专利名称：利用胎盘干细胞抑制肿瘤的制作方法
利用胎盘干细胞抑制肿瘤 1.发明领域 本发明提供了利用胎盘干细胞来抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤生长的方法。本发明还 提供了用于抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤生长的包含胎盘干细胞的化合物，胎盘干细胞的肿瘤 抑制群的分离群，以及生产此类群的方法。
2.
背景技术：
人干细胞是能够产生多种成熟的人细胞系的全能性或多能性前体细胞。现有证据 证实，干细胞可被用于再增殖多种组织(如果不是所有组织)和被用于恢复生理学和组织 学功能。 已经表征过多种不同类型的哺乳动物干细胞。参见例如C即lan等人，美国专利 号5， 486， 359 (人间充质干细胞);Boyse等人，美国专利号5， 004， 681 (胎儿和新生儿造 血干细胞和前体细胞)；Boyse等人，美国专利号5， 192，553(同上)；Beltrami等人，Cell 114(6) :763-766(2003)(心肌干细胞);Forbes等人，J. Pathol. 197 (4) :510-518(2002)
(肝脏干细胞)。脐带血和来源于脐带血的全部有核细胞已被用于移植，从而在已进行消融 疗法(ablative therapy)的患者中部分或完全恢复造血功能。 胎盘是特别有吸引力的干细胞来源。由于哺乳动物胎盘来源充足并且通常作为医 学废物丢弃，它们代表了医疗有用的干细胞的唯一来源。 目前已经证实，骨髓来源的间充质干细胞，当经过遗传修饰时，具有迁移和浸润 到某些肿瘤细胞中的能力。参见例如Hung等人，"Mesenchymal Stem Cell Targeting of Microscopic Tumors and Tumor StromaDevelopment Monitored by Noninvasive In vivo Positron Emission tomography Imaging, ，， CI in. Cancer Res. 11(21): 7749-7756(2005)。某些遗传改造的骨髓来源的间充质干细胞系已经表现出可抑制肿瘤生 长。参见Studney等人，"Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells as Vehicles for Interferon-P Delivery into Tumors， ，，Cancer Res. 62 :3603-3608 (2002M黑色素瘤细胞 系)；Nakamura等人，"Antitumor Effect of Genetically Engineered MesenchymalStem Cells in a Rat Glioma Model, "Gene Therapy 11 :1155_1164(2004(表达重组IL-2的间 充质干细胞)。然而，间充质干细胞已经表现出在体内可促进至少一种肿瘤的生长。参见 Zhu等人，"Mesenchymal Stem Cells Derivedfrom Bone Marrow Favor Tumor Cell Growth In Vivo，"E邓.Mol. Pathol.(在公开之前被电子公开，2005)(结肠腺癌细胞)。
然而，到目前为止，尚未描述过胎盘来源的干细胞抑制肿瘤生长，或者抑制肿瘤细 胞增殖的能力。本发明提供了胎盘干细胞的此类用途及其群。
3.发明概述 本发明提供了利用胎盘干细胞、胎盘干细胞群、以及包含胎盘干细胞的组合物来 抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤生长的方法。本发明还提供了组合物，包括包含具有肿瘤细胞增 殖抑制性质的胎盘干细胞的组合物。本发明还提供了基于其抑制肿瘤细胞增殖的能力而选 择的胎盘细胞群，及具有此类性质的组合物。 —方面，本发明提供了抑制大量肿瘤细胞增殖的方法，包括将所述大量肿瘤细胞
6与大量胎盘干细胞接触一段时间，与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，所述时间 足以使所述胎盘干细胞可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖。在特定实施方案中，所述 肿瘤细胞是实体瘤的一部分。在另一特定实施方案中，所述肿瘤细胞是非实体瘤细胞类型。 在另一特定实施方案中，所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急 性T-细胞白血病、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞。在所 述方法的另一特定实施方案中，所述接触在体外进行。在另一特定实施方案中，所述接触 在个体体内进行。所述个体可以是哺乳动物，例如人。在另一特定实施方案中，所述胎盘干 细胞与所述个体是HLA匹配的。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞与所述个体不是 HLA匹配的。在另一更特定的实施方案中，所述接触包括将所述胎盘细胞静脉内施用至所 述个体。在另一更特定的实施方案中，所述接触包括将所述胎盘干细胞在肿瘤位点或靠近 肿瘤位点处施用至所述个体。在特定实施方案中，所述胎盘干细胞表达CD200和HLA-G ; 表达CD73、CD105和CD200 ;表达CD200和0CT-4 ;表达CD73、CD105和HLA-G ;表达CD73和 CD105，并且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含干细胞的胎盘细胞 群中形成一个或多个胚样体，;和/或表达0CT-4并且当所述群在允许胚样体形成的条件下 培养时，有助于在包含干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体。
在另一特定实施方案中，所述大量胎盘干细胞中的至少一部分被改造为表达细胞 因子。在更特定的实施方案中，所述细胞因子是IFN-I3或IL-2。 在另一特定实施方案中，所述方法还包括将所述肿瘤细胞与一种或多种抗癌化合 物接触。在另一特定实施方案中，所述方法还包括将所述肿瘤细胞与大量间充质干细胞接 触，例如骨髓来源的间充质干细胞。在另一特定实施方案中，所述方法还包括将所述肿瘤 细胞与大量成纤维细胞接触。 在另一特定实施方案中，所述方法还包括将所述肿瘤细胞与一种或多种干细胞化 学趋化剂(chemoattractant)接触。在更特定的实施方案中，所述化学趋化剂是基质来源 的因子-l(SDF-l)。 所述方法可以采用与例如在个体中对肿瘤细胞增殖或肿瘤生长产生可检测地抑 制所需的一样多的胎盘干细胞。例如，用于与大量肿瘤细胞接触的大量胎盘干细胞可以包 含约1X105个胎盘干细胞、约1X106个胎盘干细胞、约1X107个胎盘干细胞、或约1X108 个胎盘干细胞、或更多。在多个更特定的的实施方案中，所述方法包括向所述个体施用至 少约1X1()5、至少约1X1()6、至少约1X1()7、或至少约1X1()8个胎盘干细胞。在多个更特定 的的实施方案中，所述方法包括施用个体内肿瘤细胞数量的约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、 或超过5倍的胎盘干细胞数量。可以使用任何本领域已知的方法来确定个体中肿瘤细胞 的数量。肿瘤细胞定量的示例性方法描述于美国专利号6， 365， 362和6， 645， 731 ;Mehes 等人，Haematologia 31(2) :97-109(2001);禾口 Hardingham等人，Cancer Research53 : 3455-3458(1993)中，其内容在此全文引用作为参考。在多个更特定的实施方案中，所述 方法包括基于个体的重量施用大量胎盘干细胞。例如，所述方法包括向所述个体施用约 1 X 103个胎盘干细胞/kg、5X 103个胎盘干细胞/kg、l X 104个胎盘干细胞/kg、5X 104个 胎盘干细胞/kg、 1 X 105个胎盘干细胞/kg、5 X 105个胎盘干细胞/kg、 1 X 106个胎盘干细胞 /kg、5X 106个胎盘干细胞/kg、lX 107个胎盘干细胞/kg、5X 107个胎盘干细胞/kg、或约 lXlQ8个胎盘干细胞/kg。在多个更特定的实施方案中，所述方法包括向所述个体施用至少约1 X 103个胎盘干细胞/kg、至少约5X 103个胎盘干细胞/kg、至少约1 X 104个胎盘干细 胞/kg、至少约5X 104个胎盘干细胞/kg、至少约1 X 105个胎盘干细胞/kg、至少约5X 105 个胎盘干细胞/kg、至少约1 X 106个胎盘干细胞/kg、至少约5X 106个胎盘干细胞/kg、至 少约IX 107个胎盘干细胞/kg、至少约5X 107个胎盘干细胞/kg、或至少约IX 108个胎盘 干细胞/kg。 在多个其他更特定的实施方案中，所述胎盘干细胞已在体外增殖不超过30次群 倍增、不超过20次群倍增、不超过10次群倍增、或不超过5次群倍增。在另一特定实施方 案中，所述胎盘干细胞已经过冷冻保藏和在所述接触前解冻。在所述方法的更特定的实施 方案中，与在缺少所述胎盘干细胞的条件下的等量肿瘤细胞的增殖相比，所述胎盘干细胞 被证实在体外抑制肿瘤细胞增殖，例如，至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、 80%、90%、或95%。 在另一特定实施方案中，所述方法还包括在向所述个体施用所述胎盘干细胞前， 确定所述胎盘干细胞具有肿瘤细胞生长抑制活性，例如筛选所述胎盘干细胞对代表性的 样本肿瘤细胞增殖的可检测地抑制。在本方法的更特定的实施方案中，在向所述个体施用 前，与缺少所述胎盘干细胞的条件下等量肿瘤细胞的增殖相比，所述胎盘干细胞被证实在 体外抑制肿瘤细胞增殖，例如，至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、 或95%。在某些实施方案中，在向含有肿瘤细胞的个体施用前，胎盘干细胞被确定通过直 接接触、通过非直接接触(例如，通过可溶性因子)、或通过两者来抑制肿瘤细胞增殖。例 如，在所述方法的特定实施方案中，在向所述个体施用前，在直接培养试验中，或在例如 transwell试验中，或更优选的，同时在直接培养试验和transwell试验中，所述胎盘干细 胞被证实在体外抑制肿瘤细胞增殖，例如，至少约20 % 、30 % 、40 % 、50 % 、60 % 、70 % 、75 % 、 80% 、90%或95% 。在另一特定实施方案中，针对与将按照所述方法被施用所述胎盘干细 胞的个体的内源性的肿瘤细胞具有相同细胞类型(例如上皮、鳞状上皮)、相同组织起源 (例如乳腺、前列腺等)、或更优选的具有相同细胞类型和组织起源的肿瘤细胞，在体外 筛选所述胎盘干细胞对肿瘤细胞增殖或肿瘤生长的抑制。在另一更特定的实施方案中，针 对从所述个体的活体切片中获得的肿瘤细胞，或者从所述个体的血样中纯化或分离的肿瘤 细胞，在体外筛选所述胎盘干细胞的肿瘤生长抑制活性。在所述方法的多个更特定的实施 方案中，所述胎盘干细胞可以来源于羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、脐带或灌流液，并在向所 述患者施用前，与缺少所述胎盘干细胞的条件下的等量肿瘤细胞的增殖相比，所述胎盘干 细胞被证实在体外抑制肿瘤细胞增殖，如至少约20% 、30% 、40% 、50% 、60% 、70% 、75%、 80%、90%或95%。 本发明还提供抑制大量肿瘤细胞，例如血癌细胞生长或增殖的方法，其包括将所
述大量肿瘤细胞与包含来源于大量胎盘干细胞培养物的条件培养基或上清液的组合物接
触一段时间，与未接触所述条件培养基或上清液的大量肿瘤细胞相比，所述时间足以使所
述条件培养基或上清液可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖。在特定实施方案中，所述
接触在体外进行。在另一特定实施方案中，所述接触在体内进行。在另一特定实施方案中，
所述条件培养基或上清液来源于与大量肿瘤细胞共培养的大量胎盘干细胞。 在多个特定实施方案中，所述条件培养基或上清液来源于与大量肿瘤细胞共培
养的大量胎盘干细胞，所述胎盘干细胞与肿瘤细胞的比例约i : 1、约2 : 1、约3 : 1、约4 : 1，或约5 : i。所述方法可使用条件培养基或上清液，其来源于单独培养或与大量肿瘤 细胞共培养的胎盘干细胞，所述胎盘干细胞与使肿瘤细胞增殖或肿瘤生长实现可检测的抑 制所需的一样多。例如，条件培养基或上清液可来源于培养物，所述培养物含有约1 X 105个 胎盘干细胞、约ixio6个胎盘干细胞、约ixio7个胎盘干细胞、或约ixio8个胎盘干细胞 或更多。在另一特定实施方案中，所述条件培养基或上清液可来源于共培养物，所述共培养
物含有约1X1()5至约5X105个胎盘干细胞和约1X105个肿瘤细胞、约1Xl(f至约5X106 个胎盘干细胞和约1X106个肿瘤细胞、约1Xl(f至约5X107个胎盘干细胞和约1Xl(f个 肿瘤细胞、或约1X1()8至约5X108个胎盘干细胞和约1X108个肿瘤细胞。
在抑制肿瘤细胞生长或增殖的方法的另一特定实施方案中，所述条件培养基或上 清液是来源于包含单独的、或与肿瘤细胞共培养的大量胎盘干细胞的培养物的培养基或上 清液，其中产生条件培养基的细胞数量是基于施用该条件培养基的个体的重量。例如，条 件培养基或上清液可以是由以下培养物产生的条件培养基或上清液，所述培养物包含约 1 X 103个胎盘干细胞/kg接受者体重、5 X 103个胎盘干细胞/kg、 1 X 104个胎盘干细胞/kg、
5 X 104个胎盘干细胞/kg、 1 X 105个胎盘干细胞/kg、5 X 105个胎盘干细胞/kg、 1 X 106个胎 盘干细胞/kg、5 X 106个胎盘干细胞/kg、 1 X 107个胎盘干细胞/kg、5 X 107个胎盘干细胞/ kg、或1 X 108个胎盘干细胞/kg。在另一特定实施方案中，所述条件培养基或上清液是来源 于共培养物的培养基或上清液，所述共培养物含有约1 X 103至约5 X 103个胎盘干细胞/kg 和约1X103个肿瘤细胞/kg、约1X1。4至约5X104个胎盘干细胞/kg和约1X104个肿瘤 细胞/kg、约1X1()5至约5X105个胎盘干细胞/kg和约1X105个肿瘤细胞/kg、约1X106 至约5 X 106个胎盘干细胞/kg和约1 X 106个肿瘤细胞/kg、约1 X 107至约5 X 107个胎盘 干细胞/kg和约1Xl(f个肿瘤细胞/kg，或约1X1()8至约5Xl()8个胎盘干细胞/kg和约 1X108个肿瘤细胞/kg。 本发明还提供了生产细胞群的方法，所述群包含基于其抑制肿瘤细胞或肿瘤细胞 群增殖，或抑制肿瘤生长的能力所选择的胎盘干细胞。例如，在一实施方案中，本发明提供 了生产细胞群的方法，其包括选择胎盘干细胞，其中所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b) 表达CD200和HLA-G ;或表达CD73、 CD105和CD200 ;或表达CD200和0CT-4 ;或表达CD73、 CD105和HLA-G ;或表达CD73和CD105，并且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时， 有助于在包含胎盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；或表达0CT-4，并且当 所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含干细胞的胎盘细胞群中形成一个 或多个胚样体；和(c)可检测地抑制肿瘤细胞或大量肿瘤细胞的增殖，或抑制肿瘤的生长； 以及从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。 在另一实施方案中，本发明提供了生产分离的细胞群的方法，其包括选择这样的 胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD200和HLA-G ;和(c)可检测地 抑制肿瘤细胞增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急 性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、成视网膜细胞瘤细胞、或肺癌 细胞；以及从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一实施方案中，所述方 法包括选择这样的胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD73、 CD105和 CD200 ;和(c)可检测地抑制肿瘤细胞增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、 慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网
9膜瘤细胞、或肺癌细胞；以及从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一实施 方案中，所述方法包括选择这样的胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达 CD200和0CT-4 ;和(c)可检测地抑制肿瘤细胞增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴 瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细 胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞；以及从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在 另一实施方案中，所述方法包括选择这样的胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于基质； (b)表达CD73和CD105 ;(c)当在允许胚样体形成的条件下培养时，形成胚样体；和(d)可 检测地抑制肿瘤细胞增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病 细胞细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、 或肺癌细胞；以及从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一实施方案中， 所述方法包括选择这样的胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD73、 CD105和HLA-G ;和(c)可检测地抑制肿瘤细胞增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴 瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细 胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞；以及从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在 另一实施方案中，所述方法包括选择这样的胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于基质； (b)表达0CT-4 ;(c)当在允许胚样体形成的条件下培养时，形成胚样体；和(d)可检测地抑 制肿瘤细胞增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性 T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞；以
