作为当前新出现的流感病毒株诊断的dna阵列分析的制作方法

专利名称：：作为当前新出现的流感病毒株诊断的dna阵列分析的制作方法作为当前新出现的流感病毒抹诊断的DNA阵列分析非人曱型流感毒抹有可能从其"天然"宿主转移到人类，尽管这并不常见。其中一个例子是，1997年，香港爆发的高致病性禽流感在A^中传播就是由于甲型流感H5N1病毒引起的，当时局部地区发生了H5N1病毒在家禽中的流行。该病毒致使被感染的18个患者当中有6个死亡。0007]每年的曱型流感病毒感染对人类的生命和经济方面都具有重大影响，全世界每年有500,000到1,000,000人死亡，在感染期间由于生产力的直接和间接损失而造成对经济的冲击。曱型流感病毒所经历的自然和改造的基因改变可导致能够在群体中迅速且致命地传播的病毒的出现，这是非常令人担忧的。另一个实施方案涉及标记揮:针，其能够包括流感病毒的一种或多种型或毒林的靶基因的至少部分核酸序列。在某些实例中，所述标记探针能够结合流感病毒的一种或多种型、亚型或毒株的耙基因的至少部分核酸序列。00021本文的一个示例性方法涉及使用本文所公开装置诊断受试者的流感(病毒)。才艮据本方法，本文也涉及诊断受试者的流感病毒感染的严重程度。在一个实例中，从受试者获取样品，将该样品暴露于本文所公开的装置，可评价流感病毒的存在和水平。在某些实施方案中，涉及评价流感病毒的毒抹，根据该评价对受试者进行治疗。还涉及能够在小群体或大群体中使用本文所公开的任何装置，用于评价感染以决定当在群体中爆发流感时最佳的方案，例如对感染群体的检疫或隔离。图3表示从单个保留区中筛选出适当的捕获-标记对的过程的流程图。图5表示FluChip-55TM装置布置图。捕获序列点样在"阳性对照"(PC)列的旁边，一式三份。样品基于基质基因(M)按亚型(HA和NA)或型CA或B)进行分组。图8表示溴化乙锭染色的1%琼脂糖凝胶，显示几种流感样品的PCR产物。所扩增的基因标在右侧，片段大小标在左侧。图9表示显示患者样品获取的曱型流感H3N2病毒的正确分型和分亚型的图像。00034图IOA-IOD表示7M片段序列(表明阳性对照序列(实心符号)和按一式三份点样的捕获序列(空心圓))的一般微阵列(A)的示例布置图。荧光图像显示了(B)H3N3(26个样品)、(C)H1N1(18个样品)和(D)HSN1(8个样品)病毒的典型图案。00035图11A-11D表示15M基因捕获序列(具有阳性对照序列.(实心符号)和按一式三份点样的捕获序列(空心圆))的微阵列的示例布置图，见(A)。荧光图像显示了H3N3(B)、H1N1(C)和H5N1(D)病毒亚型的典型图案。图12A-12C表示对于显示式样而不是在图2中表示的病毒的加亮微阵列式样的荧光图像的示例性方法。(A)是实验室重配病毒，包含来自H3N3病毒的HA和NA以及来自H1N1病毒的内基因，(B)是感染人的猪H3N2病毒，(C)来自禽H9N2病毒。图13A和13B表示使用15M片段探针序列(A)的58个微阵列结果的分层聚类分析(具体见方法部分)的示例性方法。相似的聚类分析见(B),以及来自24个未知患者样品的结果，而后揭示为N3N2和H1N1病毒(全都是甲型流感病毒)。具体实施方式定义00038本文未定义的术语，根据其通常和普通的意义而使用。在一个实例中，"FluChip"装置能够提供个体是否被病毒(例如流感病毒)感染的信息，以及提供该病毒的型和亚型特征。用"FluChip"装置来分析流感病毒的存在大约需要11小时，相比之下用现有技术方法则大约需要4天。该装置只需要针对若干基因的约55个序列。FluChipTM分析的一个具体实施方案采用扩增不止一个基因，也就是M片段、HA片段和NA片段。该申请于2006年1月18日提交，发明名牙尔为"DNAMicroarrayAnalysisasaDiagnosticforCurrentandEmergingStrainsofInfluenzaA"，其全部内容通过？1用结合到本文中用于所有目的。在某些其它的实施方案中，用于检测能指示病毒某毒抹、型和亚型的病毒相关序列的装置，可以包括但不限于微阵列系统、生物传感器系统、凝胶系统、浸渍装置系统、快速才企测试条系统、手提式扫描系统或基于微珠的系统。依据这些实施方案，可鉴别和合成能够与靶蛋白区域(例如多个靶基因片段、本文所公开的M片段序列)的部分核酸或互补核酸序列结合的捕获探针和/或标记探针寡核苷酸。然后，这些寡核苷酸可用于产生阵列系统，适用于分析样品中存在的靶序列。根据这些实施方案，浸渍片、固体表面、凝胶或珠系统，例如具有与浸渍片、固体表面、凝胶或珠系统締合的捕获探针序列，可用于检测指示分析样品中存在的所怀疑病毒的毒林、型或亚型的特定病毒蛋白质序列。认为本发明的任何实施方案中所公开的阵列可包括与固体表面结合或者悬浮于溶液中的阵列。简单地说，在一个实例中，可通过本领域已知方法将阵列与珠子(例如微珠)连接起来。例如，微珠阵列可通过将捕获探针配对的微球(例如直径31im)加栽到化学蚀刻的成像纤维束上来制作。在某些实施方案中，目标样品能够暴露于光导纤维阵列，然后可用第二探针例如标记探针来^r测与所述光导纤维阵列的结合(例如参见www.illumina.com)。