专利名称：一种冬瓜蛋白酶的纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种冬瓜蛋白酶的纯化方法，属于轻工食品领域。
背景技术：
冬瓜(Benincasa hispida Cogn.)，别名白瓜、枕瓜、广瓜，原产我国南方和印度，属 葫戸科植物，全国各地均有栽培。冬瓜营养丰富、耐贮藏、肉质洁白、脆爽多汁，且还具有 利尿、清热、化痰、解渴等功效，因而一直被奉为物美价廉、药食兼用的佳品而受到消费者 的青睐。
蛋白酶是一类专一水解蛋白质的酶，因其作用底物特异、催化效率高而使其在医药、食 品、化工、饲料、纺织等领域有广泛的应用，是少数几种己形成产业化的酶制剂之一。蛋白 酶制剂的原料主要有动物、植物和微生物，且以微生物为主。不同来源的蛋白酶用途不同， 植物来源的蛋白酶由于其酶学性质、生产成本等特点使其在应用上有着微生物蛋白酶无法替 代的优势。因此，人们对植物蛋白酶的开发利用从未停止过。
目前国内外对植物蛋白酶的生产和利用主要限于木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，季本仁等在 所申请的专利中公开了一种番木瓜蛋白酶精酶纯化工艺(专利号92115284.1)，谢丹青等在 申请的专利中介绍了一种菠萝蛋白酶的提取方法(申请号200610036906.4)，但目前尚没有 冬瓜蛋白酶方面的研究报道。已公开的这两类蛋白酶的生产原料均产自热带，产地温度高， 使原料的储存、运输和酶制剂生产带来许多不便。冬瓜是一种适应范围广的蔬菜，且产量极 高，冬瓜汁液中富含蛋白酶，以它为原料生产蛋白酶具有独特的优势。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种快速简便的冬瓜蛋白酶的纯化方法， 整个纯化过程仅包括硫酸铵分级沉淀、DEAE-S印harose FF阴离子交换层析和Superdex 75 凝胶过滤层析三个关键技术步骤，蛋白酶得率高，每公斤冬瓜可得40-50 mg蛋白酶；所得蛋 白酶的纯度高，经过SDS-PAGE检测已达到电泳纯；所得蛋白酶的热稳定性好，在8(TC保温 100min，仍能有90%的活性；作用温度范围宽，在25'C 80'C范围内均显示出良好的水解活 性；发挥作用的pH范围宽，在pH5.0 pH8.0的范围内，有良好的酶学活性。纯化的冬瓜蛋 白酶在食品加工、纺织品加工、医疗保健等方面具有良好的应用前景。
为了实现上述发明目的，本发明方法按照如下步骤操作
第一步，冬瓜蛋白酶的提取取冬瓜，去皮、打碎，将匀浆液过滤，滤液离心，取上清液；
第二步，硫酸铵分级沉淀及透析脱盐向上清液中边搅拌边缓慢加入硫酸铵至30%饱和 度，继续搅拌，离心，沉淀溶解在TS缓冲溶液中，上清液继续加入硫酸铵至50%饱和度，离 心，沉淀溶解在TE缓冲溶液(20訓ol/L Tris-Cl， pH8.0, 2mmol/L EDTA)中，上清液继续 加入硫酸铵至80%饱和度，沉淀溶解在TE缓冲溶液(20mmol/LTris-Cl， pH8. 0， 2mmol/L EDTA) 中，将不同饱和度的硫酸铵沉淀出的蛋白质用TS缓冲溶液溶解后，装入透析袋中，4'C下， 对TS缓冲溶液透析12小时；所用TS缓冲液为20mmol/L Tris-Cl， pH8.0， 2mmol/L EDTA, 50mmol/LNaCl，沉淀溶解液对TS缓冲液透析的体积比为1: 1000-1: 2000;
