专利名称：一株博德特氏菌及其在制备胆固醇氧化酶及胆甾-4-烯-3-酮中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及到一株博德特氏菌及其应用，尤其涉及一株产胆固醇氧化酶的博德特氏 菌及其在制备胆固醇氧化酶及胆甾-4-烯-3-酮中的应用。
背景技术：
胆固醇是一种动物性甾醇，胆固醇的代谢异常会引起人体的许多疾病，例如动脉粥 样硬化、心肌梗塞、中风、动脉瘤以及胆结石等疾病，因此，检测血浆和食品中的胆固 醇以及降低食品中的胆固醇含量具有重要的临床意义，胆固醇氧化酶可以作为检测血浆 中的胆固醇含量的重要工具；将胆固醇氧化酶添加到食品中可以降低食品中的胆固醇含 量。此外，胆固醇氧化酶还可以抑制鳞翅目幼虫的生长。而且，胆固醇氧化酶可以把胆 固醇氧化为胆甾-4-烯-3-酮，胆甾-4-烯-3-酮是许多甾体类药物重要前体，在治疗肝病及 抗肥胖等方面具有显著疗效。
胆固醇氧化酶可以作为一种重要的临床药物，并且能够进一步开发作为食品添加剂 和作为农业杀虫剂，具有非常良好的市场前景。
目前，已报道的能够产胆固醇氧化酶的菌株主要有以下几个属节杆菌属、棒状杆 菌属、诺卡氏菌属、分支杆菌属、假单胞菌属、裂褶菌、短杆菌属、链霉菌属、红球菌 属。但是，其胆固醇氧化酶的产率是非常低的，已经报导的菌株所产的胆固醇氧化酶酶 活都处于比较低的水平。经检索，关于利用博德特氏菌属产胆固醇氧化酶并在胞外高表 达的文献及专利还未见报道。
发明内容
针对目前胆固醇氧化酶产率低的问题和需要各种甾体类药物中间体以制备重要的 甾体药物的现状，本发明要解决的问题是提供一株产胆固醇氧化酶的博德特氏菌及其在 制备胆固醇氧化酶及胆甾-4-烯-3-酮中的应用。
本发明所述的博德特氏菌，其特征在于该菌命名为博德特氏菌(BoWe化/Z" S(己于2007年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中 国科学院微生物研究所，中国北京)，其保藏编号为CGMCCNo.2229。
上述博德特氏菌(50^"￡//"印.)3^为革兰氏阴性菌，单个细胞为球杆状，大小0.3 um 0. 7鹏x0.6咖 l.lum，专性好氧；16srDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示， 显示与博德特氏菌属的相似度达到99%。
本发明所述博德特氏菌在制备胆固醇氧化酶及胆甾-4-烯-3-酮中的应用。
其中应用中涉及的歩骤顺序如下
(1) 菌种选择选用博德特氏菌(化W故〃a^.)似CGMCCNo.2229;
(2) 斜面培养将菌种接种于基本无机盐培养基，其中添加质量体积比为1.5 2.0%
的琼脂，25 37'C条件下，静止培养24 72小时；
(3) 种子培养将歩骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1 2环于20 100 mL含有质量体积比为0.01 1.0%的胆固醇的基本无机盐培养基中，25 37'C条件 下，振荡培养24 72小时，制得种子液；
(4) 扩大培养以体积比为1 10%的接种量，将种子液接种于50 1000mL含有 质量体积比为0.1 1.0%的胆固醇的基本无机盐培养基中，25 37'C条件下，振荡培养 48 144小时；
(5) 收集发酵产物将步骤(4)所得的发酵液在2000 8000rpm转速离心，分别 收集上清液和沉淀，上清液即为胆固醇氧化酶粗酶液，沉淀为菌体和胆*-4-烯-3-酮的 混合物；
(6) 胆固醇氧化酶的分离纯化将步骤(5)中获得的粗酶液分别通过质量百分比 为5 10%的硫酸铵和30 80%的硫酸铵，进行分级沉淀；收集沉淀物，用pH7.0的磷酸 缓冲液溶解，利用透析的方法除去残余的硫酸铵；利用超滤的方法将发酵液浓縮至1~ 10ml，通过离子交换层析获得纯胆固醇氧化酶；
(7) 收集并分离胆甾-4-烯-3-酮将步骤(5)中获得的沉淀用有机溶剂溶解； 2000~8000rpm转速离心，上清液即为胆甾-4-烯-3-酮溶液；利用制备型TLC分离纯化， 于真空干燥器中干燥，得到胆甾-4-烯-3-酮固体。
上述的应用中歩骤(2)、 (3)、 (4)中所述的培养温度优选是32 37'C，胆固醇
的质量体积比优选为0.1% 1.0%。
