组织来源细胞的冷冻保存方法

专利名称：组织来源细胞的冷冻保存方法
技术领域：
本发明涉及组织来源细胞的冷冻保存方法，具体地，涉及一种用于简 便且有效地冷冻保存来源于从哺乳动物获取的各种组织的所希望的细胞的 方法。
本申请主张日本专利申请特愿2006-274243号(申请日2006年10 月5日)的优先权，并且将该申请的全部记载内容以引用的方式编入本申 请文件中。
背景技术：
哺乳动物的组织或器官，在从受检体上取下后不做处理或者对其进行 培养、增殖后，用于调查填补患者欠损部用的移植用组织、药剂、或化妆 品的功效。另外，从特定的组织提取出干细胞、并使其增殖而使用的面向 再生医疗的应用也受到了人们的关注。通常，从活体上获取的组织或培养 组织在维持其机能的状态下储藏是有期限的，因此不可能在全部长的期间 保持合适的在库品。为了延长储藏时间，进行利用冷冻的组织或细胞保 存。已公开有当保存组织时在添加有冷冻保护剂的保存液中浸渍培养组织 而冷冻保存的技术(例如，参照专利文献1)、将培养上皮层在浸渍到 DMEM中的状态下在8 19"C下低温保存的技术(例如，参照专利文献 2)等。
另外，作为哺乳动物细胞的保存方法，确立了冷冻保存的方法，在树 立细胞的情况下用于使遗传的变化为最小的限度，在有寿命的细胞的情况 下用于避免老化和形质转换(例如，参照非专利文献1和2)。在该方法 中，为了使活性维持在500%以上来保存培养细胞等细胞，以每分钟rc左 右的速度逐渐冷却细胞，在一20(TC左右下保存，保存结束时急速融解 (解冻)。此时，为了防止细胞由于冷冻而被破坏，将细胞悬浊于含10%甘油三酯的完全培养基、或者含5 10%二甲基亚砜的条件培养基或者无 血清培养基等中。冷冻时，液体凝固而结晶化，存在着在细胞内形成冰晶 的问题。这些冰晶在解冻时对细胞的生长(生育)力造成不良影响。 一般 认为，上述甘油三酯等的冷冻保护剂使细胞内的液体玻璃化或非晶质化， 从而抑制冰晶的生成。
为了从哺乳动物组织得到细胞，通常有利用酶处理等使细胞分散来培 养、或者将组织片段本身浸到培养基中，获取从组织游走到培养基中的细 胞的方法等。而且，本说明书中引用的全部文献通过引用而编入到本申请 文件中。
专利文献1:日本专利文献特表平9-505032号公报；
专利文献2:日本专利文献特许第2693640号公报；
非专利文献l:井出利宪著、细胞培养入门Note、 1999年、羊土社、
139页(井出利憲薯、細胞培養入門乂一K、 1999年、羊土社、139
頁)；
非专利文献2: Sigma细胞培养手册、2005年、Sigma-Aldrich Japan株 式会社、286页(、乂夕、、7細胞培養7二二7VP、 2005年、、y夕、、77WK、U :y于"亇八。y株式会社、286頁)。
当对获取的组织通过酶处理等进行分解后回收细胞时，由于多种细胞 混杂，难以只获得目标细胞。因此，使用仅由特定细胞育成的选择培养基 来培养回收的细胞，会花费用于选择目标细胞的功夫和时间。另外，在将 组织片段本身浸入到培养基中并等待细胞从组织向培养基中游走的方法的 情况下，由于需要长时间的培养并且为了将游走后所得的细胞从组织分离 而需要继代，因此要花费功夫和时间。

发明内容
本发明者发现了如下事实，即当从採取的组织仅使作为目标的细胞 游走到组织片段的边缘、并不做任何处理将其冷冻保存时，组织内的细胞 发生冰、溶质的结晶，从而细胞受到重大损伤，相对于此，存在于组织边 缘的细胞即使在组织中发生了冰、溶质的结晶也不会因此受到损伤，可以 通过通常的冷冻方法长时间储藏，并且能够通过解冻冷冻组织作为可再生
4长的细胞回收。基于这些事实，完成了本发明。
艮卩，本发明涉及的组织来源细胞的冷冻保存方法的特征在于，将含有
目标细胞的组织片段化，将片段化的组织片段在规定的培养基中培养，回 收经培养得到的组织片段，并悬浊于冷冻保护溶液中，然后将该组织片段
