专利名称：一种链霉菌、用其产生他克莫司的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的链霉菌、通过培养该菌产生他克莫司的方法 及其应用。
背景技术：
1983年，环孢霉素A通过了美国FDA的认证。该药是一种能有 效抗排斥的、由真菌产生的药物，从而给器官移植和自体免疫疾病的 治疗带来了巨大的变革。环孢霉素A通过抑制依靠钙激活的途径从而 在激活T细胞的早期阶段发挥抑制作用。环孢霉素A可以有效地提高 移植病人的存活率。但是，环孢霉素A由于高剂量的使用而引起不少 的副作用，例如肾毒性、神经毒性、肝毒性、高血压、肠胃痉挛、 血钾过多、多毛症、牙龈肿大等。
作为更有效的、低副作用的免疫抑制剂药物，日本的Fujisawa在 美国专利4,894,366中公开了一种新的大环内脂的免疫抑制剂他克 莫司。他克莫司比环孢霉素A的药效高IOO倍。这种大环内脂化合物 由链霉菌属菌5Vr印tom;;cM "t^b/k^^^发酵产生。和环孢霉素A的 作用机制相似，他克莫司的免疫抑制作用是通过抑制依靠钓激活的途 径从而在激活T细胞的早期阶段发挥抑制作用。他克莫司的第一次在 人的治疗功效表现在肝脏的移植手术中。现在，他克莫司已被广泛应 用，尤其是针对那些对环孢霉素A耐受性低的病人。他克莫司的结构 式如下
3V bCH3 OCH3
此外，美国专利4,894,366公开了两种他克莫司产生菌种 5Vr一画yc&s1加A:w^e腦S No. 9993和6Vr一蘭ycas1 /^t/roscop/cm swfe/ . ，ib^&mam^No. 7238。美国专利5,116,756和5,194,378 ^>开了另一 个属于链霉菌属的他克莫司产生菌种5Vreptom少c^ ATCC No. 55098。
目前，寻找能够产生免除或降低环孢霉素A的副作用的免疫抑制 剂他克莫司和其相关的自发的类似物的新的微生物的工作仍然正在 继续进行中。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种新的能产生他克莫司或其相关 的自发的类似物的微生物。
根据本发明的一方面，提供了一种新的链霉菌T300 (CGMCC1779 ) (5^eptom_ycas ^p. T300 )，其可以应用于产生他克莫司 或其类似物，或者应用于产生含有他克莫司的药物组合物。
根据本发明的另一方面，提供了一种采用链霉菌T300 (CGMCC1779)制备他克莫司或其类似物的方法。该方法包括采用4连 霉菌T300 ( CGMCC1779 )在含有可同化的碳、氮源的营养培养基里， 有氧发酵的步骤。
在一个实施方案中，所述可同化的碳源可以是葡萄糖、淀粉、甘
:CH2油、木糖、木聚糖、糊精、麦芽糖、海藻糖、肌醇、菊糖、水杨苷， 或上述物质的组合。
在一个实施方案中，所述可同化的氮源可以是棉籽饼粉、酵母抽 提粉、蛋白胨、谷蛋白、黄豆粉、玉米浆、花生粉、小麦粉、干酵母、 尿素氨基酸、硝酸盐，或上述物质的组合。也可以选择其它的无机氮 源和有才几氮源。
在一个实施方案中，所述营养培养基可以是营养琼脂培养基、国
际链霉菌计划培养基l (ISP1)、国际链霉菌计划培养基2 (ISP2)或 查氏培养基等，优选营养琼脂培养基。
在一个实施方案中，尤其是在泡沫严重的时候，在培养基中加入 消泡剂，该消泡剂可以是植物油、液体石蜡、脂肪油、矿物油或硅油， 或它们的组合。
在一个实施方案中，所述发酵培养的温度为20°C-40°C,优选25 °C-37°C, pH为6.5-7.5之间，优选7左右，培养时间为120-240 小时。氧通量为0.5 - l.OVVM。
在一个实施方案中，所述发酵方式包括固体发酵和液体发酵， 优选为深层液体发酵。
在一个实施方案中，所采用的他克莫司产生菌还可以为链霉菌 T300 (CGMCC1779)自发的突变抹或通过常规的诱变得到突变抹。
链霉菌T300 ( CGMCC1779 )的微生物菌种于2006年8月14日 保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(现地址北 京朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC1779,并登记入册，证明存活。
本发明描述了 5^印tow;;c^罕.T300的形态学、生理生化和分子水 平上的特征，经过和已知的他克莫司产生菌进行形态学、生理生化的 比较，可以认定5^eptom少c^印.T300属于链霉菌属，但它不同于已 ^口的4也克莫司产生菌5^eptowyces1 /^c/rascop/ct^ ， 5". ^^A:M6aew57's 、 5V，tomjc^s取5Vra/wMA6858和5^邵to，cas ATCC No. 55098,而 是一个全新的菌种；并且本发明的S^ptomycM取T300在发酵过程 中不产生有毒的H2S气体。