上述的应用中步骤(3)所述的菌体培养时间优选是48 72小时。 上述的应用中步骤(4)中所述的接种量的体积比优选是3~7%，所述的菌体振荡
培养时间优选是60 120小时。
上述的应用中步骤(5)、 (7)中所述的离心机转速优选为5000 6000rpm。
上述的应用中歩骤(7)所述的有机溶剂为非极性的有机溶剂。
其中步骤(7)所述的有机溶剂优选为三氯甲烷或乙酸乙酯。
上述博德特氏菌(Bwtfete〃fl sp.)似CGMCC No. 2229培养温度优选是32 37 °C ，
可以在基本无机盐培养基上以葡萄糖和胆固醇作为碳源生长。
其中所述菌株培养使用液体基本无机盐培养基(Basal Salts Medium, BSM)，配
方为
每1000毫升蒸馏水中添加KH2PO4 0.6g， Na2HP04 1.2g， NaC10.1g， MgS04'7H20 2.7g， CaCi20.1g， (NH4)2SO40.2g， FeSO40.02g。 115"条件下灭菌30分钟。
上述固体斜面基本无机盐培养基优选为上述液体无机盐培养基成分添加质量体积 百分比浓度为1.8%的琼脂粉。
发明人从2005年即开始了胆固醇氧化酶产生菌的筛选，本发明所述博德特氏菌是发 明人筛选获得的一株高产胆固醇氧化酶的博德特氏菌^^^^//" sp.S4 CGMCC No.
2229菌株，经过培养条件的初步优化，产胞外胆固醇氧化酶的酶活达到2000U/L。
本发明利用博德特氏菌属产胆固醇氧化酶并在胞外高表达是首次报道。博德特氏菌 所产的胆固醇氧化酶大部分分泌到细胞外，胞外酶活能够达到2000U/L (—个酶活单位 定义为在37'C下lmin内，催化l pmol胆固醇氧化为胆甾-4-烯-3-酮所需的酶量)，已 经达到或高于国际领先水平，如果通过发酵罐发酵会进一步提高酶活。
利用本发明所述的博德特氏菌^w/We//a sp』4 CGMCC No. 2229可以制备高活性 的胆固醇氧化酶和胆甾-4-烯-3-酮，前者可以作为检测血浆中的胆固醇含量的重要工具； 将胆固醇氧化酶添加到食品中可以降低食品中的胆固醇含量；胆固醇氧化酶还可以抑制 鳞翅目幼虫的生长；后者能够应用到心血管疾病治疗及抗肥胖治疗。这两种生物产品可 以应用在医药、食品工业和农业等诸多领域，具有极大的应用前景。
本发明提供的菌株博德特氏菌(5oW*//a sp.) W,已于2007年10月24日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市海淀区中关村北一 条13号，邮政编码100080，其保藏编号为CGMCC No. 2229。
图1本发明所述博德特氏菌16srDNA测序结果与NCBI中的序列比对。
图2利用薄层层析法(TLC)检测胆甾-4-烯-3-酮产生情况。
其中l.接种时2.接种后12h 3.接种后24h 4.接种后48h 5.接种后72h 6.接种后96h 7.接种后120h。
具体实施例方式
实施例1:博德特氏菌(5oWe e〃asp.)似 CGMCC No.2229的筛选。
从来自济南郊区稻田、大豆根部土壤、玉米根部土壤、菜园等的土样中，经过富集 培养，平板划线等方法获得了48株菌株，经摇瓶发酵后检测发酵产物，获得一株转化能 力很强的菌株，经16srDNA鉴定，确定该菌株为博德特氏菌属(Swrfefe//" sp.)。在培养 温度为37°C，摇床转速260rpm，发酵培养基初始pH为pH 7.0的条件下进行发酵，经薄 层层析检测和质谱分析、核磁分析，表明博德特氏菌(50^￡^//0叩.5^0产生的是胆甾-4-烯-3酮，胆固醇氧化酶酶活达到2000U/L。
上述菌株富集培养使用液体基本无机盐培养基，添加质量百分比为0.1%的胆固醇作 为唯一碳源。
上述平板初筛培养基使用液体基本无机盐培养基，添加质量百分比为0.1%的胆固醇 作为唯一碳源。
上述生产胆固醇氧化酶及胆甾-4-烯-3酮的发酵培养基使用液体基本无机盐培养基， 添加质量百分比为0.75%的葡萄糖和0.3%的胆固醇。
其中所述菌株培养使用液体基本无机盐培养基(Basal Salts Medium, BSM)，配 方为