悬浊物在一7(TC以下的温度下冷冻。
在本发明优选的实施方式中，所述组织是从哺乳动物身上採取或培养 而得的组织。而且，所述组织片段的培养进行组织内部的细胞游走到组织 片段的边缘所必要的时间。所述规定的培养基是能够使该组织中存在的所 希望的细胞游走到组织片段的边缘的培养基。
而且，在本发明的一个实施方式中还包括以下过程，即使所述冷冻 的组织片段悬浊物解冻，对解冻的组织片段进行培养，回收游走到培养基 中的细胞。
在本发明的另一个实施方式中，提供一种来源于真皮的成纤维细胞的 冷冻保存方法，其特征在于，将从哺乳动物身上採取的皮肤片段化，将片 段化的皮肤片段在含血清的最小必需培养基中培养，回收经培养得到的皮
肤片段并悬浊于冷冻保护溶液中，然后将该皮肤片段悬浊物在一7(TC以下 的温度下冷冻。所述片段化的皮肤片段的最大直径优选为5mm以下，更 优选为lmm 0.5mm。所述皮肤片的培养，在通常的细胞培养条件下，例 如约37°C、 5%的二氧化碳的条件下，优选进行5 10天，在典型的一个 实施方式中进行约l周(7天)。
在本发明的进一步优选的实施方式中，所述冷冻保护溶液含有10%的 甘油三酯或5 10%的二甲基亚砜，所述组织片段悬浊物的冷冻在液氮中 进行。
发明效果
利用本发明的方法冷冻的组织片段中含有来源于该组织的可生长的细 胞，因此在解冻该组织片段来培养时能够回收较多的生存细胞。因此，与 对从活体上採取的组织培养，并只预先回收细胞来保存的情况相比，可以 在短时间内完成冷冻保存，例如，在皮肤成纤维细胞的情况下能够以约1 周的时间完成冷冻保存，从而能够在短时间且以低成本保存组织来源细胞。而且，通过在冷冻前的组织片段的培养中使用规定的培养基，能够仅 仅将该来源于组织的所希望的细胞诱导到组织片段的边缘以可生长的状态 保存。因而，在冷冻保存结束后对组织片段进行解冻、培养时，能够高效 地只获取所希望的细胞。


图1是示出在直接冷冻保存皮肤组织的情况(D组)和利用本发明的 方法进行冷冻的情况(C组)下的刚解冻后所见情形的照片。
图2是示出在直接冷冻保存皮肤组织的情况(D组)和利用本发明的 方法进行冷冻的情况(C组)下的解冻后培养第一天所见情形的照片。
图3是示出在直接冷冻保存皮肤组织的情况(D组)和利用本发明的 方法进行冷冻的情况(C组)下的解冻后培养第七天所见情形的照片。
具体实施方式
(定义)
在本说明书中，以下的用语定义如下。用语"组织(tissue)"是指在 多细胞生物中构成细胞分化而具有同一机能、形态的细胞集团。动物的组 织根据形态、机能、或者发生学可大致分为上皮组织、结缔组织、肌肉组 织、神经组织。组织的成分不仅仅是细胞，还有作为充满细胞之间的空间 的物质的基质(matrix)。多个组织或细胞集合起来构成器官(organ)。 动物的器官也称为脏器。在本发明中，"组织"可以和"器官"或"脏 器"同义使用，例如除了皮肤、骨骼肌、心肌、神经等之外，还包括肝 脏、肾脏、胰腺、脾脏、睾丸、卵巢、副肾、脑、甲状腺等。
用语"冷冻保护溶液"，是指在冷冻保存组织或细胞时，通过液体成 分的结晶化用于保护细胞使其免受损害的所有保护剂，包括细胞浸透性的 玻璃化剂或细胞非浸透性的玻璃化剂。非细胞浸透玻璃形成剂包括软骨素 硫酸、聚乙烯吡咯垸酮、聚乙二醇、或羟乙基淀粉等复合碳水化合物的高 分子量形成体。细胞浸透玻璃化剂包括甘油三酯、丙二醇、乙二醇、二甲 基亚砜(DMSO)等。作为优选的冷冻保护溶液，可以例举有含10%甘油
6三酯的完全培养基、含10%DMSO的完全培养基、含10%甘油三酯的50 %条件培养基+ 50%新鲜培养基、含10%DMSO的50%条件培养基+ 50 %新鲜培养基、含7.5%DMSO的50%条件培养基+ 50%无血清培养基、 以及含7.5XDMSO与10XBSA的新鲜无血清培养基等，但不限于这些。
