专利名称：：包含Neochlorisoleoabundans藻的生物质提取物的美容减肥组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及到Neochlorisoleoabundans藻的生物质4是耳又物在4匕妆品领域中的应用，以及更具体地，在化妆品组合物中用作减肥剂。
背景技术：
：孩史生物在化妆品或皮肤病用组合物中的多种应用已经为人所知。下面纟合出了关于Neochlorisoleoabundans藻的分类学4言息门绿藻门纲绿藻纲目绿球藻目科绿球藻科属Neochloris种oleoabundans该藻是一种《效藻，构成国际专利申请WO2006/008401中引用的多种微生物和藻类的一部分，该申请描述了制备至少一种光合海水和/或淡水樣t生物的澄清培养基的方法，以及这些澄清(clarified)培养基的应用，尤其在化妆品领域中。所述文献并未对生物质本身的应用表示出兴趣，而^又对该澄清培养基的应用感兴趣。迄今为止，文献中尚未包含指出Neochlorisoleoabundans藻的生物质提取物用作化妆品组合物的活性剂的内容。
发明内容本发明的发明者对该藻的生物质的不同提取物所作的实验表明其在化妆品领域中具有非常特殊的价值，尤其是作为减肥剂(slimmingagent)。更确切地i兌，对本发明的发明者来i兌，4艮显然，利用极性和/或非极性溶剂获得的Neochlorisoleoabundans藻的生物质的提取物局部地应用于皮肤时，表现出非常有用的减肥特性，尤其当存在于4b妆品组合物中时。然而，很明显该藻的某些提取物证明用于减肥特别有价值，这正是利用极性溶剂获得的提取物的情形、特别是醇或水-醇提取物。而且，也很明显，这些利用极性溶剂获得的提取物、特别是醇或水-醇提取物随后可以进行各种分馏操作，其特别是有可能获得新型提取物，所述提取物本身也表现出有用的减肥特性，而同时相比第一醇或水-醇^是取物具有明显增强的感官特性或着色。因此，才艮据第一个方面，本发明涉及一种包含所述Neochlorisoleoabundans藻的生物质提取物的化妆品组合物。根据第二个方面，本发明涉及一种用于制备对实现本发明有用的才是取物的方法。才艮据第三个方面，本发明涉及这些相同的^是取物作为减肥剂在4匕妆品4页i或中的应用。根据第一个方面的基本特征，本发明涉及一种化妆品组合物，其包括一乍为活'f生剂的Neochlorisoleoabundans藻的生物质4是取物，所述活性剂被混合入适于局部应用(施用)的化妆品用载体中。如前面说明的，当应用于皮肤时，Neochlorisoleoabundans藻的生物质提取物具有有用的减肥特性。存在可产生根据本发明使用的生物质的多种培养条件。然而，Neochlorisoleoabundans藻将优选在以氯化钠含量在10g/1与30g/1之间(优选在16g/1与20g/l之间)的海水或《鼓咸水为基础的培养基中培养，该培养基还可选地包含常规/使用的营养素。特别有利;也，所述氯化钠含量为18g/l。有利地，所述培养基包括樣i咸水，即海水与淡水的混合物。优选地，使用的海水取自不列塔尼(Brittany)北海岸沿线的英吉利;每山夹，4寺别是Roscoffi也区(Finistdre，France)。如前面说明的，有利地，用来制备本发明的化妆品组合物的揭二耳又物为醇或水-醇揭JF又物或来自后者分馏的4是耳又物。在下面的描述中，第一提取物是指通过用第一醇或水-醇溶剂处理生物质而获得的醇或水-醇提耳又物。在本发明的一个有利变通例中，该第一提取物(其具有有用的减肥特性)在本发明的組合物中用作减肥剂。在其他变通例中，在本发明的化妆品组合物中使用的活性剂是通过分馏该第一提取物而获得的一种馏分。