第三步，离子交换层析将透析脱盐的提取液上DEAE-S印harose FF阴离子交换柱，分 别用含0. 1， 0. 15， 0. 2， 0. 25， 0. 3， 0. 35， 0. 4mol/LNaCl的TS缓冲液进行不连续梯度洗 脱，每个梯度使用一个柱床体积，收集0.2mol/L NaCl的洗脱液；
第四步，凝胶过滤层析将0.2mol/L NaCl的洗脱液浓縮后上Superdex 75凝胶过滤层 析柱，上样量与柱床体积比为1: 150-1: 200;洗脱液为TS缓冲液(20腿ol/LTris-Cl， PH8. 0， 2 mmol/L EDTA， 50mmol/L NaCl)流速0. 5-lmL/min，分步收集洗脱液，合并具有酪蛋白水解 活性的洗脱液；将洗脱液冷冻干燥即得到分子量在65 67kD (千道尔顿)之间的纯化冬瓜蛋 白酶。
图1为凝胶过滤层析蛋白的SDS-PAGE分析图谱。 图2为纯化冬瓜蛋白酶的酪蛋白水解活性测定图。 图3为温度对冬瓜蛋白酶活性的影响曲线图。 图4为pH对冬瓜蛋白酶活性的影响曲线图。 图5为冬瓜蛋白酶的热稳定性曲线图。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。 实施例l:冬瓜蛋白酶的分离纯化
第一步，冬瓜蛋白酶的提取取冬瓜1000g，去皮，用水果刀切成小块放于电动匀浆机
中打碎，匀浆液以4层纱布过滤，滤液放入离心杯中，4°C， 10000rpm，离心20min。取上 清液倒入1L的量筒测量体积后转移到烧杯中。
第二步，硫酸铵分级沉淀及透析脱盐向上清液中边搅拌边缓慢加入硫酸铵至30%饱和 度，继续搅拌30min， 4°C， 10000rpm,离心20min，沉淀溶解在10mLTS缓冲溶液(20 mmol/LTris-Cl， pH8. 0， 2隱ol/L EDTA， 50 mmol/LNaCl)中，上清倒入一量筒测量体积，继 续加入硫酸铵至50%饱和度，相同条件下离心，沉淀溶解在20mL TE缓冲溶液(20mmol/L Tris-Cl， pH8. 0， 2mmol/L EDTA)中，上清液继续加入硫酸铵至80%饱和度，沉淀溶解在10mLTE 缓冲溶液(20mmol/L Tris-Cl, pH8. 0， 2誦ol/L EDTA)中。将不同饱和度的硫酸铵沉淀出的 蛋白质用2mL TS缓冲溶液(20mmol/L Tris-Cl, pH8. 0, 2面ol/L EDTA， 50mmol/L NaCl)溶解 后，装入透析袋中，4'C，对2000mLTS缓冲溶液(20mmol/L Tris-Cl, pH8. 0， 2mmol/L EDTA， 50mmol/L NaCl)透析12h。
第三步，离子交换层析将透析过的80%饱和度硫酸铵的沉淀溶解液上事先用TS缓冲溶 液(20mmol/L Tris-Cl, pH8. 0, 2mmol/L EDTA， 50mmol/L NaCl)平衡好的DEAE-S印harose FF 阴离子交换柱(1.2X10cm),用1倍柱床体积的TS缓冲溶液(20mmol/L Tris-Cl， pH8. 0， 2腸1/L EDTA， 50画1/L NaCl)冲洗层析，分别用含0.1， 0.15， 0.2， 0.25， 0.3， 0.35， 0.4mol/LNaCl的TS缓冲液进行不连续梯度洗脱，每个梯度使用一个柱床体积，收集0.2 mol/LNaCl洗脱液。
