Pef-tu表达单元的制作方法

专利名称：：Pef-tu表达单元的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于调节基因转录和表达的核酸序列的用途、新启动子及其表达单元、用于改变或影响基因转录速率和/或表达速率的方法、包含该表达单元的表达盒、具有改变的或受影响的转录速率和/或表达速率的经基法'
背景技术：
多种生物合成产物例如精细化学品，尤其例如氨基酸、维生素及蛋白质是通过天然代谢过程在细胞中产生的，并被用于包括化妆品、饲料、食品及医药工业的许多工业领域中。这些物质统称为精细化学品/蛋白质，其尤其包含有才几酸、生蛋白氨基酸(proteinogenicaminoacid)和非生蛋白氨基酸(non-proteinogenicaminoacid)、核香酸和核香、月旨类和月旨肪酸、二醇、糖类、芳香化合物、维生素和辅因子以及蛋白质和酶。通过培养为了产生及分泌大量特定的目的物质而开发出的细菌，以工业规一莫上最有利的方式生产这些物质。特别适于此目的生物为棒杆菌，其为革兰氏阳性非病原菌。已知通过棒杆菌菌林的发酵，尤其是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的发酵来制备氨基酸。由于其具有重大意义，所以在改良其生产方法上进行了不懈努力。方法的改良与下列有关发酵技术手段例如搅拌与供氧；或者营养培养基的组成例如发酵中的糖浓度；或者用于获得产物的处理例如通过离子交换层析或喷雾干燥；或者微生物自身的内在性能特性。通过扩增个别基因及研究其对精细化学品/蛋白质生产的作用，重组DNA技术也已在产生精细化学品/蛋白质的棒杆菌菌株的菌林改良中应用了一些年。用于发展生产精细化学品、氨基酸或蛋白质的方法，或用于增加或提高先前存在的生产精细化学品、氨基酸或蛋白质的方法的生产率的其它方式是增加或改变一种或多种基因的表达，和/或用适宜多核苷酸序列影响mRNA的翻译。就此而言，影响可包括基因表达的增加、减少或其它限制因素，例:i口时序表达才莫式(chronologicalexpressionpattern)。细菌调节序列的各种组分是本领域^t术人员已知的。对于以下结合位点已作出了区分调节物结合位点，也称为操纵基因；RNA聚合酶全酶结合位点，也称为-35与-10区及核糖体16SRNA结合位点，也称为核糖体结合寸立点或Shiiie画Dalgarao序歹寸。为了本发明的目的，核糖体结合位点序歹iJ(也称为Shine-Dalgarno序列)是指位于翻译起始密码子上游高达20个碱基处的多核苦酸序列。据文献(E.coli和S.typhimuri腿,NeidhardtF.C.1995ASMPress)报导，Shine-Dalgarno序列的多核苷酸序列组成和碱基序列串及存在于Shine-Dalgarno序列中的多核苷酸序列的距离均对翻译起始速率具有显著影响。具有启动子活性的核酸序列可以各种方式影响mRNA的形成。其活性不依赖于生物的生理生长期的启动子称为组成型。而其它启动子响应外部的化学及物理刺激，例如氧、代谢物、热、pH等。而其它启动子在不同生长期中显示出其强的活性依赖性。例如，文献中描述的在微生物的指数生长期中或恰好在微生物生长的稳定期中显示出特别显著活性的启动子。根据代谢途径，启动子的两种特征可对精细化学品及蛋白质的生产率具有有益的作用。例如，在生长过程中关闭基因表达，但在最佳生长之后又启动基因表达的启动子可用于调节控制代谢物产生的基因。于是，修饰的菌林显示与初始菌林相同的生长参数，但每个细胞产生更多产物。此种类型的修饰可增加滴度(每升的产物克数/)及C产率(每克C源的产物克数)。已经可以从棒杆菌物种中分离出那些可用于增强或减弱基因表达的核苷酸序列。根据细胞内部和/或外部条件，这些受调节的启动子可提高或降低基因转录的速率。在某些情况下，被称为诱导物的特定因子的存在可刺激从启动子的转录速率。诱导物可直接或间接影响从启动子的转录作用。被称为抑制物的另一类因子能够降低或抑制从启动子的转录作用。与诱导物相类似，抑制物也可直接或间接地起作用。另一方面，温度调节型启动子也为已知的。因此，例如，可通过将生长温度增至高于细胞的正常生长温度来增强或减弱这类启动子的转录水平。至今已描述了少量来自谷氨酸棒杆菌的启动子。DE4440118中描述了来自谷氨酸棒杆菌的苹果酸合酶基因的启动子。将该启动子插入到编码蛋白质的结构基因的上游。这类构建体转化进入棒杆菌之后，对该启动子下游的结构基因的表达进行调节。一旦在培养基中添加适当的诱导物，就诱导结构基因的表达。Reinscheid等人在Microbiology145:503(1999)中描述了来自谷氨酸棒杆菌的pta-ack启动子与报道基因(氯霉素乙酰转移酶)之间的转录融合。包含这种转录融合的谷氨酸棒杆菌细胞在含有乙酸的培养基上生长时，呈现出报道基因的表达增强。与此相比，在葡萄糖上生长的转化细胞未显示出该报道基因的表达增强。Pa，tek等人在Microbiology142:1297(1996)中描述了能够增强谷氨酸棒杆菌细胞中报道基因表达的来自谷氨酸棒杆菌的某些DNA序列。将这些序列在一起进行比较以便确定谷氨酸棒杆菌启动子的共有序列。专利WO02/40679中已经描述了可用于调节基因表达的来自谷氨酸棒杆菌的其它DNA序列。这些分离的多核苷酸表现为可用于增加抑或降低基因表达的源自谷氨酸棒杆菌的表达单元。该专利还另外描述了源自谷氨酸棒杆菌的表达单元与异源基因在其上连接在一起的重组质粒。本文所描述的将源自谷氨酸棒杆菌的启动子与异源基因融合的方法尤其可用于调节氨基酸生物合成的基因。
发明内容本发明的一个目的是提供具有利特性的其它启动子和/或表达单元。发明人已发现，通过使用具有启动子活性的核酸可实现此目的，所述核酸包含以下用于基因转录的序列A)核酸序列SEQ.ID.NO.1,或B)通过核苷酸替代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.l衍生并且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.1具有至少90%同一性的序列，或C)在严格条件下与核酸序列SEQ，ID.NO.l杂交的核酸序列，或D)A)、B)或C)的序列的功能等效片段。根据本发明，"转录"是指从DNA模板开始产生互补RNA分子的过程。此过程涉及蛋白质如RNA聚合酶、所谓的o因子及转录调节蛋白质。接着，合成的RNA用作翻译过程中的模板，其随后产生生物合成活性蛋白质。产生生物合成活性蛋白质的形成速率是转录速率与翻译速率的结果。根据本发明，两种速率均可受到影响，并且因此影响到微生物中产物形成速率。根据本发明，"启动子"或"具有启动子活性的核酸，，是指以与待转录核酸功能性连接的方式调节该核酸转录的核酸。就此而言，"功能性连接"是指例如具有启动子活性的本发明的核酸之一与待转录核酸序列以及适当条件下的其它调节元件(例如确保核酸转录的核酸序列及终止子)以使得每一调节元件均能在该核酸序列转录中发挥其功能的方式进行的顺序排列。因此，化学意义上的直接连接并非绝对必要。例如增强子序列的遗传控制序列能够对较远位置，甚至其它DNA分子上的靼序列执行其功能。优选的是这样一种排列，即待转录的核酸序列位就此而言，启动子序列与待进行转基因表达的核酸序列之间的距离优选小于200个碱基对，特别优选小于100个碱基对，非常特别优选小于50个碱基对。根据本发明，"启动子活性"是指在特定时间内由启动子形成的RNA量，即指转录速率。根据本发明，"特异启动子活性"是指各启动子在特定时间内由启动子形成的RNA的量。根据本发明，术语"野生型"是指合适的起始微生物。视上下文而定，术语"微生物"是指起始微生物(野生型)或本发明的经遗传修饰的微生物或其两者。优选并且尤其是在不能明确归类^:生物或野生型的情状下，"野生型"是指为了改变或影响启动子活性或转录速率、为了改变或影响表达活性或表达速率及为了增加生物合成产物的含量的每个情况下的参考生物。在一个优选实施方案中，此参考生物为谷氨酸棒杆菌ATCC13032。在一个优选实施方案中，所用的起始微生物已能够产生所要精细化学品。就棒杆菌属细菌的特别优选微生物及特别优选的精细化学品L-赖氨酸、L-曱硫氨酸及L-苏氨酸而言，特别优选那些已能够产生L-赖氨酸、L-曱硫氨酸和/或L-苏氨酸的起始微生物。特别优选的为其中例如編码天冬氨酸激酶的基因(ask基因)已去调节或反馈抑制作用已消除或降低的棒杆菌。这类细菌具有例如在ask基因中导致反馈抑制作用降低或消除的突变，例如T311I突变。因此，在涉及与野生型相比的基因的"影响的启动子活性"或转录速率的情况下，与野生型相比RNA形成受到影响，其中在该方式下野生型中不存在所述RNA形成。因此，在涉及与野生型相比的基因的"改变的启动子活性，，或转录速率的情况下，与野生型相比特定时间内产生的RNA量受到改变。就此而言，"改变的"优选指增加的或降低的。例如，这可通过增加或降低本发明的内源启动子的特异启动子活性(例如通过使该启动子突变或通过刺激或抑制该启动子)进行。实现启动子活性或转录速率增加的另一种可能性是例如通过具有启动中基因的转录，其中基因相对于具有启动子活性的核酸而言是异源的。通过具有启动子活性的本发明核酸或者通过具有增加的特异启动子活性的核酸对微生物中基因转录的调节优选通过以下方式实现将一种或多种具有启动子活性于适当情况下具有改变的特异启动子活性)的本发明的核酸导入微生物基因组中，以便在所导入的具有启动子活性种或^种'内源基因的转录；或'、'^''将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在具有启动子活性于适当情况下具有改变的特异启动子活性)的本发明内源核酸的控制下进行一种或多种所导入基因的转录；或将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含具有启能性连接的一种或多种待转录核酸。具有启动子活性的本发明的核酸包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通过核苷酸替代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.l衍生并且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.1具有至少卯％同一性的序列，或C)在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.l杂交的核酸序列，或D)A)、B)或C)的序列的功能等效片段。核酸序列SEQ.ID.NO.l代表来自谷氨酸棒杆菌的蛋白质翻译延伸因子TU(PEF-TU)的启动子序列。SEQ.ID.NO.l对应于野生型的启动子序列。本发明还涉及具有启动子活性的核酸，其包含通过核苷酸替代、插入或缺失从SEQ.ID.NO.l序列衍生并且在核酸水平上与SEQ.ID，NO.l序列具有至少90%同一性的序列。序列与上述序列SEQIDNO:l进行同一性比较容易地从例如基因组序列已知的多种生物中发现。从序列SEQIDNO:l开始通过人工变异及突变(例如通过核苷酸替代、插入或缺失)可容易地得到本发明的人工启动子序列。