在另一个变通例中，如上定义的第一^是取物的混合物以及通过其分馏而获得的第一提取物的至少一种馏分，均可用于本发明的组合物中。有利地，第一提取物利用第一醇或水-醇溶剂加以制备，其中所述醇选自由d-Q单醇、C2-Q二醇及其混合物组成的组。甲醇、乙醇以及丁二醇作为这些醇的实例而特别提及。所述第一溶剂的组成可以在非常宽的水和醇范围内变动。然而，在乙醇和水的混合物的情况下，按体积计算，这两种成分各自的比例将在乙醇100%-40%和水0%-60%的范围内选才奪。如上面i兌明的，通过用醇或水-醇溶剂4是取所述生物质获得的第一提取物，具有特别有用的减肥特性，使其作为根据本发明的活性剂成为一种特别有用的l是:取物。还如上面i兌明的，特别是为了增强上述^是取物的感官特性，和/或降低其着色性，该第一4是耳又物可以进行多个分馏才喿作，以产生性质改善的新型拔」耳又物，特别是感官特性改善和/或着色性降^f氐的新型提取物。在本发明的一个有利变通例中，所述第一^€取物经受在第二水或水-醇溶剂与第三溶剂之间液-液提取的分配步骤，其中第三溶剂与第二溶剂是不混-容的而且具有0到4.7之间的4及性(该才及性由其极性系数P'来定义)，产生包含第一提取物的第一馏分的水-醇相(称为第二提取物)以及由第三溶剂组成且包含第一提取物的第二馏分的相(称为第三提取物)。关于才及性系凌tP'的定义，可以参照L.R.SNYDER在JournalofChromatography92(1974)223-230发表的文章"Classificationofthesolventpropertiesofcommonliquids"。对于这种分馏步骤，有利地，第二溶剂由水和醇的混合物组成，其中醇选自由C广Cs单醇和C2-C6二醇组成的组。甲醇、乙醇、丁二醇及其混合物将作为优选醇而被选择D本领i或中的熟练^支术人员爿夸理解7JC和醇的比例不4又依赖于醇的性质，而且依赖于所述第三溶剂的性质。如果第二溶剂是水-醇溶剂且包括乙醇，则按体积计算，后者有利;也以^氐于20%的比例存在。第三溶剂，其与第二溶剂不混溶并且具有在0到4.7之间的;f及性P'，有利地选自由氯仿、乙酸乙酯、二乙醚及其混合物组成的组。如前面说明的，如前面定义的第二和/或第三提取物将有利地被选择为一种构成根据本发明的活性剂的提取物。内变动。然而，按重量计算，基于该组合物的总重量，这些比例将有利地在0.0003-2%之间，该百分比以干提取物表示。4安重量计算，这些比例有利i也在0.003-0.3%之间。而且，在一个特别有利的具体实施方式中，即使提取物不是通过用丁二醇提取而获得，仍然可以证明以下述形式将其引入本发明的组合物中是非常有用的以在水和丁二醇混合物中的;容液形式；以及特别是以这样的溶液形式，其中基于水/丁二醇混合物的重量，并按重量计算含有0.05-5%并且优选0.1-1%干提取物。有利地，这可以利用按体积计算为50/50的水/丁二醇混合物来实现。才艮据第二个方面，本发明涉及一种用于制备Neochlorisoleoabundans^是耳又物的方法，其中Neochlorisoleoabundans4是取物计划专门用于制备如上面所定义的组合物。该方法包4舌至少一个步骤利用如上面所定义的第一醇或水-醇溶剂提取生物质，以产生第一提取物。有利地，该方法还包括至少一个用来分馏上述第一^是取物的步骤。在一个有利的变通例中，第一提取物的分馏包括在第二水一醇溶剂与第三溶剂之间分配所述第一提取物的步骤，其中第三溶剂与第二溶剂是不混溶的而且具有0到4.7之间的极性P'，所述分配过程产生第二和第三提取物，分别包含在由第二和第三溶剂构成的每个相中。最后，为了改善其感官性质或其着色性，本发明的方法可以包括用于纯化不同4是取物的其他常失见步骤。这些可以被提及的步骤的实例是用于活性炭(例如xcv炭)脱色的步骤，或者过滤步骤，例如，具有在40-0.20jam之间的过滤截止^f直(cut-off)。