专利名称：：一种酵母三杂交检测方法及其在藻毒素检测中的应用的制作方法一种酵母三杂交检测方法及其在藻毒素检测中的应用一、
技术领域：
-本发明属于生物化学与分子生物学
技术领域：
，具体涉及小分子化合物的酵母三杂交检测系统，以及该检测方法在藻毒素检测的应用。二、
背景技术：
-酵母双杂交系统是Fields和Song于1989首先描述的在细胞内分析蛋白与蛋白相互作用的一种新颖的系统，近年来，这种研究蛋白质间相互作用的实验方法已得到愈来愈广泛的应用。它是一种直接在细胞内检测蛋白质相互作用的分子遗传学方法，灵敏度很高，比以往的各种生化手段具有更为明显的优势。利用这一系统已经证实和筛选了许多具有相互作用的蛋白质，并逐渐推广到了细胞凋亡、肿瘤基因表达等多个研究领域，受到越来越多的重视。酵母双杂交系统有以下几个特点(1)在真核细胞内检测蛋白质间的相互作用，具有真实的蛋白质作用环境；(2)在基因水平上操作，无需提纯待研究蛋白质，也无需相应的抗体；(3)可检测蛋白质间较微弱的相互作用及短暂作用；(4)可进行文库筛选，从而获得与己知蛋白作用的未知蛋白的基因；(5)可用于寻找蛋白质相互作用的结构域；(6)可检测基因突变对其编蛋白质功能的影响。微囊藻毒素是由淡水微囊藻产生的次生代谢物，结构为环状七肽，分子量约1000Da，一般组成为环(D-丙氨酸-L-X-赤-P-甲基-D-异天冬氨酸-L-Z-Adda-D-异谷氨酸-N-甲基脱氢丙氮酸)，其中Adda为一种特殊氨基酸，结构为3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯基-4，6二烯酸。藻毒素对生物机体具有多种毒理作用，是一类较强的肿瘤促进剂，可诱发大面积肝损伤甚至肝肿瘤，并产生多脏器损害，国外资料已连续报导了多起因MCs污染而导致的人群、家畜、鱼类患病甚至死亡的事件，国内流行病学调查也发现MCs是导致某些地区人群原发性肝癌比率居高不下的主要原因之一。2007年春季在无锡地区太湖大规模发生的蓝藻暴发使得微囊藻毒素的快速、简便的检测成为当务之目前检测MCs的方法主要可归纳为三种，即生物学、生物化学和分析化学检测法。生物学测试法主要采用毒理学检测的方法，用动物急性毒性试验来间接推算MCs的毒性；生物化学检测法主要有酶联免疫吸附测定(Enzyme-linkedimmunoaLdsorbervtSLSsay,EUSA)禾口蛋白磷酸酶抑制法(Proteinphosphoataseinhibitionassay,PPIA);化学检测技术主要包括HPLC、TLC、气相层析(GC)、液质联用分析(LC/MS)、毛细管电泳(CE)、胶态电动学色谱(MEKC)、反相液相色谱一电离子化质谱联用技术(RPHPLC/EIMS)等方法。生物学方法和生物化学方法虽然可以检测MCs，但是不能做到准确定量、而且价格较高或费时较长，例如商业化的ELISA检测试剂盒价格较高，不能在环境监测中得到普及使用；化学方法的特点是精确客观，但大多必须配备大型精密分析仪器，因此不能用于样品的实时、原位分析。我们在前期研究中应用噬菌体表面展示肽库技术从随机12和7肽库中筛选获得若干与藻毒素有相互作用的多肽，成功获得了能与MC-LR相互识别的噬菌体克隆，通过酶联免疫吸附分析(ELISA)和免疫沉淀(IP)的检测，证明这些小肽片段对藻毒素有特异性的结合(ZhaoSW,ShenPP，ZhouY,WeiY,XinXB，HuaZC，EnvironmentInternational31(4):535-41，2005)。我们从12肽库筛选获得9个小肽，这9个多肽都具有一WHWX0-2W—的保守序列，这些小肽经ELISA分析与藻毒素具有较高的亲和力。从7肽库筛选获得8个短肽，这些短肽经ELISA分析与藻毒素具有较高的亲和力，这些短肽有的具有一QP—保守序列、有的没有任何保守序列。