5他克莫司和其相关的自发的类似物主要存在于培养的菌丝体中，
菌丝体可以通过离心或过滤所得。然后按照US 4,894,366实施例1
详细的分离纯化方法。通过减压浓缩、冷冻干燥、有机溶剂抽提、调
节pH、树脂交换、解吸、结晶、重结晶等一系列过程可得他克莫司
和其相关的类似物。
本领域技术人员在阅读本说明书后可以理解，本发明链霉菌T300
(CGMCC1779 ) ( Streptomyces sp. T300 ),不仅可以生产他克莫司，
还可以产生他克莫司类似物，这些类似物具有本发明他克莫司的类似
性质并可以实现本发明目的。此外，根据本发明的生产他克莫司的方
法不仅可以生产他克莫司，还可以产生他克莫司类似物，这些类似物
具有本发明他克莫司的类似性质并可以实现本发明目的。
本发明人已经通过大量实-险证实，由6Vre/7tom;;c^ T300 (CGMCC1779 )产生的他克莫司具有所需的性质，包括免疫抑制活性。
具体实施方式
实施例1:菌一朱来源
5Vrepto^yc^ T300从中国西部的云南省的土壤中分离得到，并 通过诱变选育得到生产菌林。将在ISP2 3(TC培养8天成熟后的斜面 孢子，用0.85%NaCl的无菌生理盐水洗下，悬浮于装有玻璃珠的无 菌小三角瓶中，经旋转式摇床振荡30分钟，使孢子均匀分散，然后 用四层无菌纱布过滤，以除去菌丝体及孢子团，即得孢子悬浮液，供 诱变处理使用。
称取NTG (亚硝基胍)晶体10mg,溶解在10ml的无菌Tris緩 冲液(pH8.0)中，再用移液管加入lml孢子悬浮液，而置于28。C培 养室中的旋转式或往复式摇床上振荡处理30min。将处理过的抱子悬 浮液，经适当稀释后涂布在ISP2平板上。未作诱变处理的孢子悬浮 液，亦经适当稀释涂布于ISP2平板上作为对照。30°C培养8天后，检查菌落数，并计致死率。
挑选其中经过NTG诱变后的菌落351林，进行摇瓶发酵，评估 产生FK506 (他克莫司)的能力。结果发现有6抹能够产生较好水平 的菌抹，为5^eptom;;c^ T300的突变才朱。
实施例2: 5Vr甲tom;;c^ T300的形态学和培养学特征
实-验方法参照Shirling和Gottlieb (Shirling E.B. and Gottlieb D. 1966. Methods for characterization of 5Vr一函yc&s1 species. Int. J. Systematic Bacteriol.， 16, 313-340)。通过对在麦芽-酵母琼脂培养基上 3(TC培养8天的培养物光学和扫描电镜的观察，孢子椭圆形，大小为 0.65-0.99jamx 1.01-1.23 |um,成孢子《连；孢子《连上有大于20个孢子， 未成熟时成明显的结状。
实验方法参照上述的Shirling和Gottlieb。采用ISP1 、 ISP2、 ISP3 、 ISP4等十种培养基，30。C培养14天后，观察菌丝体的颜色及色素情 况。结果见表1 。在ISP3、 ISP4、 ISP6和营养琼脂培养基的生长菌 落属于灰白色系列。
表1 T300培养物的表观特征
培养基生长情况菌落背部色素气丝颜色可溶性色素
ISP13米白色米白色无
ISP24橙红色深灰色无
ISP33粉红色灰白色无
ISP44灰褐色灰白色无
ISP52粉白色粉白色无
ISP64褐黄色灰白色无
ISP73蛋黄色蛋黄色暗黄色
PDA1白色无无
营养琼脂4灰褐色灰白色无查氏培养基
无色
无
无
实施例3:细胞壁组分分析和生理生化特征
采用Hasegawa, T. ( 1983 )等与王平(1986)改进的快速薄层层析法(TLC)进行全细胞氨基酸及全细胞水解液糖型的分析。菌林细胞壁化学组分分析菌林T-300细胞含有L, L-DAP和甘氨酸，胞壁类型为I型；无特征性糖(糖型为C)。
14°C到37。C均能够生长，最适合温度为28°C。 pH4.5-7.5均能够生长，最适合pH为6.5-7.0之间。《4。/。NaCl能够生长。其他的见表2-表4。
表2 菌林-T-300的碳源和氮源的利用情况
碳源D-葡萄糖D-棉子糖D-木糖D-山梨醇L-阿拉伯糖甘油麦芽糖D-果糖D-蔗糖糊精
生长情况 碳源 生长情况
+
+
+
水杨苷D-乳糖
半乳糖
肌醇甘露醇甘氨酸木聚糖菊粉鼠李糖
无机氮源硫酸铵硝酸钾
生长情况
+
+
+
+
+
表3 菌抹T-300的降解试验结果
降解物
降解物浓度
结果^
降解物
降解物浓度
结果
腺噪呤鸟噪呤
0.5%0.5%
+
酪蛋白酪氨酸
1.0%1.0%黄口票呤 0.4% + Tween-40 1.0% +
