专利名称：：促进灵芝次生代谢产物合成的细胞培养方法
技术领域：
：本发明涉及一种微生物细胞培养方法，尤其涉及一种通过在灵芝液体深层发酵过程中添加诱导子从而促进灵芝多糖和灵芝酸生物合成的灵芝细胞培养方法，属于微生物发酵领域。
背景技术：
：灵芝(Ga"oJerma/wcWwm(LeyssexFr.)Krast),属于4s子菌纟冈、多孑L菌牙牛、灵芝属，是一种珍贵的药用真菌，具有广泛的生物活性，如抗肿瘤、抗氧化等，在中国已有两千多年的历史。自古以来，一直被人们视为延年益寿的珍品，是滋补强壮、扶正固本、有利于维持机体平衡的名贵中药。灵芝在东南亚地区具有悠久的药用历史，我国人民把它作为药物也已经有两千余年的历史，始载于《神农本草经》。灵芝多糖是灵芝中一类具有广泛生物活性的代谢产物，在许多研究中，经证实对肝癌、白血病等具有良好的抑制作用。灵芝三萜类化合物(主要是灵芝酸)分为四环三辟和五环三萜，从灵芝四环三辟类化合物的结构来看，属于高度氧化的羊毛甾烷衍生物，具有抗肿瘤及抗HIV-I、HIV-I激酶的活性。这两大类活性物质均属于次生代谢产物，含量很低，不利于大规模的产业化生产，因而，需要找到一种可以提高次生代谢产物产量的有效方法，以克服现有技术存在的缺陷。细胞培养法生产灵芝酸和灵芝多糖等有效成分，由于生产周期短、需要劳动力少以及受外部环境影响小等优点被认为是一种更有效的方法。Roja等报道了壳多糖能促进雪兰莪草培养物中阿拉伯半乳聚糖的生物合成(Roja，G.,Bhangale,A.S.,Juvekar,A.R.，EapenS.，D，SouzaS.F.EnhancedproductionofthepolysaccharidearabinogalactanusingimmobilizedculturesofT7wo5poraconi^b//abyelicitationandinsituadsorption.Biotechnol.Prog.2005，21，1688-1691)。Satdive等披露了麦角菌制备的诱导子能在印度楝树培养过程中促进印楝素(一种四环三辟类物质)的大量合成(SatdiveR.K.,FulzeleD.P.,EapenS.EnhancedproductionofazadirachtinbyhairyrootculturesofJzadz.rac/^zW/caA.Jussbyelicitationandmediaoptimization.J.Biotechnol.2007，128:281-289)。但至今仍缺乏一种能够有效促进或提高灵芝次生代谢产物生物合成的细胞培养方法。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服现有的灵芝细胞培养方法中所存在的灵芝多糖和灵芝酸产量低的缺陷，提供一种能够有效促进或提高灵芝次生代谢产物(尤其是灵芝多糖和灵芝酸)生物合成的细胞培养方法。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种促进灵芝次生代谢产物合成的细胞培养方法，包括将灵芝菌种接种到斜面培养基进行培养，再依次进行一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体深层发酵，其中，在液体深层发酵过程中向发酵液中添加由真菌菌丝体所制备的诱导子。为了达到更好的技术效果优选的，在灵芝细胞对数生长期的末期向发酵液中加入由真菌菌丝体所制备的诱导子；更优选的，在液体深层发酵的第8天向发酵液中加入由真菌菌丝体所制备的诱导子。所加入的诱导子的浓度优选为60毫摩尔/升。所述的真菌优选为橘青霉(Pem'c/〃/wmc/加'"wm)、中国块菌(7l/Zjer57'"ewse)、德国^:菌(71^6/-aey"VMmWWac/)、或黑孑包块菌(r"Zerme/awcwpon^w)。这些真菌菌种者卩可从各种商业途径购买得到。所述的诱导子可以是以下三种诱导子中的任一种(1)全成分诱导子包含真菌菌丝体中的大部分成分(含多糖、蛋白和脂类)；(2)多糖蛋白诱导子主要包含真菌菌丝体中的多糖和蛋白类成分；(3)多糖诱导子主要包含真菌菌丝体中的多糖类成分。