及从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在上述方法的更特定的实施方案中， 所述胎盘干细胞主要来源于羊膜、绒毛膜、羊膜和绒毛膜、或脐带。在另一更特定的实施方 案中，所述方法中使用的干细胞是脐带干细胞。 在生产分离的胎盘干细胞群的上述方法中，在一实施方案中，所述方法可包括选 择表现出间充质干细胞的至少一种特异性特征的细胞。在更特定的实施方案中，所述间充 质干细胞的特异性特征是表达CD29、表达CD44、表达CD90、或表达上述的组合。在本方法的 另一特定实施方案中，所述选择是利用抗体实现的。在另一特定实施方案中，所述选择是利 用流式细胞仪实现的。在另一特定实施方案中，所述选择是利用磁珠实现的。在另一特定 实施方案中，所述选择是利用荧光活化的细胞分选实现的。在上述方法的另一特定实施方 案中，扩增所述细胞群。 本发明还提供例如，根据任一上述方法生产或选择的分离的胎盘干细胞群。在 一实施方案中例如，本发明提供包含胎盘干细胞的分离的细胞群，其中所述胎盘干细胞 (a)附着于基质；(b)表达CD200和HLA-G ;或表达CD73、 CD105和CD200 ;或表达CD200和 0CT-4 ;或表达CD73、CD105和HLA-G ;或表达CD73和CD105，且当所述群在允许胚样体形成 的条件下培养时，有助于在包含胎盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；或表 达0CT-4，且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含胎盘干细胞的胎盘 细胞群中形成一个或多个胚样体；和(c)与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，已 确定可检测地抑制大量肿瘤细胞的增殖。 在特定实施方案中，所述分离的胎盘细胞群包含胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a) 附着于基质；(b)表达CD200和HLA-G ;和(c)与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比， 已确定可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、 视网膜瘤细胞、或肺癌细胞。在另一特定实施方案中，所述分离的胎盘细胞群包含胎盘干细 胞，所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD73、CD105和CD200 ;和(c)与未与胎盘干 细胞接触的大量肿瘤细胞相比，已确定可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖，其中所述 肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性 髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞。在另一特定实施方案中，所 述分离的胎盘细胞群包含胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD200和 0CT-4;和(c)与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，已确定可检测地抑制所述大量 肿瘤细胞的增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性 T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞。
在另一特定实施方案中，所述分离的胎盘细胞群包含胎盘干细胞，所述胎盘干细 胞(a)附着于基质；(b)表达CD73和CD105 ; (c)当在允许胚样体形成的条件下培养时，形成 胚样体；和(d)与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，已确定可检测地抑制所述大 量肿瘤细胞的增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急 性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞。 在另一特定实施方案中，所述分离的胎盘细胞群包含胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附 着于基质；(b)表达CD73、 CD105和HLA-G ;和(c)与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞 相比，已确定可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋 巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌 细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞。在另一特定实施方案中，所述分离的胎盘干细胞群包含 胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达0CT-4 ;(c)当在允许胚样体形成的 条件下培养时，形成胚样体；和(d)与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，已确定可 检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性 髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤 细胞、或肺癌细胞。 本发明还提供包含任一上述分离的胎盘干细胞群的组合物。在特定实施方案中， 所述组合物还包含大量的非胎盘细胞，如非胎盘干细胞，如间充质干细胞，如骨髓来源的间 充质干细胞。在特定实施方案中，所述组合物还包含大量的成纤维细胞。在一些实施方案 中，所述成纤维细胞是被施用本发明中描述的胎盘干细胞组合物的个体的自体细胞。
在上述方法、分离的胎盘干细胞群和组合物中，可通过额外的标记来定义或选择 胎盘干细胞。例如，所述表达CD200和HLA-G的胎盘干细胞还表达CD73和CD105，即，0073+ 和CD105+。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是CD34—、CD38—或CD45—。在更特定的 实施方案中，所述胎盘干细胞是CD34—、CD38—、CD45—、CD73+和CD105+。在另一特定实施方案 中，当所述群当在允许胚样体形成的条件下培养时，所述大量的胎盘干细胞有助于从含有 胎盘干细胞的分离的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体。 在另一更特定的实施方案中，所述表达CD73、 CD105、 CD200的胎盘干细胞也是 HLA-G+。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是，CD34—、CD38—或CD45—。在另一特定实 施方案中，所述胎盘干细胞是CD34—、CD38—和CD45—。在更特定的实施方案中，所述胎盘干细 胞是CD34—、CD38—、CD45—和HLA-G+ 。在另一特定实施方案中，当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，所述大量的胎盘干细胞有助于从含有胎盘干细胞的分离的胎盘细胞群中形 成一个或多个胚样体。 在另一更特定的实施方案中，所述表达CD200和0CT-4的胎盘干细胞也表达CD73+ 和CD105+。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是HLA-G+。在另一特定实施方案中， 所述胎盘干细胞是CD34—、 CD38—或CD45—。在另一更特定的实施方案中，所述胎盘干细胞 是CD34—、CD38—、和CD45—。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是CD34—、 CD38—、 CD45—、 CD73+、 CD105+和HLA-G+。在另一特定实施方案中，当所述群在允许胚样体形成的条件下培 养时，所述胎盘干细胞有助于从含有胎盘干细胞的分离的胎盘细胞群中形成一个或多个胚 样体。 在另一更特定的实施方案中，所述表达CD73、 CD105和HLA-G的胎盘干细胞还是 CD34—、 CD38—或CD45—。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是CD34—、 CD38—和CD45—。 在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是0CT-4+。在另一特定实施方案中，所述胎盘干 细胞是CD200+。在更特定的实施方案中，所述胎盘干细胞是CD34—、 CD38—、 CD45—、 0CT-4+和 CD200+。在另一特定实施方案中，当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，所述干细胞 有助于从含有胎盘干细胞的分离的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体。
在另一更特定的实施方案中，所述表达CD73和CD105、并且当所述群在允许胚 样体形成的条件下培养时有助于从含有胎盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样 体的胎盘干细胞，还是CD34—、 CD38—或CD45—。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是 0CT-4+。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是CD200+。在另一特定实施方案中，所述 胎盘干细胞是0CT-4+、 CD200+、 CD34—、 CD38—和CD45一。 在另一更特定的实施方案中，所述表达0CT-4、并且当所述群在允许胚样体形成 的条件下培养时有助于从含有胎盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体的胎盘 干细胞，也是CD73+和CD105+。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是CD34—、 CD38—和 CD45—。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是CD200+。在另一特定实施方案中，所述 胎盘干细胞是CD73+、 CD105+、 CD200+、 CD34—、 CD38—和CD45—。 本发明中的方法、分离的群和组合物中使用的胎盘干细胞可来源于完整的胎盘，
或胎盘的任何部分。例如，在多个实施方案中，所述胎盘干细胞主要或仅仅来源于羊膜、或
羊膜和绒毛膜。在另一实施方案中，本发明的方法中使用的干细胞来源于脐带。 本发明还提供了包含胎盘干细胞的分离的细胞群，所述胎盘干细胞通过本发明中
描述的选择肿瘤细胞抑制性胎盘细胞群的任何方法制备。例如，在一实施方案中，本发明
提供了包含分离的胎盘干细胞的细胞群，其中所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达
CD200和HLA-G ;或表达CD73、CD105和CD200 ;或表达CD200和0CT-4 ;或表达CD73、CD105
和HLA-G ;或表达CD73和CD105，且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在
包含胎盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；或表达0CT-4，且当所述群在允
许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含胚胎干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个
胚样体；和(c)可检测地抑制肿瘤细胞或大量肿瘤细胞的增殖，或肿瘤的生长。 本发明还提供了冷冻保藏的干细胞群，例如本发明中描述的包含胎盘干细胞的细
胞群，其中所述细胞群是肿瘤细胞抑制性的。例如，本发明提供了 CD200+、HLA-G+胎盘干细
胞群，与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比， 述胎盘干细胞可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖，其中所述细胞已被冷冻保藏，并且其中所述群用容器来容纳。本发明进 一步提供了 CD73+、 CD105+、 CD200+胎盘干细胞群，与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞 相比，所述胎盘干细胞可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖，其中所述干细胞已被冷冻 保藏，且其中所述群用容器来容纳。本发明还提供了 CD200+、0CT-4+胎盘干细胞群，与未与 胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，所述胎盘干细胞可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的 增殖，其中所述干细胞已被冷冻保藏，且其中所述群用容器来容纳。本发明还提供了 CD73+、 CD105+胎盘干细胞群，与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，所述胎盘干细胞可检 测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖，其中所述细胞已被冷冻保藏，且其中所述群用容器来 容纳，并且其中当在允许胚样体形成的条件下与胎盘细胞群培养时，所述干细胞有助于一 个或多个胚样体的形成。本发明还提供了 CD73+、 CD105+、 HLA-G+胎盘干细胞群，与未与胎 盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，所述胎盘干细胞可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增 殖，其中所述细胞已被冷冻保藏，且其中所述群用容器来容纳。本发明还提供了 0CT-4+胎 盘干细胞群，与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，所述胎盘干细胞可检测地抑制 所述大量肿瘤细胞的增殖，其中所述细胞已被冷冻保藏，且其中所述群用容器来容纳，并且 其中当在允许胚样体形成的条件下与胎盘细胞群培养时，所述干细胞有助于一个或多个胚 样体的形成。 在任何前述冷冻保藏的群的特定实施方案中，所述容器是袋子。在多个特定实施 方案中，所述群包括大约、至少或至多1 X 106个所述干细胞、5X 106个所述干细胞、1 X 107 个所述干细胞、5X 107个所述干细胞、1 X 108个所述干细胞、5乂 108个所述干细胞，1 X 109个 所述干细胞、5Xl(f个所述干细胞、或1X10"个所述干细胞。在任何上述冷冻保藏的群的 其它特定实施方案中，所述干细胞已经传代大约、至少或不超过5次、不超过10次、不超过 15次、或不超过20次。在任何上述冷冻保藏的群的另一特定实施方案中，所述干细胞在所 述容器内进行扩增。 本发明进一步提供了肿瘤细胞抑制性组合物，S卩，可检测地抑制肿瘤细胞或肿瘤 细胞群增殖、或抑制肿瘤生长的组合物。在一实施方案中，本发明提供了包含上清液的组合 物，所述上清液来源于本发明中描述的任何分离的胎盘细胞群的培养物。在另一实施方案 中，本发明提供了包含培养基的组合物，所述培养基来源于分离的胎盘干细胞的培养物，其 中所述胎盘细胞(a)附着于基质;(b)表达CD200和HLA-G ;或表达CD73、 CD105和CD200 ; 或表达CD200和0CT-4 ;或表达CD73、CD105和HLA-G ;或表达CD73和CD105，且当所述群在
允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含胎盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多 个胚样体；或表达0CT-4，且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含胎 盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；和(c)可检测地抑制肿瘤细胞或肿瘤细 胞群的增殖、或肿瘤生长，其中所述胎盘干细胞的培养物已经在所述培养基中培养了 24小 时或更久。 在另一特定实施方案中，任何上述组合物包含基质。在更特定的实施方案中，所述 基质是三维支架。在另一更特定的实施方案中，所述基质包括胶原、明胶、层粘连蛋白、纤粘 连蛋白、果胶、鸟氨酸、或玻璃粘连蛋白。在另一更特定的实施方案中，所述基质是羊膜或羊 膜来源的生物材料。在另一更特定的实施方案中，所述基质包括胞外膜蛋白。在另一更特定 的实施方案中，所述基质包括合成的化合物。在另一更特定的实施方案中，所述基质包括生物活性化合物。在另一更特定的实施方案中，所述生物活性化合物是生长因子、细胞因子、 抗体、或小于5000道尔顿的有机分子。 本发明还提供了包含胎盘干细胞的药物组合物，所述胎盘干细胞经过遗传改造以 产生与肿瘤抑制相关的重组或外源性细胞因子。例如，在一实施方案中，本发明提供了包含 大量胎盘干细胞的药物组合物，其中所述胎盘干细胞经过改造表达外源性IFN-P或IL-2。 在特定实施方案中，所述胎盘干细胞以一定量表达外源性IFN-P或IL-2，与不表达外源性 IFN-P或IL-2的胎盘干细胞相比，当所述肿瘤细胞与所述胎盘干细胞接触时，所述量导致 对肿瘤细胞增殖的可检测的更大抑制。在更特定的实施方案中，所述胎盘干细胞(a)附着 于基质；(b)表达CD200和HLA-G ;或表达CD73、CD105和CD200 ;或表达CD200和0CT-4 ;或 表达CD73、 CD105和HLA-G ;或表达CD73和CD105，且当所述群在允许胚样体形成的条件下 培养时，有助于在包含干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；或表达0CT-4，且当 所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含干细胞的胎盘细胞群中形成一个 或多个胚样体；和(c)可检测地抑制肿瘤细胞或大量肿瘤细胞的增殖、或肿瘤生长。
3. l定义 如本发明中使用的，术语"约"表示与所述值例如±10%的偏差。 如本发明中使用的，术语"SH2"指与标记CD105上的表位结合的抗体。因此，被称
为SH2+的细胞是CD105+的。参见例如美国专利号5， 486， 359。 如本发明中使用的，术语"SH3"和"SH4"指与标记CD73上的表位结合的抗体。因 此，被称为SH3+和/或SH4+的细胞是CD73+的。参见例如美国专利号5， 486， 359。
如本发明中使用的，术语"分离的干细胞"是指基本上与干细胞来源的组织(如胎 盘)中的其它、非干细胞分离的干细胞。如果在例如干细胞的收集和/或培养中，从干细胞 中去除了至少50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%，或至少99%的与干细胞天然相关 的非干细胞，则该干细胞是"分离的"。 如本发明中使用的，术语"分离的细胞群"是指基本上与细胞群来源的组织(如胎 盘)中的其它细胞分离的细胞群。如果在例如干细胞的收集和/或培养中，从干细胞中去 除了至少50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%，或至少99 %的与细胞群或者衍生细胞 群的细胞天然相关的细胞，则该干细胞是"分离的"。 如本发明中使用的，术语"胎盘干细胞"指不考虑形态学、细胞表面标记、或原代培 养后的传代数，来源于哺乳动物胎盘的干细胞或前体细胞，其附着于组织培养基质上(例 如组织培养塑料或纤粘连蛋白包被的组织培养板)。术语"胎盘干细胞"涵盖了来源于哺 乳动物胎盘的任何部分的干细胞或前体细胞，包括羊膜、绒毛膜、羊膜_绒毛膜盘、和/或脐 带，以及来源于胎盘灌流液的细胞。然而，本发明中使用的术语"胎盘干细胞"不表示来源 于脐带血的滋养层或细胞。如果细胞保留了干细胞的至少一种属性，例如分化为至少一种 其它细胞类型的能力，则认为该细胞是"干细胞"。 如本发明中使用的，当特定标记是可检测的时，则干细胞对该标记是"阳性"的。例 如，由于CD73在胎盘干细胞上以可检测地大于背景(例如，与同型对照相比)的量可检测， 因此胎盘干细胞对CD73为阳性的(即，CD73+)。当标记可用于将所述细胞与至少一种其它 细胞类型区分开时，或当所述标记在细胞中存在或表达时可用于选择或分离所述细胞，则 该细胞也是所述标记阳性的。
在本方法的上下文中，"肿瘤细胞"是指表现出非正常生长模式的任何细胞，包括 良性但增生的细胞、癌细胞、转移细胞等。"肿瘤细胞"可以是例如，实体瘤中的细胞、或具有 形成实体瘤的潜力或能力的细胞、或非实体瘤的细胞，例如血癌细胞。在一些实施方案中， 所述肿瘤细胞是来源于上皮、腺体或造血细胞来源的细胞。在某些实施方案中，所述肿瘤细 胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白 血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞。 如本发明中使用的，"抑制肿瘤细胞或大量肿瘤细胞增殖"是指与对照或标准相 比，降低肿瘤细胞或大量肿瘤细胞的增殖量。例如，将例如大量胎盘干细胞存在时肿瘤细胞 或大量肿瘤细胞的增殖与不存在该胎盘干细胞时相同类型的肿瘤细胞或大量肿瘤细胞的 增殖相比。该术语涵盖了肿瘤细胞或大量肿瘤细胞的增殖的可检测的降低、增殖的中止、或 肿瘤细胞数量的下降。
4.
