专利名称：检测胃组织细胞中人vldlr基因的失活的方法
技术领域：
本发明涉及检测胃组织细胞中人极低密度脂蛋白受体(Very LowDensity Lipoprotein Receptor)(人VLDLR))基因的失活的方法。
背景技术：
在日本，每年有100,000人以上会患上胃癌(Gastric Cancer，GC)，其中男性较多，男女比例为约2∶1，是男性中最多发的癌症。在日本每年的胃癌死亡人数约为50,000人，占全部因癌死亡人数的16％。根据迄今为止的研究，认为是胃组织细胞在细胞分化和增殖的过程中一连串地发生了基因的变化，其结果是最终导致了癌化。可是，还不明确到底是怎样的基因变化诱导了胃组织细胞的癌化。因此，现有状况是还不存在胃癌的检测方法和胃癌恶性程度的检测方法。
在胃癌的诊断中，使用的是例如胃X射线检查、胃内窥镜、血中胃蛋白酶原值、肿瘤标记，其中胃内窥镜(能够得到确诊的唯一检测方法)被广泛使用。可是，这些大多属于影像诊断、早期诊断的工具，并不是癌的确诊、分型、进度判定、有否转移的判定方法。
着眼于基因的胃癌的检测方法已知有例如专利文献1记载的方法。可是，该方法是着眼于基因表达谱(expression profile)变化的一种方法。基因表达谱的测定是多个mRNA量的测定，由于mRNA非常不稳定，容易分解，而且表达的动态范围(dynamic range)也比较大，所以通过微阵列(microarray)等测定的再现性就比较差。因此，需要一种更加稳定、再现性高的方法。
比较基因组杂交(Comparative Genomic Hybridization(CGH))是一种检测基因组中基因扩增的灵敏度高、效率优异的方法，本发明人采用该CGH阵列法鉴定了在胃癌细胞中扩增的基因群，即在染色体2p24.1扩增的SDC1基因、在染色体2p23.3扩增的DNMT3A基因、在染色体3p22.3扩增的MLH1基因、在染色体3p22.1扩增的CTNNB1基因等(非专利文献1)。
一般来说，基因水平上的癌化结构已经报道了如上所述的多个基因的扩增和癌抑制基因的缺失。在采用定位克隆等通常的方法的情况下，特定基因缺失的鉴定是非常费时费力的，很难发现目的基因。而且，即便是CGH法，采用通常的中期染色体的方法检测小于5-10Mb大小的基因组DNA的缺失也是非常困难的(非专利文献2和3)。通过染色体作图法(chromosome mapping)逐步缩小同源接合体缺失区域，最终鉴定出了目的癌抑制基因例如DPC4/SMAD4、RB1、PTEN、p16-INK4A、RASSF1等。
非专利文献1Takada H，Imoto I，Tsuda H，Sonoda I，Ichikura T，Mochizuki H，Okanoue T，Inazawa J.Screening of DNA copy-numberaberration in gastric cancer cell lines by array-based comparativegenomic hybridization.Cancer Sci.2005 Feb；96(2)100-10非专利文献2Bentz，M.，Plesch，A.，Stilgenbauer，S.，Dohner，H.&Lichter，P.Minimal sizes of deletions detected by comparativegenomichybridization，Genes chromosomes Cancer，172-175，1998.
非专利文献3Kirchhoff，M.，Gerdes，T.，Maahr，J.，Rose，H.，Bentz，M.，Dohner，H.&Lundsteen，C.Deletions below 10 megabasepairs are detected in comparative genomic hybridization by standardreference intervas，Genes chromosomes Cancer，410-413，1999.
专利文献1特表2005-514051号公报。
发明内容
发明所要解决的问题本发明要解决的课题是提供一种新的胃癌相关基因、并检测该癌相关基因的失活的方法。另一方面，本发明将发现新的胃癌相关基因、并通过检测该癌相关基因的失活提供一种更加稳定、再现性更高的胃癌检测方法作为本发明要解决的课题。本发明还将提供基因水平上胃组织细胞的癌化的早期发现的方法、诊断胃癌恶性程度的方法、以及基于该机理筛选抗癌物质的方法也作为本发明要解决的课题。
解决问题的手段本发明人提高了CGH法的灵敏度和精度，开发出了高通量(high-throughput)的方法。通过筛选CGH阵列上装载的800种BAC/PAC DNA，成功鉴定了抑制胃组织细胞癌化的癌抑制基因，即人极低密度脂蛋白受体(Very Low Density Lipoprotein Receptor(VLDLR))基因(下面称为人VLDLR基因)。而且判明了引发胃组织细胞癌化的原因在于人VLDLR基因的失活，并发现该基因的失活是由(1)该基因的缺失、和(2)该基因的CpG岛的甲基化所引发。基于这些发现完成了本发明。
即，根据本发明，提供一种检测胃组织细胞中的人VLDLR基因的失活的方法，其采用DNA芯片法、Southern印记法、Northern印记法、实时RT-PCR法、FISH法或者CGH法。
优选的是，使用人VLDLR基因的基因组DNA、cDNA、或者mRNA检测人VLDLR基因的失活。
优选的是，人VLDLR基因的失活是由该基因缺失所导致的失活。更优选的是，人VLDLR基因的缺失是该基因的同源接合体缺失。
优选的是，人VLDLR基因的失活是该基因CpG岛的甲基化所导致的失活。
此外，本发明还提供了一种胃癌的检测方法，其包括通过检测胃组织细胞中的人VLDLR基因的失活而检测出该胃组织细胞的癌化。