另外，流感病毒的单个基因靶可用于产生这些阵列，或者多种微阵列的多基因靶可用于针对流感病毒的基因靶。另一个样品阵列可包括本领域已知的毛细珠阵列(例如参见Kohara等，NucleicAcidsResearch,2002，Vol.30，No.16e870)。其它实例可包括分子信标。分子信标(molecularbeacon)是双标记探针，通常用于实时PCR分析。在一个实例中，流体阵列系统被认为是对于特定的、溶液中未标记的多种检测使用微球体结合的分子信标和流式细胞计数器。在该示例系统中，分子信标可以使用键(例如生物素-链霉抗生物素键)与微球体结合。在某些实例中，采用来源于本文公开的一种或多种靶基因的至少部分核酸或互补核酸的寡核苷酸，不同大小的珠和在一种或多种荧光团颜色、合成对照序列中的分子信标可用于检测样品中存在的流感病毒(例如参见Horejsh等，NucleicAcidsRes.2005;33(2):el3)。试剂盒00061在又一些实施方案中，提出上述方法的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒具有健康应用的点，例如，试剂盒可具有在^:似病毒爆发的地点使用的便携式。在另一个实施方案中，提出病毒(例如致病性或非致病性病毒)检测试剂盒。在另一个实施方案中，提出用于分析来自患有或疑似发生病毒引起的感染的受试者的样品的试剂盒。在一个更具体的实施方案中，提出用于分析来自患有或疑似发生流感病毒引起的感染的受试者的样品的试剂盒。根据该实施方案，所述试剂盒可用于评价病毒的型、亚型或毒4^。。核酸筛选与分离。用于构建核酸的合成方法。如果可能的话，可以运^f亍其它程序作为BioEdit界面内的辅助应用。运用ClustalW(v丄4)进行多序列比对[Thompson等，1994]。用DNADIST(v.3.5cinPHYLIPv.3.6)来创建系统进化初于。用TreeView(Win32,v.1.6.6)[Page,1996]和MEGA3(v.3.0)[Kumar等，20004]来显示和操作系统进化树。除了这些现有程序以外，还编写并执行了许多Python脚本。根据GNU普通公开许可(GNUGeneralPublicLicense)，这些软件可以得自www.colorado.edu/chemistry/RGHP/software/。labd_tree用唯一整数标记.dnd文件(系统进化树)中的每个节点以便于呈现和细分系统进化树。Dnd2fa.将.dnd(或Newick.nwk)文件中的信息转回到含有序列信息的FASTA文件。Fa2fa.允许一个FASTA文件的内容减去另一个文件中的内容，输出含有剩余序列的文件。ConFind.识别特定数据组中的保守区域[Smagala等，2005]。find—oligos.选择所有合适的捕获序列和标记序列，即通过沿保守区反复步查直到满足最小GC含量、解链温度和香农熵(Shannonentropy)的要求。pick—oligos.根据长度、Shannon熵和解链温度，从'find—oligos，列出潜在的捕获和标记探针输出；选择具有最低罚分、而不让寡聚物的核苷酸位置与其它捕获-标记对重叠的寡聚物对。和Atlanta,GA的疾病控制和预防中心(CentersforDiseasesControlandPrevention,CDC)的数据库中，找到大量流感病毒的序列信息。创建用于BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)已鉴定序列的一个数据库，其含有得自EST(ExpressedSequenceTags)数据库的人类基因組序列信息和引起流感样疾病的若干生物体的序列信息。生物体的实例包括但不限于乙型流感病毒、丙型流感病毒、副粘病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、炭疽杆菌(5ac〃/wja"Arac/力、冠状病毒、腺病毒、军团菌(丄egz'o"eZ/awp.)、肺炎衣原体(C/z/am;;&a_p"co"z'<3€)、肺炎支原体(Afyco_p/osw<3p"ewmom'ae)和肺炎链球菌(5Vre/tococcwsp"ewwom'"e)，它们均来自NCBI非冗余凄史才居库(ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/)。各捕获和标记探:针中^f叉上链(topstrand)针对该数据库进行了BLAST。就默认而言，BLAST使用上链和下链(bottomstrand),即序列及其反向互补序列，以在数据库中搜索序列相似性。认为E值低于10000的各个序列是"命中"的，例如能够与非流感序列结合或杂交。一种实验方法00079一种示例性方法涉及用于在微阵列上产生扩增RNA的捕获探针和标记探针的实验方法，此实验方法用于实施例1。简而言之，捕获探针固定在固体基质上并在杂交过程中结合靶RNA。