专利名称：一种富含花粉活性肽的抗氧化酶解物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蜂花粉酶解物及其制备方法，该酶解物具有显著提高蜂花粉抗氧化能力的特征，富含花粉活性肽。本发明属于天然产物深加工和生物工程技术领域，具体涉及生物制药技术或功能性食品加工技术，特别是用蜂花粉制备富含花粉活性肽的抗氧化酶解物的方法。
背景技术：
蜂花粉为蜜蜂采集回来的花粉，除有一般花粉的成分外，还含有在采集时加进去的少量花蜜和分泌物，具有较强的生理活性，可增强人体免疫功能、抗肿瘤、抗便秘、延缓衰老，具有美容作用，是一种值得研究开发的理想的天然营养品。
蜂花粉之所以具有医疗保健作用，除了其中含有众多营养成分外，还跟蜂花粉中含有种类繁多的生物活性物质是分不开的。这些活性成分有活性蛋白、活性肽、黄酮类化合物、活性多糖及微量元素等。蜂花粉中蛋白质含量相当丰富，约占其干重的7％～35％，氨基酸占总量的20％以上，游离氨基酸1％～2％。油菜(B rassica campestris)蜂花粉中的蛋白含量约为27％，但水溶性蛋白仅占花粉总蛋白的30％左右，其余为水不溶性和难溶性蛋白，人体难以消化吸收，此外，花粉中含有一些可引起过敏的蛋白质，影响了一部分人对蜂花粉的享用。为了能够更好的利用大自然赋予人类的瑰宝，本专利利用不同的蛋白酶将花粉蛋白降解为小分子的活性肽，提高了花粉的生物利用度，降低了服用花粉引起过敏的可能性。富含花粉活性肽的抗氧化酶解物的制备在国内外未见报道。
发明内容
本发明的目的之一是为了解决现有蜂花粉存在的食用适口性差，部分人群服用后存在胃疼等过敏反应以及小剂量、短时间服用蜂花粉，其生物效能不显著的问题；提供一种源自蜂花粉的富含花粉活性肽的抗氧化酶解物。
本发明的目的之二是提供一种富含花粉活性肽的抗氧化酶解物的制备方法，该方法采用适宜的酶解方法，将蜂花粉中不溶性大分子蛋白分解为可溶性小分子肽，得到富含花粉活性肽的酶解产物。体外实验显示该酶解物具有很强的抗氧化作用，对脂质过氧化、羟自由基、超氧阴离子自由基有很好的清除作用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下将蜂花粉破壁、脱脂后，加8～25倍量去离子水，优选10～20倍量去离子水，使用碱调节pH值至6～10，优选7～9，优选使用碱金属氢氧化物(氢氧化钠、氢氧化钾等)、碱金属碳酸盐(碳酸钠、碳酸钾等)、碱金属碳酸氢盐(碳酸氢钠、碳酸氢钾等)的碱将pH保持在规定的范围，加入蛋白酶(中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶等)，优选碱性蛋白酶，温度控制在20～80℃，优选30～50℃，保温搅拌30～180min，优选120～180min，进行酶解，使花粉中的不溶性蛋白转化为可溶性肽，以提高花粉肽的提取率。反应结束后升温70～90℃，保温搅拌10～30min灭酶，然后迅速降至室温，过滤或离心除去沉淀，收集清液，用截留相对分子量＞10000D的超滤膜进行分离，取滤过液用截留相对分子量＜400D的超滤或纳滤膜进行分离，取滤余液冻干保存。该酶解物是花粉活性肽和氨基酸的混合物，富含各种大小的肽段，还含有花粉黄酮等生物活性物质。
本发明是在特定的浓度、温度、时间的条件下，用特定的酶对蜂花粉蛋白进行酶解，用不同孔径的膜对酶解液进行分离和有效成分的富集，得到富含花粉活性肽的酶解产物，可显著提高蜂花粉的抗氧化作用。
本发明所得的富含花粉活性肽的抗氧化酶解物可做食品添加剂、免疫调节剂，还可加入食用、药用或化妆品用辅料制成保健品、化妆品制剂。
本发明的优点在于1、原料为天然物质，来源广泛，所得提取物不含任何有害物质和化学助剂，具有抗氧化功能。
2、根据油菜蜂花粉中蛋白质的特性，选择适宜的酶解方法，将水不溶性花粉蛋白质降解为不同分子量的可溶性肽，大幅度提高了活性肽的含量，其中所含丰富的小分子活性肽和营养物质易被人体吸收。
3、溶解性好、提取率高，富含花粉活性肽的酶解物在水中溶解度大，生物利用度好，提取率约为60％，而普通水提物的提取率仅为30％左右，通过酶解技术使花粉的提取率得到显著增加。
4、酶解方法工艺过程简单，无污染、无残留，反应底物、反应剂和反应环境没有危害，操作方便，效率高，适合于工业化生产，有较好的应用开发前景。
5、花粉酶解产物中含有一定量的花粉黄酮，与花粉活性肽起协同作用，提高蜂花粉的生物活性，尤其是抗氧化活性。