图1 :来源于灌流液(A)、羊膜(B)、绒毛膜(C)、或羊膜_绒毛膜盘(D)、或脐带干
细胞(E)的胎盘干细胞的活力。X-轴上的数字表示从中获得干细胞的胎盘。 图2 :由FACSCalibur测定的来源于灌流液(A)、羊膜(B)、绒毛膜(C)、或羊膜_绒
毛膜盘(D)、或脐带(E)的HLA ABC—/CD45—/CD347CD133+细胞的百分比。X-轴上的数字表
示从中获得干细胞的胎盘。 图3 :由FACSAria.测定的来源于灌流液(A)、羊膜(B)、绒毛膜(C)、或羊膜-绒毛 膜盘(D)、或脐带(E)的HLA ABC—/CD45—/CD347CD133+细胞的百分比。X-轴上的数字表示 从中获得干细胞的胎盘。 图4 :在来源于胎盘灌流液的干细胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD117、 CD200的表达。 图5 :在来源于羊膜的干细胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、CD117、CD200的表达。 图6 :在来源于绒毛膜的干细胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、CD117、CD200的表达。 图7 :在来源于羊膜-绒毛膜盘的干细胞中的HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、 CD90、 CD105、 CD117、 CD200的表达。 图8 :在来源于脐带的干细胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、CD117、CD200的表达。 图9 :在来源于灌流液(A)、羊膜(B)、绒毛膜(C)、或羊膜_绒毛膜盘(D)、或脐带 (E)的干细胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD117、 CD200的平均表达。 图10 :胎盘干细胞和脐带干细胞抑制淋巴细胞样细胞系(LCL)肿瘤细胞生长。LCL 单独培养，或与来源于羊膜-绒毛膜(AC)或羊膜(AM)的胎盘干细胞，或来源于脐带(UC) 的干细胞共培养17天。胎盘干细胞与LCL的比例是2 : 1。计数大AAD—细胞(对于UC，n =3)。 图11 :胎盘干细胞与骨髓来源的间充质干细胞(BM-MSC) —样有效地杀死肿瘤细胞。显示了 LCL与BM-MSC或脐带(UC)干细胞的6天共培养(n = 1)。 图12 :胎盘干细胞肿瘤抑制的剂量依赖性。组织细胞性瘤、慢性髓性白血病
(CML)、乳腺癌、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、和结肠癌细胞单独孵育，或与胎盘干细胞以
i : 2、i : i、i.5 : l和2 : i的比例一起孵育。在共培养后，确定活的7-aad—细胞的数
量。然后计算自由生长培养物的胎盘干细胞抑制。在图例中，自由生长的肿瘤细胞的绝对
数在每个细胞系说明后的括号内给出(数字表示105个细胞)。除LCL n = 4々h，N=2。
附图13A和13B :胎盘干细胞肿瘤抑制的抑制和接触依赖性。A :在transwells (黑 色柱)或开放孔(A，空心柱)中，组织细胞性瘤、慢性髓性白血病、乳腺导管癌、LCL、视网膜 瘤、肺癌、乳腺癌、和ALL细胞单独孵育，或与胎盘干细胞以1 : l的比例一起孵育。在6天 后，计数活的7-AAD—细胞，并根据自由生长培养物中的细胞计数来计算抑制(B，计数的插 入)。B :根据抑制数据，计算接触依赖性。除LCL n = 2夕卜，Tra固ell :n = 1。
图14 :来源于于结果显示在附图13A和13B中的实验中的上清液中高表达的细胞 因子。在测试的25种细胞因子中，显示了 LCL和组织细胞性淋巴瘤的IL-6、IL-8和MCP-1。 比较图15A和15B。 图15A和15B :LCL/胎盘干细胞共培养物的细胞因子分泌谱。A ;LCL单独或与胎 盘干细胞在开口孔(LCL PDAC)或transwell(LCL PDACTW)中一起培养。用流式细胞仪计 数活的CD23+细胞。B ;用Luminex测定来源于A中实验中的上清液。N = 2。
图16A和16B :A :胎盘干细胞与骨髓间充质干细胞(BM-MSC)对肿瘤细胞的抑制。 巨核细胞白血病细胞系MEG-01、组织细胞性淋巴瘤、视网膜瘤、和慢性髓性白血病细胞单独 孵育，或与脐带干细胞(UC)、羊膜-绒毛膜胎盘干细胞(AC)、或BM-MSC—起孵育。在共培养 6天后，确定每种共培养物的活的AAD—细胞的数量。B :胎盘干细胞的肿瘤细胞抑制的时程。 MEG-01细胞单独孵育，或与人脐带上皮细胞(HUVEC)、 BM-MSC、或胎盘干细胞(PDAC)共培 养。在共培养开始后第1、2、3、4和6天，确定每种培养物中的活细胞(A皿exin V—、7_AAD—) 数量。 图17 :MEG-Ol细胞的胎盘干细胞肿瘤抑制的接触依赖性。来源于MEG-01/脐 带干细胞共培养物的条件培养基抑制巨核细胞白血病细胞系(MEG-01)的肿瘤细胞生长。 MEG-01细胞单独培养，或与脐带干细胞(MEG/UC)直接共培养，或在条件培养基(1 : 2或 1 : IO比例)中培养，所述条件培养基收获自抑制性的MEG-01/脐带干细胞共培养物(UC)、 MEG-01/骨髓间充质干细胞共培养物(BM)、或MEG-01/HUVEC共培养物(H)。在共培养6天 后，确定活细胞(Annexin V—、7_AAD—)的数量。 图18 :MEG-01/胎盘干细胞共培养物的细胞因子分泌谱。MEG-01、胎盘干细胞 (PDAC) 、 BM-MSC、禾P HUVEC细胞单独培养，或以下列组合共培养MEG-01/HUVEC、 MEG-01/ BM-MSC、或MEG-01/PDAC。收获7天培养物的上清液，并用Luminex测定血小板来源的生 长因子-AA(PDGF-AA)、颗粒细胞-单核细胞集落剌激因子(GM-CSF)、生长相关的原癌基 因-a (GROa)，和白血病抑制因子(LIF)的分泌。所述量以pg/ml显示。
图19 :对基质细胞衍生因子(SDF-1)产生应答的脐带干细胞(UC1)的迁移。UC1 胎盘干细胞在无血清培养基(基线)，或含有10% FBS、 SDF-1、或SDF-1加CXCR4抑制剂 AMD3100的培养基中孵育24小时。在向所述细胞中添加CYQUANT⑧GR染料后，用荧光 读板器在480nm/520nm处测量荧光。
5.发明详述 5. 1利用胎盘干细胞抑制肿瘤细胞 本发明提供了利用胎盘干细胞抑制肿瘤细胞的增殖，和抑制肿瘤的生长。在一实
施方案中，本发明提供了抑制肿瘤细胞或大量肿瘤细胞增殖、或肿瘤生长、或非实体瘤细胞
或大量非实体瘤细胞增殖的方法，包括将肿瘤细胞、或肿瘤与大量胎盘干细胞接触一段时
间，所述时间足以使所述胎盘干细胞可检测地抑制肿瘤细胞的增殖或肿瘤的生长。 胎盘干细胞是例如在本发明中他处描述的胎盘干细胞(参见5. 2节)。用于肿瘤
细胞抑制的胎盘干细胞可来源于或获得自单个胎盘或多个胎盘。用于肿瘤细胞抑制的胎盘
干细胞也可来源于单个物种，例如预期接受者的物种或预期其肿瘤细胞功能将被降低或抑
制的物种，或可来源于多个物种。胎盘干细胞可来源于完整的胎盘或其任何部分，例如羊
膜、绒毛膜、羊膜_绒毛膜盘、或脐带。来源于胎盘的任何部分的胎盘干细胞可在本发明的
方法中使用。可以通过本领域技术人员已知的任何方法从胎盘或其部分收集胎盘干细胞，
例如灌流或酶促消化。 肿瘤细胞可以是任何表现出成瘤性细胞生长和增殖的细胞，不论恶性或良性，并 包括前癌性和癌性细胞。肿瘤细胞的实例包括但不限于癌细胞、淋巴瘤细胞、母细胞瘤细 胞、肉瘤细胞、和白细胞细胞。肿瘤细胞更特定的实例包括乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、结 肠癌细胞、鳞状上皮细胞癌细胞、小细胞肺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、食道癌细胞、胰腺癌 细胞、胶质母细胞瘤、子宫癌细胞、卵巢癌细胞、肝癌细胞、膀胱癌细胞、肝癌细胞、结肠直肠 癌细胞、子宫内膜癌细胞、唾液腺癌细胞、肾癌细胞、肝癌细胞、外阴癌细胞、甲状腺癌细胞、 肝肉瘤细胞、和多种类型的头颈癌细胞。在特定实施方案中，所述肿瘤细胞是巨核母细胞淋 巴瘤细胞、急性淋巴母细胞白血病细胞、急性T-细胞白血病、组织细胞性淋巴瘤细胞、骨髓 急性髓性白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞。
可以通过对怀疑癌化的组织实施组织切片或根据体液样品(例如从血样分离或 纯化的细胞)来确定个体中肿瘤细胞的存在。然后可利用多种生物学、分子学、形态学、和 细胞学方法来表征癌细胞或组织。特别的，生物学和分子标记可用来评估特征，如细胞来源 的类型(如上皮细胞)、细胞的特定类型(例如器官类型，如乳腺或前列腺)、细胞生长或细 胞生长潜力、细胞生长阻断、和超倍性状态。这些细胞标记选自但不限于分子、生物化学、和 生物学标记和探针，这些标记单独使用或组合使用。 在本发明的上下文中，"接触"涵盖了在体外，例如在单个容器(如培养皿、瓶、小 瓶等)中，将胎盘干细胞和肿瘤细胞放置于一起。"接触"还涵盖了在体内，例如同一个体 (例如哺乳动物，如小鼠、大鼠、狗、猫、绵羊、山羊、马、人等)中将胎盘干细胞和肿瘤细胞 放置于一起，例如，通过将胎盘干细胞静脉内施用至个体，通过直接注射到肿瘤位点中，等 等。在体内接触的一些实施方案中，所述胎盘干细胞和所述肿瘤细胞是细胞培养物中的细 胞。在其它一些实施方案中，所述细胞是共培养在相同的物理空间中的，例如在同一培养皿 或培养皿的孔中。在另一实施方案中，所述接触不要求所述胎盘干细胞和所述肿瘤细胞间 的直接物理接触。例如，所述接触可以包括在独立的物理空间例如位于细胞培养皿的分离 的孔中培养所述胎盘干细胞和所述肿瘤细胞，其中胎盘干细胞和肿瘤细胞共享所述胎盘干 细胞和所述肿瘤细胞的培养基。在体内接触的某些实施方案中，胎盘干细胞和肿瘤细胞对 于个体都是外源性的，即，两种类型的细胞都不是来源于个体内。在另一实施方案中，所述肿瘤细胞是通过肿瘤发生在个体内产生的肿瘤细胞，即，肿瘤细胞对个体是内源性的。在 优选的实施方案中，所述接触(体外或体内)进行足够长的时间，并与足够数量的胎盘干细 胞接触，从而在所述接触后的一段时间，足以使肿瘤细胞的增殖产生可检测的抑制。更优选 的，在多个实施方案中，与缺少胎盘干细胞的条件下的免疫功能相比，在所述接触后的一段 时间，所述接触足以抑制肿瘤细胞增殖至少50 % 、60 % 、70 % 、75 % 、80 % 、90 %或95 % 。甚 至更优选的，肿瘤细胞或大量肿瘤细胞的增殖被完全抑制，从而在所述接触后的一段时间， 所述肿瘤细胞不增殖，或其增殖不足以增加肿瘤细胞的总数。在多个实施方案中，该时间段 是1、2、3、4、5、6或7天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周或更长。 肿瘤细胞的抑制，例如个体中的肿瘤细胞，可以使用对肿瘤细胞增殖或肿瘤生长 产生可检测的抑制所需要量的胎盘干细胞。例如，在本方法的多个实施方案中，大量胎盘 干细胞与大量肿瘤细胞，例如，个体内的肿瘤细胞接触，其中所述大量胎盘干细胞包含约 1乂105个胎盘干细胞、约1X106个胎盘干细胞、约1X107个胎盘干细胞、约1X108个胎盘 干细胞、约1X1(^个胎盘干细胞、约1X10"个胎盘干细胞、约1X10"个胎盘干细胞、约 1X1012个胎盘干细胞或更多。 在其它实施方案中，所述方法包括向所述个体施用每千克个体体重至少约 1X1()5、至少约1X1()6、至少约1X1()7、或至少约1X1()8个胎盘干细胞。在特定实施方案中， 向含有大量肿瘤细胞的个体施用每千克个体体重约1百万个胎盘干细胞。
在多个更特定的实施方案中，本方法包括施用约l倍、2倍、3倍、4倍、5倍，或超过 5倍于个体中肿瘤细胞数量的胎盘干细胞。可使用本领域已知的任何方法来确定个体中的 肿瘤细胞数量。肿瘤细胞定量的示例性方法描述于美国专利号6， 365， 362和6， 645， 731中； Mehes等人，Hemtologia31(2) :97-109(2001);禾口 Hardingham等人，Cancer Research 53: 3455-3458(1993)，其全文在此全部引用作为参考。在多个更特定的实施方案中，所述方法 包括基于个体的体重施用大量胎盘干细胞。例如，所述方法包括向所述个体施用约1X103 个胎盘干细胞/kg、5X 103个胎盘干细胞/kg、 1 X 104个胎盘干细胞/kg、5X 104个胎盘干 细胞/kg、 1 X 105个胎盘干细胞/kg、5 X 105个胎盘干细胞/kg、 1 X 106个胎盘干细胞/kg、 5 X 106个胎盘干细胞/kg、 1 X 107个胎盘干细胞/kg、5 X 107个胎盘干细胞/kg、或约1 X 108 个胎盘干细胞/kg。在多个更特定的实施方案中，所述方法包括向所述个体施用至少约 1 X 103个胎盘干细胞/kg、至少约5X 103个胎盘干细胞/kg、至少约1 X 104个胎盘干细胞/ kg、至少约5X 104个胎盘干细胞/kg、至少约1 X 105个胎盘干细胞/kg、至少约5X 105个胎 盘干细胞/kg、至少约1 X 106个胎盘干细胞/kg、至少约5X 106个胎盘干细胞/kg、至少约 1 X 107个胎盘干细胞/kg、至少约5 X 107个胎盘干细胞/kg、或至少约1 X 108个胎盘干细胞 /kg。 在其它多个更特定的实施方案中，所述胎盘干细胞已经在体外增殖不超过30次
群倍增、不超过20次群倍增、不超过10次群倍增、或不超过5次群倍增。在另一特定实施
方案中，所述胎盘干细胞已被冷冻保藏并在所述接触前解冻。在本方法的其它特定实施方
案中，与缺少所述胎盘干细胞条件下的等量肿瘤细胞的增殖相比，所述胎盘干细胞抑制所
述肿瘤细胞增殖约20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%或95%。 有利地，在用于例如在个体中抑制肿瘤细胞生长或增殖前，可筛选胎盘干细胞，例
