专利名称：用于显微系统的图象处理方法
技术领域：
本申请整体上涉及图象处理方法，其被用于进行自动显微 分析，以进行遗传特征的荧光原位杂交(FISH)检测。
相关技术的描述 通常，传统的光学显微镜采用显微玻片，其上的正常人染 色体套由性染色体(指定为X和Y)和22种常染色体(编号为1~22) 构成。据估计，在IO个人合子中最少有1个具有染色体异常。 一般而 言，异常的性染色体数目不是致命的，尽管能够导致不育。相反，异 常的常染色体数目典型地导致早期死亡。在活产的婴儿中所发现的三 种常染色体三体性中(21、 18和13三体性)，只有具有21三体性的个 体(通常被称作唐氏综合症)能够存活过婴儿期。 尽管在出生后能够容易诊断唐氏综合症，但产前诊断是有 问题的。目前为止，胎儿细胞的核型分析仍然是被确认的方法用于诊 断唐氏综合症以及其他与染色体数目和/或排列有关的遗传异常。这些 遗传异常包括例如染色体添加、缺失、扩增、异位和重排。这些异常 的评定是相对于健康个体(即具有上述正常人染色体套和排列的个体) 的染色体做出的。 遗传异常包括上述三体性例如唐氏综合症以及单体性和 二体性。遗传异常还包括添加和/或缺失整个染色体和/或染色体体节。 已经报道，诸如这些的变化存在于许多恶性肿瘤中。因此，染色体数 目和/或分布的异常(例如重排、易位)代表了智力迟钝和畸形综合症 (du Manoir等人，Human Genetics 90(6): 590-610 (1993)),以及可能肿瘤生成的主要原因。还参见例如(Harrison's Principles of Internal Medicine,第12版，ed. Wilson等人，McGmw Hill, N.Y., N.Y., pp. 24-46 (1991)),获得已经被绘制到具体染色体上的人类遗传病的部分列表， 特别是X染色体相关紊乱的列表。考虑到与染色体异常相关的遗传紊 乱的数目越来越多，已经报道了许多关于开发用于遗传异常检验的简 单、精确、自动检验的各种努力。 通常，核型分析用于诊断遗传异常，所述遗传异常基于个 体核酸的添加、缺失、扩增、易位和重排。"核型"是指个体的染色体的 数目和结构。典型地，个体的核型是通过例如培养个体的外周血淋巴 细胞直到发生活跃的细胞增殖，制备单个正增殖的(例如中期，以及 可能间期)细胞用于染色体可视化，将细胞固定到固体支持物上，并 将所固定的细胞进行原位杂交以特异性地使个体染色体的不连续部分 特异性地可视化。 样品含有至少一种耙核酸，该耙核酸的分布是遗传异常的 指示。"分布"的意思是存在，不存在，相对量和/或在已知包含靶核酸 的一种或者更多种核酸(例如染色体)中的相对定位。在特别优选的 实施方式中，把核酸是21三体性的指示，因此，该方法可以用于诊断 唐氏综合症。在特别优选的实施方式中，期冀用于唐氏综合症分析的 样品来自母体外周血。更特别的，根据标准程序从外周血分离淋巴细 胞，将细胞附着到固体支持物上(例如，通过离心到载玻片上)，并根 据标准程序固定到其上(参见，例如实施例)以能够检测靶核酸。 核酸杂交技术是基于碱基对的单链寡核苷酸探针与互补 核酸链即杂交的能力。核酸探针被标记荧光团(即在被特定波长的光 激发时会发出荧光的荧光标签或标记)的荧光原位杂交("FISH")技 术代表了分析染色体异常的数目以及结构异常的有力工具。