每种真菌的菌丝体都可以按照现有的方法制备成上述三种诱导子中的任一种。作为参考，上述的三种诱导子可分别参考以下方法制备得到(1)全成分诱导子的制备方法真菌菌丝体过滤收集并用去离子水沖洗两次，然后浸泡于醋酸盐緩冲液中匀浆，匀浆液高速离心，取上清液，高压灭菌，即得。(2)多糖蛋白诱导子的制备方法将真菌菌丝体浸泡于醋酸盐緩冲液中匀浆，然后加入乙酸乙酯进行混合，室溫下静置；减压抽滤，滤渣加入去离子水，高压灭菌，悬浮液过滤，取滤液，即得。(3)多糖诱导子的制备方法取菌丝体用去离子水冲洗两次，烘干，研磨成粉末加入乙醇室温下浸泡过夜；混合物减压抽滤取滤渣，加入氯仿，回流提取，残留物用丙酮沖洗并风干；向所得到的干物质加入稀盐酸，高压灭菌，悬浮液再过滤取滤液，即得。所述的斜面培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体深层发酵所用到的培养基和培养条件均为灵芝细胞培养中的常规培养基和常规培养条件，这些都是本领域技术人员所公知的，作为参考，所述的培养基和有关的培养条件可按照有关文献所公开的内容进行(Tang，Y.J.;Zhong，J.J.Fed-batchfermentationofGflwoi/erma/固W謂forhyperproductionofpolysaccharideandganodericacid.EnzymeMicrob.Technol.2002，31,20-28)。作为参考所述的斜面培养基是PDA琼脂培养基(0.15克/升的七水硫酸镁，0.30克/升的磷酸二氢钾，20克/升的葡萄糖，0.05克/升的维生素B,和200克/升的土豆)。灵芝细胞斜面培养条件是培养温度28。C，暗培养，培养时间为7天。所述的一级液体种子培养基为葡萄糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母粉2.5克/升，七水硫酸镁0.5克/升，磷酸二氢钾l克/升，维生素B,0.05克/升。一级液体种子培养条件温度30。C,旋转式摇床，转速为120转/分。所述的二级液体种子培养基为葡萄糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母粉2.5克/升，七水硫酸镁0.5克/升，磷酸二氩钾l克/升，维生素Bi0.05克/升。二级液体种子培养条件温度30。C，旋转式摇床，转速为120转/分。所述的液体深层发酵培养基为乳糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母粉5克/升，七水硫酸镁0.5克/升，磷酸二氢钾l克/升，维生素B^.05克/升。液体深层发酵条件温度30。C，旋转式摇床，转速为120转/分，暗培养。所述的灵芝菌种可以通过各种商业途径购买得到，例如，可以购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，其菌种的编号为CGMCC5.616。将本发明细胞培养方法所得到的产物分别用浓硫酸-苯酚法测定灵芝多糖的含量，釆用紫外分光光度法测定灵芝酸的含量，测定结果表明，本发明的方法可实现对灵芝细胞培养生产灵芝多糖及灵芝酸的促进。通过在液体深层发酵过程中添加由德国块菌制备的全成分诱导子，培养产物中灵芝胞外多糖产量比未添加诱导子的对照组提高了24.3%。在加入中国块菌制备的多糖蛋白诱导子后，培养产物中灵芝胞内多糖的含量及产量均有显著提高。添加由黑孢块菌所制备的多糖蛋白诱导子后，对培养产物中灵芝酸含量的提高有明显地促进作用，诱导后的灵芝酸含量比对照组提高了89.9/。，而添加由橘青霉制备的多糖成分诱导子后使灵芝酸产量达到了最高值。这表明在液体深层发酵过程中添加真菌诱导子，对于灵芝多糖及灵芝酸的生物合成均有明显地促进作用，为工业化生产灵芝中的活性成分奠定了基础。