本说明书中的术语"替代"是指一个或多个核苷酸被一个或多个核苷酸的置换。"缺失"是指核苷酸被直接连接的置换。"插入"是指将核苷酸向核酸序列中的插入，伴随者直接连接被一个或多个核苷酸的形式置换。两种核酸间的同一性是指在各情况下核酸完整长度上的核苷酸同一性，具体而言，同一性通过借助Informax(美国)的VectorNTISuite7.1软件，4吏用CIustal方法(HigginsDG,SharpPM.Fastandsensitivemultiplesequencealignmentsonamicrocomputer.ComputAppl.Biosci.1989年4月；5(2):151-1)进行比较计算出来，其中所参数设定如下多序列比对参数空位开放罚分10空位延伸罚分10空位分离罚分范围8空位分离罚分关比对延迟同一性％40残基特定空位关亲水性残基空位关过渡权重0序列两两比对参数FAST算法开K-数组尺寸(tupIesize)1空位罚分3窗口尺寸5最佳对角线数目(Numberofbestdiagonal)因此，与序列SEQIDNO:l具有至少90%同一性的核酸序列是指当其与序列SEQIDNO:l比较(具体而言是按照具有上面参数设置的上述程序化算法进行)时显示至少90%同一性的核酸序列。特别优选的启动子显示与核酸序列SEQ.ID.NO.1的同一性为91%,更加优选为92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%,特别优选为99%。此外，还可以通过本身已知的杂交技术从上述核酸序列开始、具体而言从序列SEQ.IDNO:l开始容易地从基因组序列未知的多种生物中得到启动子的其它天然实例。因此，本发明的另一方面涉及具有启动子活性的核酸，其包含在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.No.l杂交的核酸序列。此核酸序列包含至少IO个、更优选多于12、15、30、50个或特别优选多于150个核苷酸。根据本发明，在严格条件下进行杂交。此种杂交条件描述于例如Sambrook，J.，Fritseh，E.F"Maniatis，T.在MolecularCloning(ALaboratoryManual),第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989，第9.31-9.57页或者CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。严格杂交条件具体是指在由50%曱酰胺、5xSSC(750mMNaCl、75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardt溶液、10%硫酸葡聚糖及20g/ml已变性、剪切的蛙精DNA组成的溶液中于42。C孵育过夜，随后在65。C下用0.1xSSC洗涤滤膜。"功能等效片段"是指具有启动子活性片段的核酸序列，与起始序列相比其具有基本相同或较高的特异启动子活性。"基本上一致"是指表现出起始序列特异启动子活性的至少50%、优选60%、更优选70%、更优选80%、更优选卯％、特别优选95%的特异启动子活性。"片段，，是指由实施方案A)、B)或C)描述的具有启动子活性的核酸的部分序列。这种片段优选具有多于10个、但更优选多于12、15、30、50个或特别优选多于150个的核酸序列SEQ.ID.NO.l中的相连核苷酸。特别优选使用核酸序列SEQ.ID.NO.l作为启动子，即用于基因的转录。Genbank条目AP005283已在未说明功能的情况下描述了SEQ.ID.NO.1。因此，本发明进一步涉及新的、具有启动子活性的本发明核酸序列。本发明具体涉及具有启动子活性的核酸，其包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通过核苷酸替代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.l衍生并且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.1具有至少卯％同一性的序列，或C)在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.l杂交的核酸序列，或D)A)、B)或C)的序列的功能等效片段，其前提条件是排除具有序列SEQ.ID.NO.l的核酸。另外，可以本身已知方式，通过从核苷酸结构单位进行化学合成来制备上述具有启动子活性的所有核酸，例如通过双螺旋的单独重叠互补核酸结构单位的片段缩合。例如，通过亚磷酰胺方法(Voet，Voet，第2版，WileyPressNewYork,第896-897页)以已知的方式进行寡核苷酸的化学合成。S腿brook等人(1989),Molecularcloning:Alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress中描述了使用DNA聚合酶的Klenow片段及连接反应将合成的寡核苷酸加入并将补平缺口以及常规克隆方法。本发明进一步涉及表达单元的用途，所述表达单元包含一种具有启动子活性的本发明的核酸以及额外功能性连接的核酸序列，该核酸序列确保核糖核酸的翻译用便基因表达。根据本发明，表达单元是指具有表达活性的核酸，即与待表达核酸或基因功能性连接以调节表达的核酸，其中所述表达即指此核酸或该基因的转录及翻译。就此而言，"功能性连接"是指例如一种本发明表达单元与待进行转基因表达的核酸序列以及适当条件下的其它调节元件(如终止子)以每一调节元件在核酸序列的转基因表达中发挥其功能的方式进行的顺序排列。化学意义上的直接连接对此而言并非绝对必要。遗传控制序列例如增强子序列可以在较远位置、甚甚不同的DNA分子上对靼序列执行其功能。优选的是这样一种排列，即待进行转基因表达的核酸序列位于本发明表达单元序列之后(即在3，末端)以致于两个序列共价连接在一起。在这种情况下，表达单元序列与待进行转基因表达的核酸序列之间的距离优选小于200个碱基对，特别优选小于100个碱基对，非常特别优选小于50个碱基对。根据本发明，"表达活性"是指在特定时间内由表达单元产生的蛋白质的量，即表达速率。根据本发明，"特异表达活性"是指对于每一表达单元在特定时间内由表达单元产生的蛋白质的量。因此，在涉及与野生型相比的基因的"影响的表达活性"或表达速率的情况下，与野生型相比蛋白质的生产受到影响，其中在该方式下野生型中不存在所述蛋白质的生产。因此，在涉及与野生型相比的基因的"改变的表达活性"或表达速率的情况下，与野生型相比在特定时间内生产的蛋白质量受到改变。就此而言，"改变的"优选指增加的或降低的。例如，这可通过增加或降低内源表达单元的特异活性(例如通过使该表达单元突变或通过刺激或抑制该表达单元)进行。另外，例如通过本发明表达单元或具有增加特异表达活性的表达单元来调节微生物中基因的表达可以实现表达活性或表达速率的增加，其中所述基因相对于表达单元而言为异源的。通过本发明表达单元或具有增加特异表达活性的本发明表达单元对微生物中基因表达的调节优选通过以下方式实现将一种或多种于适当条件下具有改变的特异表达活性的本发明表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的于适当条件下具有改变的特异表达活性的本发明表达单元的控制下进行一种或多种内源基因的表达；或将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在于适当条件下具有改变的特异表达活性的本发明内源表达单元的控制下进行一种或多种所导入基因的表达；或将一种或多种核酸构建体导入^:生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有改变的特异表达活性的本发明表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。本发明表达单元包含具有启动子活性的上述本发明核酸和额外以功能性连接的确保核糖核酸翻译的核酸序列。确保核糖核酸翻译的该核酸序列优选包含作为核糖体结合位点的核酸序列SEQ.ID.NO.42。在一个优选实施方案中，本发明的表达单元包含E)核酸序列SEQ，ID.N0.2,或F)通过核苷酸替代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.2衍生并且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.2具有至少90%同一性的序列，或G)在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.N0.2杂交的核酸序列，或H)E)、F)或G)序列的功能等效片段。核,列SEQ.ID.NO.2代表来自谷氨酸棒杆菌的蛋白质翻译延伸因子TU(PEF-TU)表达单元的核酸序列。SEQ.ID.NO.2对应于野生型表达单元的序列。本发明还涉及表达单元，其包含通过核苷酸替代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.2^f汙生并且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.2具有至少卯％同一性的序列。对于本发明表达单元的本发明其它天然实例例如可通过对数据库中的核^列与上述序列SEQIDNO:2进行同一性比较容易地从基因组序列已知的多种生物中发现。通过人工变异及突变(例如通过核苷酸替代、插入或缺失)从序列SEQIDNO:2开始可以容易地得到表达单元的本发明人工序列。因此，与序列SEQIDNO:2具有至少90。/。同一性的核酸序列是指当其与序列SEQIDNO:2比较(具体而言是按照具有上面参数设置的上述程序化算法进行)时显示至少90%同一性的核酸序列。特别优选的表达单元显示与核酸序列SEQ.ID.NO.2具有91。/。的同一性，更加优选为92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%的同一性，特别优选为99%的同一性。此外，还可以通过本身已知的杂交技术从上述核酸序列开始、具体而言从序列SEQ.IDNO:2开始容易地从基因组序列未知的多种生物中得到表达单元的其它天然实例。因此，本发明的另一方面涉及表达元件，其包含在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.No.2杂交的核酸序列。此核酸序列包含至少10个、更优选多于12、15、30、50个或特别优选多于150个核苷酸。"杂交作用"是指在严格条件下多核苷酸或寡核苷酸与实际互补序列结合的能力，而在这些条件下非互补配偶体之间不进行非特异性结合。就此而言，序列应当优选为90-100%互补。能够彼此特异性结合的互补序列物结合。根据本发明，在严格条件下进行杂交。此种杂交条件描述于例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F"Maniatis，T.