在这个实施例中，捕获的靶能够结合捕获探针，并使用额外的荧光团缀合的寡核苷酸(例如标记探针)检测靶标。在杂交和严格洗涤之后，在基于激光(532nm激发)的荧光扫描器中以5pm分辨率扫描微阵列。—种示例性的方法公开了分析大数据库的有效方法，以便鉴别流感病毒基因组中的保守区。根据这些保守区，选择能够区别不同病毒型和亚型的捕获序列和标记序列。该方法的特点包括使用系统进化树用于数据还原并选择相对少量的捕获探针和标记探针以代表广谱流感病毒。所选序列的详细实验评价见下文。设计用于寡核苦酸微阵列的探针已经成为近来评论的主题[Russell，2003;Tomiuk和Hofmann，2001]，已经开发设计微阵列探针的若干软件工具。例如，OligoWiz[Wernersson和Nielsen,2005;Nielsen等，2003]就是搜索潜在探针的程序，即通过考虑5个不同参数特异性、解链温度、转录物中的位置、复杂性和自我退火的能力。使用者将权重赋予这些参数的每一个并计算总分。程序返回具有最佳得分的寡核苷酸。另外，有其它程序可使用，它们并非特别设计用于微阵列寡聚物选择的，而是用于发现和优化引物，尤其用于大规模测序的目的。对检查一组序列而言是非常类似的现有程序。GPRIME—开始是比对一组序列，用'ambiguityconsensus，在数据组中寻找特定长度的同源区。在Gibbs等(1998)所述的应用中，通过检查冗余值、解链温度(Tm)、空位和可能的二级结构，手工选择同源区。将所选序列与EMBL数据库比较，使用FASTA搜索，检查其对靶基因组的特异性。也概述了鉴别序列区的工具，其中通过计算来自两个数据库的共有序列之间的差异，PCR引物可区分两个亚组的数据。使用从表现出病毒症状的兰花叶片中提取的RNA,测定所选序列启动单独的RT-PCR反应的能力。尽管用于非常有限的数据组、而不用于微阵列应用，但是这些程序带来了选择捕获寡核苷酸用于诊断用途的更系统的方法理念。1000102本文所述的用于有效鉴别捕获和标记对的方法是从一组比对序列开始的。然而，与GPRIME所用的有限数据组不同，该项研究的单个基因特异性数据库含有多达1000个序列以上。用'majorityconsensus.，，发现了满足某些Shannon熵需求的最小长度保守区。本文所述的方法可用于设计阵列探针以及PCR实验的引物。在数据组上进行多序列比对。用FAST算法，bootstraps=1000和ktuple=4,进行多重比对。另外，创建了邻接系统进化树。然而，用最大似然法或简约(parsimony)方法可创建更严格的系统进化树，选择邻接算法是因为数据库规模大，使用更严格方法所需要的计算时间长。人为地对系统进化树的节点编号，有助于后来将系统进化树分开。内部编写了保守区FINDer(称为'ConFind，，图2步骤4)并按BioEdit中的'FindConservedRegions，选项来建模。在别处可找到对这一可得软件的充分描述[Smagala等，2005]。BioEdit中的'FindConservedRegions，需要所有序列都含有涵盖特定核普酸范围的数据。简而言之，编写'ConFind，，使保守区可以被找到，甚至当所包括的序列一部分在某些位置上含有序列信息时。来测定)，以及介于30-70%的GC含量。因为每个序列的长度范围为16-25nt，所以针对各开始点可以找到不同长度的若干配对。如果发现若干配对的话，则选择最高保守性的配对(即具有最低的最大Shannon熵分值的配对)。如果若干潜在的捕获-标记对仍留在其开始位置，则选择最长的一个(图3步骤2)。编写额外程序'pick—oligos'，按照以下原则将已鉴别的可能的捕获-标记对分类(图3步骤3)。对于流感微阵列，根据种系发生信息，每个基因特异性数据库在再细分，因为在种系发生信息和抗原性之间存在联系。作为一个例子，曱型流感病毒的NA基因的N1亚型的进化树的分解见图4。在这个例子中，使用寻找保守序列部分中描述的参数，对于完整的499个N1序列组而言，未找到保守区域。目测系统树表明，合理分解成4个较小亚组，再分别分析它们。亚组A由16个序列组成，它们全都是H1N1亚型，大多数是在1950年之前在人群中传播的毒抹。表2:原始流感序列数据库和来自使用所述保守区域和序列选择方法的结果的描述<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>「年份表示所包括的最早年份，其中"所有"表示分析中包括所有可用年份的序列流感的全球监测对于改善疾病管理是至关重要的，而且对降低流感大流行的影响尤为重要。提高监测需要能够提供详细的流感病毒林分析的快速有力而便宜的分析技术。对流感具有高度多元"识别标志，，的低密度寡核苷酸微阵列，具有许多有利特征。然而，流感病毒的高度突变型对于设计而言是个挑战。在一个示例性的72个流感分离物的盲试研究中，将来自各种曱型流感病毒和乙型流感病毒的RNA扩增、杂交、荧光标记并成像。全部分析时间不到12小时。从两次检测的综合结果看，其中平均71%的分离物得到了分型和分亚型，13%得到了正确的型和部分亚型信息，仅有10%得到正确的型，5%假阴性和1°/(^￡阳性。