用语"培养基"乃至"培养液"，是指为了在玻璃器内使细胞、组 织、器官等增殖、生长而给予的营养成分。用语"边缘(border or marginal)"，是指片段化的组织片段的端部区域，即从组织片段末端到 数iim以内的区域。用语"游走(migration)"是指在组织、器官或者活 体内细胞从某一地点向另一地点移动。血球细胞通过血管壁移动，另外， 肿瘤细胞转移也是一种游走。
(组织来源细胞的冷冻保存)
本发明的冷冻保存方法，首先将从活体上获取的组织片段化。可以根 据各种组织优选使用片段化方法，例如，可以是利用胰蛋白酶、胶原酶等 的酶处理的化学方法，也可以是利用手术用剪刀或手术刀细切的物理方 法。在如同哺乳动物的皮肤那样比较薄而脆弱的组织的情况下，优选利用 物理方法的片段化。被片段化的组织片段的大小根据使用的组织而不同， 例如，在皮肤组织的情况下，优选最大直径为5mm以下，更优选最大直 径为lmm 0.5mm。
然后，将片段化了的组织片段在规定的培养基中培养。例如，可以使 用片段化了的哺乳动物的皮肤。当从组织学的角度观察人的皮肤时，从表 面以表皮、真皮以及皮下组织的顺序形成了层。表皮的主要构成细胞包 括角化细胞(Keratinocyte)、黑色素产生细胞(melanocyte)、所谓与 知觉有关系的Merkel细胞、作为抗原呈递细胞的来自骨髓的细胞的朗格汉 斯(Langerhans)细胞。表皮非常薄，为0.1 0.3mm，在该表皮中起到防 御作用的是角化细胞。存在于表皮下层的母细胞反复增殖，在皮肤的表面 上形成物理上以及化学上都强韧的角化层(细胞内以被称为硬的角蛋白纤 维的物质充满的状态)，成为壁垒。对于创伤治愈，角化细胞游走覆盖伤 口表面是比较重要的。另外，真皮由成纤维细胞、以及由该细胞产生的弹 性胶原性间质构成，其在带来皮肤的伸縮性和弹性同时，还富含毛细血管，具有与表皮协调的作用。真皮(胶原纤维、弹性蛋白纤维、成纤维细 胞)被保护在表皮下而不易受到来自外部的损伤，通过保持水分支持皮肤 的机能，主要起到保持皮肤的弹性、张力的作用。
通过调节用于培养组织片段的培养基成分以及有无血清添加或者其添 加量，能够使该组织中存在的所希望的细胞游走到组织片段的边缘。作为 本发明的一个实施方式，在皮肤组织的情况下，可以通过使用含血清的最 小必需培养基来使来源于真皮的成纤维细胞良好地游走。作为最小必需培 养基，是可进行细胞培养、含有定义的数量的营养源的培养基，例如可以
例举有Eagle的MEM培养基、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、 Ham的培养基、RPMI1640培养基等。另外，为了抑制成纤维细胞的增殖 并使能增殖的角化细胞选择性地游走，已知可使用无血清、低钙浓度的培 养基。而且，为了使角化细胞、黑色素产生细胞游走，向培养基中添加的 肽添加物(上皮成长因子、胰岛素、碱性成纤维细胞增殖因子)是重要 的。
作为其他实施方式，已公开了使作为末梢神经损伤时诱导神经再生的 材料有用的施沃恩(Schwann)细胞选择性地游走的方法(参照日本专利 文献特开2003-70465号公报)。根据该方法，在用含血清的培养基对经酶 处理过的末梢神经片培养规定时间后，用无血清培养基培养规定时间，从 而能够在抑制了成纤维细胞增殖的情况下诱导施沃恩细胞游走。而且，也 可以使用2.5%左右的FCS等、低浓度的含血清的培养基进行培养。在另 外的实施方式中，可以从脐带静脉、大动脉、肺动脉等使血管内皮细胞或 血管平滑肌细胞等选择性地游走。其中使用的培养基能够从Sigma公司、 Aldrich公司、Invitrogen / GIBCO公司、Clontech公司、Qiagen公司、 Kumbo、 Takara-bio株式会社等销售商购得。