在MolecularCloning(ALaboratoryManual),第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989,笫9.31-9.57页或者CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。严格杂交条件具体是指在由50%甲酰胺、5xSSC(750mMNaCl、75mM柠檬酸三钠)、50mM辨酸钠(pH7.6)、5xDenhardt溶液、10%硫酸葡聚糖及20g/ml已变性、剪切的蛙精DNA组成的溶液中于42。C孵育过夜，随后在65。C下用0.1xSSC洗涤滤膜。本发明的核苷酸序列还可以产生用于在其它细胞类型和^L生物中鉴定和/或克隆同源序列的探针和引物。这类探针和引物通常包含在严格条件下与本发明核酸序列的有义链或相应反义链上至少约12个、优选至少约25个、例如约45、50或75个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域。根据本发明，还包含含有所谓沉默突变或者与明确提及的序列相比根据具体原始生物或宿主生物密码子选择进行修饰的核酸序列及其天然存在变体(如剪接变体或等位变体)。"功能等效片段"是指具有与起始序列基本相同或较高特异表达活性的表达单元片段。"基本上一致"是指呈现出起始序列特异表达活性的至少50%、优选60%、更优选70%、更优选80%、更优选90%、特别优选95%的特异表达活性。"片段"是指由实施方案E)、F)或G)描述的表达单元的部分序列。这些片段优选具有多于10个、但更优选多于12、15、30、50个或特别优选多于150个核酸序列SEQ.ID.NO.l的相连核苷酸。特别优选使用核酸序列SEQ.ID.NO.2作为表达单元，即用于基因的表达。Genbank条目AP005283已在未说明功能的情况下描述了SEQ.ID.NO.2。因此，本发明进一步涉及本发明的新表达单元。具体而言，本发明涉及包含具有启动子活性的本发明核酸以及另外以功能性连接的确保核糖核酸翻译的核酸序列的表达单元。本发明特别优选涉及表达单元，其包含E)核酸序列SEQ.ID.NO,2，或F)通过核苷酸替代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.2衍生并且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.2具有至少90y。同一性的序列，或G)在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.2杂交的核酸序列，H)E)、F)或G)序列的功能等效片段，其前提条件是排除具有序列SEQ.ID.NO,2的核酸。本发明表达单元包含一种或多种以下遗传元件负10("-10")序列、负35("-35")序列、转录序列起点、增强子区域及操纵基因区域。这些遗传元件优选是棒杆菌物种特异的，尤其是谷氨酸棒杆菌特异的。另外，可以本身已知方式，通过从核苷酸结构单位进行化学合成来制备上述表达元件，例如通过双螺旋的单独重叠互补核酸结构单位的片段缩合。例如，通过亚砩酰胺方法(Voet，Voet，第2版，WileyPressNewYork,第896-897页)以已知的方式进行寡核苷酸的化学合成。Sambrook等人(1989)，Molecularcloning:Alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress中描述了使用DNA聚合酶的Klenow片段及连接反应将合成的寡核苷酸加入并将补平缺口以及常规克隆方法。用于本专利发明的方法及技术是受过微生物技术及重组DNA技术训练的技术人员所已知的。用于培养细菌细胞、将分离的DNA分子插入宿主细胞中以及将所分离核酸分子进行分离、克隆和测序等的方法与技术是此类技术和方法的实例。许多标准文献来源描述了这些方法Davis等人，BasicMethodsInMolecularBiology(1986);J.H.Miller,ExperimentsinMolecularGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor,NewYork(1972);J.H.Miller,AShortCourseinBacterialGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork(1992》M.Singer与P.Berg，Genes&Genomes,UniversityScienceBooks,MillValley,California(1991);J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork(1989);PB.Kaufmann等人，HandbookofMolecularandCellularMethodsinBiologyandMedicine,CRCPress,BocaRaton,Florida(1995);MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,B.R.Glick和J.E.Thompson编著，CRCPress,BocaRaton,Florida(1993)和P.F.Smith-Keary，MolecularGeneticsofEscherichiacoli，TheGuilfordPress,NewYork,NY(1989)。本发明所有的核酸分子优选为分离的核酸分子的形式。"分离的"核酸分子是从核酸天然来源所存在的其它核酸分子中分离的，并且其还基本上没有其它细胞材料和培养基(如果其是通过重组技术制备的)或者基本上没有化学前体或其它化学品(如果其是化学合成的)。另外，本发明包括与具体描述的核苷酸序列互补的核酸分子或其部分。例如，如下所述，本发明的启动子和/或表达单元可特别有利地用于通过发酵来制备生物合成产物的改进方法中。具体地，本发明的启动子和/或表达单元的优点在于其是强的组成型启动子和表达元件。具有启动子活性的本发明核酸可用于改变(即提高或降低)或影响与野生型相比的微生物中基因的转录速率。本发明表达单元可用于改变(即提高或降低)或影响与野生型相比的微生物中基因的表达速率。具有启动子活性的本发明核酸及本发明表达单元也可用于调节及增强微生物中(尤其是在棒杆菌物种中)多种生物合成产物例如精细化学品、蛋白质、特别为氨基酸的生产。因此，本发明涉及通过以下方式改变或影响与野生型相比的微生物中基因转录速率的方法a)与野生型相比，改变微生物中具有启动子活性的本发明内源核酸的特异启动子活性，所述内源核酸调节内源基因的转录，或b)通过具有启动子活性的本发明核酸或者通过具有按照实施方案a)的改变的特异启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录，其中所述基因相对于具有启动子活性的核酸而言是异源的。按照实施方案a)，可通过改变(即增加或降低)微生物中的特异启动子活性来改变或影响与野生型相比的微生物中的基因转录速率。例如，这可通过具有启动子活性的本发明核酸序列定向突变(即通过核苷酸的定向替代、缺失或插入)来进行。可通过置换RNA聚合酶全酶结合位点(本领域的技术人员也称其为-10区与-35区)中的核苷酸来实现启动子活性的增加或降低。此外，还可通过缩小或扩大所述RNA聚合酶全酶结合位点彼此之间的距离(通过缺失核苷酸或插入核苷酸)实现。另外，还可通过将调节蛋白质(本领域的技术人员也称其为阻抑蛋白及激活蛋白)的结合位点(本领域的技术人员也称其为操纵基因)放置在RNA聚合酶全酶结合位点的空间相邻区域(以致于在结合到启动子序列之后，这些调节物减弱或增强RNA聚合酶全酶的结合及转录活性)或者将其放置在处于新的调节影响下来实现。核酸序列SEQ.ID.NO.42优选代表本发明表达单元的核糖体结合位点，且序列SEQ.ID.N0.39、40或41代表本发明表达单元的-10区。在这些区域中核酸序列的改变导致特异表达活性的改变。因此，本发明涉及核酸序列SEQ.ID.NO.42作为表达单元中核糖体结合位点的用途，所述表达单元能使基因在棒杆菌属或短杆菌(Brevibacterium)属细菌中表达。本发明进一步涉及核酸序列SEQ.ID.NO.39、40或41作为表达单元中-IO区的用途，所述表达单元能使基因在棒杆菌属或短杆菌属细菌中表达。具体地，本发明涉及能使基因在棒杆菌属或短杆菌属细菌中表达的表达单元，其包含核酸序列SEQ.ID.NO.42。在这种情况下，核酸序列SEQ.ID.NO.42优选用作核糖体结合位点。本发明进一步涉及能使基因在棒杆菌属或短杆菌属细菌中表达的表达单元，其包含核酸序列SEQ.ID.N0.39、40或41中的至少一个核酸序列。在这种情况下，核酸序列SEQ.ID.NO.39、40或41之一优选用作-10区。关于"特异启动子活性"，与野生型相比的增加或降低是指与野生型的具有启动子活性的本发明核酸相比(即例如与SEQ.ID.NO.l相比)特异活性的增加或降低。按照实施方案b)，与野生型相比微生物中基因转录速率的改变或影响，可以通过具有启动子活性的本发明核酸或者通过具有按照实施方案a)的改变的特异启动子活性的核酸来调节微生物中的基因转录来进行，其中所述基因相对于具有启动子活性的核酸而言是异源的。这可以优选通过以下方式实现bl)将具有启动子活性、于适当条件下具有改变的特异启动子活性的一种或多种本发明核酸导入^效生物基因组中，以便在具有启动子活性、于适当条件下具有改变的特异启动子活性的所导入核酸控制下进行一种或多种内源基因的转录；或b2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在具有启动子活性、^印种或多种所导入基因的转录；或b3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，其中所迷核酸构建体包含具有启动子活性、于适当条件下具有改变的特异启动子活性的本发明核酸以及功能性连接的一种或多种待转录核酸。因此，可能通过以下方式改变(即提高或降低)野生型内源基因的转录速率按照实施方案bl)，将具有启动子活性、于适当条件下具有改变的特异启动子活性的一种或多种本发明核酸导入微生物基因组中，以便在具有启动子活性、于适当条件下具有改变的特异启动子活性的所导入核酸控制下进行一种或多种内源基因的转录；或按照实施方案b2)，将一种或多种内源基因导入微生物基因组中，以便在具有启动子活性、于适当条件下具有改变的特异启动子活性的本发明内源核酸控制下进行一种或多种所导入内源基因的转录；或按照实施方案b3),将一种或多种核酸构建体导入微生物中，其中所述核酸构建体包含具有启动子活性、于适当条件下具有改变的特异启动子活性的本发明核酸以及功能性连接的一种或多种待转录内源核酸。因此，也可以通过以下方式影响与野生型相比的外源基因的转录速率按照实施方案b2)，将一种或多种内源基因导入微生物基因组中，以便在具有启动子活性、于适当条件下具有改变的特异启动子活性的本发明内源核酸控制下进行一种或多种所导入内源基因的转录；或按照实施方案b3)，将一种或多种核酸构建体导入微生物中，其中所述核酸构建体包含具有启动子活性、于适当条件下具有改变的特异启动子活性的本发明核酸以及功能性连接的一种或多种待转录内源核酸。