如来源于特定的个体或个体库、来源于特定组织等等的胎盘干细胞的肿瘤抑制活性。因此，在特定实施方案中，利用胎盘干细胞抑制肿瘤细胞增殖或生长的方法包括在向所述个体 施用所述胎盘干细胞之前，在体外筛选所述胎盘干细胞的肿瘤细胞生长抑制活性。在本方 法的更特定的实施方案中，在向所述个体施用前，与缺少所述胎盘干细胞条件下的等量肿 瘤细胞的增殖相比，所述胎盘干细胞被证实在体外可抑制肿瘤细胞增殖例如，至少约20%、 30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、或95%，其中所述增殖通过在一段时间内相 同条件下所产生的细胞数来测量。所述胎盘干细胞可以通过直接接触、通过可溶性因子、 或通过两者来抑制肿瘤细胞。因此，在本方法的其它更特定的实施方案中，在向所述个体 施用前，在体外在直接培养试验、在transwell试验、或更优选的同时在直接培养试验和 transwell试验中验证了所述胎盘干细胞抑制肿瘤细胞增殖。 可以利用任何肿瘤细胞来筛选胎盘干细胞对肿瘤细胞增殖或生长的抑制，但更有 效的筛选是那些在受感染的个体中的复现或试图复现肿瘤抑制的筛选。例如，在另一特定 实施方案中，针对与施用所述胎盘干细胞的个体内的肿瘤细胞具有相同细胞类型(例如 上皮、鳞状上皮等)、相同组织起源(例如乳腺、前列腺等)、或更优选的，相同细胞类型和 相同组织起源的肿瘤细胞，在体外筛选所述胎盘干细胞的肿瘤生长抑制活性。在另一更特 定的实施方案中，针对来源于所述个体的肿瘤细胞活体切片的、或从所述个体的血样纯化 或分离的肿瘤细胞，在体外筛选所述胎盘干细胞的肿瘤生长抑制活性。 在本方法的多个更特定的实施方案中，所述胎盘干细胞来源于羊膜、绒毛膜、羊 膜_绒毛膜、或脐带、或来源于胎盘灌流液，并在向所述个体施用前，与缺少所述干细胞条 件下的等量肿瘤细胞的增殖相比，所述胎盘干细胞被证实可在体外抑制肿瘤细胞增殖例 如，至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、或95%。
对于体内接触胎盘干细胞和内源性肿瘤，例如实体瘤或血癌，所述胎盘干细胞可 以采用本领域技术人员已知的向个体有效导入活细胞的任何方式来导入个体中。例如，可 以通过静脉内灌流，或肌肉内、腹膜内、真皮内等方法导入胎盘干细胞。在优选的实施方案 中，所述胎盘干细胞在肿瘤或肿瘤细胞的位点或周边被注射至个体体内。所述细胞还可以 通过移植，例如天然或人造基质，如明胶来导入，其中所述胎盘干细胞陷入(enmesh)其中， 并且一旦移植后，所述细胞可从中长出。此类基质的非限制性实例提供在如下5.6. 1.4节 中。 通过任何这类方法或本领域技术人员已知的其它方法将胎盘干细胞导入个体中， 所述的导入足以有助于所述胎盘干细胞和肿瘤细胞之间的接触。将胎盘干细胞导入个体， 特别是具有内源性肿瘤细胞的个体，可以包括单次导入，或在若干小时、若干天、若干星期、 若干月或若干年内的多次导入。胎盘干细胞的每次导入可以包括一定数量的干细胞，所述 量本身或在聚集物中足以可检测地抑制大量肿瘤细胞的增殖。对于体内施用，所述胎盘干 细胞可配制成如下述5. 6. 1节中描述的药物组合物。 在体外实验中可以确定在体内条件下抑制的程度，例如，通过比较在优化生长条 件下肿瘤细胞或大量肿瘤细胞在一段时间内产生的肿瘤细胞数量和接触胎盘干细胞的等 量肿瘤细胞在等量时间内产生的肿瘤细胞数量。细胞(包括肿瘤细胞)的增殖可以通过 任何本领域已知的方法来评估。例如，可以在多个时间点对培养细胞或个体内细胞进行取 样，并采用血球计数器或类似仪器进行计数。所述肿瘤细胞可以采用被设计分离进入子细 胞的非降解染料来染色，例如，用溴脱氧嘧啶(BrDU)、二醋酸羧基荧光素(CFSE)、或OregonGreen 488羧酸二乙酸(Invitrogen)来染色，并采用血细胞计数器来确定染色的程度。当 所述肿瘤细胞与胎盘干细胞接触，且比不接触胎盘干细胞的肿瘤细胞表现出可检测的更低 的每细胞染色量(例如，可检测的更低的平均每细胞染色量)时，所述胎盘干细胞抑制肿瘤 细胞生长。对于特定数量的胎盘干细胞和一定量的肿瘤细胞，从在体外实验中抑制的程度 可以外推出在个体内肿瘤或肿瘤细胞的抑制程度。 肿瘤生长的抑制可采用本领域已知的用于肿瘤成体内像或检测的任何方法来评 估。例如，所述肿瘤细胞可采用肿瘤特异性抗体来标记，并可采用例如PET扫描或CAT扫描 来成像，或可以利用x-射线来成像。肿瘤生长抑制的测定可通过，例如对肿瘤图像的视觉 检查，通过确定肿瘤标记密度，通过确定肿瘤图像中肿瘤的区域等，来确认。体内肿瘤生长 抑制的测定还可通过，检测或关注肿瘤相关症状的任何消除、改善、或恶化的减缓来确定。
所述个体可以是哺乳动物，例如人。在另一更特定的实施方案中，所述接触包括静 脉内向所述个体施用所述胎盘细胞。在另一更特定的实施方案中，所述接触包括向所述个 体的肿瘤位点或邻近位点施用所述胎盘细胞。 所述胎盘干细胞还可以与一种或多种第二类型的干细胞共同施用，例如来源于骨
髓的间充质干细胞。此类第二干细胞可以与胎盘干细胞以例如约i : io至约io : i的比
例向个体施用。 所述胎盘干细胞还可以与一种或多种不是干细胞的细胞类型共同施用。在特定实
施方案中，所述胎盘干细胞与第二种个体自体的、大量细胞一起施用。在更特定的实施方案 中，所述胎盘干细胞与成纤维细胞共同施用。在一些实施方案中，所述成纤维细胞是自体的
成纤维细胞。所述成纤维细胞可以与胎盘干细胞以例如约i : io至约io : i的比例向个 体施用。 所述胎盘干细胞还可以与一种或多种干细胞化学趋化剂一起施用。在特定实施方 案中，所述干细胞化学趋化剂是SDF-1。
5. 2胎盘干细胞和胎盘干细胞群 本发明抑制肿瘤细胞增殖的方法使用胎盘干细胞，即可从胎盘或其部分获得的干 细胞，其(1)附着于组织培养基质；(2)具有分化为非胎盘细胞类型的能力；和(3)在足够 的数量下，具有可检测地抑制肿瘤细胞或大量肿瘤细胞增殖的能力，或可检测地抑制肿瘤 生长的能力。胎盘干细胞不来源于血液，例如，胎盘血或脐带血。在本发明的方法和组合物 中使用的胎盘干细胞具有下述能力，并且可根据其能力进行选择在体外或体内抑制癌细 胞或大量癌细胞增殖，或在体内抑制肿瘤生长。 胎盘干细胞在起源上可以是胎儿或母体的(即，可以具有母亲或胎儿的基因型)。 胎盘干细胞群，或含有胎盘干细胞的细胞群，可包含在起源上仅为胎儿或母体的胎盘干细 胞，或者可以包含胎儿和母体起源的胎盘干细胞的混合群。所述胎盘干细胞，和含有胎盘干 细胞的细胞群可以通过如下描述的形态学、标记和培养特征来鉴别和选择。
5. 2. 1物理和形态学特征 当在原代培养或细胞培养时，本发明中使用的胎盘干细胞附着于组织培养基质 上，例如组织培养容器的表面(如组织培养塑料)。培养中的胎盘干细胞一般呈现出成纤维 细胞样、星状外观，从中央细胞体延伸出大量胞质突起。然而，所述胎盘干细胞与在相同条 件下培养的成纤维细胞在形态学上不同，胎盘干细胞表现出大量多于成纤维细胞的此类突起。形态学上，胎盘干细胞也与造血干细胞是可区分的，其在培养中通常呈现出更圆的，或 鹅卵石状的形态。 5. 2. 2细胞表面、分子和遗传标记 在本发明的方法和组合物中有用的胎盘干细胞和胎盘干细胞群，表达大量可用于 鉴别和/或分离干细胞、或包含干细胞的细胞群的标记。本发明的胎盘干细胞和干细胞群 (即，两种或多种胎盘干细胞)包括从胎盘或其任何部分(例如羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛 膜盘、胎盘小叶、脐带等)直接获得的干细胞和含有干细胞的细胞群。胎盘干细胞群还包括 培养中的胎盘干细胞群(即，两种或多种)，和容器例如袋子中的群。然而，胎盘干细胞不是 滋养层。 胎盘干细胞一般表达标记CD73、 CD105、 CD200、 HLA-G、和/或0CT-4，并且不表达 CD34、 CD38、或CD45。胎盘干细胞还可以表达HLA-ABC (MHC-1)禾P HLA-DR。这些标记可用 于鉴别胎盘干细胞，并将胎盘干细胞与其它干细胞类型区分开。由于胎盘干细胞可以表达 CD73和CD105，其可具有间充质干细胞-样特征。然而，由于胎盘干细胞可以表达胎儿_特 异性标记CD200和HLA-G，其可以与间充质干细胞区分开，例如骨髓来源的间充质干细胞其 既不表达CD200也不表达HLA-G。以相同的方式，缺少CD34、CD38和/或CD45的表达可鉴 别胎盘干细胞为非造血干细胞。 在一实施方案中，本发明提供了包含大量为CD200+、 HLA-G+的胎盘干细胞的分离 的细胞群，其中所述干细胞可检测地抑制癌细胞增殖或肿瘤生长。在分离群的特定实施方 案中，所述干细胞还是CD73+和CD105+。在另一特定实施方案中，所述干细胞还是CD34一、 CD38—或CD45—。在更特定的实施方案中，所述干细胞还是CD34—、 CD38—、 CD45—、 CD73+和 CD105+。在另一实施方案中，当在允许胚样体形成的条件下培养时，所述分离群产生一个或 多个胚样体。 在另一实施方案中，本发明提供了包含大量为CD73+、CD105+、CD200+的胎盘干细胞 的分离的细胞群，其中所述干细胞可检测地抑制癌细胞增殖或肿瘤生长。在所述群的特定 实施方案中，所述干细胞是HLA-G+。在另一特定实施方案中，所述干细胞是CD34—、CD38—、或 CD45—。在更特定的实施方案中，所述干细胞是CD34—、CD38—、CD45—、和HLA-G+。在另一特定 实施方案中，当在允许胚样体形成的条件下培养时，所述细胞群产生一个或多个胚样体。
本发明还提供了包含大量为CD200+、 0CT-4+的胎盘干细胞的分离的细胞群，其中 所述干细胞可检测地抑制癌细胞增殖或肿瘤生长。在特定实施方案中，所述干细胞是0073+ 和CD105+。在另一特定实施方案中，所述干细胞是HLA-G+。在另一特定实施方案中，所述干 细胞是CD34—、CD38—、和CD45—。在更特定的实施方案中，所述干细胞是CD34—、 CD38—、 CD45—、 CD73+、CD105+、和HLA-G+。在另一特定实施方案中，当在允许胚样体形成的条件下培养时，所 述群产生一个或多个胚样体。 本发明还提供了包含大量为CD73+、 CD105+、和HLA-G+的胎盘干细胞的分离的细胞 群，其中所述干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)检测中可检测地抑制T细胞增殖。在上述大 量细胞的特定实施方案中，所述干细胞还是CD34—、CD38—、或CD45—。在另一特定实施方案中， 所述干细胞还是CD34—、 CD38—、和CD45—。在另一特定实施方案中，所述干细胞还是0CT-4+。 在另一特定实施方案中，所述干细胞还是CD200+。在另一更特定的实施方案中，所述干细胞 还是CD34—、 CD38—、 CD45—、 0CT-4+和CD200+。
本发明还提供了包含大量肿瘤细胞抑制性胎盘干细胞的分离的细胞群，所述干细 胞是CD73+、CD105+干细胞，其中所述大量的细胞当在允许胚样体形成的条件下培养时形成 一个或多个胚样体，且其中所述干细胞可检测地抑制癌细胞增殖或肿瘤生长。在特定实施 方案中，所述干细胞还是CD34—、 CD38—、或CD45—。在另一特定实施方案中，所述干细胞还是 CD34—、CD38—、和CD45—。在另一特定实施方案中，所述干细胞还是0CT-4+。在更特定的实施 方案中，所述干细胞还是0CT-4+、 CD34—、 CD38—、和CD45—。 本发明还提供包含大量胎盘干细胞的分离细胞群，所述胎盘干细胞是0CT-4+干细 胞，其中所述群当在允许胚样体形成的条件下培养时形成一个或多个胚样体，且其中所述 干细胞被鉴定为可检测地抑制癌细胞增殖或肿瘤生长。 在多个实施方案中，至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少 60 % 、至少70 % 、至少80 % 、至少90 % ，或至少95 %的所述分离的胎盘细胞是0CT-4+干细 胞。在上述群的特定实施方案中，所述干细胞是CD73+和CD105+。在另一特定实施方案中， 所述干细胞还是CD34—、CD38—或CD45—。在另一特定实施方案中，所述干细胞是CD200+。在 更特定的实施方案中，所述干细胞是CD73+、 CD105+、 CD200+、 CD34—、 CD38—和CD45—。在另一 特定实施方案中，所述群已经过扩增，例如传代至少1次、至少3次、至少5次、至少10次、 至少15次，或至少20次。 在任何上述实施方案中，本方法还可以包括选择表达ABC-p (胎盘特异性ABC转运 蛋白；参见例如Allikmets等人，Cancer Res. 58(23) :5337-9(1998))的胎盘细胞。本方 法还可以包括选择表现出至少一种对例如间充质干细胞特异性的特征的细胞，例如表达 CD29、表达CD44、表达CD90、或上述组合的表达。 在另一实施方案中，本发明提供了包含大量肿瘤细胞抑制性胎盘干细胞的分离细 胞群，所述干细胞是CD29+、 CD44+、 CD73+、 CD90+、 CD105+、 CD200+、 CD34—和CD133—。
在上述提到的胎盘干细胞的特定实施方案中，所述胎盘干细胞组成性分泌IL-6、 IL-8和单核细胞化学趋化剂蛋白(MCP-1)。 每种上述大量胎盘干细胞都可以包含从哺乳动物胎盘直接获得和分离的胎盘干 细胞，或者已经培养和传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30或更多代 的胎盘干细胞，或其组合。 上述肿瘤细胞抑制性的大量胎盘干细胞可以包含大约、至少、或不超过1X105、
5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108、1X109、5X109、1X1010、5X1010、
