之一所述的探针，其特征是在所述探针的任意一 个部位弓I入支链寡核苷酸或手臂分子。
12、 根据权利要求1-7之一所述的探针，其特征在于部分或全部碱基标 记有能产生可检测信号的标记物。
全文摘要
本发明提供了一种新型的茎-环寡聚核苷酸探针，该探针具有茎-环状二级结构的初始状态，由环部和茎部构成，茎部是两段互补的碱基序列通过氢键结合形成的发卡结构，与靶分子特异性结合的识别区主要由探针的茎部序列组成；当没有靶分子存在时，所述的识别区以初始状态的发夹结构存在；当有靶分子存在时，靶分子与所述的识别区特异性结合时，茎部的发卡结构解体，同时探针或靶分子产生可检测的信号差异。本发明探针特异性识别结合或互补杂交靶分子的识别区则主要或完全以茎部结构的寡核苷酸序列为主，并且在探针分子内部存在与靶分子竞争的寡核苷酸序列，因此，本发明探针具有更高的特异性。
文档编号C12Q1/68GK101200759SQ200710093129
公开日2008年6月18日 申请日期2007年12月13日 优先权日2007年12月13日
发明者府伟灵, 庆 黄 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院