此外，可通过将基因整合至编码区或非编码区中来进行按照实施方案b2)的基因插入。优选插入至非编码区中。此夕卜，可在染色体上或染色体外进行按照实施方案b3)的核酸构建体的插入。优选将核酸构建体进行染色体插入。"染色体"整合是将外源DNA片段插入至宿主细胞的染色体中。此术语也用于外源DNA片段与宿主细胞染色体上适当区域之间的同源重组。在实施方案b)中，优选也使用具有按照实施方案a)的改变的特异启动子活性的本发明的核酸。在实施方案b)中，如实施方案a)中所述这些核酸可在微生物中存在或制备或者将其以分离的形式导入微生物中。"内源"是指已存在于野生型基因组中的遗传信息，如基因。"外源"是指不存在于野生型基因组中的遗传信息，如基因。涉及通过具有启动子活性的本发明核酸进行的转录调节的术语"基因，，，优选是指包含待转录区域(即例如调节翻译的区域)和编码区以及于适当情况下的其它调节元件(例如终止子)的核酸，涉及如下所述通过本发明表达单元进行的表达调节的术语"基因"，优选是指包含编码区以及于适当情况下的其它调节元件(例如终止子)的核酸。"编码区"是指编码蛋白质的核酸序列。涉及具有启动子活性的核酸和基因的"异源性"，是指所使用基因在具有启动子活性的本发明核酸的调节下在野生型中不转录，但是产生了在野生型中不存在的新的功能性连接并且在野生型中不存在具有启动活性的本发明核酸与特定基因的功能组合。涉及表达单元和基因的"异源性"，是指所使用基因在具有启动子活性的本发明表达单元的调节下在野生型中不表达，但是产生了在野生型中不存在的新的功能性连接并且在野生型中不存在本发明表达单元与特定基因的功能组合。在一个优选实施方案中，本发明进一步涉及与野生型相比通过以下方式提高或影响微生物中基因的转录速率的方法ah)与野生型相比，增加具有启动子活性的本发明内源核酸在微生物中的特异启动子活性，所述内源核酸调节内源基因的转录，或bh)通过具有启动子活性的本发明核酸或者通过具有按照实施方案a)的增加的特异启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录，其中所述基因相对于具有启动子活性的核酸而言是异源的。通过具有启动子活性的本发明核酸或者通过具有按照实施方案ah)的增加的特异启动子活性的本发明核酸对微生物中基因转录进行的调节优选通过以下方式实现bhl)将具有启动子活性、于适当条件下具有增加的特异启动子活性的一种或多种本发明核酸导入微生物基因组中，以便在具有启动子活性、于适当条件下具有增加的特异启动子活性的所导入核酸控制下进行一种或多种内源基因的转录；或bh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在具有启动子活性、于适当条件下具有增加的特异启动子活性的本发明内源核酸控制下进行一种或多种所导入基因的转录；或bh3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，其中所迷核酸构建体包含具有启动子活性、于适当条件下具有增加的特异启动子活性的本发明核酸以及功能性连接的一种或多种待转录核酸。在一个优选实施方案中，本发明进一步涉及与野生型相比通过以下方式降低微生物中基因转录速率的方法ar)与野生型相比，降低具有启动子活性的本发明内源核酸在孩i:生物中的特异启动子活性，所述内源核酸调节内源基因的转录，或br)将具有按照实施方案a)的降低的特异启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在所导入的具有降低的启动子活性的核酸控制下进行内源基因的转录。本发明进一步涉及与野生型相比通过以下方式改变或影响微生物中基因表达速率的方法c)与野生型相比，改变本发明内源表达单元在微生物中的特异表达活性，所迷内源表达单元调节内源基因表达，或d)通过本发明表达单元或者通过具有按照实施方案c)的改变的特异表达活性的本发明表达单元对微生物中的基因表达进行调节，其中所述基因相对于表达单元而言是异源的。按照实施方案c),可通过改变(即增加或降低)^L生物中的特异表达活性来与野生型相比改变或影响微生物中基因的表达速率。例如，这可以通过具有启动子活性的本发明核酸序列的定向突变(即通过核苷酸的定向替代、缺失或插入)来进行。例如，延长Shine-Dalgarno序列与翻译起始密码子之间的距离通常导致特异表达活性的变化，特异表达活性减弱否则增强。特异表达活性的改变也可以通过核苷酸缺失或插入而缩短或延长Shine-Dalgarno区(核糖体结合位点)序列到翻译起始密码子的距离来实现。而且还可以通过以使得与互补的3'端16SrRNA的同源性增强或减弱的方式改变Shine-Dalgarno区序列来实现。就"特异表达活性"而言，与野生型相比增加或降低是指与野生型的本发明表达单元相比(即例如与SEQ.ID.NO.2相比)特异活性的增加或降低。按照实施方案d)，可以通过本发明表达单元或者通过具有按照实施方案c)的改变的特异表达活性的本发明表达单元对微生物中基因表达的调节，从而与野生型相比改变或影响微生物中基因的表达速率，其中所述基因相对于表达单元而言是异源的。这可以优选通过以下方式实现dl)将于适当情况下具有改变的特异表达活性的一种或多种本发明表达单元导入微生物的基因组中，以便在所导入表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或d2)将一种或多种基因导入微生物的基因组中，以便在于适当条件下具有改变的特异表达活性的本发明内源表达单元的控制下进行一种或多种所导入基因的表达，或d3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有改变的特异表达活性的本发明表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。因此，可通过以下方式改变(即提高或降低)野生型内源基因的表达速率按照实施方案dl),将于适当情况下具有改变的特异表达活性的一种或多种本发明表达单元导入微生物的基因组中，以便在所导入表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或按照实施方案d2)，将一种或多种基因导入微生物的基因组中，以便在行一种或多种所导入基因的表达，或按照实施方案d3)，将一种或多种核酸构建体导入^L生物中，所述核酸功能性连接的一^或多种待表达核酸。'''、因此，还可以与野生型相比通过以下方式影响内源基因的表达速率按照实施方案d2)，将一种或多种内源基因导入微生物的基因组中，以下进行一种或多种所导入基因的表达，或按照实施方案d3)，将一种或多种核酸构建体导入^:生物中，所述核酸功能性连接的一^或多种待表达外源核酸。"'''''此外，可通过将基因整合至编码区或非编码区中来进行按照实施方案d2)的基因插入。优选插入至非编码区中。此外，可在染色体上或染色体外进行按照实施方案d3)的核酸构建体的插入。优选核酸构建体的染色体插入。在下文中，核酸构建体也称作表达盒。在实施方案d)中，优选也^f吏用具有按照实施方案c)的改变的特异表达活性的本发明表达单元。在实施方案d)中，如实施方案c)中所述这些表达单元可在微生物中存在或制备或者将其以分离的形式导入微生物中。在一个优选实施方案中，本发明进一步涉及与野生型相比通过以下方式提高或影响微生物中基因表达速率的方法ch)与野生型相比，增加本发明内源表达单元在微生物中的特异表达活性，所述表达单元调节内源基因的表达，或dh)通过本发明表达单元或者通过具有按照实施方案a)的增加的特异表达活性的表达单元对微生物中基因的表达进行调节，其中所述基因相对于表达单元而言是异源的。通过本发明表达单元或者通过具有按照实施方案C)的增加的特异表达活性的表达单元对微生物中基因表达进行的调节优选通过以下方式实现dhl)将于适当情况下具有增加的特异表达活性的一种或多种本发明表达单元导入微生物的基因组中，以便在于适当情况下具有增加的特异表达活性的所导入表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或dh2)将一种或多种基因导入微生物的基因组中，以便在于适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明内源表达单元的控制下进行一种或多种所导入基因的表达，或dh3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有提高的特异表达活性的本发明表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。本发明进一步涉及通过以下方式与野生型相比降低微生物中基因表达速率的方法cr)与野生型相比，降低本发明内源表达单元在微生物中的特异表达活性，所述表达单元调节内源基因的表达，或dr)将具有按照实施方案cr)的降低的特异表达活性的表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的具有降低的表达活性的表达单元控制下进行内源基因的表达。在用于改变或影响微生物中基因转录速率和/或表达速率的上述本发明方法的一个优选实施方案中，这些基因选自编码来自精细化学品生物合成途径的蛋白质的核酸，其中这些基因任选进一步包含调节元件。在用于改变或影响微生物中基因转录速率和/或表达速率的上述本发明方法的特别优选实施方案中，这些基因选自以下核酸编码来自生蛋白与非生蛋白氨基酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自核苷酸与核普生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自有机酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自脂类与脂肪酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自二醇生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自糖类生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自芳香化合物生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自维生素生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自辅因子生物合成途径的蛋白质的核酸以及编码来自酶生物合成途径的蛋白质的核酸，其中这些基因任选进一步包含调节元件。