本发明进一步涉及如上文所定义的、或者通过上文定义的方法所获得的4是取物或4是耳又物的混合物的应用在化妆品组合物中用作减肥剂，或者用于化妆品组合物的生产。随后的实施例中给出的结果清楚阐释了根据本发明的提取物的脂解活性，其中通过监测从皮肤移植物原位释》文的脂肪酸。最后，才艮据最后一个方面，本发明涉及一种为了实现减肥效果的人体美容护理方法。该方法包括将如上所定义的组合物应用于需要其的身体部位。这才羊一种方法包括选l奪需要减月巴处理的身体部位以及将本发明的《且合物应用于该身体部^f立。随后的实施例是用来说明本发明而不是对本发明的限制。具体实施例方式I.所述Neochlorisoleoabundans藻的培养以及生物质的回收所采用的4朱系来源于UTEXalgotheque(奥斯汀;彈克萨斯大学藻类4欠集中心(algaecollectionoftheUniversityofTexasinAustin))且以UTEX1185估支参照。该4朱系在沙特阿4立伯(SaudiArabia)分离。在本实施例中，在一个20m3装满含18g/1盐的樣丈咸水池中进行成批培养，其中加入以下组成的营养素介质■Na2EDTA:4.3610-3g/1■FeCl36H20:1.5810-3g/1■NaHC03:0.6l(T3g/1■MnCl2.4H20:0.3610-3g/l■CuS04.5H20:110-5g/1■ZnS04.7H20:2.2l(T5g/1■CoCl2.6H20:110-5g/1■MgS04:4.95102g/1■NaN03:0.17g/1■H3B03:2.47l(T3g/1■NaHC03:4.2310-3g/1■K2HP04:3.475.102g/1■CaCl2:2.94l(T2g/1國维生素B^1.lO-4g/1國维生素B^:510-7g/1國维生素H:5l(T7g/l还可以采用半连续才莫式。在所-使用类型的池中，培养物在12-15天后达到成熟。在这个时期的末尾，回收全部或部分藻悬浮物。随后通过14000g(1g=9.18m/s2)的加速度进4亍离心分离乂人而浓缩该生物质。II.根据本发明的提取物的制备1.用甲醇从第一次提取中制备提取物a,在500ml圆底烧弁瓦中，将250ml曱醇加入100g含26Q/o干才是耳又物的藻生物质中。混合物在氮气下在65°C加热30分钟。全部混合物以400rpm离心10分钟。将液相,人固态残留物分离并丢弃。随后将过滤残留物转移入250ml圓底烧并瓦中，然后在相同条件下用250ml曱醇重新提取。这个操作再重复最后一次。汇集三个液相，随后在旋转式蒸发器上蒸干。得到的固体重新溶解于100ml水中，然后冷冻并冻干。该提取物最终是粉末形式，并在下文以提取物A表示。a.l.按照如在a)中描述的相同的制备过程，将重新收集的液相在旋转式蒸发器上蒸干，随后重新溶解，^f旦这次用200ml庚烷。超声处理整个溶液，然后以4000rpm离心30分钟。回收上清液，在^走转式蒸发器上蒸干，然后通过加入100ml蒸馏水重新溶解，冷冻然后冻干，得到一种提取物，其在下文表示为A1。a.2.按照如在l.a)中描述的用于提取物A制备的相同的提取过程，这种情况下通过用曱醇提耳又获得的过滤残留物重新溶解于100ml氯仿中，并加入95ml水和5ml甲S享，然后在两相之间完成液-液分配。弃去有才几相，一夸水相用50ml氯4方重新洗涤两次，然后弃去的水相用于制备下面a.3)中描述的提取物。收集有机相，在旋转式蒸发器上蒸千，重新溶解于50ml水中并冻干，得到的提取物在下文表示为A2。a.3.将如在^2)中定义的水相在旋转式蒸发器上蒸干，重新溶解于50ml水中并冻干，得到一种提取物，其在下文表示为A3。2.通过第一次7j^乙醇提取制^^提取物B以及分餾该損_取物a.