发明效果根据本发明，可以准确地把握胃组织细胞样本中的癌化征兆、癌的发展进度、恶性程度。
图1图1A表示HSC58细胞株的典型的二重阵列CGH图像。RP11-48M17的9p24.2-24.3的拷贝数比(log2比值)的显著减少以明确的红色信号被检测出。图1B表示HSC58细胞的第9号染色体的典型的拷贝数谱图(profile)。红色和绿色线分别是表示9p24.2-24.3和9p21.2-21.3的同源接合体缺失的模式的候补点。图1C表示使用包含HSC58的几个胃癌细胞株进行的、GAPDH、阳性对照、以及在9p24.2-24.3的同源接合体缺失的附近存在的典型基因的基因组PCR试验的图像。PLC通常的末梢淋巴球。图1D表示HSC58细胞株中覆盖同源接合体缺失区域的9p24.2-24.3的谱图。点接于阵列上的BAC用水平的白线表示，通过基因组PCR确定的HSC58细胞中同源接合体缺失区域用水平的白色箭头表示。分别用黑色或灰色的线表示该区域周边存在的13个基因在HSC58细胞株中是同源接合体缺失还是未缺失，表示出了位置和转录方向。
图2A表示用基因组PCR分析检测出的胃癌细胞株中的VLDLR的同源接合体缺失(楔形箭头)。1MKN2，2MKN7，3MKN28，4MKN45，5MKN74，6KATO-III，7OKAJIMA，8OCUM-1，9HSC39，10HSC40A，11HSC41，12HSC42，13HSC43，14HSC44PE，15HSC45，16HSC57，17HSC58，18HSC60，19HSC64，20NUGC-2，21NUGC-3，22NUGC-4，23RERF-GC-1B，24AZ-521，25SNU216，26SNU484，27SNU601，28SNU638，29SNU668，30SNU719，31SH101P4，32Takigawa。图2B表示通过RT-PCR检测出的在胃癌细胞株和正常胃组织中VLDLR的表达。楔形记号表示在图2A中具有同源接合体缺失的细胞株。不具有VLDLR的同源接合体缺失的31个细胞株中的9株(29.0％)显示几乎完全抑制该基因，7株(22.6％)与通常的胃组织比较显示表达降低。图2C表示通过基因组PCR分析在所研究的39个LCM处理的原发性胃癌中检测出1个VLDLR的同源接合体缺失(楔形记号)。图2D表示使用CPGPLOT(http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/)鉴定的共计4个CpG岛的概略图。4对水平方向的箭头分别表示551-bp、994-bp、297-bp、274bp的CpG岛(从-471至+80为CpG-1；从+269至IVS+793为CpG-2；从IVS+826至IVS+1122为CpG-3；从IVS+1172至IVS+1445为CpG-4)。外显子1以开放读码框(BOX)表示，转录起始点标记为+1，启动子分析中研究的片段(片段1-3)用粗黑线表示。亚硫酸氢盐PCR(Bisulfite-PCR)分析以及用亚硫酸氢盐测序(Bisulfitesequencing)研究的区域(BS-1和BS-2)用水平的灰线表示。最下部的箭头表示MSP的引物位置。CpG位点用延伸轴上的垂直刻度表示。
图3图3A表示用5-aza-dCyd(10μM)处理5天或不进行处理、以及/或用TSA(10ng/ml)处理24小时、在SNU601和MKN74细胞内的VLDLR的表达，显示的是典型的RT-PCR分析结果。图3B表示有或无VLDLR CpG-1区域的启动子活性。将pGL3 basic的空载体(Mock)和包含VLDLR的外显子1的上游或周边的3个不同序列(片段1-3)中之一的构建体导入SNU601细胞和MKN74细胞内。荧光素酶活性相对于内部对照被标准化。图中显示的数据是分别三次重复进行的3个独立试验的平均值±SEM。图3C表示胃癌细胞株内的经HhaI消化后的VLDLR BS-2的亚硫酸氢盐-PCR的典型结果。箭头表示在被识别为甲基化CpG的位点用特异的限制酶消化的片段。图3D表示VLDLR CpG-1的亚硫酸氢盐测序的结果。用VLDLR表达细胞株(+)和VLDLR非表达细胞株(-)表示研究的结果。采用两个片段(BS-1和BS-2)，确定了71个CpG位点的全序列。各个正方形表示CpG位点白色正方形为非甲基化，黑色正方形为甲基化。
图4图4A表示胃癌细胞株的VLDLR CpG-1的MSP分析的典型结果。与图2A所示同样地，数字表示各个GC细胞株。使用对非甲基化(U)和甲基化(M)的DNA特异的引物，同时进行扩增。图4B表示原发性胃癌(T)和对应的非癌胃组织(N)的VLDLR CpG-1的MSP分析的典型结果。图4C表示7位原发性胃癌患者的、HhaI消化后的VLDLR BS-2的亚硫酸氢盐-PCR分析的典型结果。表示通过MSP分析的肿瘤组织内的甲基化。箭头表示在被识别为甲基化的CpG的位点用特异的限制酶消化的片段。图4D表示VLDLR BS-2的甲基化状态由2种典型胃癌样本对的亚硫酸氢盐测序确定。N为正常组织，T为肿瘤组织。
具体实施例方式
下面详细说明本发明的实施方式。
本发明的胃癌检测方法的特征是通过检测胃组织细胞中的人VLDLR基因的失活而检测出该胃组织细胞的癌化。
作为检测人VLDLR基因失活的对象的胃组织细胞，合适的是试样(样本)提供者的活检组织细胞。该试样组织细胞可以不拘于是正常健康人的胃组织细胞还是胃癌患者的癌组织，但是从现实的角度考虑，主要对象是(1)根据内窥镜等检查结果，胃组织中存在疑似癌化病变部的情况下的该病变组织，或者(2)已经确定为胃癌，但需要判定其恶性程度或发展进度的胃癌组织等。