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实验材料1、灵芝菌种(Ganodermalucidum(Fr.)Krast(Polyporaceae):购自中国普通4效生物菌种保藏管理中心，其编号为CGMCC5.616;2、中国块菌(Tubersinense)、德国块菌(Tuberaestivumvittad)和黑孢块菌(Tubermelanosporum)均购自于四川绵阳食用菌研究所。橘青霉(Penicilliumcitrinum);购自中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，其编号为AF93032;实施例1一、橘青霉(Penicilliumcitrinum)(购自中国典型培养物保藏中心，其编号为AF93032)发酵菌丝体的制备培养基(克/升)蔗糖30，硝酸钠3，七水硫酸镁0.5,氯化钾0.5，四水硫酸亚铁O.Ol，磷酸氢二钾l,琼脂15(液体培养时不加琼脂)；培养条件250毫升摇瓶，装液量为50毫升；培养温度25。C;120转/分；二、由橘青霉菌丝体制备3种真菌诱导子(1)全成分诱导子的制备方法橘青霉菌丝体过滤收集并用去离子水冲洗两次，然后浸泡于pH值为5.6的0.1摩尔/升的醋酸盐緩沖液中匀浆，匀浆液5,500转/分高速离心，取上清液，高压灭菌，即得；(2)多糖蛋白诱导子的制备方法将橘青霉菌丝体浸泡于pH值为5.6的0.1摩尔/升的醋酸盐緩沖液中匀浆，然后加入乙酸乙酯进行混合，室温下静置；减压抽滤，滤渣加入去离子水，调pH值至2.0,高压灭菌，悬浮液过滤，取滤液调pH至3.0,即得。(3)多糖诱导子的制备方法将橘青霉用去离子水沖洗两次，烘干，研磨成粉末加入80%乙醇室温下浸泡过夜；混合物减压抽滤取滤渣，加入氯仿，回流提取，残留物用丙酮冲洗并风干；向所得到的干物质加入l摩尔/升的盐酸，高压灭菌，悬浮液再过滤取滤液，调pH至3.0，即得。三、实验分为试验组和对照组对照组将灵芝菌种接种到斜面培养基进行培养，再依次进行一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体深层发酵；试验组与对照组所不同的仅在于，在液体深层发酵过程的第8天分别向发酵液中添加由橘青霉菌丝所制备的3种诱导子(浓度为60毫摩尔/升)，试验组和对照组所用到的培养基和培养条件分别如下(1)斜面培养基PDA,28°C，暗培养7天；(2)—级液体种子培养基(克/升)葡萄糖35，蛋白胨5，酵母粉2.5，七水硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1,维生素B！0.05，pH5.5;培养条件50毫升培养基/250毫升摇瓶，温度3(TC,旋转式摇床，转速为120转/分。(3)二级液体种子培养基(克/升)葡萄糖35,蛋白胨5，酵母粉2.5，七水硫酸镁0.5，磷酸二氢钾l,维生素B^.05，pH5.5;培养条件200毫升培养基/500毫升摇瓶，温度30。C,旋转式摇床，转速为120转/分。(4)发酵培养基(克/升)乳糖35，蛋白胨5，酵母粉5，七水硫酸镁0.5,磷酸二氢钾l,维生素B!0.05,pH5.5;培养条件50毫升培养基/250毫升摇瓶,温度30°C,旋转式摇床，转速为120转/分。细胞在60。C烘干后称重，烘干的细胞按照TangandZhong(EnzymeMicrob.Technol.2002，31,20-28)的方法萃取处理后，分别用浓硫酸-苯酚法和紫外分光光度法测定灵芝多糖和灵芝酸的含量，实验结果见表l。表1三种橘青霉诱导子诱导后的灵芝次生代谢产物含量及产量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>细胞干重达到最大的培养时间从表1可知，与对照组(不添加诱导子)相比，试验组添加由橘青霉菌丝体制备的多糖诱导子后，灵芝酸产量获得一定程度的提高；而在加入由橘青霉菌丝体制备的多糖蛋白诱导子后，灵芝胞内多糖的含量及产量分别提高了18.0%和37.3%。这表明在灵芝液体深层发酵过程中添加由橘青霉菌丝体制备的诱导子，可以促进灵芝酸及灵芝多糖的生物合成。