该方法包括将固定的细胞与被标记第 一 荧光团用于通过组织化学 染色对细胞进行核型分析的抗体接触，接着将固定的细胞与被标记第 二荧光团用于对细胞进行核型分析的DNA探针接触。所述第一和第二 荧光团在相互不同的波长下发出荧光，这样能够对同一固定的样品进 行表型和遗传分析。 焚光原位杂交是指一种核酸杂交技术，其采用荧光团标记 的探针用于特异地杂交耙核酸，进而促进耙核酸的可视化。这些方法是本领域技术人员公知的，并且^^皮公开在例如美国专利No. 5,225,326、 美国专利申请No. 07/668,751、 PCT WO 94/02646中,通过参照将其全 部内容并入本文。通常，原位杂交可以用于测定在单细胞水平上核酸 在含有核酸的样品中的分布，例如组织。这些技术已经被用于核型分 析应用，以及用于检测细胞中所包含的特异性基因的存在、不存在和/ 或排列。然而，对于核型分析，样品中的细胞典型地被允许增殖直到 中期(或间期)以在将细胞附着到固体支持物上进行原位杂交反应之 前获得"中期-伸展(metaphase spread )"。简言之，荧光原位杂交包括将样品固定到固体支持物上， 并通过将样品与含有至少沉淀剂和/或交联剂的培养基接触而保持其所 包含的组分的结构完整性。可用于"固定"样品的示范性试剂是本领域技 术人员公知的，并且被描迷在例如上述专利和/或专利申请中。 在荧光显微镜中使用的 一种荧光染料是DAPI或4，，6-联脒 -2-苯基p引哚[CAS号[28718-90-3]]， 一种与DNA强烈结合的荧光染 料。因为DAPI会通过完整的细胞膜，因此，其可以用于对活细胞和经 固定的细胞进行染色。DAPI被紫外线激发。在结合到双链DNA时， 其最大吸收可以是大约358nm,其最大发射可以是大约461nm。 DAPI 还会结合RNA,尽管不是作为强荧光剂。在结合到RNA时，其发射 变换成大约400nm。 DAPI的蓝色发射光对于希望在单种样品中使用多 种荧光染色的使用显微镜的技术人员是便利的。几乎没有荧光重叠， 例如在DAPI和绿色荧光分子如荧光团和绿色荧光蛋白(GFP)，或者 红色荧光染料如Texas Red之间。使用其他荧光染料用于检测其他生物 结构。 在原位杂交(FISH)中使用其他类型的焚光材料。FISH 方法使用焚光标签检测染色体结构。这些标签可以针对特异的染色体， 和特异的染色体区域。这些技术可以用于鉴定染色体异常和基因作图。 例如，针对染色体21的FISH探针允许人们鉴定作为唐氏综合症的病 因的具有21三体性的细胞，即存在一条额外染色体21的细胞。包含 多颜色DNA探针的FISH试剂盒是商业上可以利用的。例如，Abbott Laboratories的Vysis分支所销售的AneuVysion Multicolor DNA Probe
(FISH),体外诊断测试羊水样品中的染色体13、 18、 21、 X和Y的异常。AneuVysion Assay (CEP 18, X, Y-a卫星，LSI 13和21) Multi-color Probe Panel使用CEP 18/X/Y探针用于检测染色体18着丝 粒区域中的a卫星序列，X和Y和LSI 13/21探针用于检测13ql4区域 以及21q22.13至21q22.2区域。AneuVysion试剂盒可以用于鉴定和计 数染色体13、 18、 21、 X和Y,其通过在从被推测高风险怀孕的对象 的羊水中所获得的中期细胞和间期细胞核中的荧光原位杂交。标签所
性。^ ; 、 、 、 ' ' ^ 以类似的风才各，Abbott Laboratories的Vysis分支的 UroVysion⑧试剂盒被设计为通过检测染色体3、 7、 17的非整倍性以及 9p21基因座的丧失检测与膀胱癌的产生和进展相关的染色体异常，其 通过在来自具有血尿怀疑患有膀胱癌的人的尿液样品中进行荧光原位 杂交。UroVysion试剂盒由与染色体3、 7、 9和17上特异性区域同源 的DNA探针序列的四色、四探针混合物构成。