根据本发明的检测方法，当确认在“根据内窥镜等检查结果，胃组织中存在疑似癌化病变部的情况下的该病变组织”中的人VLDLR基因失活的情况下，其表示该病变组织或者在向癌化发展或者已经属于癌化状态，而且，判明恶性程度持续升高，需要及早进行正式治疗(由手术等切除病变部位、正式的化学疗法等)。当确认“已经确定为胃癌，但需要判定其恶性程度或发展进度的胃癌组织”中的人VLDLR基因失活的情况下，也表示判明该癌组织的恶性程度持续升高，需要及早进行正式治疗(由手术等切除病变部位、正式的化学疗法等)。作为试样采取的胃组织可以进行必要的处理，例如，由采取的组织制备DNA或RNA，作为进行本发明检测方法的对象。
如上所述，本发明的检测方法是通过检测胃组织细胞中的人VLDLR基因的失活从而能够确定该细胞的癌化(特别是，癌化的起始)。该人VLDLR基因的失活的形式可以列举(1)人VLDLR基因的缺失或(2)人VLDLR基因没有缺失的情况下基因表达量的降低。
(1)人VLDLR基因的缺失可以直接进行该人VLDLR基因缺失的检测的代表性的方法可以列举CGH(Comparative Genomic Hybridization)法、FISH(FluorescenceIn Situ Hybridization，荧光原位杂交)法。这些形式的检测方法可以标记具有人VLDLR基因的BAC(Bacterial Artificial Chromosome，细菌人工染色体)DNA、YAC(Yeast Artificial Chromosome，酵母人工染色体)DNA或PAC(Phage Artificial Chromosome，噬菌体人工染色体)DNA(下面也称为BAC DNA等)，然后进行FISH，cong而检测人VLDLR基因的缺失部分。具体地，具有人VLDLR基因的BAC DNA可以列举RP-11-671F16、RP11-320E16、RP11-578M2、RP11-719M6、RP11-941D23。
采用基因组DNA固定基质进行上述方法是合适的，而且是现实的。
由于通常得到的BAC DNA等的量很少，难以用于制造多个基因组DNA的固定化基质，所以就需要将该DNA作为基因扩增产物而获得(该基因扩增过程也称为“无穷化”)。在无穷化过程中，首先将BAC DNA等用识别4碱基的酶例如RsaI、DpnI、HaeIII等消化以后，加入连接体(adaptor)进行连接(ligation)。
连接体(adaptor)为由10-30个碱基、特别合适的是15-25个碱基组成的寡核苷酸，具有2条互补的序列，退火以后，形成平末端一侧的3′端的寡核苷酸需要磷酸化。接下来，采用与连接体的一端的寡核苷酸具有相同序列的引物，通过聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction)法进行扩增，可以进行无穷化。另一方面，可以将各BAC DNA等的特征性的50-70个碱基的氨基化寡核苷酸作为检测用探针。
通过将以上述方式进行无穷化的BAC DNA等固定于基质上、优选固定于固体基质上，即可以制备出所希望的DNA固定基质。固体基质可以列举玻璃、塑料、膜、三维阵列等，优选载玻片等玻璃基板。玻璃等固体基质更优选通过多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)、氨基硅烷、金·铝等的粘附包被基质。
将上述无穷化的DNA点接于基质上的浓度优选为10pg/μl至5μg/μl，更优选为1ng/μl至200ng/μl。点接量优选为1nl至1μl，更优选为10nl至100nl。对固定于基质上的各个点的大小和形状不作特别限定，例如，大小可以为直径0.01-1mm，俯视形状可以为圆形至椭圆形。对干燥点的厚度也不作特别限定，可以为1-100μm。进一步，对点的个数不作特别限定，在每个使用的基质上的个数可以为10-50,000个，更优选为100-5,000个。虽然各个DNA可在单一至四次重复的范围内点接，但优选是两次重复或三次重复点接。
干燥点的制备可以通过采用点样仪将无穷化的BAC DNA等滴于基质上，形成多个点以后，将点干燥而制得。点样仪可以使用喷墨式打印机、针形阵列式打印机、气泡喷墨式(注册商标Bubble Jet)打印机，优选使用喷墨式打印机。例如，可以使用GENESHOT(NGKINSULATORS株式会社，名古屋)等。
这样，通过将无穷化的BAC DNA等固定于基质上，特别合适的是固定于固体基质上，可以制备出所希望的DNA固定化基质。
而且，作为直接检测该人VLDLR基因缺失的方法还可以列举Sorthern印记法。Sorthern印记法是将从试样得到的基因组DNA分离固定，通过检测其与人VLDLR基因的杂交来检测试样中是否存在该基因的方法。另外，人VLDLR基因的碱基序列和氨基酸序列都已经公知，分别表示于序列表的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。
(2)人VLDLR基因没有缺失的情况下基因表达量的降低检测这种情况的方法，可以以人VLDLR基因(基因组DNA)为基础，定量多核苷酸的量或人VLDLR蛋白质的量，以该定量值为指标，检测人VLDLR基因表达的降低。上述的多核苷酸可以列举由人VLDLR基因转录的mRNA、或以此为模板得到的cDNA。
另外，根据常规方法，可以制备出针对人VLDLR蛋白质的抗体，采用该抗体对试样中的人VLDLR蛋白质进行定量，由此求得上述定量值，但是，本发明的检测方法的检测对象是基因表达量的“降低”，将蛋白质量作为这种阴性检测中的指标，必须解决背景的存在等问题，还不能说是高效的方法。因此，这种情况的检测方法中，合适的是以人VLDLR基因(基因组DNA)为基础、检测多核苷酸的量的方法。该多核酸的量的检测方法例如可以举出以下方法最典型的形式就是通过检测试样中的以人VLDLR蛋白质的mRNA为模板的cDNA，间接检测出试样中存在的mRNA，由此确定人VLDLR基因表达程度的检测方法(下面将该种检测方法也称为VLDLR mRNA检测方法。该检测方法包括下述的实时RT-PCR方法)。