次黄噪呤 0.4% + Tween-80 1.0% +
表4菌林T-300主要的生理生化特征
试验项目结果试验项目结果试验项目
明胶液化+牛奶胨化+纤维素利用
淀粉水解+硝酸盐还原+氧化酶
牛奶凝固+石克化氲产生-过氧化氢酶
M.R实马全+V. P实验—黑色素产生
实施例4: 16SrDNA序列分析以及与已知的他克莫司产生菌的比较
收集待测菌林的新鲜菌体，采用溶液菌酶法改进的Pitcher法(Pitcher等，198提取总DNA模板，采用通用引物(27F和1495R)进行16S rRNA基因扩增，PCR产物经检测纯化后，TA克隆后进行序列测定，测序由上海生工生物工程技术有限公司进行。所测的16SrDNA序列经校对后与GenBank数据库中相关种、属的序列进行同源序列BLAST比较，以确定该菌4朱的分类地位。与GenBank中相关序列进行BLAST比较的结果见表5 (表中只列出同源性较高的菌抹)。
表5 菌抹T-300和相关菌株的同源性
种名GenBank No.碱基差异数同源性(％)
AY 1270793697.4
AF4558133697.4
AB0880693697.4
AY2076054097.2
S鄉tom戸s取5799AJ3918144297.0
AJ3150724596.8
AY1776624796.7
9结果发现T300弁的16sDNA测序结果比较发现和6V";^^yc^ NRRL 30562、/SV"/ tow;;c&s1 / ada""51和6V厂eptow;;cas1 >sp. TP-A0274的同 源性达到了 97.4%。
T-300和已知的他克莫司产生菌的比较
T-300菌落属于灰色群，《4。/。NaCl能够生长。14°C到37。C均能 够生长，最适合温度为28°C。明胶液化，淀粉水解，牛奶凝固且胨化， 硝酸盐还原，纤维素利用，M.R实验和过氧化氬酶均为阳性。能够利 用葡萄糖、木糖、麦芽糖、糊精、肌醇和木聚糖，部分利用半乳糖。 可以利用硝酸钾为唯一无4几氮源。
T-300菌落属于灰色群，不产生HzS; Strain MA
6858属于黄色群，产生H2S。 ^"/7tom;;cM取ATCC No. 55098属于
黄色群，产生仏S。
T-300能够利用麦芽糖、肌醇和木糖，不能利用果糖，乳糖； 5V^ptom;;cMw. Strain MA 6858不能利用麦芽糖、肌醇和木糖，能够 利用果糖。T-300最适合温度为28°C,在37。C能够生长；
Strain MA 6858最适合温度为27°C ,在37。C不能生长。5V"/ tom;;c^ /i>;cfrascop/cus No. 7238可以利用乳斗唐。S&e^cwyc&s sp. ATCC No. 55098不能利用麦芽糖，能够利用果糖，乳糖。
T-300可以使淀粉水解，牛奶凝固，硝酸盐还原；5". toiw6"m^ 不能。T-300能够利用肌醇、木糖和部分利用半乳糖，不利用甘氨酸； X ^^t/Zww^不能利用肌醇、木糖和半乳糖，利用甘氨酸。 ^reptom;;ces /y^raycc^c"^ No. 7238不能使牛奶凝固，硝酸盐还原。
综上所述，T-300属于链霉菌属，但它不同于已知的他克莫司产 生菌iSVr一麵少c^ /zj^/rc^cop,cws, S. 加AwZ ae肌S 、 6Y厂一o，c^y取 5Vrafw MA 6858和5^eptowtyces s卩ATCC No. 55098。 T-300是一个全 新的菌种。
实施例5:
种子培养基(葡萄糖1.5%、酵母抽提粉0.3%、黄豆粉1%、 CaC030.2%， pH为6.7),装量为25ml/250ml摇瓶，120。C灭菌30min。从T-300的斜面挖一块接入种子培养基，置于摇床上25。C培养2天。然后1.25ml的种子培养液接入发酵培养基(糊精6.0%,葡萄糖0.5%,酵母抽提粉1.0%，花生粉2.0%, NaCl 0.35%, K2HPO40.5%, pH为7.3,装量为25ml/250ml摇瓶，120。C灭菌30min),置于摇床上25。C培养6天。他克莫司通过有机溶剂从发酵液中萃取所得，(去除多余空格)HPLC测定。其含量为250 pg/ml。取发酵液32L，发酵液过滤得湿菌丝。用4倍重量的丙酮萃取。萃取液加水至丙酮含量为50%(注明各百分比是质量百分比还是体积百分比)，上HP20大孔吸附树脂，再用75%丙酮洗脱，得洗脱液1L。浓缩去丙酮后再加乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取液600ml。再上硅胶柱。用正已烷乙酸乙酯=1: 2展层。收集纯组份洗脱液800ml,浓缩干。再用乙腈溶解，降温至4。C,结晶48小时。过滤得FK506湿品。烘干后得3.5克FK506成品。结构鉴定红外IR: 3457.51, 2935.75, 1741.37， 1694.07, 1640.71,1450.83, 1384.07, 1193.91, 1090.64 cm画l;紫外UV: Xmax 203.40 nm;高分辨质i普HRMS: 826.4702 ( C44H69N012), M+Na。