UroVysion探针混合物 由染色体计数才果针(CEP) CEP 3 SpectmmRed 、 CEP 7 SpectrumGreen、 CEP 17 SpectmmAqua和基因座特异性标识剂(LSI 9p21) SpectrumGold 构成。尽管上面描述了开发用于诊断遗传异常的免疫原位杂交 方法中的进展，但荧光团标记的样品的分析仍然是劳动密集型的，并 且包含了显著水平的主观性。对于遗传异常的产前诊断，这是特别真 实的，其中在所述产前诊断中，进行遗传异常评估之前，胎儿细胞必 须要从母体细胞分离，或者可视化与其区分开。因此，例如实验室技 术员必须手工制备并依次对样品进行染色(首先使用组织化学染色以 对细胞进行表型分析，接着使用杂交探针对细胞进行基因型分析)；在 光学—见野中从其他细胞中可视化选择胎儿细胞(例如，使用上述组织 化学染色程序)；评估归结于与荧光团标签探针的杂交的荧光颜色分 布；以及将可视化观察的分布与在含有正常人染色体套的对照样品中
所观察到的进行比较。容易清楚的是，上述程序是相当耗费时间的。 而且，因为结果是可视化观察的，因此，错误结果的频率会在每次实 验之间以及每个观察者之间变化。 在共有的美国专利6,221,607"遗传异常的自动荧光原位杂 交检测"中所公开的发明中公开了 一种计算机执行的方法，用于确定遗传异常，例如21三体性，其排除了对经选择性染色的染色体的主观分 析。更具体的，该专利提供了一种方法用于检测是否在所固定的含有 至少一种靶核酸的样品中存在遗传异常。该方法可以用于诊断遗传异 常，其与染色体数目和/或排列的异常有关，例如染色体添加、缺失、 扩增、易位和重排。
发明概述 公开了发挥各种图象处理功能的实施方式，其可以用于执 行自动荧光原位杂交方法。这些实施方式包括自动曝光方法，用于可 接受地对样品的强度范围超出数字电子设备动态范围的所有区域进行 成像；用于对计数的所关注对象进行荧光原位杂交(FISH)的方法， 其对样品中的靶进行定位；细胞核(nuclei)鉴定，其是区分和表征所 计数所关注的对象的方法；对细胞核进行节段化，这是用于限定所鉴 定所关注对象的形状的方法。该方法的实施方式能够用于表征所有的 细胞核，或者对染色体进行计数。该方法的实施方式适于进行 AneuVysion 检验(Vysis, Inc., Downers Grove， IL)。
在实施方式中，公开了用于分析荧光杂交的样品的荧光原位杂交图象的成像处 理方法，其使用具有荧光激发光源和电子成像装置的显微镜系统，该 方法包括下列步骤使用荧光激发照明，照亮样品；调节电子成像装置的曝光参数，用于在所照亮的区域内的 焦深处捕获样品的图象； 对所捕获的样品的图象中所关注的对象进行计数； 鉴定图象中的细胞核； 对图象中的细胞核进行节段化； 对细胞核内出现的荧光信号进行计数和表征；以及 解释和报告结果。
图1是流程图，其代表用于实施本发明自动分析的计算机 程序的实施方式的总览。
图2是流程图，其代表用于调节曝光参数的程序模块的实 施方式。图3是流程图，其代表用于对所关注的对象进行计数的程 序模块的实施方式。图4是流程图，其代表用于鉴定细胞核的程序模块的实施 方式。图5是流程图，其代表用于对细胞核进行节段化的程序模 块的实施方式。图6是流程图，其代表用于表征信号和报告结果的程序模 块的实施方式。