在VLDLR mRNA检测方法中，典型的是遵照公知的方法(例如采用寡聚dT的方法)，从试样的总RNA中分离mRNA。然后，通过以与公知的人VLDLR基因的碱基序列对应的核苷酸链作为扩增用引物，并使用耐热DNA聚合酶，由得到的mRNA中的mRNA为模板进行基因扩增的基因扩增法，例如，通过RT-PCR法，扩增编码人VLDLR蛋白质的cDNA，再通过检测由这些基因扩增操作产生的扩增产物的有无、多少，即可以检测出试样中人VLDLR蛋白质的mRNA的存在，此时优选采用实时检测。
实时RT-PCR法是通过逆转录反应和聚合酶链式反应而实时测定目的基因的扩增的方法，根据扩增效率可以进行作为模板的mRNA的定量。该定量可以采用荧光色素进行，有两种方法。即采用向双链DNA特异性插入(intercalate)发出荧光的色素(例如，SYBR Green)的方法和采用对扩增的DNA序列特异性的寡核苷酸上结合荧光色素的探针的方法。
如上所述，以扩增的、编码人VLDLR蛋白质的cDNA为模板，进一步再采用PCR法等，利用耐热性DNA聚合酶进行基因扩增操作，通过检测由这些基因扩增操作产生的基因扩增产物的有无、多少，即可以更加准确地检测出试样中人VLDLR蛋白质的mRNA的存在(该第二次基因扩增操作中，需要以下述的方式选择引物，即，与第1次基因扩增操作使用的基因扩增用引物相比，其互补核苷酸链位于人VLDLR基因的更内侧)。
DNA芯片法是对试样细胞中表达的mRNA进行定量的方法之一。例如，在基质(与上述CGH法中使用的基质实质上相同)上，将具有人VLDLR基因特征序列的寡核苷酸进行固定(也可以固定cDNA)，将从试样制备的RNA在通过逆转录酶合成cDNA时进行标记。将该标记的cDNA与基质上的合成寡核苷酸进行杂交，通过扫描结合的标记的数量即可以测定mRNA的表达量。
Northern印记法是将试样中获得的mRNA分离、固定，通过检测其与具有人VLDLR基因特征序列的合成寡核苷酸(也可以采用cDNA)的杂交来检测试样中人VLDLR基因的表达的方法。
除了人VLDLR基因缺失以外，该基因表达量减少的主要原因是人VLDLR基因的CpG岛的甲基化而导致的失活。下面，针对该原因进行简单说明。
已经报道，当富含CpG的启动子和外显子区域出现密集的甲基化时就会发生转录失活(Bird，A.P.&Wolffe A.P.Methylation-induced repression-belts，braces，and chromatin，Cell，451-454，1999)。在癌细胞中，CpG岛与其它区域比较，存在高频率的密集的甲基化，启动子区域的超甲基化(Hypermethylation)与人癌中的癌抑制基因的失活紧密相关(Ehrlich，M.，Jiang，G.，Fiala，E.，Dome，J.S.，Yu，M.C.，Long，T.I.，Youn，B.，Sohn，O.S.，Widschwendter，M.，Tomlinson，G.E.，Chintagumpala，M.，Champagne，M.，Parham，D.，Liang，G.，Malik，K.，&Laird，P.W.Hypomethylationand hypermethylation of DNA in Wilms tumors，Oncogene，6694-6702，2002)。
如后所述，实际上，已经证明人VLDLR基因的外显子1的一部分和其上游区域中存在的CpG岛具有启动子活性，而且，该CpG岛的甲基化的程度与一部分胃癌细胞中的人VLDLR基因表达的抑制强烈相关。而且，通过将胃癌细胞在脱甲基化试剂5-氮杂-脱氧胞嘧啶(5-aza-dC)的存在下进行培养，可以使CpG岛脱甲基化，其结果是，人VLDLR基因的表达可以恢复。根据这些结果可以证明CpG岛的高度甲基化(Hypermethylation)是高频引发胃癌细胞中癌抑制基因表达抑制的原因之一。
下面通过实施例进一步详细地说明本发明，但本发明并不因这些实施例而受到限制。
实施例实施例1由National Cancer for Biotechnology和University of CaliforniaSanta Crus Biotechnology的基因组数据库网站和所选择的DNA的BLAST检索结果选择了具有对癌化以及癌细胞增殖极端重要的基因或序列标签位置标记(Sequence Tagged Site marker)的800种BAC/PAC克隆。
将BAC/PAC DNA用DpnI、RsaI、HaeIII进行消化，然后，进行与连接体DNA(adaptor DNA)的连接。接下来，采用具有连接体序列的引物进行2次PCR。2条引物中的一个5′端被氨基化。将该步骤称为“无穷化”，得到的DNA被定义为“无穷化DNA”。将该无穷化DNA使用喷墨型的点样仪(GENESHOT，NGK Insulators，名古屋)两次重复地以共价键打印于寡聚DNA微阵列(松浪硝子工业株式会社，大阪)上。
实施例2为了检测出胃癌中的新的同源接合体缺失，使用由32种胃癌细胞制备的基因组DNA，使用实施例1的CGH阵列进行CGH阵列分析。