实施例2添加的诱导子为中国块菌(7l^ew/wewse)制备的三种诱导子；中国块菌(r"6ers/we似e)菌丝体的制备方法如下(1)斜面培养PDA,25°C,培养6天；(2)—级液体种子培养培养基(克/升)葡萄糖35,蛋白胨5,酵母粉2.5，七水硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1，维生素B,0.05，pH5.5;培养条件50毫升培养基/250毫升摇瓶，25。C,120转/分。(3)二级液体种子培养培养基(克/升)葡萄糖35,蛋白胨5,酵母粉2.5，七水硫酸镁0.5,磷酸二氢钾l,维生素B^.05，pH5.5;培养条件200毫升培养基/500毫升摇瓶，25。C,120转/分；(4)液体深层发酵发酵培养基(克/升)葡萄糖35,蛋白胨5,酵母粉5，七水硫酸镁0.5,磷酸二氢钟l,维生素Bi0.05,pH5.5;发酵条件50毫升培养基/250毫升摇瓶，25°C,120转/分。由中国块菌(rw/)er67'wewse)的菌丝体制备成3种i秀导子的方法同实施例1,i式马全组和对照组的处理也同实施例1，实验结果见表2。表2三种中国块菌诱导子诱导后的灵芝次生代谢产物含量及产量对照组全成分诱导子多糖蛋白诱导子多糖诱导子细胞干重(克/升)13.94±0.62(12天)12.32±0.89(16天)15.05±0.17(14天)13.57±0.66(16天)胞外多糖产量(克/升)0.71±0.050.67±0.080.64±0.050.67±0.06胞内多糖含量(毫克/100毫克细胞干重)10.40±1.0710.76±0.4812.91±1.0510.32±0.04胞内多糖产量(克/升)1.26±0.041,27±0.201.94±0.181.39±0.12灵芝酸含量(毫克/ioo毫克细胞干重)1,90±0.152.40±0.041.87±0.291.72±0.06灵芝酸产量(毫克/升)264.6±9.5272.9±22.0281.1±14.4233.8±3.0从表2可知，与对照组(不添加诱导子)相比，添加中国块菌(rWerW"e^e)菌丝体所制备的多糖蛋白诱导子后，灵芝胞内多糖含量及产量均有大幅度提高，分别比对照组提高了24.1%和54.0%;而在加入由中国块菌(rWe/"Wwe"w)菌丝体所制备的全成分诱导子后，灵芝酸含量提高了26.3%。实施例3与实施例2相比，实施例3的诱导子由黑孢块菌(rwterme/a"(wpww附)的菌丝体制备而得，其他条件均同实施例2，实验结果见表3。表3三种黑孢块菌诱导子诱导后的灵芝次生代谢产物含量及产量对照组全成分诱导子多糖蛋白诱导子多糖诱导子细胞干重(克/升)14.05±0.16(14天)14.92±0.41(14天)9.06±0.55(8天)13.88±0.86(16天)胞外多糖产量(克/升)0.74±0.040.69±0.050.73±0.090.82±0.02胞内多糖含量(毫克/ioo毫克细力包干重)10.21±0.4910.53±0.2010.46±0.649.87±0.18胞内多糖产量(克/升)1.35±0.081.57±0.010.47±0.001.28±0.00灵芝酸含量(毫克/100毫克细胞干重)1.49±0.031.49±0.032.83±0.081.49±0.03灵芝酸产量(毫克/升)152.5±16.0117.2±4.284.9±16.2120.0±11.0从表3可知，与对照组(不源"口诱导子)相比,添加由黑孢块菌(7l^erme/a"o^on^m)菌丝体制备的多糖蛋白诱导子后，灵芝酸含量有大幅度提高，比对照组提高了89.9%，这表明在灵芝液体深层发酵过程中添加该种诱导子，可以有效促进灵芝酸的生物合成。实施例4与实施例2相比，本实施例的3种诱导子由德国块菌(7l^erae幼Vwwv故acO的菌丝体按照实施例2的方法制备而得，其他条件均同实施例2,实验结果见表4。