发明的详细描述自动曝光获取数字图象典型地需要正确曝光被检验样品 的所有区域。电子成像装置可以是电荷偶合元件(CCD)或补金属氧 化物半导体(CMOS)元件或任何其他适于将光图象转化成电子信号的 技术中的光敏探测器的多像素平面阵列。示范性的CCD相机包括增强 型CCD相机，其利用门控技术(gating techniques )用于以改进的量子 效率达到低于大约9纳秒的门控速度(gate speed)(例如，Princeton Instruments (Trenton, NJ) PIMAXMG,其支持全部范围的16位科研级 CCD ),其能够使非常快速的反应受到输出闪烁物的时间恒量以及电子 轰击型CCD (EBCCD)的限制，其中光子被光电阴极检测，并且所释 放的电子被通过加速通过缝隙，并碰撞到CCD的后侧(能够得到额外 的收获和伴随的速度)。特别的，CMOS相机可以在荧光显微镜中发现 用途。CMOS相机具有以在芯片上集成的模式与每个光电二极管连接 的放大器和数字转换器。最近的CMOS传感器具有大大降低的残留噪 音，并且提供了特别的动态范围。
通过采用图象增强器和类似的技术可以增强低强度检测。 正确的曝光时间可以使用考虑诸如下列条件的运算法则进行计算(i) 某些区域(细胞核)中平均图象强度值的范围；(ii)最高图象强度的范 围；(iii)最大允许曝光时间；和(iv)独立提供的曝光条件。每个传感器图片要素或像素典型地聚集电荷，其与落到要 素上的光子的数目(光的量)成比例。因为，通常在所需曝光时间和撞击到像素上的光的强度之间存在反线性关系，因此通过提高曝光时 间可以在分别的曝光中对教暗区域进行成像。曝光之后，可以以连续 扫描的模式对成像阵列的像素分别进行测量。接着，可以利用模拟数 字转换器(A/D)或其他数据数字化手段对每个要素测量进行数字化。 所得到的数字化测量流可以被保存在存储器中，之后可以进行图象分 析程序。 然而，在大部分情况中，单次曝光时间不能充分地对样品 的全部部分进行成像，因为图象传感器和相关电子器件的动态范围典 型地低于从单个样品的各种位置发出的强度的范围。例如，8位D/A 转换器的动态范围是256:1，这对于本应用是不适合的。对于该情形， 利用单次曝光时间，如果最暗的区域被适当曝光，会损失亮的对象或 者细胞核；或者可替换的，在最亮的对象被适当曝光时，会损失暗对 象。当成像视野的强度动态范围对于单次曝光持续时间而言 过大，则可以采用多次曝光策略。首先使用相对较短的时间对强度最 大的样品或细胞核部分进行曝光和分析。对于该曝光，可以接着使用 边缘检测或熵度量法对图象的较暗区域进行分析，以测定是否较长的 曝光时间对于这些区域进行充分成像是必要的。如果是这样的话，可 以对可以进行适当长的曝光时间的额外曝光，其中像素测量对应图象 中被排除或遮盖的高强度细胞核。可以重复该过程进行更长的曝光时 间，直到没有发现更多的所关注的结果。作为较长曝光时间的替换， 可以将多次较短的曝光进行计算机组合以合成单次较长的曝光。可替 换的，可以通过改变显微镜的有效孔径或照射强度而改变曝光。"点"计数样品具有有限的厚度，其中所关注的对象分散 在样品的整个深度中。本文所使用的"所关注的对象"涉及显微镜视野中 作为标记FISH探针的结果而已经被鉴定的任何特征。所关注的对象的 非限制性例子包括质膜或其部分、胞质细胞器或结构、核糖体、线粒 体或其部分、线粒体核酸、高尔基体膜、内质网或其部分、核内体 (endosome)、细胞核、核膜或其部分、染色体或其部分、部分DNA 分子。因此，成像需要光学系统被单独地聚焦，以形成充分分辨的每 个对象的图象。可替换的，可以在以充分小的间隔选择的隔开的焦平 面进行一 系列曝光，以便所有所关注的对象都能够被可接受地曝光。可以从样品的厚度以及光学系统的焦深容易地确定焦平面的所需数目 和间隔。 —旦已经获得了适当聚焦的曝光，则可以对图象进行处理 以鉴定和区分原位杂交"点"中的所关注的对象或荧光。这些"点"被它们 所释放的荧光光线所显示，所释放光线的性质会根据对象的特征而变 化。