另外，作为对照，使用男性健康人的基因组DNA，用Cy5进行标记。作为被检测的DNA，使用由上述胃癌细胞制备的基因组DNA，并用Cy3进行标记。具体地，将DpnI消化的基因组DNA(0.5μg)在0.2mM dATP、0.2mM dTTP、0.2mM dGTP、0.1mM dCTP和0.4mMCy3-dCTP(胃癌细胞)或0.4mM Cy5-dCTP(正常细胞)的存在下，通过缺口翻译(nick translation)进行标记。Cy3和Cy5标记的dCTP从AmershamBiosciences公司(东京)获得。将两个标记的基因组DNA在Cot-1 DNA(Invitrogen公司)的存在下加入乙醇，使其沉淀，溶解于120μl杂交混合液(50％甲酰胺、10％葡聚糖硫酸酯、2×SSC(1×SSC150mM氯化钠/15mM柠檬酸钠))、4％十二烷基硫酸钠(sodiumdodecyl sulfate，PH7)。在37℃孵育30分钟以后，加在设于杂交室(hybridization chamber)中的CGH阵列上，在37℃下、以3rpm(转每分钟)的速度一边振动一边孵育48-72小时。然后，将CGH阵列在50％甲酰胺/2×SSC(PH7.0)的溶液中50℃下清洗15分钟，接下来在2×SSC/0.1％SDS中50℃下清洗15分钟，进一步再使用包含0.1％NonidetP-40的0.1M磷酸盐缓冲液(PH8)在室温下清洗15分钟。风干以后，用GenePix4000B扫描仪(Axon Instruments，CA，USA)检测CGH阵列上来源于Cy3和Cy5的荧光。用GenePixPro4.1imaging软件(Axon Instruments)分析所得到的结果。将来源于Cy3的荧光强度的平均值与来源于Cy5的荧光强度的平均值调整为相同的值，求得Cy3/Cy5的比值(ratio)。在基因组没有异常的情况下，比值为1，当比值为1.32以上时，基因组有扩增，为4以上时被确认具有显著的扩增。当比值为0.75以下时基因组异源接合体缺失的可能性极大，当为0.25以下时同源接合体缺失的可能性极大。
其结果显示，胃癌(HSC58)细胞中存在于染色体9p24.2上的人VLDLR基因缺失了。此时的Log2比值为-2.63(图1A采用被检细胞HSC58的基因组DNA在实施例1所示的CGH阵列上进行CGH分析时的代表性的阵列图像。用明显的信号(Log2比值＝-2.63)显示出染色体9p24.2-24.3中的人VLDLR基因拷贝数减少(用右边放大图中的箭头指示)。
对其它细胞种类进行了研究，在31种胃癌细胞中(图2A表示胃癌细胞中人VLDLR基因的同源接合体缺失的检测。PLC表示采用正常健康人来源的DNA进行检测的结果。将GAPDH(Glyceraldehyde-3-phophate dehydrogenase，3-磷酸甘油醛脱氢酶)基因的PCR作为对照。)没有发现人VLDLR基因的同源接合体缺失。进一步，在进行激光捕获显微切割(Laser-captured microdissection(LCM))处理的原发性胃癌的39个样品中的1个样品(用图2C的楔形记号表示。图2C表示激光捕获显微切割处理的原发性胃癌中的人VLDLR基因的同源接合体的缺失。楔形记号表示检测出同源接合体的缺失的细胞。将GAPDH基因的PCR作为对照。)检测出了人VLDLR基因的同源接合体缺失。
实施例3由人VLDLR基因序列设计各2种引物，在胃癌细胞中用RT-PCR法检测来源于两区域的mRNA。
其结果显示，在发生同源接合体缺失的细胞株中检测不到mRNA。进一步，在没有发生同源接合体缺失的32个细胞株中的9个细胞株中没有检测出RT-PCR产物，在7个细胞株中同通常的胃组织比较显示明显的表达降低(图2B表示通过RT-PCR分析检测出的胃癌细胞的人VLDLR基因的表达。对图2A中箭头所示的表示同源接合体缺失的细胞同样给予了箭头标记。在没有发生同源接合体缺失的31种细胞中的9种细胞中，人VLDLR mRNA的表达以29.0％的比率消失，以22.6％的比率出现表达降低)。因此，不能检测出人VLDLRmRNA的理由，除基因组上的基因缺失以外，还需要考虑其它机制，进一步对其进行了研究。
实施例4CpG岛的甲基化是抑制基因表达的机制之一。采用CpGPLOT分析了人VLDLR基因的CpG岛，结果鉴定了人VLDLR基因的外显子1周围的4个片段。显示出本区域中CpG部位和CpG部位密集存在的CpG岛(图2D为人VLDLR基因的外显子1周围的CpG岛的图解，以白色方框表示外显子1，转录起始点以+1表示。CpG岛由CpGPLOT(http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/)鉴定，以水平箭头表示。CpG岛由人VLDLR基因的-514至+1914组成。用启动子分析法分析的区域(片段1至3)、进行亚硫酸氢盐-PCR分析的区域、进行亚硫酸氢盐测序的区域用水平线表示)。
这里，为了研究鉴定的人VLDLR基因的CpG岛的启动子活性，将包含该CpG岛周围的区域分为3个片断(图2D的片段1-3)，将这些片段插入到荧光素酶报告质粒(pGL3-Basic载体Promega，WI，USA)中，将SNU601细胞和MK704细胞与pRL-hTK内部标准载体(Promega)瞬间共转染。所使用的报告分析(reporter assay)，是通过对表达萤火虫荧光素酶的信使RNA、并转换为蛋白质作为活性酶起作用的发光物进行测定来完成的。用pGL3-Basic载体(Promega)，将在下游配置荧光素酶基因、并作为启动子分析区域包含VLDLR基因的片段1至3的构建体导入到不表达VLDLR基因的SNU601、MK704细胞中，测定其酶活性(图3B)。片段2在两个细胞中均显示了较高的荧光素酶活性，由此证明，VLDLR基因的转录活化区域的基本单位位于片段2。
根据是否进行作为基因变异的检测方法的亚硫酸氢钠处理，基因组DNA中的非甲基化胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶结构上比较稳定，不受此反应的影响，不转变为尿嘧啶。进行将其作为模板的PCR检测，再与受甲基化影响的限制酶组合，通过限制酶是否进行切割来分析来源于改变了的胞嘧啶和非甲基化胞嘧啶的扩增产物中的序列差异，即可以鉴定出甲基化DNA的存在(COBRA法亚硫酸氢盐-PCR法与限制酶切割进行组合的方法)。因此，通过COBRA法检测出了VLDLR基因的外显子1附近的甲基化(图3C)。在VLDLR基因表达降低的MKN28、MKN74、KATO-III、SNU601、SNU638和SNU719细胞株中，由于存在HhaI的切割位点，在电泳中可观察到3个切断DNA(箭头)。另一方面，在可以确认VLDLR基因表达的MKN45、HSC41、NUGC-3、AZ-521、SNU216、SNU484和SH101P4细胞株中，由于不存在依赖于甲基化的限制酶切割位点，所以电泳只显示单一条带(M)。