每1000毫升蒸馏水中添加KH2P04 0.6g， Na2HP04 1.2g， NaCl O.lg， MgS04'7H20 2.7g, CaCl20.1g， (NH4)2S04 0.2g， FeSO40.02g。115'C条件下灭菌30分钟。
固体基本无机盐培养基为上述液体无机盐培养基成分添加质量体积百分比为1.8%的 琼脂粉。
上述菌株博德特氏菌(&W^〃a sp.)己于2007年10月24日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市海淀区中关村北一条13号， 邮政编码100080，其保藏编号为CGMCC No. 2229。
实施例2:博德特氏菌(5orafe/e〃a w. ) 54 CGMCC No. 2229的16s rDNA鉴定。
粗提实施例1所述博德特氏菌(&W他/tosp.) W CGMCC No. 2229菌体的基因 组，设计引物为上游引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物 5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，常规PCR扩增16s rDNA。
测序结果16srDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
与NCBI中的序列进行比对，比对结果见图l。
根据16s rDNA序列比对结果显示，筛选到的本发明所属的菌株确定为博德特氏菌 (5orafe/"e〃a sp.)。
实施例3:利用博德特氏菌(^WWe//" sp.) 54 CGMCC No. 2229制备胆固醇氧 化酶及胆甾-4-烯-3-酮。其中，转速为220rpm。
(1) 菌种选择选用博德特氏菌(&r血fe〃"sp.)似CGMCC No. 2229;
(2) 斜面培养将菌种接种于基本无机盐培养基，其中添加质量体积比为1.8%的 琼脂，37'C条件下，静止培养38小时；
(3) 种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1 2环于100 mL含有质量体积比为0.3。/。的胆固醇的基本无机盐培养基中，28X:条件下，振荡培养24 小时，制得种子液；
(4) 扩大培养以4.0%的体积比的接种量，将种子液接种于50mL含有质量体积 比为0.3%的胆固醇的基本无机盐培养基中，28'C条件下，220rpm培养64小时；
(5) 收集发酵产物将步骤(4)所得的发酵液6000 rpm离心，分别收集上清液 和沉淀，上清液即为粗酶液，沉淀为菌体和胆甾-4-烯-3-酮的混合物。
(6) 胆固醇氧化酶的分离纯化将步骤(5)中获得的粗酶液分别通过质量百分比 为8%的硫酸铵和50%的硫酸铵，进行分级沉淀；收集沉淀物，用pH 7.0的磷酸缓冲液 溶解，利用透析的方法除去残余的硫酸铵；利用超滤的方法将发酵液浓縮至7 10ml， 通过离子交换层析获得纯胆固醇氧化酶；
(7) 收集并分离胆甾-4-烯-3-酮将步骤(5)中获得的沉淀用三氯甲垸溶解；6000 rpm转速离心，上清液即为胆甾-4-烯-3-酮溶液；利用制备型TLC分离纯化，于真空干 燥器中干燥，得到胆甾-4-烯-3-酮固体。
实施例4:利用博德特氏菌(万w^fc〃"sp.) W CGMCC No. 2229制备胆固醇氧 化酶及胆甾-4-烯-3-酮。其中，转速为240rpm。
(1)菌种选择选用博德特氏菌(5wrfe^/asp.)CGMCC No. 2229;(2) 斜面培养将菌种接种于基本无机盐培养基，其中添加质量体积比为1.8%的 琼脂，32t:条件下，静止培养42小时；
(3) 种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1 2环于100 mL含有质量体积比为0.3。/。的胆固醇的基本无机盐培养基中，32'C条件下，振荡培养36 小时，制得种子液；
(4) 扩大培养以4.0%的体积比的接种量，将种子液接种于150 mL含有质量体 积比为0.3%的胆固醇的基本无机盐培养基中，32'C条件下，240rpm培养48小时；
(5) 收集发酵产物将步骤(4)所得的发酵液5000 rpm离心，分别收集上清液 和沉淀，上清液即为粗酶液，沉淀为菌体和胆吊-4-烯-3-酮的混合物。