对于~95%的分离物而言的总体检测提供了正确的型和/或亚型信息。在绝大多数情况下，当观察到不完全亚型时，失败是因为RNA扩增步骤，而不是微阵列的限制。用于扩增模板RNA的引物序列和条件的优化是本领域众所周知的，是本领域技术人员的常规实验。在某些方法中，多元就是DNA微阵列技术能够提供同时筛选上千个不同核酸序列的方法。DNA微阵列使用固体表面固定化的、能与靶基因片段结合的寡核苷酸(捕获探针)。使用更长的捕获探针能够检测大范围的遗传多样性序列，因为长序列具有更高的错配容许量。已经提出，基于更短的捕获序列的寡核普酸阵列是获取更大特异性并区分类似遗传序列的方法。,设计出低密度微阵列，以便使用小的一组捕获序列和标记序列(55，"FluChip誦55TM"装置)，用于3种重要的曱型流感病毒和某些乙型流感病毒的亚型分析。本文描述了完全盲试的微阵列结果。该项工作的独特方面包括微阵列设计，使用靶RNA而不是DNA,以及用于测试微阵列的大范围的病毒。用CDC提供的72个未知样品进行盲试。样品含有来自若干物种的近期流感病毒分离物的RNA,包括人、禽、马、犬和猪。另外，在微阵列中测定了先前表现出流感阳性、但没有提供亚型信息的9个患者样品。盲试研究结果对于目测鉴別结合的序列而言，相关荧光信号强度的变化反映了病毒RNA被捕获和标记的程度。也观察到了与给定亚型结合的寡核苷酸的模式差异。例如，比较H1N1病毒(图6A)和H5N1病毒(图6C)的Nl捕获序列的结合，显示出单个亚型的模式可变性。在Nl方框区，序列1、6和7结合H1N1，而5、7和9结合H5N1病毒。对此寄予希望，因为设计微阵列序列选择算法，以选择与系统树给定"分枝"匹配的捕勤标记探针对。通常，对于特定基因特异性亚型(例如N1)而言，系统树的分叉，产生对宿主物种或病毒亚型(例如禽H5N1以及通常来自人H1N1病毒的单独分枝中存在的N1序列)具有特异性的分枝。因此，正的赋值只需要一次命中或结合设计用于特定基因(例如MP、H或N)的指定组的序列。任何错误赋值(例如如果命中或结合赋予Nl和N2两者)都列为假阳性，即使可得到某种程度的正确信息。另一个例子是样品El，其中对HA亚型进行了正确鉴别，但NA亚型却"缺失(missed)"。大量扩增了MP基因，可以看到对应于HA基因的模糊条带，但是没有看到NA的可辨识产物。这一趋势的一个例外就是样品C9(A/H3N8病毒)，其中显示出HA产物，但没有从微阵列图像分析中进行H亚型鉴别。在这种情况下，明显扩增了HA,但没有成功地与微阵列杂交。杂交失败的可能原因如下所讨论。通过统计缺失的捕获/标记探针(如上详述)和缺失的RNA，评价了微阵列结果(独立于扩增步骤)。矫正的微阵列结果的汇总见图7C和图7D。在这种情况下，显然，微阵列本身给高达98%的样品提供完全和准确的信息。总的来说，假阳性率约为1%，与本领域已知的许多其它诊断用流感试验的表现相近或小于后者。设计寡核苦酸阵列的问题是尽管较短寡聚物因降低错配容许量而增加特异性，但是捕获溶液中的类似寡核苷酸的概率却增加了。然而，通过将流感RNA与结合在表面的捕获探针和溶液中的标记杂交，得到额外水平的选择性。因此，与先前类似的寡核苷酸阵列相比，使用两步杂交流程可有助于减少假阳性命中数量。000137假阴性分析。从72个未知样品的两项研究中，完整的检测得到的平均假阴性信号为4.0%。假阴性之所以产生是因为捕获和/或标记探针与靶RNA间的序列互补性差或者非理想的RNA的易接近性。假定单链RNA高度结构特性，与微阵列捕获序列和标记序列杂交差，可导致缺乏易接近性或非理想性断裂。已有记录表明，RNA二级结构可导致不均匀断裂，当使用化学断裂试剂时。所用的碱催化的RNA断裂方法可能在这样的位置上优先切割病毒RNA:所述位置在某些基因组区将会阻碍捕获探针和标记探针的相互作用，因此阻碍了微阵列上的捕获和/或检测。尽管进行断裂是为了简化RNA的结构特点[Small等，2001],但是长度为38-150nt的RNA仍然具有重要结构[Mehlmann等，2005〗。000138为了评价这种可能性，一个示例性方法用于用计算才几预测断裂RNA的可能结构(数据未显示，MFold参见Mathews等，1999;Zuker，2003)。将对应于捕勤标记杂交位点的病毒RNA区(平均长度为37-50nt)连续延长10个核苦酸的增量，两端各加5nt，直到最大长度为100个核苷酸。自我締合片段的Tm当作微阵列上的命中和阴性。预期分子内Tm高的自我締合片段更少与捕获/标记探针杂交，因此产生更弱的命中，而分子内Tm低的片段更多杂交，产生更强的命中。然而，没有观察到直接关系，表明序列错配，而且没有RNA易接近性在假阴性结果中是主要因素。尽管假阴性的总体比例低(~4%),但是在序列选择和覆盖方面的改善应当会进一步增加正确赋值。在另一个实施例中，在盲试研究期间筒单目测图4象显示，少数病毒分离物产生M片段微阵列识别标志，明显偏离图10所示的典型模式。这表明，一个"odd"识别标志源自已经感染人的猪H3N2病毒。观察到实验室重配病毒的另一个非典型性识别标志。