通过亚硫酸氢盐测序(Bisulfite sequence)法分析了人VLDLR基因的CpG岛内的各CpG二核苷酸的甲基化程度，结果显示，在不存在同源接合体缺失的细胞(SNU601和MKN74)中，人VLDLR基因的CpG岛的甲基化程度特别高，在表达人VLDLR基因的细胞(AZ-521)中没有出现甲基化(图3D表示人VLDLR基因的CpG岛的基因组亚硫酸盐测序序列。转录起始点以+1表示，CpG岛为从+471至+1914。在该区域具有71个CpG部位，用格子表示，白格子是没有甲基化的CpG部位，黑格子是被甲基化的CpG部位。使用的细胞是表达人VLDLR基因的细胞(用表达(+)表示)的AZ-521、和不表达人VLDLR基因的细胞(用表达(-)表示)的SNU601和MKN74)。因此，在胃癌细胞中存在人VLDLR基因的同源接合体的缺失的情况下和人VLDLR基因的CpG岛高度甲基化的情况下，检测不出人VLDLR基因的表达或表达非常低。这两种情形强烈暗示了人VLDLR基因表达与胃组织细胞癌化之间的关系。
实施例5到此为止，已经进行了胃癌细胞中人VLDLR基因的CpG岛的甲基化的分析。此外，又研究了实际上在胃癌细胞中是否也会发生同样的现象。其结果显示，在7例原发性胃癌中，发生了人VLDLR基因的CpG岛的甲基化(图4C表示COBRA分析原发性胃癌的人VLDLR基因的CpG岛的甲基化。N为非癌胃组织，T为原发性胃癌组织)。根据以上结果可以推理得出由人VLDLR基因的CpG岛的甲基化导致的人VLDLR基因的失活对胃组织细胞的癌化具有重要的作用。
实施例6研究了将胃癌细胞中的人VLDLR基因CpG岛进行脱甲基化时的人VLDLR基因的表达情况。具体地，在各种浓度的甲基转移酶抑制剂5-aza-dC的存在下，将胃癌细胞处理5日，测定此时的人VLDLRmRNA的诱导能力。其结果显示，在人VLDLR基因不缺失但也检测不出人VLDLR mRNA的细胞中，通过进行5-aza-dC处理，呈现出了人VLDLR mRNA的诱导能力(图3A表示在5-aza-dC的存在和不存在下胃癌细胞中人VLDLR基因的表达分析。采用用于扩增人VLDLR基因的2种特异引物进行RT-PCR，显示了其电泳结果的条带。GAPDH作为内标使用。作为模板使用的基因组是将不存在同源接合体缺失、但又不表达人VLDLR基因的细胞(SNU601、MKN74)在5-aza-dC的存在和不存在下培养5天后进行制备)。
实施例7明确了伴随CpG岛甲基化的基因抑制是起因于改变了基因组的染色体结构。同样，与基因组互作的组蛋白的低乙酰化也改变了基因组结构，影响基因表达。采用组蛋白脱乙酰基转移酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA) (Trichostatin A)与甲基转移酶抑制剂5-aza-dC研究了CpG甲基化与组蛋白乙酰化的关系。
将人VLDLR基因的CpG岛呈密集甲基化的SNU601细胞和MKN74细胞在TSA存在下孵育，结果与TSA不存在下相比表达量没有变化(图3A表示在5-aza-dC和TSA存在下培养后的、不表达人VLDLR基因的胃癌细胞(SNU601和MKN74)中人VLDLR mRNA的表达。将两种细胞在5-aza-dC存在下培养5天、在TSA存在下或5-aza-dC和TSA共同存在下培养12小时。将由各自的细胞制备的基因组DNA作为模板，采用扩增人VLDLR基因的2种特异引物进行RT-PCR，示出电泳结果条带。GAPDH作为内标使用)。结果，在TSA和5-aza-dC共同存在下孵育的两种细胞均没有发现人VLDLR基因的表达变化。该结果暗示出，只有CpG岛的甲基化对人VLDLR基因的表达具有影响，人VLDLR基因的表达与染色体高级结构的变化无关。
实施例8关于启动子区的甲基化的检测方法，通过亚硫酸氢钠处理，基因组DNA中的非甲基化胞嘧啶(C)可以改变为尿嘧啶(U)，通过采用与亚硫酸氢钠处理后的变化部位尿嘧啶对应的引物对此被检DNA进行PCR，即可以进行特定部位甲基化的检测(甲基化特异的PCR法Methylation Specific PCR，MSP)。利用该方法，采用如图2D所示的MSP引物对来自于胃癌细胞株、以及临床样品的邻近正常组织、癌组织的样品进行分析(图4A和4B；U非甲基化、M甲基化、N正常部位、T肿瘤部位)。并且，在胃癌细胞株中获得了预想的结果，即不表达VLDLR基因的MKN74(No.5)、SNU601(No.27)两株的启动子部位被甲基化(MSP法的结果)，而在表达VLDLR基因的AZ-521(No.24)细胞中则未被甲基化。在通过MSP法对临床癌组织的甲基化进行分析，20个样本中7个样本被检出了甲基化。而且在能够分析癌组织和邻近正常组织的7个样本中，有5个样本在癌组织检测出了癌部位特异的甲基化，而在邻近正常部位没有检测出甲基化。采用检测出这些甲基化差异的样本(17、21)，按照亚硫酸氢盐测序(Bisulfite-sequence)法进一步对VLDLR基因BS-2区域(参考图2D)进行甲基化分析(图4D)。在检测出甲基化差异的癌样本17、21中观察到了预想的甲基化(甲基化部位用黑色表示)。
将在上述各实施例中使用的引物序列和PCR条件记载于下面的表1中。
表1VLDLR基因的引物序列和PCR条件