1X1011或更多个胎盘干细胞。 5. 2. 3选择和生产胎盘干细胞群 在另一实施方案中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中选择大量胎盘干细胞的方 法，包括选择胎盘细胞群其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少 60 % 、至少70 % 、至少80 % 、至少90 % 、或至少95 %的所述细胞是CD200+、 HLA-G+胎盘干细 胞，并且其中所述胎盘干细胞可检测地抑制癌细胞增殖和肿瘤生长。在特定实施方案中，所 述选择包括选择那些还是CD73+和CD105+的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选 择包括选择那些还是CD34—、CD38—或CD45—的干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择包 括选择那些还是CD34—、 CD38—、 CD45—、 CD73+和CD105+的干细胞。在另一特定实施方案中， 所述选择还包括选择那些当在允许胚样体形成的条件下培养时，形成一个或多个胚样体的大量胎盘干细胞。 在另一实施方案中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中选择大量胎盘干细胞的方 法，包括选择大量胎盘细胞其中至少10 % 、至少20 % 、至少30 % 、至少40 % 、至少50 % 、至少 60%、至少70%、至少80%、至少90%，或至少95%的所述细胞是CD73+、 CD105+、 CD200+胎 盘干细胞，并且其中所述胎盘干细胞可检测地抑制癌细胞增殖或肿瘤生长。在特定实施方 案中，所述选择包括选择那些还是^^-6+的干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择包 括选择那些还是CD34—、CD38—或CD45—的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择包 括选择那些还是CD34—、CD38—和CD45—的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择包 括选择那些还是CD34—、 CD38—、 CD45—和HLA-G+的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所 述选择还包括选择那些当在允许胚样体形成的条件下培养时，形成一个或多个胚样体的胎 盘细胞群。 在另一实施方案中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中选择大量胎盘干细胞的方 法，包括选择大量胎盘细胞其中至少10 % 、至少20 % 、至少30 % 、至少40 % 、至少50 % 、至少 60 % 、至少70 % 、至少80 % 、至少90 % 、或至少95 %的所述细胞是CD200+、 0CT-4+胎盘干细 胞，并且其中所述胎盘干细胞可检测地抑制癌细胞增殖和肿瘤生长。在特定实施方案中，所 述选择包括选择那些还是CD73+和CD105+的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选 择包括选择那些还是HLA-G+的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择包括选择那 些还是CD34—、CD38—和CD45—的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择包括选择那 些还是CD34—、 CD38—、 CD45—、 CD73+、 CD105+和HLA-G+的胎盘干细胞。 在另一实施方案中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中选择大量胎盘干细胞的方 法，包括选择大量胎盘细胞其中至少10 % 、至少20 % 、至少30 % 、至少40 % 、至少50 % 、至少 60 % 、至少70 % 、至少80 % 、至少90 % 、或至少95 %的所述细胞是CD73+、CD105+和HLA-G+胎 盘干细胞，并且其中所述胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)检测中可检测地抑制T细 胞增殖。在特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD34—、CD38—或CD45—的胎盘干细 胞。在另一特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD34—、CD38—和CD45—的胎盘干细 胞。在另一特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD200+的胎盘干细胞。在另一特 定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD34—、 CD38—、 CD45—、 0CT-4+和CD200+的胎盘干 细胞。 在另一实施方案中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中选择大量胎盘干细胞的方 法，包括选择大量胎盘细胞，其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至 少60 % 、至少70 % 、至少80 % 、至少90 % 、或至少95 %的所述细胞是CD73+、 CD105+胎盘干细 胞，并且其中所述大量细胞当在允许胚样体形成的条件下培养时，形成一个或多个胚样体， 并且其中所述干细胞可检测的抑制癌细胞增殖或肿瘤生长。在特定实施方案中，所述选择 包括选择那些还是CD34—、CD38—或CD45—的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择 包括选择那些还是CD34—、CD38—和CD45—的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择 包括选择那些还是0CT-4+的胎盘干细胞。在更特定的实施方案中，所述选择包括选择那些 还是0CT-4+、 CD34—、 CD38—和CD45—的胎盘干细胞。 在另一实施方案中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中选择大量胎盘干细胞的方 法，包括选择大量胎盘细胞，其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60 % 、至少70 % 、至少80 % 、至少90 % ，或至少95 %的所述分离的胎盘干细胞是0CT-4+ 干细胞，并且其中所述大量的细胞当在允许胚样体形成的条件下培养时，形成一个或多个 胚样体，并且其中所述干细胞可检测的抑制癌细胞增殖或肿瘤生长。在特定实施方案中，所 述选择包括选择那些还是CD73+和CD105+的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选 择包括选择那些还是CD34—、CD38—或CD45—的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选 择包括选择那些还是CD200+的胎盘干细胞。在更特定的实施方案中，所述选择包括选择那 些还是CD73+、 CD105+、 CD200+、 CD34—、 CD38—和CD45—的胎盘干细胞。 本发明还提供生产可以抑制肿瘤细胞增殖的胎盘干细胞群的方法。例如，本发明 提供了生产细胞群的方法，包括选择任何上述大量胎盘干细胞，并从其它细胞，例如，其它 胎盘细胞中分离大量胎盘干细胞。在特定实施方案中，本发明提供了生产细胞群的方法， 包括选择胎盘细胞，其中所述胎盘细胞(a)附着于基质；(b)表达CD200和HLA-G ;或表达 CD73、 CD105和CD200 ;或表达CD200和0CT-4 ;或表达CD73、 CD105和HLA-G ;或表达CD73 和CD105，且当所述群培养在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含干细胞的胎盘 细胞群中形成一个或多个胚样体；或表达0CT-4，并且当所述群培养在允许胚样体形成的 条件下培养时，有助于在包含干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；和(c)可检 测地抑制癌细胞增殖或肿瘤生长；以及从其它细胞中分离所述胎盘细胞来形成细胞群。
在更特定的实施方案中，本发明提供了生产细胞群的方法，包括选择胎盘干细胞， 其中所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD200和HLA-G;和(c)可检测的抑制癌 细胞增殖或肿瘤生长；并且从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一特定 实施方案中，本发明提供了生产细胞群的方法，包括选择胎盘干细胞，其中所述胎盘干细胞
(a) 附着于基质；(b)表达CD73、CD105和CD200，和(c)可检测的抑制癌细胞增殖或肿瘤生 长；并且从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一特定实施方案中，本发 明提供了生产细胞群的方法，包括选择胎盘干细胞，其中所述胎盘干细胞(a)附着于基质；
(b) 表达CD200和0CT-4，和(c)可检测的抑制癌细胞增殖或肿瘤生长；并且从其它细胞中 分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一特定实施方案中，本发明提供了生产细胞群的 方法，包括选择胎盘干细胞，其中所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD73和CD105，
(c) 当在允许胚样体形成的条件下培养时形成胚样体，和(d)可检测的抑制癌细胞增殖或 肿瘤生长；并且从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一特定实施方案中， 本发明提供了生产细胞群的方法，包括选择胎盘干细胞，其中所述胎盘干细胞(a)附着于 基质；(b)表达CD73、 CD105和HLA-G，和(c)在MLR中可检测的抑制CD4+或CD8+T细胞增 殖；并且从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。生产细胞群的方法包括选择胎 盘干细胞，其中所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达0CT-4， (c)当在允许胚样体形成 的条件下培养时形成胚样体，和(d)可检测地抑制癌细胞增殖或肿瘤生长；并且从其它细 胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。 对于上述选择胎盘干细胞群的方法，所述选择可以包括确定所述胎盘干细胞的样 品是否抑制癌细胞增殖，或抑制肿瘤生长，并且如果所述胎盘干细胞的样品可检测地抑制 癌细胞增殖或肿瘤生长，则选择胎盘干细胞群。
5. 2. 4培养生长 对于任何哺乳动物细胞，本发明中描述的胎盘干细胞的生长，都部分依赖于选择用于生长的特定培养基。在最优条件下，胎盘干细胞一般在3-5天内数量加倍。在培养过 程中，本发明的胎盘干细胞附着在培养基质上，例如组织培养容器的表面(例如组织培养
皿塑料、纤维粘连蛋白包被的塑料等)，并且形成单层细胞。 分离的胎盘细胞群包括本发明的胎盘干细胞，当在合适的条件下培养时，形成胚 样体，g卩，在附着的干细胞层上生长的三维细胞簇。胚样体内的细胞表达与极早期的干细 胞，例如0CT-4、 Nanog、 SSE3和SSE4相关的标记。如同本发明中描述的胎盘干细胞，胚样 体内的细胞一般不附着在培养基质上，但是在培养过程中仍然依附于附着的细胞。胚样体 细胞的活力依赖于附着的胎盘干细胞，在缺少附着的胎盘干细胞时不形成胚样体。因此，附 着的胎盘干细胞有助于在包含附着的胎盘干细胞的胎盘细胞群中的一个或多个胚样体的 生长。不希望受制于理论，胚样体细胞被认为在附着的胎盘干细胞上的生长与胚胎干细胞 在滋养层细胞上的生长相似。间充质干细胞，例如骨髓来源的间充质干细胞，在培养中不产 生胚样体。 5. 3获得胎盘干细胞的方法
5. 3. l干细胞收集组合物 本发明进一步提供了收集和分离胎盘干细胞的方法。 一般利用生理学可接受的溶 液，例如，干细胞收集组合物从哺乳动物胎盘中获得干细胞。干细胞收集组合物详细地在 2005年12月29日提交的名为"用于收集和保藏胎盘干细胞的改良组合物及利用组合物的 方法(Improved Composition forCollecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using theComposition)"的相关美国临时申请号60/754， 969中进行了描 述。 所述干细胞收集组合物可以包括适合干细胞收集和/或培养的任何生理学可接 受的溶液，例如，盐溶液(例如磷酸缓冲盐溶液、Kreb氏液、改良的Kreb氏液、Eagle氏液、 0. 9% NaCl等)、培养基(例如DMEM、 H. DMEM等)等。 干细胞收集组合物可以包括用于保存胎盘干细胞的一种或多种组分，S卩，从收集 时间到培养的时间内，保护胎盘干细胞免于死亡，或延缓胎盘干细胞的死亡，降低细胞群中 胎盘干细胞的死亡数等。此类组分可以是例如，凋亡抑制剂(例如半胱天冬酶抑制剂或 JNK抑制剂)、血管扩张剂(例如硫酸镁、抗高血压药物、心钠肽(ANP)、促肾上腺皮质激 素、皮质激素释放激素、亚硝基铁氰化钠、肼苯哒嗪、三磷酸腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸镁、 磷酸二酯酶抑制剂等)、坏死抑制剂(例如2-(lH-吲哚-3-基)-3-戊氨基-马来酰亚胺、 吡咯烷二硫代氨基甲酸盐、或氯硝西泮)、TNF-a抑制剂、和/或携氧全氟化碳(例如全氟 辛基溴、全氟癸基溴等)。 干细胞收集组合物可以包括一种或多种组织降解酶，例如金属蛋白酶、丝氨酸蛋 白酶、中性蛋白酶、RNA酶、或DNA酶等。此类酶包括但不限于胶原酶(例如胶原酶I、11、
ni或iv，来源于溶组织梭状芽胞杆菌的胶原酶等)、分散酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、
胃蛋白酶、LIBERASE、透明质酸酶等。 所述干细胞收集组合物可以包括杀菌或抑菌有效量的抗生素。在一些非限制性的 实施方案中，所述抗生素是大环内酯(例如妥布霉素)、头孢菌素(例如头孢氨苄、头孢 拉定、头孢呋辛、头孢罗齐、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄)、克拉仙霉素、红霉素、青霉 素(例如青霉素V)、或喹诺酮(例如氧氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星)、四环素、链霉素等。在特定实施方案中，所述抗生素是抗革兰氏(+)和/或革兰氏(_)细菌活性的，例如绿
月农假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、金黄色酉良月农葡萄球菌(staphylococcus aureus)等。 干细胞收集组合物还可以包括一种或多种下列化合物腺苷(约ImM至约50mM)、 D-葡萄糖(约20mM至约lOOmM)、镁离子(约ImM至约50mM)、分子量大于20， 000道尔顿的 大分子，在一实施方案中，以足够维持内皮完整性和细胞活性的量存在(例如合成的或天 然存在的胶体，多糖例如葡聚糖或聚乙二醇以约25g/l至约100g/l、或约40g/l至约60g/1 存在)、抗氧化剂(例如叔丁对甲氧酚、丁基羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素C或维生素E，以 约25iiM至约100iiM存在)、还原剂(例如N-乙酰半胱氨酸，以约O. lmM至约5mM存在)、 防止钙进入细胞内的试剂(例如维拉帕米，以约2iiM至约25iiM存在)、硝化甘油(例如 约0. 05g/L至约0. 2g/L)、抗凝剂，在一实施方案中，以足够帮助防止残留血液凝结的量存 在(例如，浓度为约1000单位/1至约100，000单位/1存在的肝素或水蛭素)、或含有阿米 洛利的化合物(例如以约1. 0 ii M至约5 ii M的量存在的阿米洛利、乙基异丙基阿米洛利、 环己基阿米洛利、二甲基阿米洛利、或异丁基阿米洛利)。