发明内容为克服已有技术的缺点，本发明有如下二个目的1。将酵母双杂交系统只能用于细胞内分析蛋白与蛋白相互作用，创新和改进成为能够检测短肽和小分子化合物相互作用的酵母三杂交检测体系；2。提供一种简便易行、成本低廉的藻毒素酵母检测系统，用于藻毒素的检测。为达到上述目的，本发明的技术方案是将两个不同序列的、能够与小分子化合物相互作用的短肽(短肽l、短肽2)分别构建进入酵母双杂交载体，将两个肽段的编码基因分别融合在含有结合结构域(BD)编码基因和激活结构域(AD)编码基因的表达载体中，然后共同转化酵母双杂交菌株，构建成为能够检测小分子化合物的酵母三杂交检测系统。在这个能够检测小分子化合物的酵母三杂交检测系统中，当培养基中存在被检测的小分子化合物时，就形成了GAL4-BD-短肽1…小分子化合物…短肽2-GAL4-AD的复合物，该复合物的形成将启动下游g-Gal基因的表达，从而导致e-Gal底物的显色反应，达到检测小分子化合物的目的。在该酵母三杂交检测系统中，短肽l、短肽2的序列可以是直接来源于已知的小分子化合物的亲和肽段、也可以是从与小分子化合物相互作用蛋白质上的直接与小分子化合物发生相互作用的部分肽段、也可以是利用肽库筛选技术从肽库中筛选获得的小分子化合物亲和短肽；短肽l、短肽2应该分别作用于小分子化合物的不同部位，短肽l、短肽2在小分子化合物上作用位点应该互不重叠。短肽l、短肽2长度为2-60氨基酸残基。进一步地，利用上述小分子化合物的酵母三杂交检测系统能够简便易行、成本低廉地用于小分子化合物的检测。进一步地，釆用从不同长度肽库中筛选获得的、具有不同保守序列的两个藻毒素亲和短肽构建进入酵母双杂交系统，即将不同肽段的编码基因分别融合在含有结合结构域编码基因和激活结构域编码基因的表达载体中，共转化酵母菌株AH109，获得表达有两个不同的藻毒素亲和短肽的酵母双杂交系统，在培养基中存在藻毒素的情况下，通过测定P-半乳糖苷酶活性来反映下游报告基因半乳糖苷酶的表达情况。进一步地，利用藻毒素亲和短肽构建的、基于酵母双杂交的藻毒素酵母检测系统可以应用于藻毒素检测方面。进一步地，一种藻毒素酵母三杂交检测方法，其特征是能够形成半乳糖苷酶基因转录因子GAL4的DNA结合区(GAL4-BD)-短肽1…藻毒素…短肽2-半乳糖苷酶转录因子GAL4的DNA激活区(GAL4-AD)的复合物，启动下游P-半乳糖苷酶基因的表达，从而导致P-Gal底物的显色反应，其中，短肽1的序列为WHWSLWRPPYTL、短肽2的序列为QPHPYYM，…代表藻毒素与短肽1、短肽2之间的相互作用。进一步地，一种藻毒素酵母三杂交检测方法，其特征是能够形成半乳糖苷酶基因转录因子GAL4的DNA结合区(GAL4-BD)-短肽1…藻毒素…短肽2-半乳糖苷酶转录因子GAL4的DNA激活区(GAL4-AD)的复合物，启动下游e-半乳糖苷酶基因的表达，从而导致P-Gal底物的显色反应，其中，短肽1的序列为WHWSLWRPPYTL、短肽2的序列为SEMRLAL，…代表藻毒素与短肽1、短肽2之间的相互作用。上述利用藻毒素亲和短肽构建的、基于酵母双杂交的藻毒素酵母检测系统可以通过20分钟-2小时的显色反应反映培养基里面是否含有藻毒素，利用此方法可以简便易行、成本低廉地用于藻毒素的检测。同已有的酵母双杂交系统相比，本发明具有鲜明的特色和创新之处(1)系统构成的创新己有的酵母双杂交系统是用于蛋白质之间相互作用的分析、筛选和鉴定，其原理是通过表达在同一个酵母细胞中两个表达质粒上的、分别与GAL4的AD和BD结构域融合表达的两个蛋白质之间的相互作用，将原来单独表达的GAL4的AD和BD结构域通过两个蛋白质间的结合而靠近，进而启动下游报告基因e-Gal的表达；而在本发明中，本发明首次将两个序列不同的、能够与同一个小分子化合物相互作用的短肽分别与GAL4的AD和BD结构域融合表达，而且这两个短肽之间并不能发生相互作用。