特别的，从所关注的对象发出的荧光性质的非限制性例子包括荧 光标记的光学性质和FIS H探针与对象杂交的强度。 获得图象之后，可以采用计数运算法则对所关注的荧光原 位杂交对象("点")进行计数。运算法则的第一步可以是4，,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI, —种双链DNA染色荧光探针)染色图象的节段化， 其根据每幅图象焦平面中亮度的强度、有效限定的亮度的等高线 (contour )。原始焚光原位杂交通道图象可以被计算机转化成强反差图 象。强反差图象是原始图象的数学转换，其中每个被转化的像素的强 度代表相对于原始图象中邻近像素的强度变化。可以通过将对比度阈 从可能最高值连续降低到预设的低数值，对细胞核内的对象进行分辨。 对于每个对象，可以将最高反差与之前对象的平均移动和标准偏差进
行比较。如果在反差中观察到了显著的条约，则可以将具有较高反差 的所有对象标记为可能的荧光原位杂交"点"。此外，如果两个可能的荧 光原位杂交"点"位置比预设的阈值近，则它们可以被合并形成单个"点" 所鉴定的可能荧光原位杂交"点"的相对反差和尺寸可以被比较，并可以 表征最终的荧光原位杂交"点"并记录在数据库中。 细胞核鉴定 一旦鉴定了可能的所关注对象或者荧光原位 杂交"点"，则可以采用自动模式识别技术对每个对象进行分类和表征。 通过荧光原位杂交"点"技术分析所确定的每个荧光原位杂交"点"可以 被分析以得到对于平移(translation )、旋转和缩放比例恒定(scaling invariant shape)的对象的椭圆形傅里叶形态描述符。其他的特征包括 但不限于对象尺寸和所发出的强度在细胞核中的分布，也可以用于描
述对象。模式识别运算法则可以用于对所关注的对象基于它们的特征 而进行鉴定和分类。开始时，可以通过采用专门的人观察者对对象进 行分类并将其结果输入到模式识别数据库中，而对模式识别运算法则 进行训练。在起始学习阶段之后，可以自动运行运算法则，并连续更 新模式识别数据库。
细胞核节段化对于通过模式识别运算法则所鉴定的细胞 核，可以测定从最大亮度开始的恒定强度的等高线。在每条等高线上 的每个点，还可以计算斜率。作为非限制性例子，可以将细胞核的尺 寸确定为对应最大平均斜率的等高线。 AneuVysionTM扫描方法AneuVysionTM检验是FDA批准 的测试用于产前诊断，其能够使用荧光原位杂交快速检测最常见的染 色体数目异常。其利用分子遗传技术用于形成荧光DNA探针，该探针 在选择性附着到特定染色体的特异性部分时会产生亮的显微信号。这 些DNA探针能够附着到未分裂细胞中适当的染色体上。信号是对于不 同的染色体的不同颜色。通过计算细胞内信号的数目，细胞生成技术 员知道是否在胎儿中出现了可检测染色体的正常数目或三体性、单体 性或其他染色体异数。
行AneuVysio;M、检验。可以组织计算初:柱状图，其中柱状图中的每个 库(bin)代表每种可能的染色体构成的组合。AneuVysion CEP (染色 体计数探针)分析结果利用柱状图结构，其包括三个系数，代表X染色 体、Y染色体和染色体18。另一个对应LSI探针的柱状图结构包括两 个系数代表染色体12和染色体13。自动化荧光显微镜系统发现了使用 低放大倍数限定的细胞核数目(N)。在非限制性的例子中，N的数值 -故限定为例如10或20或30或40或50或60或80或100或125或150 或200或更高的整数。而且，N可以被限定成本文所鉴定数值之间任 何位置的整数。接着，该系统使用高放大倍数对细胞核分别进行成像。 对于所有通道，对荧光原位杂交光点进行计数，并将结果组织成上述 的柱状图模式。