6、通过酶解工艺获得的功能因子(花粉活性肽、花粉黄酮)与蜂花粉相比具有更显著的、特定的医疗保健功能，同时避免了蜂花粉中的植物蛋白对人体产生的过敏现象。本发明中的花粉酶解物中几乎不含有或者完全不含有可以作为抗原的大分子蛋白质，因此，可以避免过敏反应。
9、体外抗氧化活性实验显示本发明的蜂花粉酶解物具有抗脂质过氧化，清除超氧阴离子自由基和羟自由基的作用。
图1为本发明方法的简单工艺流程图。
图2为花粉酶解物和花粉水提物清除羟自由基作用的比较图3为花粉酶解物和花粉水提物清除超氧阴离子自由基的比较图4为花粉酶解物和花粉水提物抗脂质氧化的比较为了更好地理解发明的实质，下面用实施例来详细说明本发明的技术内容，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1酶解物的制备称取一定量的破壁油菜蜂花粉，以料水比1∶10加入pH值为9的缓冲体系中，混匀，调节温度50℃，按酶量与底物浓度比例为1500U/g加入碱性蛋白酶进行水解。反应3h后，90℃灭酶10min，在4000rpm下离心15min，上清液用截留相对分子量＞10000D的超滤膜除去蛋白质等大分子化合物，将膜透过部分(即小分子化合物部分)用截留相对分子量＜400D的超滤或纳滤膜除去单糖、氨基酸、离子成分等，取滤余液冷冻干燥。经检测，油菜蜂花粉经碱性蛋白酶水解和膜分离后，原花粉水提物中游离态氮的含量由3％提高到60％以上，花粉蛋白大部分降解为小分子的多肽，溶解于酶解液中。
实施例2酶解物的制备称取一定量的破壁油菜蜂花粉，以料水比1∶10加入pH值为6.5的缓冲体系中，混匀，调节温度50℃，按酶与底物浓度比为10000U/g加入木瓜蛋白酶进行水解。反应3h后，90℃灭酶10min，在4000rpm下离心15min，上清液用截留相对分子量＞10000D的超滤膜除去蛋白质等大分子化合物，将膜透过部分(即小分子化合物部分)用截留相对分子量＜400D的超滤或纳滤膜除去单糖、氨基酸、离子成分等，取滤余液冷冻干燥。
实施例3酶解物的制备称取一定量的破壁油菜蜂花粉，以料水比1∶10加入pH值为7的缓冲体系中，混匀，调节温度40℃，按酶与底物浓度比例800U/g加入中性蛋白酶进行水解。反应3h后，90℃灭酶10min，在4000rpm下离心15min，上清液用截留相对分子量＞10000D的超滤膜除去蛋白质等大分子化合物，将膜透过部分(即小分子化合物部分)用截留相对分子量＜400D的超滤或纳滤膜除去单糖、氨基酸、离子成分等，取滤余液冷冻干燥。
实施例4花粉酶解物和花粉水提物清除羟自由基的比较称取一定量的破壁油菜蜂花粉，以料水比1∶10，混匀，调节温度50℃，反应3h后，在4000rpm下离心15min，上清液冷冻干燥，得到花粉水提物。花粉酶解物按实施例1制备，进行体外羟自由基的清除试验。实验步骤50mmol/lPH7.4的PBS 0.4ml，0.1ml一定浓度的样品A(对照用溶样品的溶剂代替)，1.04mmol/L EDTA 0.1ml，1mmol/l FeSO4 0.1ml，1mmol/l Vc 0.1ml，10mmol/L H2020.1ml，60mmol/l脱氧核糖0.05ml(A样品不加，用蒸馏水代替)。定容到1.0ml。37℃水浴加热60min，然后加入2.0ml的TCA-TBA-HCl混合液。100沸水加热15min，测定532nm处的吸光度。
抑制率＝[A对照-(A测定-A样品)]/A对照A对照-以溶剂代替样品A测定-加入DR和样品A样品-以蒸馏水代替DR，加入样品油菜蜂花粉酶解物和水提物清除羟自由基试验结果表明，两者均具有清除羟自由基的能力，且有剂量效应关系，即随着样品浓度的增加清除羟自由基的作用逐渐加强。在25mg/mL浓度时，酶解物对羟自由基的抑制率达到83.1％，而水提物对羟自由基的抑制率仅为46.9％。比较二者的EC50(即50％清除自由基的有效浓度)可知，酶解物EC50为3.35mg/mL而水提物EC50为24.23mg/mL，通过酶解，花粉提取物清除羟自由基的能力是水提物的7倍多，这说明，酶解油菜蜂花粉能够显著提高其清除羟自由基的能力。
实施例5花粉酶解物和花粉水提物清除超氧阴离子自由基作用的比较采用实施例1制备的花粉酶解物和实施例4制备的花粉水提物进行体外超氧阴离子自由基的清除试验，采用南京建成生物工程研究所的抗超氧阴离子自由基测试盒，模拟人体中黄嘌呤氧化酶反应体系产生超氧阴离子自由基。按照测试盒说明进行加样，充分混匀，置于37℃恒温水浴40min，分别加入2.0mL显色剂，混匀后静置10min，用蒸馏水调零，测定550nm处的吸光度。