上述组织片段的培养，优选进行为了使组织内部的所希望的细胞游走 到组织片段的边缘所必需的时间，例如，在皮肤组织的情况下，在约37°C 的培养温度下培养5 10天，优选约l周(7天)。如果培养时间短，那 么真皮成纤维细胞就不能完全游走到皮肤组织片段的边缘，由于停留在组 织内(皮肤片内)，所以在冷冻组织片段时，这些细胞会受到损伤，另外，如果培养时间较此更长，那么细胞就游走到组织片段的外部，与通常 的细胞冷冻保存没有什么变化。
然后，回收上述培养组织片段，在去除培养基后，悬浊于冷冻保护溶 液中。培养组织片段由于是浮游在培养基中或者是缓缓地黏附到培养容 器，所以能够通过对容器给予轻轻的敲击或吸管操作等容易地回收。
最后，在一7(TC以下的温度下冷冻上述组织片段悬浊物。优选在约一 14(TC 约一18(TC下冷却。冷却速度优选缓慢的1分钟一rc左右，使用 程序冷冻仪，或者用小瓶立放到绝热箱(发泡苯乙烯制箱等)中，放入一 70°C —9(TC的冷冻库中冷冻。冷冻后，优选转移到液氮保存容器中在进 一步低的温度下保存。
(冷冻保存的组织片段悬浊物的解冻)
冷冻的组织片段悬浊物通过高速升温解冻，以便在约1 数秒以内解 冻。例如，可以将冷冻组织片段悬浊物的管在水浴中加热、或者诱导加 热。优选地，通过将在管内冷冻的组织片段悬浊物浸渍到37。C的水浴中来 解冻。
如果长时间与冷冻保护剂接触就有损伤细胞的可能，因此优选在维持 在组织片段的边缘部存在的细胞的活力的基础上，在尽可能短的时间内从 解冻的组织片段上去除冷冻保护剂溶液。例如，将安瓿或小瓶的内容物转 移到加有15 20ml培养基的烧瓶或者适当的容器中，照常进行培育。在 黏附细胞的情况下，大部分的细胞黏附后(通常3 4小时)立即将已稀 释的含有冷冻保护剂的培养基除去，更换成新的培养基。在对冷冻保护剂 具有易感性的细胞的情况下，可以通过低速离心分离而容易地将旧的培养 基除去。例如，将安瓿或小瓶的内容物转移到加入有新的10ml培养基的 15ml的离心管中，以100Xg离心分离5分钟，将含有冷冻保护剂的上清 废弃，使组织片段切片再次悬浊于新的培养基。随后，将组织片段的悬浊 物转移到合适的培养容器中，照常进行培育。
而且，在以下的实施例中，具体说明了本发明实施所使用的材料以及 方法，但所述实施例并不是对本发明的限定。实施例1
成人女性3名(年龄33岁、27岁以及35岁)和成人男性1名(年龄 50岁)，经本人的同意，採取了皮肤进行以下的实验。麻醉各被验者后， 从耳廓后面採取lmm 3mm的全层皮肤。立即进行2小时酶(dispase 2000单位/ml、合同酒精)处理，将全层皮肤分离为表皮层和真皮层，废 弃掉表皮层后，细切真皮层(直径约0.5mm)，制作10切片标本。将得 到的10个标本切片分成2组，以供以下的实验。
D组(直接组)将标本切片不作任何处理而浸到冷冻保存液(10% DMSO、 80%aMEM、 10%人血清)或者市售的细胞冷冻保存液cell banker (注册商标)1 (十慈field株式会社)，在一8(TC下保管12小时 后，用液氮冷冻2周。
C组(培养组)将标本切片在含10X人血清的aMEM培养基中， 并在5%二氧化碳浓度、37"下培育1周。随后，将切片回收到离心管 中，去除上清后，与上述同样地浸入到冷冻保存液中，在—8(TC下保管12 小时后，用液氮冷冻2周。
经过2周后，将上述D组以及C组的各标本从液氮中取出并解冻，在 含10X人血清的aMEM培养基中，并在5%二氧化碳浓度、37。C下培 育。用显微镜观察各标本刚解冻后、培养第1天、以及培养第7天的情 形，各自的代表例如图1、图2以及图3所示。如图1所示，刚解冻后的 标本，D组和C组都没有差异。从图2可见，D组在刚解冻后没有特别的 变化，但C组中细胞开始向组织片段的附近游走了。在培养第7天的D组 中，在2个皮肤片中发现了细胞游走(参照图3的d—l)，而在其他3个 皮肤片中未发现细胞游走而死灭(参照图3的d—2)。另外，在培养第7 天的C组中，从全部5个皮肤片都发现了良好且大量的细胞游走(参照图 3的c—1以及c一2)。