这两个短肽通过与共同识别的小分子化合物共同发生相互作用时，导致GAL4的AD和BD因为融合的这两种短肽通过与小分子化合物(如藻毒素)的结合而靠近，进而启动下游报告基因e-Gal的表达。因此，本发明的特色创新之处在于1。已有的酵母双杂交系统使用的是相互作用的两个蛋白质，而本发明中使用的是并不发明相互作用的两个短肽；2。已有的酵母双杂交系统依据的是相互作用的两个蛋白质，而本发明中的酵母三杂交检测系统依据的是短肽1…小分子化合物…短肽2之间的三元相互作用。(2)检测研究对象的创新已有的酵母双杂交系统是用于蛋白质之间的相互作用分析、筛选和鉴定；而本发明的酵母三杂交检测系统的检测是小分子化合物。(3)系统用途的创新已有的酵母双杂交系统是用于蛋白质之间相互作用的分析、筛选和鉴定；从来没有报道或发明将酵母双杂交系统用于培养基环境中小分子化合物的检测。与已有的藻毒素检测方法相比，本发明亦有着鲜明的特色和创新之处(1)本发明首次发明了一种基于生物菌株的藻毒素的检测工具。(2)本发明方法具有简便易行、成本低廉的特点。具体实施例方式实施例1:(1)藻毒素酵母三杂交检测菌株1的构建从前期实验结果(ZhaoSW，ShenPP，ZhouY,WeiY,XinXB，HuaZC，EnvironmentInternational31(4):535-41，2005)中，根据亲和力高低挑选了线性随机12肽库中的3号肽段(W冊SLWRPPYTL)、线性随机7肽库中的7号肽段(QPHPYYM)，根据酵母偏好密码子以及克隆时限制内切酶位点需要，分别合成了6条引物(引物1:5，-GATCCTTTGGCACTGGTCCTTGTGGAGACCACCATACACTTTGTAAC-3，;引物2:5，-TCGAGTTACAAAGTGTATGGTGGTCTCCACAAGGACCAGTGCCAAAG-3，；引物3:5，-AATTCCAACCACACCCATACTACATGTAAG-3，；引物4:5，—GATCCTTACATGTAGTATGGGTGTGGTTGG—3')。引物l和引物2配对退火就可以得到两端带有BamHI和XhoI粘性末端的、可表达3号肽段的双链DNA;引物3和引物4配对退火就可以得到两端带有EcoRI和BamHI粘性末端的、可表达7号肽段的双链DNA。将获得的可表达3号肽段的双链DNA片段与经过BamHI和XhoI酶切的pACT2载体(美国CL0NTECH公司)连接得到pACT2-3质粒，而可表达7号肽段的双链DNA片段和经过EcoRI和BamHI酶切的pGBKT7载体(美国CLONTECH公司)连接，得到pGBKT7-7质粒。pGBKT7酵母表达载体含有表达半乳糖苷酶基因转录因子GAL4的DNA结合区，pACT2酵母表达载体含有表达半乳糖苷酶转录因子GAL4的DNA激活区。将得到的两个质粒分别转化大肠杆菌后，取菌液作菌液PCR(PCR引物pACT2-3:引物1:5，-GGCACACTACTCTCTAATGAG-3，，引物2:5，-CGAGTTACAAAGTGTATGGTGG-3，，退火温度61°C;pGBKT7-7:引物3:5，-GCTATACCAAGCATACAATCAACTCCAAGC-3'，引物4:5，-GATCCTTACATGTAGTATGGGTGTGGTTGG-3，，退火温度67°C)初步验证阳性克隆，然后将PCR之后的阳性克隆进行DNA序列测定分析加以进一步验证，测序结果显示编码两个个不同多肽的重组子DNA序列正确，与设计的DM序列完全一致。。