油菜蜂花粉酶解物和水提物抗超氧阴离子自由基试验结果表明，两者均有清除超氧阴离子自由基的能力，且存在剂量效应关系，清除效果随样品浓度的增加而增加，清除超氧阴离子自由基的趋势与清除羟自由基的趋势相同，水提物抑制率较低，在30mg/mL时抑制率只有40.56％，而酶解物已达到73.51％。比较二者的抗氧化能力，酶解物的EC50为9.92mg/mL而水提物的EC50为53.27mg/mL，酶解物清除超氧阴离子自由基的能力是水提物的5倍多。由此可见，蜂花粉酶解后能够显著提高其抗超氧阴离子自由基的能力。
实施例6花粉酶解物和花粉水提物抗脂质氧化的比较采用实施例1制备的花粉酶解物和实施例2制备的花粉水提物进行体外抗脂质过氧化的试验，脂质体分散体系300mg溶解于30ml 10mmol/L pH 7.4PBS，冰浴震荡。三氯醋酸-硫代巴比妥酸-盐酸混合液15g TCA，0.375gTBA，2.1ml浓盐酸依次放入100ml水中。测定步骤与样品管中依次加入0.2ml卵磷脂(A样品不加，用缓冲液代替)、一定浓度的样品1.0ml(A对照用溶样品的溶剂代替)、50ulFeSO4(347.5mg硫酸亚铁，35mg抗坏血酸，定容到25ml)加PBS缓冲液定容到3ml，37℃水浴加热40min，每5min摇匀一次。然后加入2.0ml的TCA-TBA-HCl混合液。100沸水加热15min，5000rpm离心10min，以蒸馏水作空白，测定532nm处的吸光度。
抑制率＝[A对照-(A测定-A样品)]/A对照A对照-以溶剂代替样品A测定-加入卵磷脂和样品A样品-以PBS代替卵磷脂，加入样品油菜蜂花粉酶解物和水提物抑制脂质过氧化试验结果表明，两者均有很强的抑制脂质过氧化的能力，且趋势基本相同，抑制率随样品浓度的增加而增加，呈现剂量效应关系。在30mg/mL浓度时，酶解物和水提物对脂质过氧化的抑制率都已达到90％。二者的EC50分别为1.71mg/mL和3.31mg/mL，酶解物抑制脂质过氧化能力很强，是水提物的2倍左右，说明花粉酶解后其抑制脂质过氧化的能力增强了。
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种富含花粉活性肽的抗氧化酶解物，其特征在于，以蜂花粉为原料，将蜂花粉破壁、脱脂后，加8～25倍量去离子水，调整pH值为6～10，加热到30～60℃，加入蛋白酶进行酶解反应，温度控制在20～80℃，保温搅拌30～180min，进行酶解，使花粉中的不溶性蛋白转化为可溶性肽，然后迅速加热升温到70～90℃，保温搅拌10～30min灭酶，终止酶解反应，然后迅速降至室温，进行固液分离，上清液过截留相对分子量＞10000D的超滤膜，取滤过液用截留相对分子量＜400D的膜进行分离，取滤余液干燥。
2.如权利要求1所述的酶解物，其特征在于，所述的蜂花粉为各种类可商品化的蜂花粉，包括油菜蜂花粉。
3.如权利要求1所述的酶解物，其特征在于，所述的固液分离是以3000～8000rpm的速度离心10～20min。
4.如权利要求1所述的酶解物，其特征在于，所述的截留相对分子量＜400D的膜为超滤膜或纳滤膜，超滤膜或纳滤膜材质包括聚醚砜、聚醚酮、聚酰胺。
5.如权利要求1所述的酶解物，其特征在于，所述的干燥为冷冻干燥或喷雾干燥。
全文摘要
本发明涉及一种富含花粉活性肽的抗氧化酶解物，是以蜂花粉为原料，将蜂花粉破壁、脱脂后，加8～25倍量去离子水，调整pH值为6～10，加热到30～60℃，加入蛋白酶进行酶解反应，温度控制在20～80℃，保温搅拌30～180min，在酶解反应进行到蛋白含量较少时，迅速加热升温到80℃以上，保温搅拌10～30min，终止酶解反应，然后迅速降至室温，进行固液分离，得到清液，用截留相对分子量＞10000D的超滤膜进行分离，取滤过液用截留相对分子量＜400D的超滤膜或纳滤膜进行分离，取滤余液干燥。该酶解物具有抗氧化等作用，可制成粉剂、片剂、胶囊、冲剂等。本发明不含有任何化学试剂，极具开发潜力，在保健品、化妆品和食品添加剂方面有良好的应用前景。
文档编号A23J3/34GK101058600SQ20071009771
公开日2007年10月24日 申请日期2007年4月28日 优先权日2007年4月28日
发明者孙丽萍, 张智武, 田文礼, 董捷, 朱晓丽 申请人:中国农业科学院蜜蜂研究所 被以下专利引用 (1),