制备7K乙醇^C取物B在500ml圓底烧瓶中，将250ml乙醇/水混合物(94/4，体积/体积，以下表示为v/v)加入100g含14.6%干拔_耳又物的藻生物质中。该混合物回流(reflux)30分钟，冷却后，^寻4是取物以4000rpm离心20分钟，然后离心残留物用250ml水-醇溶液重新提取3次。随后汇集上清液，用0.40jum过滤器(GF/F,Whatman)在Biichner漏斗上过滤，然后在旋转式蒸发器上蒸干。得到的提取物B随后以5%(重量/体积，下文表示为w/v)的浓度;容解于DMSO中，用于生物学冲全测。b.通过液-液分配来分镏提取物B，以制^^^取物Bl和提取物B2将2g前面的才是取物B在约80ml乙醇/水混合物(20/40,v/v)中稀释，以得到2.5%的溶液。加入53ml乙酸乙酯，以形成两相系统。将该两相分离以回收第一有^4目。用53ml乙酸乙酯重新洗涤水相，并且共重复4次。汇集4个有机相，然后在旋转式蒸发器上蒸发，得到一种拔:取物，其在下文称为I是耳又物B1。水相也在旋转式蒸发器上干燥，得到一种干提取物，其在下文称为4是取物B2。得到的提取物Bl以5%(w/v)的浓度溶解于DMSO中，并且提取物B2以50/。(w/v)的浓度溶解于水中，用于生物学检测。3.通过第一次7JC-乙醇提取制备提取物C在500ml圓底烧瓶中，将250ml乙醇/水混合物(96/4,v/v)加入100g含12%千|是取物的藻生物质中。该混合物回流30分钟，冷却后，将提取物以400rpm离心20分钟，然后离心残留物用250ml水-醇溶液重新4是取3次。随后汇集上清液，在陶漏斗(GF/F过滤器，Whatman,40jum)上过滤，然后在旋转式蒸发器上蒸干。得到的干提取物为提取物C，其随后以5%(w/v)的浓度〉容解于DMSO中，用于生物学才企测。III.本发明的提取物的脂解活性的测定mi.测定原理目的是评估才艮据本发明的Neochlorisoleoabundans提取物只十{呆持活性脂肪组织的外才直块(explant)的脂解活性。在下面描述的条件下，将不同的提取物加入培养基中。接触8天后，通过测定释放入培养基中的脂肪酸来评估其活性。III2.步骤外植块制备9个脂肪组织外才直块，并在BEM(BIO-EC'sExplantsMedium)中4呆持活性。将外才直块分为三组，每组3块。-培养基存在时的参照组-咖啡因处理纟且，作为阳性参照-用才艮据本发明的^是耳又物加以处理的组。一检测产物阳性参照在存活培养基中咖啡因以终浓度0.1%(1mg/ml)使用，即为根据本发明的提取物终浓度10倍以上的浓度；浓度为0.01%(100ing/ml)时，咖啡因不再具有脂解作用。根据本发明的Neochloris的提取物提取物以干粉末的形式存在，该粉末以50%的浓度溶解于DMSO中，随后在外植块的培养基中1/500稀释，以在终浓度0.01%(100jug/ml)下检测。^^取物的应用在D0，将外植块在2ml培养基中保持活性，其中培养基中混入了4企测4是取物。在D2、D4和D6重复该处理过禾呈。糾在D2、D4、D6和D8,对培养基取样。对于每个外植块，将在D2、D4、D6和D8取样的培养基合并于同一个管中，并储存于-20°C,用于测定培养基中存在的脂肪酸。测定培养基中存在的游离脂肪酸培养基提取后，将其中存在的游离脂肪酸分离，并通过高效薄层层析(色谱)法测定。III3.结果通过组织学监测脂肪细胞的生存力和形态。保持活性8天后，参照和经处理的外植块既未表现出可见的降解，也未表现出细胞坏死。通过测定释》文入培养基中游离脂肪酸的比例来评估脂解活性。所得的结果在下表中给出，并与8天处理过程中释放入培养基中的脂肪酸重量相对应，重量以jug表示。a.用根据本发明的提取物B得到的结果释》文的脂肪酸<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>b.