5. 3. 2胎盘的收集和处理 —般，在出生排出后立即回收人胎盘。在优选的实施方案中，在告知同意并采集患 者与胎盘相关的完整医疗史后，从患者处回收胎盘。优选的，在分娩后继续记录医疗史。此 类医疗史可用于调整胎盘或从其收获的干细胞的收获后的应用。例如，根据医疗史，人胎盘 干细胞可用于与胎盘相关的婴儿、或用于所述婴儿的父母、兄弟姐妹或其他亲戚的个人化 药物。 在回收胎盘干细胞之前，去除了脐带血和胎盘血。在一些实施方案中，在分娩后 回收胎盘中的脐带血。所述胎盘可以采用常规的脐带血回收方法。 一般使用针头或插管， 在重力帮助下，将胎盘放血(参见例如Anderson，美国专利号5， 372， 581 ;Hessel等人，美 国专利号5， 415， 665)。所述针头或插管通常置于脐静脉内，并且可以轻轻地按摩胎盘帮助 从胎盘中排出脐带血。可以商业方式来实施此类脐带血回收，例如LifeBank公司，Cedar Knolls，N. J. ，ViaCord，Cord Blood Registry and Cryocell。优选的，对所述月台盘通过重 力来放血不进行其他操作，从而使脐带血回收过程中的组织破坏最小化。
典型地，胎盘被从分娩室或初生室转移至另一地点，例如实验室，用于脐带血回收 和干细胞收集，例如，通过灌流或组织解离。所述胎盘优选的在无菌的、保温的转移装置 (维持胎盘温度在20-28t:)中转移，例如，将脐带近端夹紧的胎盘放置在无菌的、夹拉链封 闭的塑料袋中，然后将其放置在保温容器内。在另一实施方案中，所述胎盘在实质上如2005 年9月19日提交的未决美国专利申请号11/230， 760中描述的脐带血收集试剂盒中转移。 优选的，在分娩后4至24小时将胎盘递送至实验室。在某些实施方案中，在脐带血回收前， 夹紧脐带近端，优选的在插入胎盘的4-5cm(厘米)内。在其它实施方案中，在脐带血回收 后但是在胎盘的进一步处理前夹紧近端脐带。 在收集干细胞前，可以将胎盘储存在无菌条件下，并储存在室温或者5至25t:(摄 氏度)的温度下。所述胎盘可以储存超过48小时的时间，并且优选的在灌流胎盘以去除任 何残留的脐带血前储存4至24小时。所述胎盘优选的在5至25t:(摄氏度)下储存在抗凝 剂溶液中。合适的抗凝剂溶液是本领域公知的。例如，可以使用肝素或华法令钠(warfarinsodium)溶液。在优选的实施方案中，所述抗凝剂溶液含有肝素溶液(例如，在l : IOOO溶
液中1% w/w)。在收集胎盘干细胞前，放血的胎盘优选地储存不超过36小时。 —旦按照上述一般收集和制备，哺乳动物胎盘或其部分可以按照本领域已知的任
何方法处理，例如，可以被灌流或解离，如用一种或多种组织解离酶来解离从而获得干细胞。 5. 3. 3胎盘纟目织的物理解离和酶促消化 在一实施方案中，通过器官的物理解离，例如酶促消化，从哺乳动物胎盘中收集干 细胞。例如，可以在与本发明的干细胞收集组合物接触的同时，例如将胎盘或其部分压碎 (crush)、剪碎(shear)、绞碎(mince)、切块(dice)、切细(chop)、浸软(macerate)等，然 后将组织用一种或多种酶来消化。胎盘或其部分还可以被物理的解离，并用一种或多种酶 消化，然后将获得的材料浸入本发明的干细胞收集组合物或与本发明的干细胞收集组合物 混合。任何物理解离的方法均可以使用，只要通过如台盼蓝不相容可确定，所述解离方法 能使所述器官中多数的，更优选的大量，更优选的至少60 % 、 70 % 、80 % 、90 % 、95 % 、98 %或 99%的细胞存活。 在物理解离和/或酶促消化和干细胞回收前，所述胎盘可以被分割成部分。例如， 可以从羊膜、绒毛膜、胎盘绒毛叶或其任何组合中获得胎盘干细胞。脐带干细胞也可用于本 发明的方法。在优选实施方案中，胎盘干细胞来源于包含羊膜和绒毛膜的胎盘组织。在另 一特定实施方案中，胎盘干细胞来源于脐带。 一般的，胎盘干细胞可以通过将胎盘组织解离 为小块来获得，例如胎盘组织块的体积是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、 80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或约1000立方毫米。 优选的干细胞收集组合物包含一种或多种组织解离酶。酶促消化优选地使用酶 的组合，例如基质金属蛋白酶和中性蛋白酶的组合，如胶原酶和分散酶的组合。在一实施 方案中，胎盘组织的酶促消化使用了基质金属蛋白酶、中性蛋白酶和用于消化透明质酸 的粘多糖酶的组合，例如胶原酶、分散酶和透明质酸酶的组合或者LIBERASE(Boehringer Mannheim Corp. ， Indian即olis， Ind.)和透明质酸酶的组合。可用于裂解胎盘组织的其它 酶包括木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶、或弹性蛋白酶。 丝氨酸蛋白酶可被血清中的a2微球蛋白所抑制，因此用于消化的基质通常是无血清的。 在酶促消化过程中通常使用EDTA和DNA酶来增加细胞回收的效率。消化物优选的被稀释 从而避免干细胞陷入粘稠的消化物中。 任何组织消化酶的组合均可以使用。组织消化酶的典型浓度包括例如50-200U/ ml的I型胶原酶和IV型胶原酶，l-10U/ml的分散酶，和10-100U/ml的弹性蛋白酶。可以 组合使用蛋白酶，即在同一消化反应中使用两种或多种蛋白酶，或者可以按顺序相继使用 从而释放胎盘干细胞。例如，在一实施方案中，胎盘干细胞或其部分首先用合适量的I型胶 原酶按2mg/ml消化30分钟，然后用0. 25%的胰蛋白酶在37。C消化10分钟。丝氨酸蛋白 酶优选地在使用其它酶后再连续使用。 在另一实施方案中，在从干细胞收集组合物中分离干细胞之前，向含有干细胞的 干细胞收集组合物，或者向将在其中解离和/或消化组织的溶液中添加螯合剂来进一步解 离组织，所述螯合剂例如乙二醇双(2-氨基乙醚)-N， N，N' N'-四乙酸(EGTA)或乙二胺四 乙酸(EDTA)。
可以理解，当完整的胎盘或胎盘的一部分同时含有胎儿和母体细胞(例如，胎盘 的一部分包含绒毛膜或绒毛小叶)时，收集的胎盘干细胞将同时包含来源于胎儿和母体源 的胎盘干细胞的混合物。当胎盘的部分不含有或只含有可忽略量的母体细胞(例如，羊膜) 时，收集的胎盘干细胞将几乎只含有胎儿的胚胎干细胞。
5. 3. 4.胎盘灌流 还可以通过灌流哺乳动物胎盘来获得胎盘干细胞。灌流哺乳动物胎盘以获得干 细胞的方法公开在例如Hariri,美国专利号7， 045， 148中，和于2005年12月29日提交 的，名为"用于收集胎盘干细胞和保存器官的改良基质以及使用该组合物的方法(Improved Medium for Collecting PlacentalStem Cells and Preserving Organs and Methods of Using the Composition)"的相关的美国临时申请号60/754， 969中。 可以利用例如干细胞收集组合物作为灌流液，通过灌流例如通过胎盘脉管系统来 收集胎盘干细胞。在一实施方案中，通过使灌流液流经脐动脉和/或脐静脉来灌流哺乳动 物胎盘。可以利用如重力流入胎盘来实现灌流液在胎盘中的流动。优选的，利用泵如，蠕动 泵来迫使灌流液流经胎盘。例如，可以用套管，如TEFLON⑧或塑料套管对脐静脉进行插 管，所述套管与无菌的连接装置，如无菌管道相连。无菌的连接装置与灌流歧管相连。
在准备灌流中，胎盘优选的按脐动脉和脐静脉位于胎盘最高点的方式来定位 (如，悬挂)。可以通过灌流液，例如本发明的干细胞收集组合物，在胎盘脉管系统或在胎盘 脉管系统和相邻组织中的流通来灌流胎盘。在一实施方案中，脐动脉和脐静脉同时连接移 液器，所述移液器通过可变的连接管与灌流液的储器相连。所述灌流液流入脐静脉和动脉。 所述灌流液渗出和/或流经血管壁进入胎盘的周围组织，并从在孕期附着于母亲子宫上的 胎盘表面合适的开放脉管中收集。所述灌流液还可以通过脐带开口导入，并允许从与母体 子宫壁接触的胎盘壁中的开口流出或渗出。在另一实施方案中，所述灌流液流经脐静脉并 从脐动脉收集，或者流经脐动脉并从脐静脉收集。 在一实施方案中，在灌流过程中夹紧脐带近端，更优选的，在脐带插入胎盘的 4-5cm(厘米)内夹紧。 在放血过程中从哺乳动物胎盘首先收集的灌流液一般都被脐带血和/或胎盘血 残留的血红细胞着色。随着灌流继续和残留的脐带血细胞从胎盘中洗出，灌流液变得越来 越无色。 一般30至100ml (毫升)灌流液足以初步将胎盘放血，但根据观察的结果可以使 用或多或少的灌流液。 用于收集胎盘干细胞的灌流液体积可以根据收集的干细胞数量、胎盘大小、对 单个胎盘进行的收集次数等来变化。在不同的实施方案中，灌流液的体积可以自50mL 至5000mL、50mL至4000mL、50mL至3000mL、100mL至2000mL、250mL至2000mL、500mL至 2000mL、或750mL至2000mL。 一般，在放血后用700-800mL灌流液来灌流胎盘。
胎盘可以在数小时或数天的过程中进行多次灌流。当胎盘进行多次灌流时，可 以在容器或其它合适的器皿中在无菌条件下维持或培养，并用干细胞收集组合物或标准 灌流液(例如，普通的盐溶液如磷酸盐缓冲液("PBS"))灌流，其中含有或不含抗凝剂 (如，肝素、华法令钠、香豆素、双香豆素)，和/或含有或不含抗微生物剂(如，P-巯基乙 醇(0. lmM);抗生素如链霉素(如40-100 iig/ml)、青霉素(如40U/ml)、两性霉素B (如 0. 5ii g/ml))。在一实施方案中，将分离的胎盘维持或培养一段时间而没有收集灌流液，从而所述胎盘在灌流和收集灌流液前，被维持或培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个小时，或者2或3或更多天。灌流的胎盘可以被维 持用于再进行一次或多次灌流，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24或更多个小时，并用如700-800mL灌流液再灌流第二次。所述胎盘可以 灌流1、2、3、4、5或更多次，例如每1、2、3、4、5或6小时一次。在优选的实施方案中，胎盘的 灌流和灌流液的收集，如干细胞收集组合物，被重复直至回收的有核细胞数低于100细胞/ ml。不同时间点的灌流液可以分别进一步处理用来回收时间依赖性的细胞群，如干细胞。不 同时间点的灌流液也可以被混合。 不希望被任何理论约束，在放血并灌流胎盘足够长时间后，胎盘干细胞被认为迁 移到被放血和灌流的胎盘的微循环中，根据本发明的方法，收集干细胞，优选的通过灌流冲 洗到收集器皿中。灌流分离的胎盘不仅用来去除残留的脐带血，而且为胎盘提供了合适的 营养，包括氧气。所述胎盘可以采用那些用于去除残留脐带血细胞的相似溶液来培养和灌 流，优选的不用添加抗凝剂。 根据本发明方法的灌流导致获得的胎盘干细胞显著多于从未用所述溶液灌流，或 者未经其它处理(例如，通过组织解离如酶促消化)来获得干细胞的哺乳动物胎盘中可获 得的数量。在本文的上下文中，"显著多于"是指多至少10%。根据本发明的方法灌流产生 的胎盘干细胞显著多于例如，从被培养的胎盘或其一部分的培养基中可获得的胎盘干细胞 数量。 通过用包含一种或多种蛋白酶或其他组织解离酶的溶液灌流，可以从胎盘中分离 干细胞。在特定实施方案中，将胎盘或其一部分(例如，羊膜、羊膜和绒毛膜、胎盘小叶或绒 毛小叶、脐带或任何上述的组合)恢复至25-37°C ，并在200mL培养基中用一种或多种组织 解离酶孵育30分钟。收集灌流液中的细胞，降至4°C，并用包含5mM EDTA、2mM 二硫苏糖醇 和2mMI3 -巯基乙醇的冷却抑制剂混合物洗涤。数分钟后，用本发明的冷却的(如4°C )干 细胞收集组合物来洗涤干细胞。 可以理解，利用盘法(pan method)灌流获得的是胎儿和母体细胞的混合物，即通 过该方法，灌流液在其从胎盘的母体侧渗出后被收集。结果，通过该方法收集的细胞包含混 合的胎儿和母体来源的胎盘干细胞群。相反，仅通过胎盘脉管系统灌流，因为灌流液流经一 根或两根胎盘血管，并仅通过剩余的血管收集，将导致胎盘干细胞群的收集物几乎都是胎 儿来源的。 5. 3. 5胎盘干细胞的分离、分选和鉴别 来源于哺乳动物胎盘的干细胞，不论是否由灌流或酶促消化获得的，可以通过聚 蔗糖(Ficoll)梯度离心从其它细胞中初步纯化(即分离)。此类离心可以遵循任何标准 离心方法的速度等。例如，在一实施方案中，从胎盘收集的细胞是通过在5000 X g室温离心 15分钟从灌流液中回收的，其将细胞与例如污染的残渣和血小板分离开。在另一实施方案 中，胎盘灌流液被浓縮至约200ml，轻轻地铺在Fico11上，在22t:以约1100Xg离心20分 钟，收集低密度的细胞中间层用于进一步处理。 细胞沉淀可重悬于新鲜的干细胞收集组合物中，或适合干细胞维持的培养基中， 例如含有2U/ml肝素和2mM EDTA的MDM无血清培养基(GibcoBRL， NY)。可以利用例如 LYMPHOPREP (Nycomed Pharma， Oslo，挪威)，按照生产商的推荐方法来分离总单核细胞部分。 如本发明中使用的，"分离"的胎盘干细胞是指将一般在完整哺乳动物胎盘中与干 细胞相关的细胞去除至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。当 其存在于包含少于50%的一般在完整器官内与干细胞相关的细胞的细胞群中时，来源于器 官的干细胞就是"分离的"。 通过灌流或消化获得的胎盘细胞，例如，可以采用，如具有0.2% EDTA(Sigma， St. Louis M0)的0. 05%胃蛋白酶溶液通过差别胰酶消化来进一步或初步地分离。由于胎 盘干细胞一般在约5分钟内从塑料表面脱离，而其它附着的群一般要求超过20-30分钟孵 育，因此差别胰酶消化是可能的。在胰酶消化和利用例如胰蛋白酶中和溶液(TNS，Cambrex) 的胰蛋白酶中和反应后，可以收获脱离的胎盘干细胞。在分离附着细胞的一实施方案中，等 份的细胞，如5-10 X 106个细胞被放置在每个T-75瓶中，优选的纤连蛋白包被的T75瓶中。 在此类实施方案中，所述细胞可以用商购的间充质干细胞生长培养基(MSCGM) (Cambrex)， 并且置于组织培养箱(37°C，5% C02)中来培养。在10-15天后，通过用PBS洗涤从瓶中去 除非附着细胞。然后用MSCGM替代PBS。优选的每天检查培养瓶中不同附着细胞类型的存 在，并且特别的鉴别和扩增成纤维样细胞簇。 从哺乳动物胎盘中收集的细胞数量和类型可以被监测例如通过利用标准的细胞 检测技术，如流式细胞仪、细胞分选、免疫组织化学(例如，用组织特异性或细胞标志特异 性抗体染色)、荧光活化细胞分选(FACS)、磁性活化细胞分选(MACS)来测量细胞表面标记 和形态学；通过利用光学或共聚焦显微镜来检测细胞形态学；和/或利用本领域公知的技 术，例如PCR和基因表达谱来检测基因表达的改变。这些技术也可用于鉴别对于一种或多 种特定标记呈阳性的细胞。例如，利用CD34的抗体，利用上述技术，可以确定细胞是否含有 可检测量的CD34 ;如果是，则细胞是CD34+。同时，如果细胞产生足够的能被RT-PCR所检测 的0CT-4 RNA，或者显著多于成体细胞的0CT-4 RNA，则该细胞是0CT-4+。细胞表面标记(例 如CD标记如CD34)的抗体，和干细胞特异性基因例如0CT-4的序列，也是本领域公知的。