7个M片段序列的微阵列识别标志指示H1N1病毒，而HA和NA序列指示H3N2病毒。这表明，病毒含有来自H3N2病毒的HA和NA基因以及来自A/PuertoRico/8/1934(H1N1)的内在基因。在这些实施例中，仅用设计靶向高度保守基因片段的7个序列，出乎意料地进行了亚型鉴别。这些结果促使更充分地检查M片段鉴别和流感的亚型鉴别。选择大量额外M片段探针序列，来扩大模式识别能力(Mehlmann，M.等，FluChipTM:robustsequenceselectionmethodforadiagnosticmicroarray./C7/".Mz'cra&o/.(2006)，通过引用全部结合到本文中用于所有目的)。在另一个示例性方法中，所用的序列选择方法是独特的，因为它识别类似流感病毒大家族内的保守区。然后根据保守区来设计合适的探针序列(捕获和标记)(参见方法部分)。选择探针序列，得到对所有病毒亚型都具有的广泛反应性或者对指定病毒亚型或宿主物种具有的高度特异的反应性。通过评价可能的探针序列与用于设计它们的数据库中所有序列之间的错配数，用计算机来测定预期反应性。000155在一个实施例中，从曱型流感M片段中选出15个寡核苷酸探针序列，用作MChipTM的基础(参见表4的序列表)。得自CDC的58个曱型流感病毒分离物用于测定微阵列的表现，因为分离物代表各种亚型，包括H1N1(18)、H3N2(26)和H5N1(8),其中圆括号中的数字就是用于测定给定亚型的分离物数目。对所有58个测试样品，成功扩增M基因片段，所有这些样品在《鼓阵列上都产生阳性焚光信号(图像见图10，相对强度值见表6)。用多重PCR进行的先前研究表明，未能扩增的一个或多个基因在阵列上产生假阴性，这表明扩增过程失败、而非反映出微阵列的表现(Townsend，M.B.等，FluChip(TM):experimentalevaluationofadiagnosticinfluenzamicroarray./C7/".M/cra&o/.提交(2006)，通过引用全部结合到本文中用于所有目的)。使用单个基因扩增看来消除了所有这些假阴性结果。实施例4在一个实施例中，图13说明了除了一个人H1N1病毒之外的所有(浅灰色)都存在于同一聚类中，它们也类似于H1N1疫苗抹。另外，人H3N2(浅灰色线)病毒在系统树图中看来关系密切。所测的两个马H3N8(黑线)病毒出现在人H3N2病毒中成为一对。它们与H3N2病毒的相似性可能象征相似的病毒来源，但是在所测的有限数量的H3N8病毒中难以充分评价这一点。图12A和12B所讨论的H3N2/H1N1实验室重配抹和猪H3N2病毒也与其它H3N2病毒构成松散的聚类，但是看来组外(out-grouped)作为一对，与主要人H3N2分枝很不同。如图12所示，仅使用7个探针序列的原始分析表明重配病毒的信号模式落入含有H1N1病毒的聚类中。在此，使用额外探针序列提供额外模式区另'j,重配病毒含有来自1934年的病毒的H1N1M片段明显在组外。神经网络A/H5N1病毒的MChip验证。为了进一步研究MChip正确识别快速新出现的亚型的潜力，对从大量的A/H5N1病毒提取的RNA进行额外的分析。检测了34个不同的A/H5N1样品，它们代表2003-2006年间的人、猫和各种鸟感染的病毒，以及来自不同的地理位置，包括越南、印度尼西亚、尼日利亚和哈萨克斯坦。来自87个独立的微阵列测试的结果代表流感、4个流感样疾病(ILI),和若干阴性对照的结果归纳在表8。微阵列和试验的灵敏度为95°/。，特异性为100%。<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>表3.用于流感病毒鉴定的捕获、标记和把序列标记寡聚物寡聚物名称开始结束捕获区域区域开始结束TCAAAGACA"N1-526526A-N1-欲挑829A"N1-952952ArN1-966舰562629860991CCATACAA丁TCAAGGTAGTCAGTTGC丌GGTCATTG526GAATTOGAATTTCTGGCCAGACAATGGGGCTGT593GATGCACCTAATTCTCCTACGAGGAATGTTC826TATATGCAGTGGAGTTTTGAGTATCAAATAGGATCGGAG9288ATACATCTGCAGTGGATGTTCGGTGACAATCC950GGAGCGGTTTTGAAATGA-N1-110711071146CAAAAGCACTAGTTCCATTTGG10995726478761001itm"484174GATAATAACAATTGGCCCGTCTCTCTAAOCATT30106249679A-N2"8幼866A^N2-953953A-N2-1178ArN2-1240113811781240加568712901娜"7212化1272GAMTATGCCCCMACAGCAGAATACAGAMTTG240CATGGTCCAGCTCAAG534CTCAGGAGTCAGAATG675CAAACAAGTGTGCATACTCAAAATATCCTCAGACTCGATATCCTGGTGTCTAGCATTGTTTCCAGTTATGTGTGCAGGTTATGAGACTTTCACCTAACTCCAMTTOCAGGATGTGTCTGCAGAGA864TCAGGACTT(3丌GGAGAC943GAGTCATTGGTGGTTGG1122TAAATAGOCAAGTCATAGTTG1178ATTCTGGTATTTTCTCGTTGAAGGCAAAAGCT1232激580722鄉1008117412221280AGATGAGTCTTCTMCA^MP-242457CAGGTCGAAACGTAOGT22TGGCTAAAGACAAGAA-MP"15S158192CCATCCTGTCACCTCTGA1522072092"TTTGTGTTCACGCTCACGTGCCCAGTGAGCGAW270AAACT"TAAGAGGGAGTTCCATGGGGCCAAAGAArMP~329329細ATAACAAT323372A"MP匿547547579ACATGAGAACAGAATGTTT丁GGCCAGCACTAC536585ATTTATCGTCGCCTTACGGTTTGAAAAGAGGGCA"MP~865865903MTCT850938919CCTGAGTCTATGAGGATCGAAAGGAACAGCAG961GAAGAAAATG粉8鹏B"HA>106106138CCAACAAAATCTCATTTGCAAATCTCAAAGGA97164B"HA-503503535CAGCAACAAATTCATTACAATAGAAGTACCAT478567BHA"613613645rATGGAGACTCAM7"CTCAMAG7TCACCTCA597647保守区AGACAGGA^CCCCTATAGAACTTTAATGACCATACAATTCAAGGTTTGAGTCDGTTGCTTGGTCAGCRAGTGCTTGTOACAATTCJGAATTTCTGGCCCAGACARTGG加CTOTGQCTGTATTGAAATACAA7TGRATGCACCTAATTCTCACTAYGAGGAATGTTCCTGTTACCCTGATACCTGGGTATCTTTCAATCAAAATTTGGAGTATCAAATASGATATATATGCAGTGGAGTTTTCGGAGACAATCCACGTGGATTATCAAATAGGATACATCTGCAGTGGRGTGTTCGGTGACAATCCGCGTCCCAAAGATGGAGGGAGAACCAAAAGCACTAGTTCYAGGAGCGGTTTTGAAATGATTTGGGACCAAATCAGAAGATAATAACAATTGGYTCHRTCTCTCTAACCATTGCAACAGTATGTTTCCTYATGCAGATTGCCATATAGAGAAG6AAATATGCCCCAAACTAGCAGAATACAGAAATTGGTCAAAGCCGCMTGTACCAAACAAGT6TGCATRGCATGC3TCCAGCTCAAGCTGCCATGATGGTGGTCYCAAAATATCCTCA(SAACTCAG6AGTCAGAATGYGTTTGCATCTATCCTCGATATCCT加TGTCAGATGTGTCTGCAGAGACAACTGGAAAGGCTCCAATAGGCCCATTAAAGGATTATAGCATTOTTTCCA(JTTATGTC5TGCTCAGGACTTGTTGGAGACACACCCAGAAAAAAGCAAGGA丁TCACGCTCAGGTTAT(SARACTTTCAGRGTCATTGGTGGTTGGACMCTAAYTCCAAATTGCW5AYAAATAGGCAAGTCATAGTTGACAGGTCCGGTTATTCTGGTATTTTCTCYOTTGAAGGCAAAAGCTGCATCAATAAAGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCRTCCCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTRGGGGGATnTAGGKTTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCARAAT~ATAGAAAACTTAAGAGGGAGATAACRTTCCATGGGGCCAAAGAAATAGCCCATTAATAARACATGAGAACAGRATGGTTTTGGCCAGCACTACAGCTAACmrrCTTCAAATGYATTTATCGTC(3CCTTAAATAC加TTTGAAAAGAGGGCCTTCTACGGAAGGRRTGCCrGAGTCTATGAGGGAAGAGGGCCTTCTACGGAAGGAGTACCTGAGTCTATGAGGGAAGAATATCGAAAGGAACAGCAGAATGCTGTGGATGCTGACGACAGTCATTTTGTCAGCATAGAGACMCAACACCAACAAAATCTCATTTTGCAAATCTCAAAGGAACAAAGACCAGAGGGAAACTATGCCCGTCCCAAAAAACGAMAACAACAAAACAGCAACAAATTCATTAACAATAGAAGTACCATACAT丌GTACAGAAGGAGAAGACCAAATTACCCCAAATGAAAAACCTCTATGGA6ACTCAAATCCYCAAAAGTTCACCTCRTC表3.