在验证插入片段正确之后，将pACT2-3质粒和pGBKT7-7质粒分别共转AH109酵母，通过SD/-Trp/-Leu营养缺陷平板筛选，从共转化获得的阳性重组酵母菌中挑选克隆，分别接种在没有藻毒素或者含有一定浓度藻毒素的YPDA培养基中培养，然后利用0NPG(邻硝基苯-e-D-半乳吡喃糖苷)法测量e-Gal的活性。以上酵母的相关实验以及培养基和溶液的配制都是参照美国CL0NTECH公司的MATCHMAKERTwo-HybridSystem3的手册进行。(2)藻毒素酵母检测菌株在藻毒素检测中的应用挑选酵母菌株(pACT2-3\pGBKT7-7)，测定菌株在含有藻毒素和不含藻毒素的培养基中e-Gal的活性水平及变化情况。为了排除其它因素影响下游基因的启动，我们在实验中加入了共同转化了pGBKT7和pACT2空载质粒的AH109酵母菌作为对照，同样在没有和加有藻毒素的YPDA培养基中培养，然后测量并计算e-Gal值。Gal(单位)-1000XOD420/(tXVXOD600)，其中t-显色时间(min)，V=0.lmLX稀释倍数(本实验中均为5)，0D600为1raL酵母培养液在600nm的光密度值，0D420为显色后的lmL液体在420nm的光密度值。1个P-Gal单位定义为每分钟每细胞可水解llimolONPG(邻硝基苯e-D-半乳糖苷)产生邻-苯基酚和D-半乳糖的量。我们用藻毒素酵母检测菌株在含有藻毒素和不含藻毒素的培养基中3-Gal值的变化情况来反映藻毒素的存在。实施例2:(1)藻毒素酵母三杂交检测菌株2的构建从前期实验结果(ZhaoSW,ShenPP,ZhouY,WeiY,XinXB,HuaZC，EnvironmentInternational31(4):535-41，2005)中，根据亲和力高低挑选了线性随机12肽库中的3号肽段(W冊SLWRPPYTL)、线性随机7肽库中的9号肽段(SEMRLAL),根据酵母偏好密码子以及克隆时限制内切酶位点需要，分别合成了6条引物(引物1:5'-GATCCTTTGGCACTGGTCCTTGTGGAGACCACCATACACTTTGTAAC-3';引物2:5，-TCGAGTTACAAAGTGTATGGTGGTCTCCACAAGGACCAGTGCCAAAG-3，;引物5:5，-AATTCTCCGAGATGAGATTGGCTTTGTAAG-3，;引物6:5，-GATCCTTACAAAGCCAATCTCATCTCGGAG_3，)。引物l和引物2配对退火就可以得到两端带有BamHI和XhoI粘性末端的、可表达3号肽段的双链DNA;引物5和引物6配对退火就可以得到两端带有EcoRI和BamHI粘性末端的、可表达9号肽段的双链DNA。将获得的可表达3号肽段的双链DNA片段与经过BamHI和XhoI酶切的pACT2载体(美国CLONTECH公司)连接得到pACT2-3质粒，而可表达9号肽段的双链DNA片段分别和经过EcoRI和BamHI酶切的pGBKT7载体(美国CLONTECH公司)连接，得到pGBKT7-9质粒。将得到的两个质粒分别转化大肠杆菌后，取菌液作菌液PCR(PCR引物pACT2-3:引物1:5，-GGCACACTACTCTCTAATGAG-3，，引物2:5，-CGAGTTACAAAGTGTATGGTGG-3，，退火温度61°C;pGBKT7-9:引物5:5，-GCTATACCAAGCATACAATCAACTCCAAGC-3'，引物6:5'-GATCCTTACAAAGCCAATCTCATCTCGGAG-3'，退火温度67°C)初步验证阳性克隆，然后将PCR之后的阳性克隆进行DNA序列测定分析加以进一步验证，测序结果显示编码两个不同多肽的重组子DNA序列正确，与设计的DNA序列完全一致。。在验证插入片段正确之后，将ACT2-3质粒和pGBKT7-9质粒分别共转AH109酵母，通过SD/-Trp/-Leu营养缺陷平板筛选，从共转化获得的阳性重组酵母菌中挑选克隆，分别接种在没有藻毒素或者含有一定浓度藻毒素的YPDA培养基中培养，然后利用0NPG(邻硝基苯-P-D-半乳吡喃糖苷)法测量P-Gal的活性。