胎盘细胞，特别是已经经过Ficoll分离、差别附着，或两者的结合所分离的细胞 可以利用荧光活化细胞分选仪(FACS)来分选。荧光活化细胞分选(FACS)是基于颗粒的荧 光性质用于分离颗粒(包括细胞)的普遍已知的方法(Kamarch，1987， Methods Enzymol， 151 :150-165)。单个颗粒中荧光部分的激光激发产生微小的电荷，从而允许混合物中正电 和负电颗粒的电磁分离。在一实施方案中，用不同的荧光标签来标记细胞表面标记特异性 抗体或配体。细胞经过细胞分选仪处理，从而允许基于其与所用抗体的结合能力来分离细 胞。FACS分选的颗粒可以直接注入96-孔或384-孔板的单个孔中，从而便于分离和克隆。
在一个分选技术方案中，来源于胎盘的干细胞基于标记CD34、 CD38、 CD44、 CD45、 CD73、 CD105、 0CT-4和/或HLA-G的表达来分选。它可以通过结合基于细胞在培养中的附 着性质来选择干细胞的步骤来实现。例如，可以在基于标记表达的分选之前或之后实现附 着选择干细胞。例如，在一实施方案中，首先基于CD34的表达来分选细胞；保留CD34—的 细胞，并将CD200+HLA-G+的细胞与所有其它CD34—细胞分离。在另一实施方案中，基于标记 CD200和/或HLA-G的表达来分选来源于胎盘的细胞；例如，表现出任一这些标记的细胞被 分离以供进一步使用。在特定实施方案中，表达例如CD200和/或HLA-G的细胞可以进一 步被分选，所述分选可以基于CD73和/或CD105的表达，或通过抗体SH2、 SH3或SH4识别的表位，或缺少CD34、 CD38或CD45的表达。例如，在一实施方案中，胎盘细胞通过CD200、 HLA-G、 CD73、 CD105、 CD34、 CD38和CD45的表达或其缺失来分选，并且将CD200+、 HLA_G+、 CD73+、 CD105+、 CD34—、 CD38—和CD4—5的细胞与其它胎盘细胞分离，供进一步使用。
在另一实施方案中，可以使用磁珠来分离细胞。可以利用磁性活化细胞分选 (MACS)技术分选细胞，所述技术是基于颗粒结合磁珠(0. 5-100 ym直径)的能力来分选颗 粒的方法。对磁微珠可以进行多种有效的修饰，包括共价添加特异性识别特定细胞表面分 子或半抗原的抗体。所述磁珠随后与细胞混合，从而允许结合。然后将细胞通过磁场，以分 离出具有特定细胞表面标记的细胞。在一实施方案中，这些细胞可随后分离，并与偶联了抗 其它细胞表面标记的抗体的磁珠再混合。所述细胞再次通过磁场，分离结合两种抗体的细 胞。然后可以将此类细胞稀释入不同的培养皿中，例如微滴培养皿中用于克隆分离。
胎盘干细胞还可以基于细胞形态学和生长特征来表征和/或分选。例如，胎盘干 细胞可以表征为在培养中具有成纤维细胞样表型，和/或基于成纤维细胞样表型来选择。 胎盘干细胞还可以表征为具有形成胚样体的能力，和/或基于其形成胚样体的能力来选 择。在一实施方案中，例如，将形状为成纤维细胞样，表达CD73和CD105,并在培养中产生一 个或多个胚样体的胎盘细胞与其它胎盘细胞分离。在另一实施方案中，将培养中产生一个 或多个胚样体的0CT-4+胎盘细胞与其它胎盘细胞分离。 在另一实施方案中，胎盘干细胞可以通过集落形成单位试验来鉴别和表征。集落 形成单位试验是本领域公知的，例如MESEN CULT 培养基(Stem Cell Technologies, Inc.， Vancouver British Columbia)。 利用本领域已知的标准技术，例如台盼蓝不相容试验、醋酸荧光素摄取试验、碘化 丙锭摄取试验(评估活力)；和胸腺嘧啶核苷摄取试验、MTT细胞增殖试验(评估增殖)来 分析胎盘干细胞的活力、增殖潜力和寿命。寿命可以通过本领域公知的方法可以确定，例如 通过延长培养中群倍增的最大数来确定。 利用本领域已知的其它技术也可以用来将胎盘干细胞和其它胎盘细胞分离开，例 如期望细胞的选择性生长(阳性分选)、不需要细胞的选择性破坏(阴性选择)、基于混合 群与例如大豆凝聚素的差别细胞可凝集性的分离、冻融步骤、过滤、常规离心和区带离心、 离心冲洗(逆流离心)、单位重力分离、逆流分布、电泳等等。
5.4胎盘干细胞的培养
5. 4. 1培养基 分离的胎盘干细胞、或胎盘干细胞群、或从其中生长出胎盘干细胞的细胞或胎盘 组织可被用于起始或接种细胞培养物。细胞一般转移到无菌的组织培养容器内，所述容 器使用或未使用胞外基质或配体包被，例如层粘连蛋白、胶原(如天然的或变性的)、明 胶、纤连蛋白、鸟氨酸、玻璃体粘附蛋白、和胞外膜蛋白(例如MATRIGEL(BD Discovery Labware， Bedford, Mass.))。 可以在本领域认为适合干细胞培养的任何培养基和任何条件下培养胎盘干细胞。 优选的，培养基包含血清。胎盘干细胞可以培养在例如DMEM-LG(Dulbecco改良的必需培 养基，低糖)/MCDB 201 (鸡成纤维细胞基础培养基)，其含有ITS (胰岛素-转铁蛋白-硒)、 LA+BSA(亚油酸-牛血清白蛋白)、右旋糖、L-抗坏血酸、PDGF、 EGF、 IGF-1，和青霉素/链 霉素；含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM-HG(高糖)；含有15% FBS的DMEM-HG ;含有10%FBS、10X马血清和氢化可的松的MDM(Iscove改良的Dulbecco培养基)；含有10% FBS、 EGF和肝素的M199 ;含有10XFBS、GLUTAMAXTM和庆大霉素的a-MEM(最低必需培养基)；含 有10% FBS、GLUTAMAXTM和庆大霉素等的DMEM。优选的培养基是含有2% FBS、 ITS、LA+BSA、 右旋糖、L-抗坏血酸、PDGF、 EGF，和青霉素/链霉素的DMEM-LG/MCDB-201 。
可用于培养胎盘干细胞的其它培养基包括DMEM(高糖或低糖)、Eagle基础培养 基、Ham的F10培养基(F10) 、 Ham的F12培养基(F12) 、 Iscove的改良的Dulbecco培养 基、间充质干细胞生长培养基(MSCGM) 、 Liebovitz的L-15培养基、MCDB、 DMIEM/F12、 RPMI 1640、改良的DMEM(Gibco)、DMEM/MCDB201 (Sigma)和CELL-GR0 FREE。 培养基可以添加一种或多种组分，包括例如血清(如胎牛血清(FBS)，优选的约 2-15% (v/v);马血清(ES);人血清(HS)) ;P-巯基乙醇(BME)，优选的约0. 001 % (v/v); 一种或多种生长因子，例如，血小板衍生的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、基础成 纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素-样生长因子-1 (IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)、血管内 皮生长因子(VEGF)、和促红细胞生成素(EPO);氨基酸包括L-缬氨酸；和用于控制微生物 污染的一种或多种抗生素和/或抗真菌剂，例如青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、和制霉 菌素，单独或组合使用。
5. 4.2胎盘干细朐的扩增和增猎 —旦分离胎盘干细胞或分离干细胞群(例如，与至少50%的胎盘细胞分离的干细 胞或干细胞群，所述胎盘细胞在体内是通常与干细胞或干细胞群相关的)，就可以在体外增 殖或扩增干细胞或干细胞群。例如，可以在组织培养容器(例如皿、瓶、多孔板等)中培养 胎盘干细胞群一段时间，足够使干细胞增殖至70_90%汇合度，8卩，直到干细胞及其后代占 据组织培养容器的70_90%的培养表面区域。 胎盘干细胞可以允许细胞生长的密度接种在培养容器内。例如，所述细胞可以低 密度(例如约1， 000至约5， 000细胞/cm2)至高密度(例如约50， 000或更多细胞/cm2) 来接种。在优选的实施方案中，在约0至约5%体积0)2的空气中培养细胞。在一些优选的 实施方案中，在约2至约25%体积02的空气中培养细胞，优选的在约5至约20%体积02的
空气中培养细胞。细胞优选的培养在约25t:至约4(rc，优选的37t:。细胞优选的在培养箱
中培养。所述培养基可以是静态的或搅动的，例如，利用生物反应器。胎盘干细胞优选的生 长在低氧化压力下(例如，添加谷胱甘肽、抗坏血酸、过氧化氢酶、生育酚、^乙酰半胱氨酸 等)。 —旦获得70% _90%汇合度，细胞就可以传代。例如，所述细胞可以利用本领域公
知的技术来酶促处理，例如胰蛋白酶消化，从而将其与组织培养表面分离。在通过移液除去
细胞和计数细胞后，约20， 000-100， 000个干细胞，优选的约50， 000个干细胞被传代到含有
新鲜培养基的新培养容器内。 一般的，新培养基与从中去除干细胞的培养基是相同类型的
培养基。发明涵盖了已经传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20次或更多次
的胎盘干细胞群。 5. 4. 3胎盘干细胞群 本发明提供了胎盘干细胞群。胎盘干细胞群可以直接分离自 一个或多个胎盘；即， 所述胎盘干细胞群可以是包含胎盘干细胞的胎盘细胞群，所述胚胎肝细胞获自或包含于 灌流液，或者来源于或包含于消化液(即，通过酶促消化胎盘或其部分所获得的细胞收集物)。还可以培养和扩增本发明的分离的胎盘干细胞来产生胎盘干细胞群。还可以培养和 扩增包含胎盘干细胞的胎盘细胞群来产生胎盘干细胞群。 本发明的胎盘干细胞群包含胎盘干细胞，例如本发明中描述的胎盘干细胞。在多 个实施方案中，在分离的胎盘干细胞群中，至少10% 、20% 、30% 、40% 、50% 、60% 、70%、 80%、90%、95%或99%的细胞是胎盘干细胞。即，胎盘干细胞群可以包含例如多至1%、 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的非干细胞。 在本文的实施方案中，所述基质可以是能实现细胞(例如胎盘干细胞)的培养和 /或选择的任何表面。 一般的，所述基质是塑料，例如组织培养皿或多孔板塑料。组织培养 塑料可以用生物分子例如层粘连蛋白或纤连蛋白包被。 可以通过细胞选择领域任何已知的方法来选择细胞(例如胎盘干细胞)用于胎 盘干细胞群。例如，可以利用抗一种或多种细胞表面标记的抗体选择细胞，例如，在流式细 胞仪或FACS。利用与磁珠连接的抗体可以实现选择。特异性针对某些干细胞相关标记的 抗体是本领域已知的。例如，炕0CT-4抗体(Abcam， Cambridge, MA) 、 CD200抗体(Abeam)、 HLA-G抗体(Abcam) 、CD73抗体(BD Biosciences Pharmingen， San Diego， CA) 、CD105抗体 (Abeam ;BioDesign International, Saco，ME)等。其他标记的抗体也是可商购的，例如可 以从如StemCell Technologies或BioDesign International获得的CD34、 CD38禾口 CD45 抗体。 分离的胎盘干细胞群可以包括不是干细胞的胎盘细胞，或者不是胎盘细胞的细 胞。 分离的胎盘干细胞群可以与一个或多个非干细胞或非胎盘细胞的群结合。例如， 分离的胎盘干细胞群可以结合血液(例如胎盘血或脐带血)、血液来源的干细胞(例如 来源于胎盘血或脐带血的干细胞)、血液来源的有核细胞的群、骨髓来源的间充质干细胞、 骨来源的干细胞群、原始骨髓、成人(成体)干细胞、包含在组织内的干细胞群、培养的干 细胞、完全分化的细胞的群(例如软骨细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、成骨细胞、肌细胞、 心肌细胞等)等。与每个群中总有核细胞的数量相比，分离的胎盘干细胞群内的细胞可
以与大量另一种类型的细胞相结合，结合比例为约ioo，ooo，ooo : i、50，ooo，ooo : i、 20， ooo， ooo : iuo，ooo，ooo : i、5，ooo，ooo : 1、2，000，000 : iu，ooo，ooo : i、 50o，ooo : i、20o，ooo : iuoo，ooo : 1、50，000 : 1、20，000 : iuo，ooo : i、5，ooo : i、 2，ooo : iu，ooo : i、soo : 1、200 : i、ioo : i、50 : 1、20 : i、io : i、5 : i、2 : i、 i : i;i : 2、i : 5、i : io、i : ioo、i : 200、1 : soo、i : i，ooou : 2，ooo、i : 5，ooo、 i : io， ooo、 i : 20，000、1 : 50，000、1 : ioo，ooou : 500，000、1 : i，ooo，ooo、 i : 2， ooo， ooo、 i : 5，ooo，ooo、i : io，ooo，ooo、i : 20，000，000、1 : 50，(K)0，000，或约 i : ioo，ooo，ooo。在分离的胎盘干细胞群中的细胞也可以与多种细胞类型的大量细胞相
^口 口 。 在一实施方案中，分离的胎盘干细胞群与大量造血干细胞结合。此类造血干细胞 可以是例如，包含在未处理的胎盘、脐带血或外周血中；在来源于胎盘血、脐带血或外周血 的总有核细胞中；在来源于胎盘血、脐带血或外周血的分离的CD34+细胞群中；在未处理的 骨髓中；在来源于骨髓的总有核细胞中；在来源于骨髓的分离的CD34+细胞群中；等等。