在一个特别优选的实施方案中，来自氨基酸生物合成途径的蛋白质选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氩吡啶二羧酸合成酶、二氬吡咬二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸丙糖异构酶、转录调节物LuxR、转录调节物LysRl、转录调节物LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱疏醚y合酶、胱硫醚p裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、苏氨酸输出子栽体(exportercarrier)、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出子、生物素连接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和2、磷酸腺苦-磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节物、RXN2910调节物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸排出蛋白质(effluxprotein)、丝氨酸羟曱基转移酶、果糖-l，6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247、蛋白质OpcA、1-来自氨基酸生物合成途径的上述蛋白质的优选蛋白质以及编码这些蛋白质的核酸分别为微生物来源的蛋白质序列及核酸序列，优选来自棒杆菌属或短杆菌属细菌，优选来自棒杆菌，特别优选来自谷氨酸棒杆菌。这些蛋白质的相应核酸序列的实例、其参考文献及其在参考文献中的名称列于表l中表l<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>特别优选的来自氨基酸生物合成途径的蛋白质序列及编码该蛋白质的序列(SEQ.ID.NO.4)及编码硫酸盐还原作用中的蛋白质的相应核酸序列(SEQ.ID.NO.3)。其它特别优选的来自氨基酸生物合成途径的蛋白质序列在每一情况下具有表l所示的对于该蛋白质的氨基酸序列，其中各个蛋白质在表2/第2列所示对于该氨基酸序列的氨基酸位置中的至少一个位置上具有与表2/第3列同一行中所示的各个氨基酸不同的生蛋白氨基酸。在另一个优选实施方案中，蛋白质在表2/第2列所示对于该氨基酸序列的氨基酸位置中的至少一个位置上具有表2/第4列同一行中所示的氨基酸。表2中所示的蛋白质是氨基酸生物合成途径的突变的蛋白质，其具有特别有益的特性并因此特别适合通过本发明的启动子表达相应的核酸，并产生氨基酸。例如，T311I突变导致ask的反馈抑制被切断。编码表2中上述突变的蛋白质的相应核酸可以通过常规方法制备。例如，用于制备编码突变的蛋白质的核酸序列的适合起始点是谷氨酸棒杆菌菌抹基因组或表l所提到的核酸序列，所述谷氨酸棒杆菌菌林可以从美国典型培养物保藏中心获得，保藏好为ATCC13032。为了将突变的蛋白质的氨基酸序列逆翻译成编码这些蛋白质的核酸序列，有利地使用该核酸序列将被导入的或者该核酸序列存在于其中的生物的密码子选择。例如，就谷氨酸棒杆菌而言，使用谷氨酸棒杆菌的密码子选择是有利的。可以本身已知的方式从描述目的生物中至少一种蛋白质及一种编码该蛋白质的基因的数据库或专利申请中确定具体生物的密码子选择。以如下方式理解表2中的信息在第l列"标识"中，对于表l所涉及的每一序列所指定的明确名称。在第2列"AA位置"中，各个数字指来对应于表l中多肽序列的氨基酸位置。因此，"AA位置"列中"26"是指相应所示多肽序列的氨基酸第26位。位置的编号是由N末端+1起始。在第3列"AA野生型"中，各个字母表示表l中相应野生型菌林序列上在笫2列所示位置上的氨基酸，其以单字母代码表示。在第4列"AA变体"中，各个字母表示相应变体菌林中在第2列所示位置上的氨基酸，其以单字母代码表示。在第5列"功能"中，指明相应多肽序列的生理功能。就具有特定功能(笫5列)及特定起始氨基酸序列(表1)的突变的蛋白质而言，第2、3及4列描述了至少一个突变及某些序列的多个突变。该多个突变始终是指在每一情况下最接近的上述起始M酸序列(表1)。术语特定氨基酸序列的"至少一个氨基酸位置"优选是指第2、3及4列中对于该氨基酸序列所述的至少一个突变。生蛋白氨基酸的单字母代码A丙氨酸C半胱氨酸D天冬氨酸E谷氨酸F苯丙氨酸G甘氨酸H组氨酸I异亮氨酸K赖氨酸亮氨酸M甲硫氨酸N天冬酰胺P脯氨酸Q谷氨酰胺R精氨酸S丝氨酸T苏氨酸V缬氨酸W色氨酸Y酪氨酸表2<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>标识AA位置AA野生型AA变体功能ask317SA天冬氨酸激酶311TI279ATasd66DG天冬氨酸半醛脱氢酶234RH272DE285KE20FdapA2SA二氩吡咬二羧酸合成酶84KN85VdapB91DA二氢吡啶二羧酸还原酶83DNddh174DE内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶235F237SAlysA265AD二氨基吡啶甲酸脱羧酶320DN332IVargS355GD精氨酰-tRNA合成酶156AS513VA540HRzwf8ST葡萄糖-6-磷酸脱氢酶150TA321GSgap264GS甘油醛-3-磷酸脱氢酶pycA7S丙酮酸羧化酶153ED182AS206AS227HR455AG<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>在用于改变或影响微生物中基因转录速率和/或表达速率的上述本发明方法及用于产生基因修饰微生物(下面称为基因修饰微生物)的下述方法及用于产生生物合成产物的下述方法中，优选以SacB方法将具有启动子活性的本发明的核酸、本发明表达单元、上述基因及上述核酸构建体或表达盒导入^L生物中，具体而言将它们导入棒杆菌中。SacB方法是本领域技术人员所已知的，且描述于例如SchaferA，TauchA,J3gerW，KalinowskiJ，ThierbachG，PtihlerA.;Smallmobilizablemulti-purposecloningvectorsderivedfromtheEscherichiacoliplasmidspK18andpK19:selectionofdeigneddeletionsinthechromosomeofCorynebacteriumglutamic腿，Gene.1994年7月22曰；145(1):69-73及BlomfieldIC，VaughnV，RestRF，EisensteinBI.;AllelicexchangeinEscherichiacoliusingtheBacillussubtilissacBgeneandatemperature-sensitivepSC101replicon;MolMicrobiol.1991年6月；5(6):1447-57。在上述本发明方法的一个优选实施方案中，通过将具有启动子活性的本发明的核酸或本发明表达单元导入微生物中来改变或影响微生物中基因的转录速率和/或表达速率。在上述本发明方法的另一个优选实施方案中，通过将上述核酸构建体或表达盒导入微生物中来改变或影响微生物中基因的转录速率和/或表达速率0因此，本发明也涉及表达盒，其包含至少一种本发明表达单元，至少一种其它的待表达核酸序列，即待表达基因，及于适当情况下的另外的遗传控制元件，例如终止子，其中至少一种表达单元与另一种待表达核^列功能性连接在一起，且所述的另一种待表达核酸序列相对于该表达单元而言是异源的。待表达核酸序列优选为至少一种编码来自精细化学品生物合成途径的蛋白质的核酸。待表达核酸序列特别优选地选自下列核酸编码来自生蛋白与非生蛋白氨基酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自核普酸与核普生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自有机酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自脂类与脂肪酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自二醇生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自糖类生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自芳香化合物生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自维生素生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自辅因子生物合成途径的蛋白质的核酸及编码来自酶生物合成途径的蛋白质的核酸。来自氨基酸生物合成途径的优选蛋白质描述如上，且其实例描述于表l与2中。对表达单元在本发明表达盒中相对于待表达基因的物理位置进行选择，以便表达单元调节待表达基因转录且优选也调节待表达基因的翻译，且因此能够产生一种或多种蛋白质。就此而言，"能够产生"包括生产的组成型增加、在特定条件下生产的减少或阻断和/或在特定条件下生产的增加。就此而言，"条件"包含(l)向培养基中添加组分，(2)从培养基移除组分，(3)以另一种组分替换培养基中的一种成份，(4)提高培养基的温度，(5)降低培养基的温度，及(6)调节大气条件，例如培养基所保持的氧或氮浓度。本发明进一步涉及包含上述本发明表达盒的表达载体。载体为本领域的技术人员熟知，且可在"CloningVectors"(PouwelsP.H.等人，编者，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)中找到。除质粒以外，载体也是指本领域技术人员已知的所有其它载体，例如噬菌体、转座子、IS元件、噬粒、粘粒及线性或环状DNA。这些栽体可在宿主生物自主复制或者进行染色体复制。适合且特别优选的质粒为那些在棒杆菌中复制的质粒。众多已知质粒栽体例^口pZl(Menkel等人，AppliedandEnvironmentalMicrobiology(1989)64:549-554)、pEKExl(Eikmanns等人，Gene102:93-98(1991))或pHS2画l(Sonnen等人，Gene107:69-74(1991))基于隐秘质粒pHM1519、pBLl或pGAl。可以相同方式使用其它质粒载体，例如pCLiK5MCS或基于pCG4(US漏A4，489，160)或pNG2(Serwold-Davis等人，FEMSMicrobiologyLetters66，119-124(1990))或pAGl(US-A5，158，891)的那些质粒载体。同样也适用的是如下那些质粒载体，即借助于这些质粒载体可使用染色体整合的基因扩增方法来复制及扩增hom-thrB操纵子，如Reinscheid等人(AppliedandEnvironmentalMicrobiology60，126-132(1994))戶斤述。在i亥方法中，完整基因,皮克隆至在宿主(通常为E.coli)中能够复制而在谷氨酸棒杆菌中不能复制的质粒载体中。