继续测量过程，直到 一个库计数达到了预定的数目(M )。 例如数目M可以是50，这对应目前的政府指南。更通常，在非限制性 实施例中，M的数值是例如10或20或30或40或50或60或80或100 或125或150或200或更高的整数。此外，M可以被预先确定为本文 所鉴定的数值之间任何处的整数。如果在已经测量过N个细胞核时没 有库含有所需的M量，则该系统可以以低放大倍数检索其他细胞核， 并在高放大倍数时计算测量，直到一个库达到量N。在达到N时，停 止测量，并可以将最高库计数与第二高的库计数进行比较。如果最高 的库计数比第二高计数高几个预定的百分比，则对应该库的结果可以被报告为临床结果。如果不满足该条件，则可以报告为不确定的结果。 在各种非限制性例子中，用于将最高库计数与第二高库计数比较的预
或45%或50%或60%或70%或80%或90%或100%或125%或150%或 175%或200%或更高的百分比数值。而且，可以将预定的百分比设定在 本文所鉴定的这些之间的任何整数和非整数数值。用于分析本发明荧光原位杂交图象的图象处理方法的实 施方式被示意性描绘在图1中。将含有样品的显微镜玻片置于显微镜 的观察视野中400,其中所述样品已经被适当处理以与荧光探针原位杂 交。在非限制性实施方式中，可以用于本方法的显微镜的基础元件包 括X-Y平台，适于激发标记焚光的汞或等同光源，荧光显微镜，检测 CCD图象检测装置的颜色，计算机以及一台或更多台显示器。该系统 的每个元件可以是定做的，或者作为标准组件现货供应购买的。样品 的非限制性例子包括细胞、血液细胞、上皮细胞、组织、分解的组织、 组织切片、活体组织样品、切离的手术样品等。 显微镜被调节成使得样品在样品厚度内所选择焦平面处 聚焦410。使用激发荧光的照明对样品进行照射420,这使得结合被标 记探针的样品的各种基因座发出荧光。调节电子成像装置的曝光参数 以适当曝光这些区域430。正如本领域中^^知的，可以通过改变曝光时 间和/或孔径和/或照明水平而改变曝光参数。捕获图象440。在许多情况中，经过仔细研究并在所捕获的图象(图1，440) 中提供的视野中的强度范围会超出电子成像装置和/或其支持电子设备 的动态范围能力。参考图2，对于这些情况，使用图象顺序调节曝光。 最亮的点首先被鉴定500,并设置曝光参数510以便最亮的量被适当曝 光，这对应电子成像装置的动态范围的顶端。在这些条件下捕获图象 520。对所捕获图象的不太亮部分进行分析530,以确定是否由于曝光 不足而损失细节。这些区域的曝光不足可能不能检测较暗的荧光点。 如果在这些较暗的区域中缺少细节540,则提高曝光参数550,以将电 子成像装置的动态范围延伸到起始动态范围之下。将电子成像装置的 支持电子设备的范围调节到比所成像低的强度水平；遮盖或绕开对应 起始最亮区域的图象传感器像素的输出560,以便不会使得支持电子装 置超负荷。捕获新图象520,并进行类似的分析530。重复该过程，直到已经对整个图象进行可接受地成像570。接着从所捕获图象组(图1, 450)对所关注的对象进行计数。 参考图3，计数运算法则的示意图，对于仔细研究的视野 深度中的给定水平，将所捕获的图象进行低通过滤(low pass filter )600。 也可以将这些图象经过数学重新表达为强反差图象610,其通过将每幅 原始图象除以对应的低通过滤版本。可以通过形成恒定反差的等高线， 而鉴定所关注的对象和特征。可以通过将对比度阈从所观察到的最高 值连续降低到所选择的低数值，而对连续较低的恒定反差的等高线进 行分辨620。对于每个对象，可以对最高的反差进行比较630，以得到 对象的平均移动和标准偏差。