(6) 胆固醇氧化酶的分离纯化将步骤(5)中获得的粗酶液分别通过质量百分比 为5%的硫酸铵和40%的硫酸铵，进行分级沉淀；收集沉淀物，用pH 7.0的磷酸缓冲液 溶解，利用透析的方法除去残余的硫酸铵；利用超滤的方法将发酵液浓縮至7 10ml， 通过离子交换层析获得纯胆固醇氧化酶；
(7) 收集并分离胆甾-4-烯-3-酮将步骤(5)中获得的沉淀用三氯甲垸溶解；5000 rpm转速离心，上清液即为胆甾-4-烯-3-酮溶液；利用制备型TLC分离纯化，于真空干 燥器中干燥，得到胆留-4-烯-3-酮固体。
实施例5:利用博德特氏菌(Swr/欲〃"sp.)似CGMCC No. 2229制备胆固醇氧 化酶及胆甾-4-烯-3-酮。其中，转速为260卬m。
(1) 菌种选择选用博德特氏菌(SoWe&〃asp.)CGMCC No. 2229;
(2) 斜面培养将菌种接种于基本无机盐培养基，其中添加质量体积比为1.8%的 琼脂，37。C条件下，静止培养48小时；
(3) 种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1 2环于100 mL含有质量体积比为0.7。/。的胆固醇的基本无机盐培养基中，37'C条件下，振荡培养48 小时，制得种子液；
(4) 扩大培养以4.0%的体积比的接种量，将种子液接种于250 mL含有质量体 积比为0.7%的胆固醇的基本无机盐培养基中，37'C条件下，260rpm培养36小时；
(5) 收集发酵产物将步骤(4)所得的发酵液5000 rpm离心，分别收集上清液 和沉淀，上清液即为粗酶液，沉淀为菌体和胆甾-4-烯-3-酮的混合物。
(6) 胆固醇氧化酶的分离纯化将步骤(5)中获得的粗酶液分别通过质量百分比 为10%的硫酸铵和70%的硫酸铵，进行分级沉淀；收集沉淀物，用pH 7. 0的磷酸缓冲液 溶解，利用透析的方法除去残余的硫酸铵；利用超滤的方法将发酵液浓縮至7 10ml， 通过离子交换层析获得纯胆固醇氧化酶；
(7) 收集并分离胆甾-4-烯-3-酮将步骤(5)中获得的沉淀用乙酸乙酯溶解；6500 rpm转速离心，上清液即为胆甾-4-烯-3-酮溶液；利用制备型TLC分离纯化，于真空干 燥器中干燥，得到胆甾-4-烯-3-酮固体。
实施例6:利用博德特氏菌(Sw^/e〃" sp.) CGMCC No. 2229制备胆固醇氧
化酶及胆甾-4-烯-3-酮。分别在接种时、接种后12h、 24h、 48h、 72h、 96h、 120h取样， 薄层层析法(TLC)检测胆甾-4-烯-3-酮产生情况。
(1) 菌种选择选用博德特氏菌(^We&〃asp.) S￥ CGMCC No. 2229;
(2) 斜面培养将菌种接种于基本无机盐培养基，其中添加质量体积比为1.8%的 琼脂，37'C条件下，静止培养48小时；
(3) 种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1 2环于100 mL含有质量体积比为0.5。/。的胆固醇的基本无机盐培养基中，37"条件下，振荡培养48 小时，制得种子液；
(4) 扩大培养以4.0%的体积比的接种量，将种子液接种于50mL含有质量体积 比为0.5%的胆固醇的基本无机盐培养基中，37 'C条件下，260rpm培养96小时，分别 在接种时、接种后12h、 24h、 48h、 72h、 96h、 120h取样;
(5) 收集发酵产物将步骤(4)所得的发酵液6000 rpm离心，收集沉淀，用三
氯甲烷溶解。
(6) 将步骤(5)中获得的胆甾-4-烯-3-酮溶液利用薄层层析法(TLC)检测胆甾-4-烯-3-酮产生情况(结果见图2)。
上述实施例中菌株培养使用液体基本无机盐培养基(Basal Salts Medium, BSM)， 配方为
每1000毫升蒸熘水中添加KH2PO4 0.6g， Na2HP041.2g， NaC10.1g， MgS04'7H20 2,7g， CaCl20.1g， (NH4)2S04 0.2g， FeS04 0.02g。 U5'C条件下灭菌30分钟。
序列表
〈110>山东大学
<120>—株博德特氏菌及其在制备胆固醇氧化酶及胆甾-4-烯-3-酮中的应用
〈141〉 2007-11-6
<210〉1
〈211〉 1523
<212> DNA
<213>博德特氏菌(Bordetella sp.)