适宜载体的实例为pSUP301(Sirnon等人，Bio/Technology1，784-791(1983))、pK18mob或pK19mob(Schafer等人，Gene145，69-73(1994)，Bernard等人，JournalofMolecularBiology,234:534-541(1993))、pEMl(Schrumpf等人，1991,JournalofBacteriology173:4510-4516)或pBGS8(Spratt等人，1986，Gene41:337-342)。随后通过转化，将包含待扩增基因的质粒载体转移进入目的谷氨酸棒杆菌菌林中。用于转化的方法例如描述于Thierbach等人(AppliedMicrobiologyandBiotechnology29，356-362(1988))、Dunican和Shivnan(Biotech加logy7，1067-1070(1989))以及Tauch等人(FEMSMicrobiologicalLetters123，343-347(1994))中的方法。本发明进一步涉及基因修饰微生物，其中该基因修饰作用导致与野生型相比改变或影响至少一种基因的转录速率，且其取决于a)改变至少一种具有按照第l项的启动子活性的内源核酸在微生物中的特异启动子活性，其中所述内源核酸调节至少一种内源基因的转录，或b)通过具有按照第l项的启动子活性的核酸或者通过具有按照实施方案a)的改变的特异启动子活性的、带有按照第l项的启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录，其中所述基因相对于具有启动子活性的所述核酸而言是异源的。就上述方法而言，通过具有按照第l项的启动子活性的核酸或者通过具有按照实施方案a)的改变的特异启动子活性的、带有按照第l项的启动子活性的核酸对微生物中基因转录的调节是通过以下方式实现bl)将一种或多种具有按照第l项的启动子活性、于适当情况下具有改变的特异启动子活性的核酸导入孩i生物基因组中，以《更在所导入的具有按照第1项的具有启动子活性、于适当情况下具有改变的特异启动子活性的核酸的控制下进行一种或多种内源基因的转录，或b2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在具有按照第l项的启动子活性、于适当情况下具有改变的特异启动子活性的内源核酸的控制下进行一种或多种所导入基因的转录，或b3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含具有按照第1项的启动子活性、于适当情况下具有改变的特异启动子活性的核酸以及功能性连接的一种或多种待转录核酸。本发明进一步涉及与野生型相比至少一种基因的转录速率已提高或影响的基因修饰微生物，其中ah)与野生型相比，具有按照第l项的启动子活性的内源核酸在微生物中的特异启动子活性是增加的，其中所迷内源核酸调节内源基因转录，或bh)通过具有按照笫l项的启动子活性的核酸或者通过具有按照实施方案ah)的增加的特异启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录，其中所述基因相对于具有启动子活性的核酸而言是异源的。就上述方法而言，通过具有^f姿照第l项的启动子活性的核酸或者通过具有按照实施方案a)的增加的特异启动子活性、具有按照第l项的启动子活性的核酸对微生物中基因转录的调节通过以下方式实现bhl)将一种或多种具有按照第l项的启动子活性、适当条件下具有增加的特异启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在所导入的具有启动子活性、于适当条件下具有增加的特异启动子活性的核酸的控制下进行一种或多种内源基因的转录，或bh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在具有按照第1项的启动子活性、于适当条件下具有增加的特异启动子活性的内源核酸的控制下进行一种或多种所导入基因的转录，或bh3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含具有按照第1项的启动子活性、于适当条件下具有增加的特异启动子活性的核酸以及功能性连接的一种或多种待转录核酸。本发明进一步涉及与野生型相比至少一种基因的转录速率已降低的基因修饰微生物，其中ar)与野生型相比，至少一种具有按照第l项的启动子活性的内源核酸在微生物中的特异启动子活性是降低的，其中所述内源核酸调节至少一种内源基因的转录，或br)将一种或多种具有按照实施方案a)的已降低启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在所导入的具有已降低启动子活性的核酸控制下进行至少一种内源基因的转录。本发明进一步涉及基因修饰微生物，其中基因修饰导致与野生型相比至少一种基因的表达速率的改变或影响，且其取决于c)与野生型相比，改变至少一种按照第2或3项的内源表达单元在微生物中的特异表达活性，其中所述内源表达单元调节至少一种内源基因的表达5或d)通过按照第2或3项的表达单元或者通过具有按照实施方案a)的改变的特异表达活性的按照第2或3项的表达单元调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于表达单元而言是异源的。就上述方法而言，通过按照第2或3项的表达单元或者通过具有按照实施方案a)的改变的特异表达活性的按照第2或3项的表达单元进行对微生物中基因表达的调节通过以下方式实现dl)将一种或多种于适当条件下具有改变的特异表达活性的按照第2或3项的表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的于适当条件下具有改变的特异表达活性的按照第2或3项的表达单元的控制下进行一种或多种内源基因的表达，或d2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在于适当条件下具有改变的特异表达活性的按照第2或3项的内源表达单元控制下进行一种或多种导入基因的表达，或d3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有改变的特异表达活性的按照第2或3项的表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。本发明进一步涉及与野生型相比至少一种基因的表达速率已提高或受影响的基因修饰微生物，其中ch)与野生型相比，至少一种按照第2或3项的内源表达单元在微生物中的特异表达活性是增加的，其中所述内源表达单元调节内源基因表达，或dh)通过按照第2或3项的表达单元或者通过具有按照实施方案a)的增加特异表达活性的按照第2或3项的表达单元来调节微生物中的基因表达，其中所述基因相对于表达单元而言是异源的。就上迷方法而言，通过按照第2或3项的表达单元或者通过具有按照实施方案a)的增加的特异表达活性的按照第2或3项的表达单元对微生物中基因表达的调节通过以下方式实现dhl)将一种或多种于适当条件下具有增加的特异表达活性的按照第2或3项的表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的于适当条件下具有增加的特异表达活性的按照第2或3项的表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或dh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在于适当条件下具有增加的特异表达活性的按照笫2或3项的内源表达单元控制下进行一种或多种所导入基因的表达，或dh3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有增加的特异表达活性的按照第2或3项的表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸，本发明进一步涉及与野生型相比至少一种基因的表达速率已降低的基因修饰微生物，其中cr)与野生型相比，至少一种按照笫2或3项的内源表达单元在^:生物中的特异表达活性是降低的，其中所述内源表达单元调节至少一种内源基因的表达，或dr)将一种或多种具有已降低表达活性的按照笫2或3项的表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的具有已降低表达活性的按照第2或3项的表达单元控制下进行至少一种内源基因的表达。本发明进一步涉及基因修饰微生物，其包含按照笫2或3项的表达单元以及功能性连接的待表达基因，其中所述基因相对于表达单元而言是异源的。该基因修饰微生物特别优选包含本发明的表达盒。本发明特别优选涉及包含载体、特別是穿梭载体或质粒载体的基因修饰微生物、特别是棒杆菌，所述载体含有至少一种如本发明所定义的重组核酸构建体。在基因修饰微生物的一个优选实施方案中，上述基因为至少一种编码来自精细化学品生物合成途径的蛋白质的核酸。在基因修饰微生物的一个特别优选的实施方案中，上述基因选自编码来自生蛋白tt酸与非生蛋白^^基酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自核苷酸与核苷生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自有机酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自脂类与脂肪酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自二醇生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自糖类生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自芳香化合物生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自维生素生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自辅因子生酸，其中所述基因可任选包含另外调节元件。来自氨基酸生物合成途径的优选蛋白质选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氩吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸异构酶、转录调节物LuxR、转录调节物LysRl、转录调节物LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱硫醚Y合酶、胱石克醚p裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚曱基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、苏氨酸输出子栽体、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出子、生物素连接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、辅酶B12依赖型曱硫氨酸合酶、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-辨酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节物、RXN2910调节物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸排出蛋白质、丝氨酸羟曱基转移酶、果糖-l，6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247、蛋来自氨基酸生物合成途径的蛋白质及基因的特别优选实例如上描述于表1及表2中。