用于流感病毒鉴定的捕获、标记和把序列寡聚物寡聚物<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>表4:用于辆究的M基因片段探针序列<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>表5:15个MChip捕获和标记探针对与用于序列选择的M基因序列数据库的反应性(sw-猪，eq-马，11=人，av=*)<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>*宿主物种用下列缩写词表示h-人，av-禽，sw-猪，eq-马，can-犬表6:58个患者分离物和9个未知样品的微阵列信号的相对强度<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>表7.使用人工神经网络(ANN)对53个样品进行曱型流感亚型的测定。每个ANN输出指定分值在0-1的范围之内。样品按顺序编号，大于0.75的任何指定赋值突出显示。检查标志表示正确的病毒型、亚型或阴性，X表示不正确的指定。<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>科罗4立多公共卫生和环境部(ColoradoDepartmentofPublicHealthandEnvironment,CDPHE)通过免疫荧光测定鉴别HA部分亚型；完整的抗原性表征由疾病控制中心(CDC)提供；样品47-53是流感样疾病，包括阴性对照SARS(严重急性呼吸综合j正，severeacuterespiratorysyndrome),hMPV(人间质肺炎病毒'humanmetapneunovirus)、RSV(呼吸道合胞病毒)，hPIV3(人类副流感病毒3型)<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>根据本公开，本文所公开和要求保护的所有组合物、方法和装置无需过多的实验就可以做出和实施。尽管通过优选的实施方案对所述组合物、方法和装置作了说明，但是，对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不偏离本发明的构思、精神和范围的前提下，可以对所述组合物、方法和装置以及本文所述方法的步骤或步骤的顺序进行^修改。更具体地讲，某些化学和生理相关的试剂可以替换本文所述的试剂，而得到相同或相似的结果，是显而易见的。所有这样的的类似替换和修改，只要对本领域技术人员来说是显而易见的，都视为落入所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和构思之内。权利要求1.一种阵列，其包括多个含有寡核苷酸的捕获探针，其中所述捕获探针能够结合包括一种或多种流感病毒的靶基因的至少部分核酸序列或互补核酸序列的寡核苷酸。2.如权利要求1所述的阵列，其中所述捕获探针能够结合一种或多种型的流感病毒。3.如权利要求1所述的阵列，其中所述捕获探针能够结合一种或多种曱型流感病毒的亚型或毒抹。4.如权利要求1所述的阵列，其中所述多个捕获探针与固体基质的表面结合。5.如权利要求4所述的阵列，其中所述阵列含有100个以下的能与固体基质表面结合的捕获探针。6.如权利要求4所述的阵列，其中所述固体基质选自玻璃、塑料、硅涂敷基质、大分子涂敷基质、颗粒、珠、微粒、微珠、浸渍片、磁珠、顺石兹珠及其组合。7.如权利要求4所述的阵列，还包括与固体基质表面结合的阳性对照探针，其中所述阳性对照探针能够指示足以使捕获探针与寡核苷酸结合形成复合物的条件，所述寡核苷酸包括靶基因的至少部分核酸序列或互补核酸序列。8.如权利要求l所述的阵列，其中所述阵列是微阵列。9.如权利要求8所述的阵列，其中所述微阵列是来源于不止一个耙基因的多种特征性阵列。10.如权利要求l所述的阵列，其中所述捕获探针能够结合流感病毒林，该流感病毒林选自曱型流感病毒H3N2、曱型流感病毒H1N1、曱型流感病毒H5N1、曱型流感病毒H7N7、甲型流感病毒H9N2、曱型流感病毒H3N8、曱型流感病毒H1N2、甲型流感病毒H3N3、曱型流感病毒H3及其組合。11.如权利要求1所述的阵列，其中所述包括至少部分核酸序列或互补核酸序列的寡核芬酸来源于单个靶基因片段。12.如权利要求1所述的阵列，其中所述捕获探针选自表3、表4中所列出的序列或其组合。13.如权利要求l所述的阵列，其中每个捕获探针的长度独立地是约10个至约100个核苷酸。14.一种制作用于检测流感病毒存在的阵列的方法，其包括将多个捕获4笨针与固体基质表面连接以形成阵列，其中所述捕获探针能够结合包括一种或多种流感病毒的靶基因的至少部分核酸序列或互补核酸序列的寡核苷酸。15.