<221〉博德特氏菌(Bordetella sp. ) B4 CGMCC No. 2229 16S rDNA
〈222〉 (1)…(1523)
〈400>1
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ggceigcgcggacttcggtctggcggcgeigtggcg咖gggtgagt肌tgtatcgg肌cgt120
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ctacccttgacatgtctggaatgccg犯gagatttggcagtgctcgcaag1020
cacaggtgctgc已tggctgtcgtcagctcgtgtcgtg卿tgttgggtta1080
agtcccgcaaccttgtcattagttgctacga犯gggractcta3tg邓ac1140
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agggcttcacacgtcatacaatggtcgggacag鄉gttgccaagccgcgaggtggagcc1260
acccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcgg1320
aatcgctagtaatcgcggatcagcatgtcgcggtg肌tacgttcccgggtcttgtacaca1380<formula>formula see original document page 11</formula>
权利要求
1、一株博德特氏菌，其特征在于该菌命名为博德特氏菌(Bordetella sp.)B4，已于2007年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.2229。
2、 如权利要求1所述的博德特氏菌，其特征在于所述博德特氏菌(化^/ete^s邵.) S4为革兰氏阴性菌，单个细胞为球杆状，大小0.3 um 0. 7 umXO. 6um 1. lum，专性 好氧；16srDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3、 权利要求1或2所述博德特氏菌在制备胆固醇氧化酶及胆甾-4-烯-3-酮中的应用。
4、 如权利要求3所述的应用，其特征在于应用中涉及的步骤顺序如下(1) 菌种选择选用博德特氏菌(汲)r^ te"a邵.)54 CGMCC No. 2229;(2) 斜面培养将菌种接种于基本无机盐培养基，其中添加质量体积比为1. 5 2. 0% 的琼脂，25 37 t:条件下，静止培养24 72小时；(3) 种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1 2环于20 100 raL含有质量体积比为0.01 1.0%的胆固醇的基本无机盐培养基中，25 37'C条件 下，振荡培养24 72小时，制得种子液；(4) 扩大培养以体积比为1 10%的接种量，将种子液接种于50 1000 mL含有 质量体积比为0. 1 1.0%的胆固醇的基本无机盐培养基中，25 37'C条件下，振荡培养 48 144小时；(5) 收集发酵产物将步骤(4)所得的发酵液在2000 8000 rpm转速离心，分 别收集上清液和沉淀，上清液即为胆固醇氧化酶粗酶液，沉淀为菌体和胆甾-4-烯-3-酮 的混合物；(6) 胆固醇氧化酶的分离纯化将步骤(5)中获得的粗酶液分别通过质量百分比 为5 10%的硫酸铵和30 80%的硫酸铵，进行分级沉淀；收集沉淀物，用pH 7.0的磷酸缓冲液溶解，利用透析的方法除去残余的硫酸铵；利用超滤的方法将发酵液浓縮至1 10ml，通过离子交换层析获得纯胆固醇氧化酶；(7) 收集并分离胆甾-4-烯_3-酮将步骤(5)中获得的沉淀用有机溶剂溶解；2000 8000 rpm转速离心，上清液即为胆甾_4-烯-3-酮溶液；利用制备型TLC分离纯化，于真 空干燥器中干燥，得到胆甾-4-烯-3-酮固体。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于歩骤(2)、 (3)、 (4)中所述的培养温度 是32 37 。C，胆固醇的质量体积比为0. 1% 1. 0%。
6. 如权利要求4所述的应用，其特征在于步骤(3)所述的菌体培养时间是48 72 小时。
7. 如权利要求4所述的应用，其特征在于步骤(4)所述的菌体振荡培养时间是60 120小时。
8. 如权利要求4所述的应用，其特征在于歩骤(5)、 (7)中所述的离心机转速为 5000 6000 rpm。
9. 如权利要求4所述的应用，其特征在于歩骤(7)所述的有机溶剂为非极性的有 机溶剂。
10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于歩骤(7)所述的有机溶剂为三氯甲垸 或乙酸乙酯。
全文摘要
本发明公布了一株博德特氏菌及其在制备胆固醇氧化酶及胆甾-4-烯-3-酮中的应用。所述菌株为博德特氏菌(Bordetella sp.)B4 CGMCC No.2229，该菌株能够合成胞外型胆固醇氧化酶，并能将胆固醇转化为胆甾-4-烯-3-酮。本发明菌株具有发酵时间短，产酶活性高的特点，胞外酶活能够达到2000U/L，已经达到或高于国际领先水平。
文档编号C12N1/20GK101182481SQ200710114218
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月9日 优先权日2007年11月9日
发明者欣 宋, 曲音波, 林建强, 林彦良 申请人:山东大学