序列表<110>富士胶片株式会社<120>检测胃组织细胞中人VLDLR基因的失活的方法<130>FI-070327-59<160>14<210>1<211>3646<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1ctctccggcc gccgccggtg cgggtgctcc gctaccggct cctctccgtt ctgtgctctc 60ttctgctctc ggctccccac cccctctccc ttccctcctc tccccttgcc tcccctcctc 120tgcagcgcct gcattatttt ctgcccgcag gctcggcttg cactgctgct gcagcccggg 180gaggtggctg ggtgggtggg gaggagactg tgcaagttgt aggggagggg gtgccctctt 240cttccccgct cccttccccc gccaactcct tcccctcctt ctcccccttt cccctccccg 300cccccacctt cttcctcctt tcggaaggac tggtaacttg tcgtgcggag cgaacggcgg 360cggcggcggc ggcggcggca ccatccaggc gggcaccatg ggcacgtccg cgctctgggc 420gctctggctg ctgctcgcgc tgtgctgggc gccccgggag agcggcgcca ccggaaccgg 480gagaaaagcc aaatgtgaac cctcccaatt ccagtgcaca aatggtcgct gtattacgct 540gttgtggaaa tgtgatgggg atgaagactg tgttgacggc agtgatgaaa agaactgtgt 600aaagaagacg tgtgctgaat ctgacttcgt gtgcaacaat ggccagtgtg ttcccagccg 660atggaagtgt gatggagatc ctgactgcga agatggttca gatgaaagcc cagaacagtg 720ccatatgaga acatgccgca tacatgaaat cagctgtggc gcccattcta ctcagtgtat 780cccagtgtcc tggagatgtg atggtgaaaa tgattgtgac agtggagaag atgaagaaaa 840ctgtggcaat ataacatgta gtcccgacga gttcacctgc tccagtggcc gctgcatctc 900caggaacttt gtatgcaatg gccaggatga ctgcagcgat ggcagtgatg agctggactg 960tgccccgcca acctgtggcg cccatgagtt ccagtgcagc acctcctcct gcatccccat 1020cagctgggta tgcgacgatg atgcagactg ctccgaccaa tctgatgagt ccctggagca 1080gtgtggccgt cagccagtca tacacaccaa gtgtccagcc agcgaaatcc agtgcggctc 1140tggcgagtgc atccataaga agtggcgatg tgatggggac cctgactgca aggatggcag 1200tgatgaggtc aactgtccct ctcgaacttg ccgacctgac caatttgaat gtgaggatgg 1260cagctgcatc catggcagca ggcagtgtaa tggtatccga gactgtgtcg atggttccga 1320tgaagtcaac tgcaaaaatg tcaatcagtg cttgggccct ggaaaattca agtgcagaag 1380tggagaatgc atagatatca gcaaagtatg taaccaggag caggactgca gggactggag 1440tgatgagccc ctgaaagagt gtcatataaa cgaatgcttg gtaaataatg gtggatgttc 1500
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225 230 235 240Ala Ser Glu Ile Gln Cys Gly Ser Gly Glu Cys Ile His Lys Lys Trp245 250 255Arg Cys Asp Gly Asp Pro Asp Cys Lys Asp Gly Ser Asp Glu Val Asn260 265 270Cys Pro Ser Arg Thr Cys Arg Pro Asp Gln Phe Glu Cys Glu Asp Gly275 280 285Ser Cys Ile His Gly Ser Arg Gln Cys Asn Gly Ile Arg Asp Cys Val290 295 300Asp Gly Ser Asp Glu Val Asn Cys Lys Asn Val Asn Gln Cys Leu Gly305 310 315 320Pro Gly Lys Phe Lys Cys Arg Ser Gly Glu Cys Ile Asp Ile Ser Lys325 330 335Val Cys Asn Gln Glu Gln Asp Cys Arg Asp Trp Ser Asp Glu Pro Leu340 345 350Lys Glu Cys His Ile Asn Glu Cys Leu Val Asn Asn Gly Gly Cys Ser355 360 365His Ile Cys Lys Asp Leu Val Ile Gly Tyr Glu Cys Asp Cys Ala Ala370 375 380Gly Phe Glu Leu Ile Asp Arg Lys Thr Cys Gly Asp Ile Asp Glu Cys385 