实施例6:
种子培养基(淀粉1.5%、干酵母1.2%、大豆蛋白胨1%、CaCO30.3%, pH为7.0 ),装量为20ml/250ml摇瓶，120。C灭菌30min。从T-300的斜面挖一块接入种子培养基，置于摇床上25。C培养42hr。然后1.50ml的种子培养液接入发酵培养基(淀粉7.0。/Q,葡萄糖1.0%,棉籽饼粉1.0%,花生粉2.5%, NaC10.50%, K2HPO40.5%, pH为7.0,装量为25ml/250ml摇瓶，120。C灭菌30min),置于摇床上25。C培养7天。HPLC测定。其含量为300 pg/ml。分离纯化按照实施例5进行。
实施例7:
种子培养基(淀粉1.5%、干酵母1.2%、牛肉浸出粉1.2%、 CaC030.3%， pH为7.0),装量为25ml/250ml摇瓶，120。C灭菌30min。从
iiT-300的斜面挖一块接入种子培养基，置于摇床上25。CTC培养42hr。然后1.25ml的种子培养液接入发酵培养基(淀粉6.5%，乳糖1.0%,棉籽饼粉1.0%,玉米浆2.5%, KH2PO40.5%, K2HPO40.5%, pH为7.0,装量为25ml/250ml摇瓶，120。C灭菌30min)，置于摇床上25。C培养6天。他克莫司通过有机溶剂从发酵液中萃取所得，HPLC测定。其含量为175 pg/ml。分离纯化按照实施例5进行。
上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以对其作出各种变化和修改，因此所有等同的技术方案也应落在本发明的范围内。本发明的专利保护范围应由所附的权利要求书限定。
权利要求
1、一种链霉菌T300(CGMCC1779)，其具有产生他克莫司或其类似物的能力。
2、 根据权利要求1所述的链霉菌T300 (CGMCC1779)在制备他克 莫司或其类似物中的应用。
3、 一种制备他克莫司或其类似物的方法，其特征在于包括采用链 霉菌T300 (CGMCC1779)在含有可同化的碳源和氮源的营养培养基里， 有氧发酵的步骤。
4、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述可同化的碳 源选自葡萄糖、淀粉、甘油、木糖、木聚糖、糊精、麦芽糖、海藻糖、 肌醇、菊糖、水杨苷，或上述物质的组合。
5、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述可同化的氮 源为选自棉籽饼粉、酵母抽提粉、蛋白胨、谷蛋白、黄豆粉、玉米浆、 花生粉、小麦粉、干酵母、尿素氨基酸、硝酸盐，或上述物质的组合。
6、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述培养基中还 包括消泡剂，该消泡剂选自植物油、液体石蜡、脂肪油、矿物油、硅油， 或上述物质的组合。
7、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述发酵培养的 温度为20°C-40°C， pH为6.0-8.0,培养时间为120-240小时。
8、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于其中所采用的他 克莫司产生菌还可以为链霉菌T300 (CGMCC1779)自发的突变抹或通 过常规的诱变得到突变林。
9、 根据权利要求3~8所述的制备方法在制备含有他克莫司的药物 组合物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种新的链霉菌、通过培养它制备他克莫司的方法及其应用。本发明的链霉菌Streptomyces sp.T300(CGMCC1779)是一个全新的菌种，且在发酵过程中不产生有毒的H<sub>2</sub>S气体。其在含有可同化的碳和氮源的营养培养基里并在通氧的条件下通过发酵培养下制得他克莫司，并可应用于制备含有他克莫司的药物组合物。
文档编号C12N1/20GK101486975SQ200810001069
公开日2009年7月22日 申请日期2008年1月18日 优先权日2008年1月18日
发明者叶美丽, 林剑秋, 丹 潘, 骅 白, 胡建红, 詹佩君, 马海霞 申请人:浙江海正药业股份有限公司