以上酵母的相关实验以及培养基和溶液的配制都是参照美国CLONTECH公司的MATCHMAKERTwo-HybridSystem3的手册进行。(2)藻毒素酵母检测菌株在藻毒素检测中的应用挑选酵母菌株(pACT2-3\pGBKT7-9)，测定菌株在含有藻毒素和不含藻毒素的培养基中e-Gal的活性水平及变化情况。为了排除其它因素影响下游基因的启动，我们在实验中加入了共同转化了PGBKT7和pACT2空载质粒的AH109酵母菌作为对照，同样在没有和加有藻毒素的YPDA培养基中培养，然后测量并计算e-Gal值。0-Gal(单位)二1000X0D420/(tXVX0D600)，其中t二显色时间(min)，V=0.lmLX稀释倍数(本实验中均为5)，0D600为1raL酵母培养液在600nm的光密度值，OD420为显色后的lmL液体在420nm的光密度值。1个P-Gal单位定义为每分钟每细胞可水解lymolONPG(邻硝基苯P-D-半乳糖苷)产生邻-苯基酚和D-半乳糖的量。我们用藻毒素酵母检测菌株在含有藻毒素和不含藻毒素的培养基中0-Gal值的变化情况来反映藻毒素的存在。表i:邻硝基苯-e-d-半乳吡喃糖苷法测量e-半乳糖苷酶活性值。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实验结果表明(如表1所示)藻毒素的存在对重组酵母菌的生长基本没有影响；当有藻毒素存在时，空载酵母菌的P-Gal值几乎没有变化；但是当含有两个质粒时，Gal值发生了明显的变化，增加幅度在10-20%。例如，在共转了pACT2-3和pGBKT7-7质粒的酵母菌在加有500ng/mL藻毒素的培养基中，加入ONTG底物96分钟后，e-Gal值相对于在没有加入藻毒素培养基中培养的增大了21.36%，而在共转了pACT2-3和pGBKT7-9质粒的酵母菌在加有500ng/mL藻毒素的培养基中培养的时候，^-Gal值相对于在没有加入藻毒素培养基中培养的增大了.12.30%。这说明转进酵母菌中的两个质粒编码的肽段确实通过藻毒素为桥梁，形成了复合物，从而启动了下游e-Gal基因的表达，导致了e-Gal值的升高。根据酵母双杂交技术的常规操作，我们选定了加入ONPG后84至136分钟内测定e-Gal值，并对3+7(共转了pACT2-3和pGBKT7-7质粒的酵母菌)、3+9(共转了pACT2-3和pGBKT7-9质粒的酵母菌)两个酵母菌e-Gal表达的稳定性进行了分析，结果显示酵母菌3+9在测定时间范围内表现出很好的P-Gal表达稳定性，可以用作进一步的研究和分析工程菌。本发明探索建立一种全新的、利用酵母三杂交技术进行包括藻毒素在内的小分子化合物的检测方法。本发明首次将两个序列不同的、能够与同一个小分子化合物相互作用的短肽分别与GAL4的AD和BD结构域融合表达，而且这两个短肽之间并不能发生相互作用。这两个短肽通过与共同识别的小分子化合物共同发生相互作用时，导致GAL4的AD和BD因为融合的这两种短肽通过与小分子化合物的结合而靠近，进而启动下游报告基因P-Gal的表达。因此，本发明与常用的酵母双杂交系统不同之处在于已有的酵母双杂交系统使用的是相互作用的两个蛋白质，而本发明中使用的是并不发明相互作用的两个短肽；已有的酵母双杂交系统依据的是相互作用的两个蛋白质，而本发明中的酵母三杂交检测系统依据的是短肽1…小分子化合物…短肽2之间的三元相互作用。作为应用实例，本发明中我们在前期研究中利用噬菌体随机肽库技术，以MC-LR为靶分子，分别从噬菌体表面展示线性随机12肽库和7肽库中筛选获得了能与MC-LR特异性结合的短肽片段。