第四步，凝胶过滤层析对活性最高的0.2mol/LNaCl洗脱液用离心浓縮管浓縮至2mL左 右，上事先用TS缓冲溶液平衡好的Superdex 75凝胶过滤层析柱(1.2X60cm)，洗脱液为 TS缓冲溶液(20mmol/LTris-Cl， p朋.0， 2mmol/L EDTA， 50咖ol/L NaCl)，流速为0. 5mL/min， 280nm检测，分步收集洗脱液，每管2mL，分别测定各管中流出液的蛋白酶活性，合并具有酪 蛋白水解活性的洗脱液；用考玛斯亮蓝R250测定蛋白酶的蛋白浓度，并进行SDS-PAGE分析。
图1中，1:洗脱峰l的蛋白；2-4:纯化的蛋白酶；5:标准蛋白。结果表明，有蛋白酶活性
的洗脱液有14mL，蛋白浓度为3. lmg/mL，共得到蛋白酶43. 4mg。 SDS-PAGE检测，所得蛋白 酶纯度高，己达到电泳纯。将洗脱液冷冻干燥即得到分子量在65 67kD (千道尔顿)之间的 纯化冬瓜蛋白酶。
实施例2:冬瓜蛋白酶的活性测定与性质实验 1、蛋白酶活性测定
取60mL Tris-HCl缓冲液(20mmol/L, pH8.0)在小烧杯中，加入0.75g琼脂，lg脱脂
奶粉(完全溶解后再加热煮沸，其中要不断地搅拌)，冷却至50-60'C时加入0.5%的链霉素
0.6mL，摇匀倒入三个培养皿备用，凝固后分别用无菌打孔器打取直径约5mm的小孔若干，分
别取本发明纯化的冬瓜蛋白酶样品加入孔中，以等体积的TE缓冲液或蒸馏水作为对照，37
。C保温12h。图2纯化冬瓜蛋白酶的酪蛋白水解活性测定图中，1:冬瓜汁(5PL); 2:冬瓜
汁(15uL); 3:从DEAE-S印haroseFF离子交换柱上洗脱的蛋白(2ug); 4:纯化的冬瓜蛋
白酶(l!ig); 5:纯化的冬瓜蛋白酶(2Ug); 6:纯化的冬瓜蛋白酶(5ug)。结果表明，纯 化的蛋白酶具有很强的酪蛋白水解活性，在加样孔周围形成明显的透明圈。
2、 温度对蛋白酶活性的影响
取12只具塞试管，配制反应体系。将这12只试管分别于25、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80。C水浴锅中保温1. 0 h,加0. 4mo1/1三氯乙酸200PL，于7000rpm离心 10min，取上清加200叱Na2COj 5mL Folin-酚A试剂和0. 5mL Folin-酚B试剂，于 4CTC显色15min，用分光光度计测0D680值，用煮沸的200pL酶液作空白对照，最大酶活定 义为100%。
以相对酶活为纵坐标，以温度为横坐标绘图，确定冬瓜蛋白酶的最适作用温度。图3结果 表明，冬瓜蛋白酶的最佳作用温度为68 72'C左右，在25'C 8(TC范围内均显示出良好的水
解活性。
3、 pH对蛋白酶活性的影响
取10只具塞试管，分别加入不同缓冲溶液配制的0.5%酪蛋白溶液和待测蛋白酶样品各 200PL，于50。C反应1. 0 h，加入0. 4mol/L三氯乙酸200叱，于7000rpm离心10min，取上清 200叱,加200PL Nam和5mL Folin-酚A试剂和0. 5mL Folin-酚B试剂，于40。C显色15min， 用分光光度计测0D680值，用煮沸的200叱酶液作空白对照，酶活定义50°C，每mg酶蛋白 每h水解底物产生Wg酪氨酸为1个酶活单位。
以相对酶活为纵坐标，以pH为横坐标作图，确定冬瓜蛋白酶的最适作用pH。图4结果 表明，在pH5.0 pH8.0的范围内，有良好的酶学活性，最适pH为6.2 6.6。
4、 冬瓜蛋白酶的热稳定性