优选的微生物或基因修饰微生物为细菌、藻类、真菌或酵母菌。具体地，特别优选的微生物为棒杆菌。优选的棒杆菌为棒杆菌属细菌、特别是谷氨酸棒杆菌、乙酰谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)、热产氛棒軒菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)、栖糖蜜棒杆菌(Corynebacteriummelassecola)及Corynebacteriumefficiens或者短杆菌属细菌、特别是黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)及叉开短杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)。特别优选的棒杆菌与短杆菌属细菌选自谷氨酸棒杆菌ATCC13032、乙酰谷氨酸棒杆茵ATCC15806、嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870、热产氨棒杆菌FERMBP-1539、栖糖蜜棒杆菌ATCC17965、CorynebacteriumefficiensDSM44547、CorynebacteriumefficiensDSM44548、CorynebacteriumefficiensDSM44549、黄色短杆菌ATCC14067、乳糖发酵短杆菌ATCC13869、叉开短杆菌ATCC14020、谷氨酸棒杆菌KFCC10065及谷氨酸棒杆菌ATCC21608。缩写KFCC是指韩国联邦菌物保藏中心，缩写ATCC是指美国典型培养物保藏中心，缩写DSM是指德国微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikrorganismen)。其它特别优选的棒杆菌与短杆菌属细菌列于表3中<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>这些缩写具有以下含义ATCC:美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD，美国FERM:发酵研究所，Chiba，曰本NRRL:ARS保藏中心，北方农业研究所，Peoria,IL，美国CECT:西班牙典型培养物保藏中心，Valencia,西班牙NCIMB:国立工业和海洋微生物保藏有限公司，Aberdeen,英国CBS:真菌菌种保藏中心，Baarn，荷兰NCTC:国立典型培养物保藏中心，London,英国DSMZ:德国樣i生物保藏和细胞培养中心，Braunschweig,德国。通过具有启动子活性的本发明核酸及本发明表达单元，可以借助于上的代谢途径。为了此目的，例如，导致特定生物合成产物的代ilt途径可以通过影响或提高该生物合成途径中基因转录速率或表达速率来增强，其中增加的蛋白质数量导致目的生物合成途径的这些蛋白质的总活性增加，且因此导致通向目的生物合成产物的代谢通量增加。此外，从特定生物合成产物分支的代谢途径可通过降低该分支生物合成途径的基因转录速率或表达速率来减弱，其中减少的蛋白质数量导致不必要的生物合成途径的那些蛋白质的总活性减少，并且因此额外导致通向目的生物合成产物的代谢通量增加。本发明基因修饰微生物能够产生例如来自葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素的生物合成产物或来自甘油与乙醇的生物合成产物。因此，本发明涉及通过培养本发明的基因修饰微生物来生产生物合成产物的方法。取决于目的生物合成产物，必须提高或降低多种基因的转录速率或表达速率。通常，有利的是改变多个基因的转录速率或表达速率，即提高基因组合的转录速率或表达速率和/或降低基因組合的转录速率或表达速率。在本发明基因修饰微生物中，至少一种基因的改变了的(即提高的或降低的)转录速率或表达速率是归因于具有启动子活性的本发明的核酸或本发明表达单元。另外，基因修饰樣史生物中其它基因的额外改变的(即额外提高的或额外的核酸或本发明表达单元。因此，本发明进一步涉及通过培养本发明基因修饰微生物来生产生物合成产物的方法。优选的生物合成产物为精细化学品。术语"精细化学品，，为本领域所知并且包括由生物生产并用于许多种工业例如(但不限于)制药业、农业、化妆品业、食品业及祠料业的化合物。如酒石酸、衣康酸及二氨基庚二酸、生蛋白氨基酸及非生蛋白氨基酸、嘌呤及嘧啶碱基、核苷及核苷酸(如描述于例如Kuninaka,A.(1996)Nucleotidesandrelatedcompounds,第561-612页，在Biotechnology,第6巻，编者Rehm等，VCH:Weinheim及其中的参考文献)、脂类、饱和及不饱和脂肪酸(例如花生四烯酸)、二元醇(如丙二醇及丁二醇)、碳水化合物(如透明质酸及海藻糖)、芳族化合物(如芳族胺、香草醛及散蓝)、维生素及辅因子(如描述于Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,第A27巻，"Vitamins"，笫443-613页，(1996)VCH:Weinheim及其中的参考文献；及Ong，A.S.，Mki，E.和Packer,L.(1995)"Nutrition,Lipids,HealthandDisease"UNESCO44义录/CoiifederationofScientificandTechnologicalAssociationsinMalaysia和theSocietyforFreeRadicalResearch-Asia,1994年9月1-3日于马来西亚槟城举行，AOCSPress(1995))、酶及由Gutcho(1983)在ChemicalsbyFermentation,NoyesDataCorporation,ISBN:0818805086及其中指出的参考文献中所述的所有其它化学品。以下进一步说明特定精细化学品的代谢及用途。I.氨基酸的代谢和用途氨基酸构成所有蛋白质的基础结构单元并且因此对于细胞的正常功能是必需的。术语"氨基酸"为本领域所知。生蛋白氨基酸有20种，它们作为蛋白质的结构单元起作用，在蛋白质中氨基酸通过肽键连接在一起，而非生蛋白氨基酸(已知有数百种)通常不出现在蛋白质中(见Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,第A2巻，第57-97页，VCH:Weinhdm(1985))。虽然L-氨基酸是天然存在蛋白质中常见的唯——种类型，但是氨基酸可以以D或L构型存在。20种生蛋白氨基酸中每一(见例如，Stryer，L.Biochemistry,第3版，第578-590页(1988))。"必需，'氨基酸(組氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸)可通过简单的生物合成途径转变成其它ll种"非必需"氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸)，对于"必需"氨基酸，之所以如此称呼是因为由于其生物合成的复杂性其必须从食物中摄取。高等动物能够合成这些氨基酸中的一些氨基酸，但是必须从食物中摄取必需氨基酸以便进行正常蛋白质合成。除了其在蛋白质生物合成中的功能以外，这些氨基酸本身是令人感兴趣的化合物，例如已经发现许多氨基酸在食品、饲料、化学品、化妆品、农业及制药业中具有多种应用。不但对于人类营养，而且对于单胃物种如家禽及猪，赖氨酸为重要的氨基酸。谷氨酸为最常用作调味添加剂(谷氨酸单钠，MSG)，并且广泛用于食品业，天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸及半胱氨酸同样如此。甘氨酸、L-曱硫氨酸和色氨酸皆用于制药业。谷氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、丝氨酸及丙氨酸用于制药业及化妆品业。苏氨酸、色氨酸及D/L-曱硫氨酸广泛使用于伺料添力口剂(Leuchtenberger,W.(l996)Aminoacids-Technicalproductionanduse,第466-502页，在Rehm等人，(编者)Biotechnology，第6巻，第14a章，VCH:Weinheim)。已经发现，这些氨基酸额外适合作为合成氨基酸及蛋白质合成的前体，如N-乙酰半胱氨酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸、(S)-5-羟基色氛酸以及描述于Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,第A2巻，第57-97页，VCH:Weinheim，1985中的其它物质。已经很好地表征了这些天然氨基酸在能够生产它们的生物(例如细菌)中的生物合成(对于细菌氨基酸生物合成及其调节的综述，见Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47:533-606)。谷氨酸通过a-酮戊二酸(柠檬酸循环中的一种中间体)的还原性胺化反应合成。谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸的每一个由谷氨酸相继产生。在三步骤方法中进行丝氨酸生物合成，开始于3-磷酸甘油酸(糖酵解的中间体)，并在氧化、转氨基和水解步骤之后得到此氨基酸。半胱氨酸和甘氨酸各自从丝氨酸产生，前者通过高半胱氨酸与丝氨酸的缩合作用产生，而后者通过在丝氨酸转羟曱基酶催化的反应中将侧链P-碳原子转移至四氢叶酸而产生。苯丙氨酸和酪氨酸从糖酵解及戊糖磷酸途径的前体赤藓糖-4-磷酸及磷酸烯醇丙酮酸于9步骤生物合成途径中合成，其仅在预苯酸合成后的最后两步中分开。色氨酸同样从这两个起始分子产生，但其通过11步的途径合成。酪氨酸也可通过苯丙氨酸羟化酶催化反应从苯丙氨酸制备。丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸各自从糖酵解终产物丙酮酸生物合成。天冬氨酸从草酰乙酸(柠檬酸循环的中间体)形成。天冬酰胺、甲硫氨酸、苏氨酸和赖氨酸各自通过天冬氨酸转化产生。异亮氨酸从苏氨酸形成。组氨酸在复杂的9步途径中从5-磷酸核糖-l-焦磷酸(一种活化糖)形成。