390 395 400Gln Asn Pro Gly Ile Cys Ser Gln Ile Cys Ile Asn Leu Lys Gly Gly405 410 415Tyr Lys Cys Glu Cys Ser Arg Gly Tyr Gln Met Asp Leu Ala Thr Gly420 425 430Val Cys Lys Ala Val Gly Lys Glu Pro Ser Leu Ile Phe Thr Asn Arg435 440 445Arg Asp Ile Arg Lys Ile Gly Leu Glu Arg Lys Glu Tyr Ile Gln Leu450 455 460Val Glu Gln Leu Arg Asn Thr Val Ala Leu Asp Ala Asp Ile Ala Ala465 470 475 480Gln Lys Leu Phe Trp Ala Asp Leu Ser Gln Lys Ala Ile Phe Ser Ala485 490 495Ser Ile Asp Asp Lys Val Gly Arg His Val Lys Met Ile Asp Asn Val500 505 510
Tyr Asn Pro Ala Ala Ile Ala Val Asp Trp Val Tyr Lys Thr Ile Tyr515 520 525Trp Thr Asp Ala Ala Ser Lys Thr Ile Ser Val Ala Thr Leu Asp Gly530 535 540Thr Lys Arg Lys Phe Leu Phe Asn Ser Asp Leu Arg Glu Pro Ala Ser545 550 555 560Ile Ala Val Asp Pro Leu Ser Gly Phe Val Tyr Trp Ser Asp Trp Gly565 570 575Glu Pro Ala Lys Ile Glu Lys Ala Gly Met Asn Gly Phe Asp Arg Arg580 585 590Pro Leu Val Thr Ala Asp Ile Gln Trp Pro Asn Gly Ile Thr Leu Asp595 600 605Leu Ile Lys Ser Arg Leu Tyr Trp Leu Asp Ser Lys Leu His Met Leu610 615620Ser Ser Val Asp Leu Asn Gly Gln Asp Arg Arg Ile Val Leu Lys Ser625 630 635 640Leu Glu Phe Leu Ala His Pro Leu Ala Leu Thr Ile Phe Glu Asp Arg645 650 655Val Tyr Trp Ile Asp Gly Glu Asn Glu Ala Val Tyr Gly Ala Asn Lys660 665 670Phe Thr Gly Ser Glu Leu Ala Thr Leu Val Asn Ash Leu Asn Asp Ala675 680 685Gln Asp Ile Ile Val Tyr His Glu Leu Val Gln Pro Ser Gly Lys Asn690 695 700Trp Cys Glu Glu Asp Met Glu Asn Gly Gly Cys Glu Tyr Leu Cys Leu705 710 715 720Pro Ala Pro Gln Ile Asn Asp His Ser Pro Lys Tyr Thr Cys Ser Cys725 730 735Pro Ser Gly Tyr Asn Val Glu Glu Asn Gly Arg Asp Cys Gln Ser Thr740 745 750Ala Thr Thr Val Thr Tyr Ser Glu Thr Lys Asp Thr Asn Thr Thr Glu755 760 765Ile Ser Ala Thr Ser Gly Leu Val Pro Gly Gly Ile Asn Val Thr Thr770 775 780Ala Val Ser Glu Val Ser Val Pro Pro Lys Gly Thr Ser Ala Ala Trp
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<223>人工序列的描述合成DNA
<400>14ccctcctttc cctcaacaca。20
权利要求
1.一种检测胃组织细胞中人VLDLR基因的失活的方法，其采用DNA芯片法、Southern印记法、Northern印记法、实时RT-PCR法、FISH法或者CGH法。
2.权利要求1所述的检测方法，其使用人VLDLR基因的基因组DNA、cDNA、或者mRNA检测该基因的失活。
3.权利要求1或2所述的检测方法，其中，人VLDLR基因的失活是由该基因的缺失所导致的失活。
4.权利要求3所述的检测方法，其中，人VLDLR基因的缺失是该基因的同源接合体缺失。
5.权利要求1或2所述的检测方法，其中，人VLDLR基因的失活是该基因CpG岛的甲基化所导致的失活。
全文摘要
本发明提供一种新的检测胃组织细胞中人VLDLR基因的失活的方法。根据本发明的检测胃组织细胞中人VLDLR基因的失活方法，其采用DNA芯片法、Southern印记法、Northern印记法、实时RT－PCR法、FISH法或者CGH法。
文档编号C12Q1/68GK101092650SQ20071009794
公开日2007年12月26日 申请日期2007年4月23日 优先权日2006年4月21日
发明者高田久, 井本逸势, 稻泽让治 申请人:富士胶片株式会社, 国立大学法人东京医科齿科大学