分别将纯化的冬瓜蛋白酶置于60、 70、 80、 9(TC的水浴锅中保温一定时间，取出200PL， 加入200叱0.5%酪蛋白溶液，于50。C反应1.0h，加入0.4mol/L三氯乙酸200l^L，于7000rpm 离心10min,取上清20(mL,加200叱Na2C0j 5mL Folin-酚A试剂和0. 5mL Folin-酚B试 剂，于40'C显色15min,用分光光度计测OD680值，用煮沸的200化酶液作空白对照，酶活定 义每mg酶蛋白每h水解底物产生lPg酪氨酸为l个酶活单位。
以相对酶活性为纵坐标，以保温时间为横坐标作图，确定冬瓜蛋白酶在不同温度下的稳 定性。图5结果表明，冬瓜蛋白酶8(TC保温100min，仍能有90%的活性。
权利要求
1、一种冬瓜蛋白酶的纯化方法，其特征在于按照以下步骤操作第一步，取冬瓜，去皮、打碎，将匀浆液过滤，滤液离心，取上清液；第二步，向上清液中边搅拌边加入硫酸铵至30％饱和度，继续搅拌，离心，沉淀溶解在TS缓冲溶液中，上清液继续加入硫酸铵至50％饱和度，离心，沉淀溶解在TE缓冲溶液中，上清液继续加入硫酸铵至80％饱和度，沉淀溶解在TE缓冲溶液中，将不同饱和度的硫酸铵沉淀出的蛋白质用TS缓冲溶液溶解后，装入透析袋中，4℃下，对TS缓冲溶液透析12小时；第三步，将透析脱盐的提取液上DEAE-SepharoseFF阴离子交换柱，分别用含0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4mol/LNaCl的TS缓冲液进行不连续梯度洗脱，收集0.2mol/L NaCl的洗脱液；第四步，将收集到的洗脱液浓缩后上Superdex 75凝胶过滤层析柱，上样量与柱床体积比为1∶150～1∶200；洗脱液为TS缓冲液，流速0.5-1mL/min，分步收集洗脱液，合并具有酪蛋白水解活性的洗脱液；将洗脱液冷冻干燥即得到分子量在65～67kD的纯化冬瓜蛋白酶。
2、 根据权利要求1所述的一种冬瓜蛋白酶的纯化方法，其特征在于第二、四步所用的TS 缓冲液为20mmol/LTris-Cl， pH8.0, 2mmol/L EDTA, 50mmol/LNaCl，沉淀溶解液对TS缓冲液 透析的体积比为1: 1000~1: 2000。
3、 根据权利要求l所述的一种冬瓜蛋白酶的纯化方法，其特征在于第二步所用的TE缓 冲液为20mmol/LTris-Cl， pH8.0， 2mmol/LEDTA。
4、 根据权利要求l所述的一种冬瓜蛋白酶的纯化方法，其特征在于第三步中将透析过的 提取液上事先用TS缓冲溶液平衡好的DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱，用1倍柱床体积的 TS缓冲溶液冲洗层析；每个梯度洗脱所用的TS缓冲液为一个柱床体积。
全文摘要
本发明涉及一种冬瓜蛋白酶的纯化方法。将冬瓜匀浆、过滤、离心，上清液用不同饱和度的硫酸铵沉淀出的蛋白质用TS缓冲溶液溶解后，透析，上DEAE-Sepharose FF离子交换柱梯度洗脱，将收集到的0.2mol/L NaCl的洗脱液浓缩后上Superdex 75凝胶过滤层析，即得到分子量为65～67KD的纯化冬瓜蛋白酶。该蛋白酶具有明显的酪蛋白水解活性，其最适pH为6.2～6.6，最适温度为68～72℃，具有较好的热稳定性，80℃条件下保温100分钟，蛋白酶仍保有90％的活性。可应用于食品加工、纺织品加工、医疗保健等领域。
文档编号C12N9/50GK101182504SQ200710114209
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月12日 优先权日2007年11月12日
发明者惠静璇 申请人:惠静璇