如果在反差中检测到显著跳跃640,则可 以将具有较高反差的所有对象标记为可能的所关注对象("点")。如果 其具有显著较低的反差或较小的尺寸，则该"点"被认为是无关的并不会 进行进一步的考虑650。另外，如果两个可能的荧光原位杂交"点"位置 比预设的阈值近，则它们可以被合并660以形成单独的"点"。可以对所 鉴定可能的荧光原位杂交"点"的相对反差和尺寸进行比较670,并可以 表征最终的荧光原位杂交"点"并记录在数据库中680。对于进行整个样 品深度的分析所需的附加聚集平面，重复该过程(图1， 455)。 在已经对所关注的对象进行计数后，接着鉴定细胞核(图 1， 460)。正如图4中所示意显示的，在低放大倍数下获得适当聚焦和 曝光的DAPI图象700。通过数学计算产生恒定强度的等高线以对图象 进行节段化，进而鉴定对象710。对于每个计数的对象450，计算到对 于平移、旋转和缩放比例恒定的特征表征，例如椭圆形傅里叶形态描 述符720。对每个对象的构成特征粒度测定或尺寸分布进行计算730。 采用用于所有变量的组合的对象和特征进行分类，对细胞核进行充分 描述。将模式识别运算法则结合基于经验的数据库，用于鉴定和分类 所关注的对象740。因此，接着，根据图5中所示意显示的，将所鉴定的细胞 核进行节段化(图1, 470)。首先将对应最高强度的恒定强度的等高线 进行计算800。这样记录了所鉴定的对象特征810。连续降低阈值强度， 并计算新的等高线820。由于强度阈值降低，每个对象相关的等高线将 扩展830,新的对象将变成可见的840。在某些情况中，在较高强度水 平被分离的对象可以在阈值降低时被合并850。 一旦强度阈值已经达到充分低的水平，则终止附加等高线的计算860。通常，阈值水平终止使
用对于所使用显微镜系统特定的仪器或系统参数，其。因此，建立阈 值是对于装置特定的程序。作为非限制性的实施例，现为系统可以提 供强度量度如光子计数或电流或电荷积聚。本发明所属领域的技术人 员理解并能够执行一方面区分整个背景的阈值水平，另一方面显著的 等高线强度水平的评估。在这一点上，不符合有效尺寸范围的对象可
以被排除于进行进一步的考虑870。已经被计算的恒定量度的等高线被 用于确定每个对象的边缘880。在沿着每条等高线的点上，对强度梯度 进行计算并取平均值。每个细胞核的边界被定义为具有最大平均梯度 的等高线。此后，仅在其边缘内对对象进行限定890。 在如此限定和节段化细胞核后(图1, 470),对每个细胞核 内的荧光信号进行计数和表征(图1, 480),接着进行解释，并报道结 果(图1, 490)。该最后步骤的实施方式显示在图6中，并适于用于例 如AneuVysionTM检验。正如前面所描述的，AneuVysionTM检验是用于 产前诊断的测试。本申请中所描述的所公开实施方式对于其他荧光原 位杂交检验是等价有效的。形成数学柱状图结构900,以便每个库对应 细胞核中所包含荧光斑量和颜色的可能组合。第一组N个荧光斑的每 一个被进行计数910,对其颜色进行表征，并将结果加入到柱状图的适 当库中。在已经对首批N斑点计数后，则确定所有柱状图中的最大计 数920。如果最大值低于N 930,则对其他的细胞核进行定位940。 N 数值的非限制性例子上面已经公开。如果没有新的细胞核被定位945, 则报道不确定的结果。数目M是预定的，并且可以对应规章的要求。 M示范性的数值是50。 M数值的非限制性例子已经在上面公开。对相 关的附加光斑进行计数和表征950，并将结果加到现有的库成分中。继 续该处理，直到最大库计数大于或等于N 930。当任何库中的最大数目 都达到M时，则确定第二大柱状图库中的数970。如果M超过第二大 数目预定的Z。/。，则将染色体构成报告为可信的测试结果980。上面已 经公开了预定百分比的数值的非限制性例子。另一方面，如果M没有 超过第二大数目Z%,则将该测试报告为不确定的960。