如上所述，D组中，细胞的游走数明显少，而且在真皮内细胞死灭、 完全没有细胞游走的皮肤片在半数以上。与此相对，C组中，细胞的游走 数明显多，而且在真皮内细胞死灭、完全没有细胞游走的皮肤片一个也没 有。产业上的利用可能性
以往，关于保存细胞，如果不完全是细胞的形态，则很难实现半永久 性保存。但是，例如通过将皮肤这样的组织细切、并使目标细胞游走到组 织边缘后、冷冻保存每个组织片段，能够简便且有效地保存所希望的细 胞，由此在使用细胞的诊断、治疗等的生命科学相关产业、以及医药品产 业中有用。
本发明基于上述实施例进行了说明，但不限于上述实施例。在本发明 全部公开(包含权利要求书)的范围内，基于本发明的基本技术思想，可 进一步对实施方式或实施例进行变更和调整。而且，在本发明权利要求书 的范围内，可进行各种公开要素的多样组合或选择。并且，本发明进一步 的要解决的问题、目的以及展开方式可从包含权利要求书在内的本发明的 全部公开事项得以明确。
权利要求
1. 一种组织来源细胞的冷冻保存方法，其特征在于，将含有目标细胞的组织片段化，将片段化的组织片段在规定的培养基中培养，回收经培养得到的组织片段，并悬浊于冷冻保护溶液中，然后将该组织片段悬浊物在—70℃以下的温度下冷冻。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组织是从哺乳动物 身上採取或者培养而得的组织。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组织片段的培养进 行组织内部的细胞游走到组织片段的边缘所必要的时间。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述规定的培养基是能 够使该组织中存在的所希望的细胞游走到组织片段的边缘的培养基。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，还包括以 下过程，即使所述冷冻的组织片段悬浊物解冻，对解冻的组织片段进行 培养，回收游走到培养基中的细胞。
6. —种来源于真皮的成纤维细胞的冷冻保存方法，其特征在于，将从 哺乳动物身上採取的皮肤片段化，将片段化的皮肤片在含血清的最小必需 培养基中培养，回收经培养得到的皮肤片并悬浊于冷冻保护溶液中，然后 将该皮肤片悬浊物在一7(TC以下的温度下冷冻。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述片段化的皮肤片的 最大直径为5mm以下。
8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述片段化的皮肤片 的最大直径为lmm 0.5mm。
9. 根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述皮 肤片的培养在约37。C的温度下进行5 10天。
10. 根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述皮 肤片的培养在约37"的温度下进行约7天。
全文摘要
本发明提供一种简便且有效地冷冻保存来源于各种组织的所希望的细胞的方法。该方法包括以下步骤，即将含有目标细胞的组织片段化，将片段化的组织片段在规定的培养基中培养，回收经培养得到的组织片段并悬浊于冷冻保护溶液中，然后将该组织片段悬浊物在-70℃以下的温度下冷冻。在优选的方式中，所述细胞为来源于皮肤组织的成纤维细胞。
文档编号C12N5/06GK101522890SQ20078003743
公开日2009年9月2日 申请日期2007年10月4日 优先权日2006年10月5日
发明者北条元治 申请人:细胞银行株式会社