表4三种德国块菌诱导子诱导后的灵芝次生代谢产物含量及产量对照组全成分诱导子多糖蛋白诱导子多糖诱导子细胞干重(克/升)14.05±0.16(14天)14.49±0.55(14天)14.59±0.25(16天)14.65±0.12(16天)胞外多糖产量(克/升)0.74±0.040.92±0.070.64±0.000.90±0.01胞内多糖含量(毫克/100毫克细胞干重)10.21±0.4911.34±0.659.30±0.789.05±0.22胞内多糖产量(克/升)1.35±0.081.64±0.161.25±0.211.32±0.03灵芝酸含量(毫克/i00毫克细胞干重)l.l士O.l0.8±0.10.9±0.00.8±0.0灵芝酸产量(毫克/升)152.5±16.0137.6±9.9121.2±6.6135.0±5.5从表4可知，与对照组(不添加诱导子)相比，添加德国块菌(71/Z)erae幼'VMmv/"a力菌丝体制备的全成分诱导子后，灵芝胞外多糖的产量提高了24.3%,胞内多糖产量提高了21.5%,这表明在灵芝液体深层发酵过程中添加该种诱导子，可以有效促进灵芝多糖的生物合成。权利要求1、一种促进灵芝次生代谢产物生物合成的细胞培养方法，包括将灵芝菌种接种到斜面培养基进行培养，再依次进行一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体深层发酵，其特征在于在液体深层发酵过程中向发酵液中添加由真菌菌丝体所制备的诱导子以诱导灵芝次生代谢产物的生物合成。2、按照权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于在灵芝细胞对数生长期的末期向发酵液中加入由真菌菌丝体所制备的诱导子。3、按照权利要求2所述的细胞培养方法，其特征在于在液体深层发酵的第8天向发酵液中加入60毫摩尔/升的由真菌菌丝体所制备的诱导子。4、按照权利要求l-3任何一项所述的细胞培养方法，其特征在于所述的由真菌菌丝体所制备的诱导子是全成分诱导子、多糖蛋白诱导子或多糖诱导子。5、按照权利要求4所述的细胞培养方法，其特征在于所述的全成分诱导子的制备方法包括菌丝体过滤收集并用去离子水冲洗两次，然后浸泡于醋酸盐緩冲液中匀浆，匀浆液高速离心，取上清液，高压灭菌，即得。6、按照权利要求4所述的细胞培养方法，其特征在于所述的多糖蛋白诱导子的制备方法包括将菌丝体浸泡于醋酸盐緩冲液中匀浆，然后加入乙酸乙酯进行混合，室温下静置；减压抽滤，滤渣加入去离子水，高压灭菌，悬浮液过滤，取滤液，即得。7、按照权利要求4所述的细胞培养方法，其特征在于所述的多糖诱导子的制备方法包括取菌丝体用去离子水冲洗两次，烘干，研磨成粉末加入乙醇室温下浸泡；混合物减压抽滤取滤渣，加入氯仿，回流提取，残留物用丙酮冲洗并风干；向所得到的干物质加入稀盐酸，高压灭菌，悬浮液再过滤，^c滤液，即得。8、按照权利要求l-3任何一项所述的细胞培养方法，其特征在于，所述的真菌选自橘青霉(尸e"/cZ〃/Mmc"n'"wm)、中国块菌(r"6erw'wem"e)、德国块菌(Jl^erae幼'vwmv故—或黑孑包块菌(7l^er膨/awos7or謹)。9、权利要求l-3任何一项所述的细胞培养方法所培养得到的产物。全文摘要本发明公开了一种促进灵芝次生代谢产物生物合成的细胞培养方法，该方法包括首先将灵芝菌种接种到斜面培养基进行培养，再依次进行一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体深层发酵，其中，在液体深层发酵过程向发酵液中添加一定量的由真菌菌丝体所制备的诱导子以诱导灵芝多糖和灵芝酸的生物合成。将所得到的细胞培养物分别用浓硫酸-苯酚法和紫外分光光度法测定灵芝多糖和灵芝酸的含量，结果表明，本发明方法可有效促进灵芝细胞培养物中灵芝多糖和灵芝酸的生物合成，为灵芝多糖和灵芝酸的工业化和商业生产奠定了基础。文档编号C12N1/14GK101215526SQ20081000105公开日2008年7月9日申请日期2008年1月15日优先权日2008年1月15日发明者朱丽雯,李冬生,汤亚杰申请人:湖北工业大学