5.5胎盘干细胞的保存
33
胎盘干细胞可以置于允许长期储存的条件下，或置于抑制细胞死亡(如凋亡或坏 死)的条件下保存。 如2005年12月29日提交的名为"用于收集和保藏胎盘干细胞的改良组合 物及禾U用该组合物的方法(Improved Composition for Collecting andPreserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition)，，的相关美国临时申请 号60/754， 969中所述，可以利用例如包含凋亡抑制剂、坏死抑制剂和/或携氧全氟化碳的 组合物保存胎盘干细胞。在一实施方案中，本发明提供了保存干细胞群的方法，包括将所述 干细胞群与含有凋亡抑制剂和携氧全氟化碳的干细胞收集组合物相接触，与未接触凋亡抑 制剂的干细胞群相比，其中所述凋亡抑制剂存在的量和时间可足以降低或预防干细胞群中 的凋亡。在特定实施方案中，所述凋亡抑制剂是JNK抑制剂。在更特定的实施方案中，所述 JNK抑制剂不调节所述干细胞的分化或增殖。在另一实施方案中，所述干细胞收集组合物 包含所述凋亡抑制剂和在分离的相中的所述携氧全氟化碳。在另一实施方案中，所述干细 胞收集组合物包含所述凋亡抑制剂和在乳液中的所述携氧全氟化碳。在另一实施方案中， 所述干细胞收集组合物还包含乳化剂，例如卵磷脂。在另一实施方案中，在接触干细胞时， 所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳处于约ot:和约25t:之间。在另一更特定的实施方案中， 在接触干细胞时，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳处于约2t:和约i(TC之间，或约2t:和约 5t:之间。在另一更特定的实施方案中，所述接触是在转移所述干细胞群的过程中实施的。
在另一更特定的实施方案中，所述接触是在冷冻和融化所述干细胞群的过程中实施的。 在另一实施方案中，本发明提供了保存胎盘干细胞群的方法，包括将所述干细胞
群与凋亡抑制剂和器官防腐化合物相接触，与未接触凋亡抑制剂的干细胞群相比，其中所 述凋亡抑制剂存在的量和时间可足以降低或预防干细胞群中的凋亡。在特定实施方案中，
所述器官防腐化合物是UW溶液(描述于美国专利号4， 798， 824中；其也被称为ViaSpan ; 还参见Southard等人，Transplantation 49(2) :251-257(1990))或者在Stern等人的，美 国专利号5， 552， 267中描述的溶液。在另一实施方案中，所述器官防腐化合物是羟乙基淀 粉、乳糖酸、棉子糖，或其组合。在另一实施方案中，所述干细胞收集组合物还包含位于两相 或位于乳液中的携氧全氟化碳。 在本方法的另一实施方案中，胎盘干细胞在灌流过程中与包含凋亡抑制剂和携氧 全氟化碳，器官防腐化合物，或其组合的干细胞收集组合物相接触。在另一实施方案中，在 组织破坏(例如，酶促消化)过程中，所述干细胞产生接触。在另一实施方案中，在灌流收 集后，或在组织破坏(例如，酶促消化)后，胎盘干细胞与所述干细胞收集化合物相接触。
—般的，在胎盘细胞收集、富集和分离过程中，优选的最小化或消除由于缺氧和机 械压力导致的细胞胁迫。因此，在本方法的另一实施方案中，在收集、富集或分离过程中，干 细胞或干细胞群在所述保存中暴露在低氧条件下少于6个小时，其中所述低氧条件是氧浓 度低于正常的血氧浓度。在更特定的实施方案中，所述干细胞群在所述保存中暴露在所述 低氧条件下少于2个小时。在另一更特定的实施方案中，在收集、富集或分离过程中，所述 干细胞群暴露在所述低氧条件下少于1个小时、或少于30分钟、或不暴露于低氧条件下。在 另一更特定实施方案中，在收集、富集或分离过程中，所述干细胞群不暴露于剪切力下。
本发明的胎盘干细胞可以冷冻保存，例如置于小容器(如安瓿瓶)中的冷冻保存 培养基中。合适的冷冻保存培养基包括但不限于如下培养基，其包括例如生长培养基或细胞冷冻培养基，例如可商购的细胞冷冻培养基，例如C2695、 C2639或C6039 (Sigma)。冷 冻保存培养基优选的包含匿SO(二甲亚砜)，其浓度为例如约10% (v/v)。冷冻保存培养 基可以包含其它试剂，例如甲基纤维素和/或甘油。在冷冻保存过程中，胎盘干细胞优选 的以约1°C /分钟冷却。优选的冷冻保存温度是约-S(TC至约-IS(TC，优选的约-125°〇至 约-14(TC。在解冻使用前，冷冻保存的细胞可以转移到液氮中。在一些实施方案中，例如，
一旦安瓿瓶达到约-g(rc，就将其转移至液氮储存区域。冷冻保存的细胞优选的在温度约
25°C至约40°C ，优选的在温度约37°C下解冻。 5.6胎盘干细胞的用途 5. 6. l包含胎盘干细朐的纟目合物 本发明的肿瘤细胞抑制的方法可以使用包含胎盘干细胞或其来源的生物分子的 组合物。以相同的方式，本发明的大量胎盘干细胞和胎盘干细胞群可以与任何生理学可接 受的，或医学可接受的化合物、组合物相结合，或与例如在研究或治疗中使用的仪器结合使 用。 5. 6. 1. l冷冻保存的胎盘干细朐 本发明的肿瘤细胞抑制性胎盘干细胞群可以保存，例如冷冻保存供后期使用。冷 冻保存细胞，例如干细胞的方法是本领域公知的。胎盘干细胞群可以制备成易于向个体施 用的形式。例如，本发明提供了包含在适合医学使用的容器内的胎盘干细胞群。此类容器 可以是例如，无菌的塑料袋、瓶、罐，或其它可以方便的分配胎盘干细胞群的容器。例如，所 述容器可以是适合将液体静脉施用至接受者的血袋或其它塑料的、医学可接受的袋。所述 容器优选的是允许冷冻保存组合的干细胞群的容器。 冷冻保存的肿瘤细胞抑制性胎盘干细胞群可以包括来源于单个供体，或多个供 体的胎盘干细胞。所述胎盘干细胞群可以与目标接受者是完全的HLA匹配，或者部分的 HLA-不匹配、或完全的HLA-不匹配。 因此，在一实施方案中，本发明提供了位于容器中的包含肿瘤细胞抑制性胎盘干 细胞群的组合物。在特定实施方案中，所述干细胞群是冷冻保存的。在另一特定实施方案 中，所述容器是袋、瓶或罐。在更特定的实施方案中，所述袋是无菌塑料袋。在更特定的实 施方案中，所述袋适合、允许或有助于静脉施用所述胎盘干细胞群。所述袋可以包括相互 连接的多个内腔或隔室，其允许在施用前或施用过程中将胎盘干细胞与一种或多种其它溶 液，例如药物进行混合。在另一特定实施方案中，所述组合物包括有助于冷冻保存所述组合 的干细胞群的一种或多种化合物。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞群包含在生理 可接受的水溶液中。在另一特定实施方案中，所述生理可接受的水溶液为0. 9% NaCl水溶 液。在更特定的实施方案中，所述胎盘干细胞群包含与所述干细胞群的接受者HLA匹配的 胎盘细胞。在另一特定实施方案中，所述组合的干细胞群包括与所述干细胞群的接受者至 少部分HLA不匹配的胎盘细胞。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞来源于大量供体。
5. 6. 1. 2药物组合物 肿瘤细胞抑制性的胎盘干细胞群，或包含胎盘干细胞的细胞群，可以配制成体内 使用的药物组合物。此类药物组合物在制药可接受的载体(例如用于体内施用的盐溶液 或其它生理学可接受的溶液)中包含胎盘干细胞群，或包含胎盘干细胞的细胞群。本发明 的药物组合物可以包括本发明其他部分描述的任何胎盘干细胞群，或胎盘干细胞类型。所述药物组合物可以包括胎儿、母体，或同时包括胎儿和母体的胎盘干细胞。本发明的药物组
合物还可以包括来源于单个个体或胎盘，或来源于多个个体或胎盘的胎盘干细胞。 本发明的药物组合物可以包含任何肿瘤细胞抑制性数量的胎盘干细胞。例如，
在不同的实施方案中，单个单位剂量的胎盘干细胞可以包含大约、至少、或不超过1X105、
5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108、1X109、5X109、1X1010、5X1010、
1X1011或更多个胎盘干细胞。 本发明的药物组合物包含含有50%或更多活细胞的细胞群(即，群中至少50%的 细胞是功能性的或活的)。优选的，群中至少60%的细胞是活的。更优选的，药物组合物的 群中至少70%、80%、90%、95%或99%的细胞是活的。
5. 6. 1.3胎盘干细朐条件培养某 本发明的胎盘干细胞可用于生产肿瘤细胞抑制性的条件培养基，即含有干细胞分 泌或排出的一种或多种生物分子，所述生物分子对大量一种或多种类型的肿瘤细胞具有可 检测的肿瘤细胞抑制性效果。在多个实施方案中，所述条件培养基包含在其中胎盘干细胞 已经生长了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天的培养基。在其它实施 方案中，所述条件培养基包含在其中胎盘干细胞已经生长达至少30 % 、40 % 、50% 、60 % 、 70%、80%、90%汇合度，或高达100%汇合度的培养基。此类条件培养基可用于支持胎盘干 细胞，或另一类干细胞的分离群的培养。在另一实施方案中，所述条件培养基包含在其中的 胎盘干细胞已经分化为成体细胞类型的培养基。在另一实施方案中，本发明的条件培养基 包含在其中已经培养了胎盘干细胞和非胎盘干细胞的培养基。 因此，在一实施方案中，本发明提供了包含来源于胎盘干细胞培养物的培养基的 组合物，其中所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD200和HLA-G ;或表达CD73、CD105 和CD200 ;或表达CD200和0CT-4 ;或表达CD73、 CD105和HLA-G ;或表达CD73和CD105，且 当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含胎盘干细胞的胎盘细胞群中形 成一个或多个胚样体；或表达0CT-4，并且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有 助于在包含胎盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；和(c)可检测地抑制肿瘤 细胞或肿瘤细胞群的生长或增殖。在特定实施方案中，所述组合物进一步包含大量的所述 胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述组合物包含大量的非胎盘细胞。在更特定的实 施方案中，所述非胎盘细胞包括CD34+细胞，例如造血前体细胞，如外周血造血祖细胞，脐带 血造血祖细胞，或胎盘血造血祖细胞。所述非胎盘细胞还可以包含其它干细胞，例如间充质 干细胞，例如骨髓来源的间充质干细胞。所述非胎盘细胞还可以是一种或多种类型的成体 细胞或细胞系。在另一特定实施方案中，所述组合物包含抗增殖剂，例如，抗MIP-la抗体 或抗MIP-1P抗体。 在特定实施方案中，胎盘干细胞条件培养基或上清液来源于与大量肿瘤细胞以胎
盘干细胞比肿瘤细胞约i : 1、约2 : 1、约3 : 1、约4 : i或约5 : i的比例共培养的大
量胎盘干细胞。例如，所述条件培养基或上清液可以来源于包含约1乂105个胎盘干细胞、约 1 X 106个胎盘干细胞、约1 X 107个胎盘干细胞、或约1 X 108个胎盘干细胞、或更多。在另一 特定的的实施方案中，所述条件培养基或上清液来源于包含约1 X 105至约5 X 105个胎盘干 细胞和约1X1()5个肿瘤细胞、约1X1()6至约5X106个胎盘干细胞和约1X1()6个肿瘤细胞、 约1X1Q7至约5X107个胎盘干细胞和约1X107个肿瘤细胞、或约1X1Q8至约5X108个胎盘干细胞和约1X108个肿瘤细胞的共培养物。 在抑制肿瘤细胞生长或增殖的方法的另一特定实施方案中，所述条件培养基或上清液是来源于培养物的培养基或上清液，所述培养物包含大量的单独培养的、或与肿瘤细胞共培养的胎盘干细胞，其中产生条件培养基的胎盘细胞数量是基于要对其施用所述条件培养基的个体的重量。例如，所述条件培养基或上清液可以是由以下培养物产生的条件培养基或上清液，所述培养物包含约1 X 103个胎盘干细胞/kg接受者体重、5 X 103个胎盘干细胞/kg、 1 X 104个胎盘干细胞/kg、5 X 104个胎盘干细胞/kg、 1 X 105个胎盘干细胞/kg、5 X 105个胎盘干细胞/kg、 1 X 106个胎盘干细胞/kg、5 X 106个胎盘干细胞/kg、 1 X 107个胎盘干细胞/kg、5X 107个胎盘干细胞/kg、或1 X 108个胎盘干细胞/kg。在另一特定实施方案中，所述条件培养基或上清液是来源于共培养物的培养基或上清液，所述共培养物含有约lX103至约5Xl()3个胎盘干细胞/kg和约1Xl()3个肿瘤细胞/kg、约1X1()4至约5X104个胎盘干细胞/kg和约1 X 104个肿瘤细胞/kg、约1 X 105至约5 X 105个胎盘干细胞/kg和约1X105个肿瘤细胞/kg、约1X1()6至约5X106个胎盘干细胞/kg和约1X106个肿瘤细胞/kg、约1X1()7至约5X107个胎盘干细胞/kg和约1X107个肿瘤细胞/kg、或约1X108至约5 X 108个胎盘干细胞/kg和约1 X 108个肿瘤细胞/kg。 在特定实施方案中，适合向70kg的个体施用的条件培养基包含在约200mL培养基中由70， 000， 000个胎盘干细胞条件化的上清液。 条件培养基可被浓縮以制备可施用的药物级产品。例如，通过去除水分，例如蒸发、冻干等，可以浓縮条件培养基至约90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或更浓。在特定实施方案中，例如，来源于70， 000， 000个胎盘干细胞的200mL条件培养基可被浓縮至体积约180mL、160mL、140mL、120mL、100mL、80mL、60mL、40mL、20mL或更少。所述条件培养基还可以基本干燥为例如粉末。
5. 6. 1. 4包含胎盘干细胞的基质 本发明还包括包含肿瘤细胞抑制性胎盘干细胞群，或肿瘤抑制性量的胎盘干细胞条件化培养基的基质，例如水凝胶、支架等。 本发明的胎盘干细胞可以接种在天然基质上，例如胎盘生物材料，如羊膜材料。此类羊膜材料可以是例如直接从哺乳动物胎盘切割的羊膜；固定的或热处理的羊膜、基本干燥(即，< 20% H20)的羊膜、绒毛膜、基本干燥的绒毛膜、基本干燥的羊膜和绒毛膜等。优选的可以接种胎盘干细胞的胎盘生物材料描述在Hariri的，美国申请
发明者卡斯帕尔·帕卢丹, 罗伯特·J·哈黎里, 罗斯安·默里, 莱赫尔·哈巴库斯奇, 詹姆士·爱丁格 申请人:人类起源公司