如权利要求14所述的方法，其中所述捕获探针能够结合一种或多种型的流感病毒。16.如权利要求14所示的方法，其中所述捕获探针能够结合一种或多种甲型流感病毒的亚型或毒林。17.如权利要求14所述的方法，还包括阳性对照探针与固体基质表面的结合，其中所述阳性对照探针能够指示足以使捕获纟笨针与寡核香酸结合形成复合物的条件，所述寡核苷酸包括把基因的至少部分核酸序列或互补核酸序列。18.如权利要求14所述的方法，其中所述捕获探针能够结合包括靶基因的至少部分核酸序列或互补核酸序列的寡核苷酸，所述靶基因选自血凝素(HA基因片段)、神经氨酸酶(NA基因片段)、基质蛋白(M基因片段)及其组合。19.如权利要求14所述的方法，其中所述捕获探针能够结合包括M基因片^R的至少部分核酸序列或互补核酸序列的寡核苷酸。20.—种检测样品中流感病毒的方法，该方法包括a)使样品与阵列中的多个捕获探针接触以产生测试阵歹。,其中当所述样品含有寡核苷酸且所述寡核苷酸包括一种或多种流感病毒的靶基因的至少部分核酸序列或互补核酸序列时，所述测试阵列包括捕获探针-样品复合物；和b)使所述测试阵列与一个或多个检测探针接触以产生被标记的阵列，其中当所述测试阵列包括捕获探针-样品复合物时，所述被标记的阵列包括靶-探针复合物，且其中所述靶-探针复合物的存在表明样品中存在流感病毒。21.如权利要求20所述的方法，其中所述阵列包括多个捕获探针，该捕获探针包括流感病毒的至少一种型、亚型或毒抹的一个或多个靶基因的至少部分核酸序列或互补核酸序列。22.如权利要求20所述的方法，其中通过检测由耙4果针复合物中的探针产生的信号来确定样品中流感病毒的存在。23.如权利要求22所述的方法，其中由所述靶4笨针复合物产生的信号根据样品中存在的流感病毒的型、亚型或毒抹而形成不同的样式。24.如权利要求20所述的方法，其中所述捕获探针能够结合一种或多种型的流感病毒。25.如权利要求20所述的方法，其中所述捕获探针能够结合一种或多种曱型流感病毒的亚型或毒林。26.如权利要求20所述的方法，还包括与固体基质表面结合的阳性对照探针，其中所述阳性对照探针能够指示足以使捕获探针与寡核苷酸结合形成复合物的条件，所述寡核芬酸包括耙基因的至少部分核酸序列或互补核酸序列。27.如权利要求20所述的方法，还包括与固体基质表面结合的阴性对照探针，其中所述阴性对照探针能够指示足以显示捕获标记探针与流感病毒结合而不与阴性对照探针结合的特异性的条件。28.如权利要求20所述的方法，其中所述靶基因选自血凝素(HA基因片段)、神经氨酸酶(NA基因片段)、基质蛋白(M基因片段)及其组合。29.如权利要求20所述的方法，其中所述样品选自鼻咽冲洗液、咳吐物、目艮拭子、呼吸道拭子、咽喉拭子、鼻拭子、鼻粘液、气管吸出物、支气管肺泡灌洗液、粘液、血液、尿液、组织、唾液、空气样品、空气过滤器样品、表面相关样品及其组合。30.如权利要求20所述的方法，还包括在12小时以内鉴定样品中流感病毒的存在。31.—种阵列，其包括多个含有寡核苷酸的捕获4果针，其中所述捕获探针能够结合包括一种或多种流感病毒的单个靶基因片段的至少部分核酸序列或互补核酸序列的寡核苷酸。32.如权利要求31所述的阵列，其中所述捕获探针能够结合一种或多种型的流感病毒。33.如权利要求31所述的阵列，其中所述捕获探针能够结合一种或多种曱型流感病毒的亚型或毒林。34.如权利要求31所述的阵列，其中所述捕获探针能够结合包括M基因的至少部分核酸序列或互补核酸序列的寡核苷酸。35.如权利要求31所述的方法，其中所述单个靶基因片段的所述部分核酸序列或互补核酸序列包括流感病毒的型、亚型或毒林的保守序列区域。36.—种试剂盒，其包括(a)与固体基质表面结合的多个捕获探针的阵列，其中所述捕获探针能够结合包括一种或多种流感病毒的靶基因的至少部分核酸序列或互补核酸序列的寡核苷酸；和(b)—个或多个加标记的标记4笨针，其中所述加标记的标记探针能够产生信号，且其中所述标记探针能够结合包括一种或多种流感病毒的耙基因的至少部分核酸序列或互补核酸序列的寡核苷酸。37.如权利要求36所述的试剂盒，还包括与所述固体基质表面结合的阳性对照探针，其中所述阳性对照探针能够指示足以使捕获探针与寡核苷酸结合形成复合物的条件，所述寡核苷酸包括靶基因的至少部分核酸序列或互补核酸序列。全文摘要本发明的实施方案提供了用于检测和/或诊断病毒的型、亚型和/或毒株的方法、组合物和装置。在具体实施方案中，所述病毒是流感病毒。所述装置包括附着有捕获探针的微阵列，该被设计为能够结合寡核苷酸的微阵列能够结合大范围的流感病毒的型、亚型或毒株中的一个或多个靶基因的至少部分核酸序列。所述组合物可包括用于诊断和/或检测流感病毒的作为捕获探针、靶序列和/或加标记的标记探针的分离的核酸。文档编号C12P19/34GK101405400SQ200780009707公开日2009年4月8日申请日期2007年1月18日优先权日2006年1月18日发明者C·B·史密斯,C·L·穆尔,D·梅尔曼,E·道森,J·斯马加拉,K·L·劳伦,M·梅尔曼,M·汤森,N·科克斯,R·库奇塔申请人:科罗拉多州大学评议会