关于优选实施方式的声明 尽管根据优选实施方式已经对本发明进行了描述，但本领域技术人员容易理解可以对本发明进行各种变化和/或修改，而不离开 后附权利要求所限定的本发明的主旨或范围。通过参照将所有引用的 文件并入本文，其适于教导额外的或可替换的细节、特征和/或技术背景。
权利要求
1.用于对使用显微镜系统的荧光杂交样品的荧光原位杂交图象进行分析的图象处理方法，所述显微镜系统具有荧光激发光源以及电子成像装置，所述方法包括下列步骤使用荧光激发照明照亮所述样品；调节所述电子成像装置的曝光参数用于在所照亮区域的焦深处捕获所述样品的图象；对所捕获的所述样品的图象内的所关注对象进行计数；鉴定所述图象中的细胞核；对所述图象中的细胞核进行节段化；对所述细胞核中出现的荧光信号进行计数和表征；以及解释和报告结果。
2. 权利要求l的方法，其中在不同的焦深重复步骤(b)和(c)。
3. 权利要求l的方法，其中调节曝光参数进一步包括 确定所述样品的一个或者更多个最亮的斑点； 调节曝光参数，以便所述最亮的斑点基本上在所述电子成像装置的动态范围的最大值处被曝光； 进行曝光以捕获所述图象；分析所述被捕获图象的较暗部分，以确定是否所述较暗部分中的 细节曝光不足；以及如果所述图象的较暗部分曝光不足，则提高所述曝光参数； 遮盖亮区域；以及重复步骤(c)和(d),直到所述样品的较暗部分被充分成像。
4. 权利要求1的方法，其中对所关注的对象进行计数进一步包括在沿着所述杂交的样品的深度间隔的焦平面捕获多幅图象； 将所述所捕获的图象计算转化成由恒定反差等高线表征的强反差 图象；以及进行计数运算法则，以对所述杂交样品的整个深度的所关注对象 进行计数。
5. 权利要求l的方法，其中鉴定细胞核进一步包括 a)计算每个所关注样品的对平移、旋转和缩放比例恒定形态描述符； b) 计算每个所关注对象的尺寸分布；以及c) 结合基于经验的模式数据库，将模式识别运算法则用于鉴定和分 类所述所关注对象。
6. 权利要求l的方法，其中对细胞核进行节段化进一步包括a) 以连续的强度间隔计算恒定亮度的等高线，其从局部最大值开始 并朝着低阈值强度水平进行；b) 计算每个所述等高线的平均梯度；以及c) 将每个所述细胞核的边缘限定为对所述细胞核具有最大所述平均梯度的等高线。
7. 权利要求1的方法，其中解释和报告结果进一步包括a) 形成数学柱状图结构，以便每个库对应细胞核中所包含的所述斑 点量和颜色的可能组合；b) 对每个焚光斑点进行计数，并表征它们各自的颜色；c) 在所述柱状图的所述适当库中记录所述计数的结果；d) 继续所述计数，直到一个所述库中的所述计数对应预定的数目；e) 停止所述计数，并将所述库中的计数与所有其他库中的第二大计 数进行比较；f) 如果所述第二大数目比所述预定数目低预定的百分比，则报告最 大数目库识别符；或者，g) 如果所述第二大数目与所述预定数目相同，或比预定数目大预定 的百分比，则报告为不确定的结果。
8. 权利要求l的方法，其中对细胞的细胞核进行表征。
9. 权利要求1的方法，其中对染色体进行计数。
全文摘要
公开了一种实施方式用于进行图象处理，以分析荧光原位杂交(FISH)显微镜自动样品分析的结果，以测定特异性的染色体特征。
文档编号C12Q1/00GK101553727SQ200780037464
公开日2009年10月7日 申请日期2007年8月2日 优先权日2006年8月4日
发明者T·P·塔法斯, X·王, Y·朱, Y·金 申请人:伊康尼西斯公司