结果显示，从12肽库筛选获得的短肽核心保守序列(一WHWX0-2W—)明显不同于从7肽库中筛选获得的短肽的核心保守序列(一QP—)或没有核心保守序列的多肽序列(SEMRLAL)。据此，我们认为这两类具有不同长度的藻毒素亲和短肽(12肽、7肽)可能分别与藻毒素的不同部位或者活性基团发生相互作用，那么就可以将这两种短肽的编码DNA序列分别克隆到含有AD或BD结构域的酵母双杂交载体中，将这两个质粒共同转化AH109酵母菌，然后分别在没有藻毒素或者加入了藻毒素的培养基中培养。因为这两种短肽与藻毒素的结合位点不同，那么在加入藻毒素的培养基中培养的酵母菌中，GAL4的AD和BD因为融合的两种短肽通过与藻毒素的结合而靠近，进而启动下游报告基因0-Gal的表达，因此可以通过测得的P-Gal酶活性高低来反映培养基中是否存在藻毒素。我们的实验结果表明我们确实达到了预期的设计目标。与没有藻毒素存在的培养情况相比，在含有500ng/mL藻毒素的培养基中，只含有AD或BD结构域的酵母双杂交载体pACT2和pGBKT7的酵母菌的P-Gal基本没有任何改变；但是含有两种不同的藻毒素亲和短肽质粒的酵母菌的0-Gal值在藻毒素存在情况下发生了明显的变化，增加幅度在10-20%。其中克隆3+9在测定时间范围内表现出很好的P-Gal表达稳定性，可以用作检测工程菌用于检测藻毒素在环境中的存在。权利要求1.一种酵母三杂交体系，其特征是能够形成半乳糖苷酶基因转录因子GAL4的DNA结合区(GAL4-BD)-短肽1…小分子化合物…短肽2-半乳糖苷酶转录因子GAL4的DNA激活区(GAL4-AD)的复合物，启动下游β-半乳糖苷酶基因的表达，从而导致β-Gal底物的显色反应，其中，短肽1、短肽2分别为能够与同一个小分子化合物相互作用的、不同氨基酸序列的、长度为2-60个氨基酸残基的短肽，…代表小分子化合物与短肽1、短肽2之间的相互作用。2.权利要求l所述的一种酵母三杂交体系的构建，其特征是利用基因工程技术构建两种分别表达GAL4-BD-短肽l、短肽2-GAL4-AD的重组质粒，将这两种质粒共同转化酵母菌，从而获得酵母三杂交菌株。3.—种权利要求l所述的酵母三杂交体系检测小分子化合物的检测方法，其特征是将酵母三杂交菌株在含有小分子化合物的培养基中培养，然后加入P-半乳糖苷酶的显色底物反应20分钟-2小时后，测定e-Gal值，用与不存在小分子化合物时相比13-Gal值的变化反映小分子化合物的存在。4.一种权利要求i所述的酵母三杂交体系构建的藻毒素检测方法，其特征是能够形成半乳搪苷酶基因转录因子GAL4的DNA结合区(GAL4-BD)-短肽1…藻毒素…短肽2-半乳糖苷酶转录因子GAL4的DNA激活区(GAL4-AD)的复合物，启动下游P-半乳糖苷酶基因的表达，从而导致e-Gal底物的显色反应，其中，短肽l、短肽2分别为能够与藻毒素相互作用的、不同氨基酸序列的、长度为2-60个氨基酸残基的短肽，…代表藻毒素与短肽1、短肽2之间的相互作用。5.权利要求l所述的一种酵母三杂交体系在小分子化合物及污染物检测中的应用。6.权利要求4所述的一种藻毒素检测方法在藻毒素检测中的应用。全文摘要本发明属于生物化学与分子生物学
技术领域：
，具体涉及一种新的酵母三杂交体系，该体系通过形成GAL4-BD-短肽1…小分子化合物…短肽2-GAL4-AD的复合物，启动下游β-Gal基因的表达，从而导致β-Gal底物的显色反应，能够用于小分子化合物的检测；本发明还涉及一种利用藻毒素亲和短肽构建的藻毒素酵母检测系统。该方法简便易行、成本低廉，可用于包括藻毒素在内的小分子化合物的检测。文档编号C12Q1/68GK101131363SQ20071013279公开日2008年2月27日申请日期2007年9月30日优先权日2007年9月30日发明者华子春,沈萍萍,晓潘申请人:南京大学