用揭:取物Bl(乙酸乙酯馏分)得到的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>III4.结论可以看到，根据本发明的所有检测提取物均具有显著的脂解活性，因为大量脂肪酸被释放入培养基中。甚至可以认为该脂解活性非常显著，尤其是提取物Bl的脂解活性，因为在用于根据本发明的才是取物的0.01%剂量，咖啡因(一种其脂解活性众所周知的阳性参照)不再有活性。IV.s己方实例下面阐述的局部〗匕妆品ia合物以常失见方式制备自以下百分比组成(用重量表示)。去离子水73.5%醇96.2vol%21AMPS聚合物(Sepigel305)3防腐剂0.3香料浓缩物0.1Neochlorisoleoabundans提取物(在50/50的水/丁二醇中，提取物Bl为3%)2透明质酸钠(高分子量)0.1减肥霜石更脂酸甘油酯+石更脂酸聚乙二醇(100)酯6.0%氢化聚异丁烯3.0异三十烷3.0辛酉交甘油酯/葵酸甘油三酯3.0甘油2.0甲氧基肉桂酸辛酯2.0申卧臾多求^fl石更面旨^西旨(cetylstearyloctanoate)1.5蜂蜡1.5鲸蜡醇1.0硬脂醇1.0二甲基硅油1,0黄原月交0.2Neochlorisoleoabundans提取物(在50/50的7JC/丁二醇中，提取物B2为3%)2防腐剂，香并牛，着色剂0.2水余量(qsp)液态减肥乳液才宗榈酸辛酯7.0%辛酸甘油酯/葵酸甘油三酯3.0辛酸辛酯2.0苯基三甲基石圭氧烷2.0甘油2.0石更脂酸1.0去水山梨糖醇1.0鲸蜡醇0.5石更脂醇0.5Neochlorisoleoabundans提耳又物C1防腐剂，香冲+，着色剂，中和剂0.1水qsp减月巴洗液丁二醇3%EDTA0.1助溶剂1香料浓缩物0.1醇5.2Neochlorisoleoabundans提取物A0.5二笨甲酉同一4(benzophenone-4)0.13防腐剂，香坤牛，着色剂，中和剂0.1水qsp权利要求1.一种化妆品组合物，其特征在于包括作为活性剂的Neochlorisoleoabundans藻的生物质l是耳又物，所述活性剂被混合入适于局部应用的4匕妆品用载体中。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述生物质是通过在i咅养基中i咅养所述Neochlorisoleoabundans藻而获4寻的，其中所述培养基以氯化钠含量在10g/1与30g/1之间，优选在16g/1与20g/1之间的海水或微咸水为基础，所述培养基还可选地包含营养素。3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于所述培养基的氯化钠含量是18g/1。4.根据权利要求2或3所述的组合物，其特征在于所述培养基包含微咸水。5.根据权利要求1到4中任一个所述的组合物，其特征在于所述提取物是通过用第一醇或水-醇溶剂处理所述生物质而获得的醇或者水-醇换:耳又物，称为第一纟是取物；和/或通过分馏所述第一4是耳又物而荻得的所述第一纟是耳又物的至少一种馏分。6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于所述第一溶剂的醇是选自由C!-C5单醇、C2-C6二醇及其混合物组成的组的醇。7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于所述醇是曱醇、乙醇或丁二醇。8.根据权利要求5到7中任一个所述的组合物，其特征在于按体积计算，所述第一溶剂包含100%-40%的乙醇和0%-60%的7^。9.才艮据权利要求5到8中任一个所述的组合物，其特征在于所述分馏由利用所述第一提取物在第二水或水-醇溶剂与第三溶剂之间的液-液^是耳又的分配步骤产生，所述分配步骤其中所述第三溶剂与所述第二溶剂是不混溶的而且具有由其极性系数P'来定义的0到4.7之间的极性，所述分配步骤产生包含称为第二4是取物的所述第一提耳又物的第一馏分的水-醇相以及由所述第三溶剂组成且包含称为第三提取物的所述第一提取物的第二馏分的相。10.才艮据权利要求9所述的组合物，其特征在于所述第二溶剂是水-醇溶剂，所述第二溶剂的醇选自由C广C5单醇、Q-C6二醇及其混合物组成的组。11.根据权利要求10所述的组合物，其特征在于所述醇是甲醇、乙醇或丁二醇。12.根据权利要求10或11所述的组合物，其特征在于所述醇是乙醇，而且其按体积计算以至少20%的比例存在于所述水-醇溶剂中。13.根据权利要求9到12中任一个所述的组合物，其特征在于所述第三溶剂选自由氯仿、乙酸乙酯、二乙醚及其混合物组成的组。14.才艮据^又利要求1到8中任一个所述的组合物，其特征在于所述提取物是如一又利要求5到8中任一个所定义的第一提取物。15.才艮据4又利要求1到8中任一个所述的组合物，其特4正在于所述才是取物是如4又利要求10到13中任一个所定义的第二l是取物。16.根据权利要求1到8中任一个所述的组合物，其特征在于所述提取物是如权利要求10到13中任一个所定义的第三提取物。17.根据权利要求1到8中任一个所述的组合物，其特征在于其包含至少一种如权利要求5到13中所定义的第一提耳又物和/或第二才是耳又物和/或第三4是耳又物。18.根据权利要求1到17中任一个所述的组合物，其特征在于基于所述组合物的重量，按重量计算其含有0.003-2%并且优选0.003画0.3%以固体表示的Neochlorisoleoabundans生物质^是取物。19.一种用于制备Neochlorisoleoabundans4是取物的方法，其尤其用于制备如权利要求1到18中任一个所定义的组合物，所述方法的特征在于其包括至少一个用于利用如在4又利要求6到8中之一所定义的第一醇或水-醇溶剂来提耳又所述生物质以产生第一提取物的步骤。20.才艮据4又利要求19所述的方法，其特征在于，其还包括至少一个用于分馏所述第一l是耳又物的步骤。21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，其包括用于在第二水-醇或水:溶剂与第三溶剂之间分配所述第一揭_耳又物的步骤，其中所述第三溶剂与所述第二溶剂是不混溶的而且具有0与4.7之间的极性P'，所述分配产生分别包含在由所述第二溶剂和第三溶剂构成的每个相中的第二和第三提取物。22.4又利要求1到18中^f壬一个所定义的至少一种提耳又物、或者通过权利要求19到21中任一个所述的方法获得的至少一种才是取物的应用，其在化妆品组合物中用作减月巴剂，或者用于制造化妆品组合物。23.—种为了实现减肥效果的人体美容护理方法，其特征在于，其包括将权利要求1到18中任一个所定义的组合物应用于需要其的身体部位。全文摘要本发明涉及一种化妆品组合物，该组合物包括Neochlorisoleoabundans藻的生物质提取物作为活性剂，该活性剂混合入适于局部应用的化妆品用载体中。该提取物有利地是醇或者水-醇提取物，称为第一提取物，其是通过用第一醇或水-醇溶剂处理该生物质而获得的；和/或通过分馏所述第一提取物获得的所述第一提取物的至少一种馏分。本发明进一步涉及一种为了实现减肥效果的美容疗法，其中，将如上述定义的组合物应用于身体的合适部位。文档编号C12N1/14GK101120910SQ200710140618公开日2008年2月13日申请日期2007年8月9日优先权日2006年8月11日发明者伊莎贝尔·雷尼梅尔,塞西尔·拉米,德尔菲娜·杜邦,西尔维·达尔诺申请人:Lvmh研究公司