超过细胞中蛋白质生物合成所需量的氨基酸无法被储存，而是被分解，所以给细胞中的主要代谢途径提供中间体(对于综述，见Stryer，L.Biochemistry，第3版，第21章,"AminoAcidDegradationandtheUreaCycle"，第495-516页，(1988))。虽然细胞能够将不需要的氨基酸转变成为有用的代谢中间体，但是就合成所需的能量、前体分子及酶而言氨基酸的生产是昂贵。因此毫不奇怪氨基酸生物合成受反馈抑制的调节，由此特定氨基酸的存在使其自身生产减慢或完全停止(对于氨基酸生物合成途径中反馈机制的综述，见Stryer，L.Biochemistry,第3版，第24章，"BiosynthesisofAminoAcidsandHeme"，第575-600页，(1988))。因此特定氨基酸的产出受细胞中该氨基酸量的限制。II.维生素、辅因子及营养补充品(Nutraceutical)的代谢和用途维生素、辅因子及营养补充品包含其它组的分子。高等动物已丧失合成它们的能力，所以必须摄取，但是其可轻易地由其它生物如细菌合成。这些分子为本身具有生物活性分子或者为作为许多代谢途径中的电子载体或中间体的生物活性物质前体。这些化合物除了具有营养价值以外，它们还作为着色剂、抗氧化剂和催化剂或其它加工辅料具有明显的工业价值。(对于这些化合物的结构、活性及工业应用的综述，见例如Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,"Vitamins",第A27巻，第443-613，VCH:Weinheim,1996)。术语"维生素"为本领域所知并且包括生物正常功能所需要但无法由该生物本身合成的营养物。维生素组可包括辅因子和营养补充品化合物。术语"辅因子"包含正常酶活性所需的非蛋白质化合物。这些化合物可以是有机的或无机的；本发明的辅因子分子优选是有机的。术语"营养补充品，，包括在植物和动物、特别是人中具有健康促进作用的食物添加剂。此类分子的实例为维生素、抗氧化剂以及某些脂类(如多不饱和脂肪酸)。这些分子在能够生产它们的生物(如细菌)中的生物合成已被详细地表征(Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,"Vitamins",第A27巻，第443-613页，VCH:Weinheim,1996，Michal，G(1999)BiochemicalPathways:AnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology,JohnWilely&Sons;Ong，A.S.，Niki,K和Packer,L.(1995)"Nutrition,Lipids,HealthandDisease"UNESCO会议录/ConfederationofScientificandTechnologicalAssociationsinMalaysia和theSocietyforFreeRadicalResearch-Asia,1994年9月1-3日于马来西亚槟城举4亍，AOCSPress,Champaign,ILX，374S)。硫胺(维生素BO由嘧啶及塞唑单元化学偶联形成。核黄素(维生素B2)从鸟苷5'-三磷酸(GTP)和核糖-5，-磷酸合成。核黄素用于合成黄素单核酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。此化合物家族统称为"维生素B6"(例如吡,醇、吡,胺、吡,醛5，-磷酸和商业使用的盐酸吡哆醇)，其皆为共同结构单元5-羟基-6-曱基吡啶的衍生物。泛酸盐(泛酸，R-(+)-N-(2,4-二羟基-3，3-二曱基-l-氧丁基)-(3-丙氨酸)可通过化学合成或发酵制备。泛酸生物合成的最后步骤为ATP驱动的P-丙氨酸与泛解酸的缩合。负责转变成泛解酸和转变成P-丙氨酸以及缩合成泛酸的生物合成步骤的酶是已知的。泛酸的代谢活性形式为辅酶A，其生物合成由5个酶促步骤产生。泛酸、砩酸吡喷醛5，-磷酸、半胱氨酸和ATP为辅酶A的前体。这些酶不仅催化泛酸的形成，还催化(R)-泛解酸、(R)-泛解酸内酯、(R)-泛醇(维生素原B5)、泛酰巯基乙胺(及其衍生物)和辅酶A的生产。已经详细研究了^:生物中生物素从前体分子庚二酰-CoA的生物合成，并且已经鉴定出几个有关基因。已显示许多相应蛋白质参与Fe簇合物合成并且属于nifS蛋白质类。硫辛酸源自辛酸并且作为能量代谢中的辅酶，它成为丙酮酸脱氢酶复合物和a-酮戊二酸脱氢酶复合物的组成成分。叶酸类为全部源自叶酸的一組物质，叶酸依次从L-谷氨酸、对氨基苯曱酸和6-曱基喋呤衍生而来。已经在某些微生物中详细研究了从代谢中间产物鸟苷5，-三磷酸(GTP)、L-谷氨酸和对氨基苯曱酸开始的叶酸及其衍生物的生物合成。类咕啉(如钴胺素，特别是维生素Bu)和卟啉属于通过四吡咯环系统区别的一组化学品。维生素B,2的生物合成太过复杂以至于尚未完全了解，但现已知大多数有关的酶及底物。烟酸(烟酸酯)及烟酰胺为吡咬衍生物，也称为"尼克酸"。尼克酸是重要辅酶NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADP(烟酰胺腺噤呤二核苷酸磷酸)及其还原形式的前体。虽然这些化合物中有一些已经通过大规模微生物培养而生产，如核黄素、维生素B"泛酸和生物素，但是这些化合物在工业规模上的生产主要基于无细胞的化学合成。只有维生素812由于其合成的复杂性而只能通过发酵生产。体外方法需要相当大的材料花费和时间，并且成本常常很高。III.噪呤、嘧啶、核苷及核苷酸的代谢和用途用于嘌呤和嘧梵代谢的基因及其相应蛋白质对于肿瘤疾病和病毒感染的治疗为重要的目标。术语"噤呤"或"嘧啶"包含含氮碱基，其是核酸、辅酶及核苷酸的组分。术语"核普酸"包含核酸分子的基础结构单元，其包括含氮碱基、戊糖(在RNA中此糖为核糖，在DNA中此糖为D-脱氧核糖)和磷酸。术语"核苦，，包含作为核苷酸前体的分子，但与核苷酸相比其无磷酸单元。通过抑制这些分子的生物合成或者通过抑制其动员形成核酸分子，可以抑制RNA和DNA合成；在癌细胞中对该活性的耙向抑制则能够抑制肿瘤细胞分裂和复制的能力。还有一些核苷酸不形成核酸分子而是作为能量储存(即AMP)或辅酶(即FAD和NAD)。几个出版物已经描述了这些化学品在医学指征中的用途，其中嘌呤和/或嘧啶代谢受到影响(例如Christophrson，R.I.和Lyons,S.D.(1990)，"Potentinhibitorsofdenovopyrimidineandpurinebiosynthesisaschemotherapeuticagents"，Med.Res.Reviews10:505-548)。对噤呤和嘧咬代谢所涉及酶的研究集中于可以用作例如免疫抑制剂或抗增殖剂的新药开发上(Smith,J丄."EnzymesinNucleotideSynthesis"Curr.Opin.Struct.Biol.5(1995)752-757;Biochem.Soc.Transact.23(1995)877-902)。然而，嘌呤及嘧咬碱基、核苷及核苷酸还有其它可能的用途作为多种精细化学品生物合成中的中间体(如硫胺、S-腺苷甲硫氨酸、叶酸或核黄素)、作为细胞的能量载体(例如ATP或GTP)并且对于化学品自身通常用作增味剂(例如IMP或GMP)或用于许多医学应用(见例如Kuninaka，A"(19%)"NucleotidesandRelatedCompoundsinBiotechnology",第6巻,编者Rehm等，VCH:Weinheim，第561-612页)。参与嘌呤、嘧啶、核苷或核苷酸代谢的酶也日渐成为为了作物保护而正在开发的化学品(包括杀真菌剂、除草剂和杀虫剂)所针对的目标。这些化合物在细菌中的代谢已被表征(对于综述，见例如Zalkin，H.和Dixon,J.E.(1992)"Denovopurinenucleotidebiosynthesis"，在ProgressinNucleicAcidsResearchandMolecularbiology,第42巻，AcademicPress,笫259-287页；以及Michal，G.(1999)，"NucleotidesandNucleosides";第8章，在BiochemicalPathways:AnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology,Wiley,NewYork)。嘌呤代谢为深入研究的课题，其为细胞正常功能所必需的。高等动物中噤呤代谢受损可能引起严重失调，例如痛风。通过许多步骤从核糖5-磷酸经由中间体化合物肌苷5，-磷酸(IMP)合成嘌呤核苷酸，导致产生鸟苷5，-单磷酸(GMP)或腺苷5，-单磷酸(AMP)，由此可轻易地制备作为核苷酸使用的三磷酸形式。将这些化合物还可以作为能量储存使用，以致于它们的降解能够为细胞中的许多不同生物化学过程提供能量。嘧啶生物合成从核糖5-磷酸经由尿苷5，-单磷酸(UMP)进行。之后将IJMP转变成胞苷5，-三磷酸(CTP)。所有核苷酸的脱氧形式都是由核苷酸的二磷酸核糖形式在一步还原反应中制备从而产生核苷酸的二磷酸脱氧核糖形式。磷酸化后，这些分子可参与DNA合成。IV.海藻糖代谢和用途海藻糖由以a，a-l，l键连接在一起的两个葡萄糖分子组成。它通常在食品业中用作甜味剂、干燥或冷冻食品及饮料中的添加剂。然而，其还用于制药业或化妆品业和生物工程业(见例如Mshimoto等人，(1998)美国专利号5759610;Singer,M.A.和Lindquist,S.TrendsBiotech.16(1998)460-467;Paiva，C.L.A和Panek，A.D.BiotechAnn.Rev.2(1996)293-314;以及Shiosaka，M.J.Japan172(1997)97-102)。海藻糖由许多微生物的酶生产并且以天然方式^皮释放入周围培养基，可通过本领域已知的方法从所述培养基中分离海藻糖。特别优选的生物合成产物选自有机酸、蛋白质、核苷酸与核苷、生蛋白与非生蛋白氨基酸、脂类与脂肪酸、二醇、糖类、芳香化合物、维生素与辅因子、酶及蛋白质。优选的有机酸为酒石酸、衣康酸及二氨基庚二酸。优选的核苷与核苷酸描述于例如Kuninaka，A.(1996)Nucleotidesandrelatedcompounds,第561-612页，Biotechnology,第6巻,Rehm等人，编者，VCH:Weinheim及其中所出现的参考文献。优选的生物合成产物此外还有脂类、饱和及不饱和脂肪酸如花生四烯酸、二醇如丙二醇及丁二醇、糖类如透明质酸及海藻糖、芳香化合物如芳香胺、香草醛及欷蓝、维生素及辅因子(例如描述于Ullmann'sEncyclopediaofIndustrialChemistry,笫A27巻，"Vitamins",第443-613页(1996)VCH:Weinheim与其中所出现的参考文献及Ong，A.S.，Niki，E.与Packer,L.(1995)"Nutrition,Lipids,HealthandDisease"UNESCO会i义录/ConfederationofScientificandTechnologicalAssociationsinMalaysia和theSocietyforFreeRadicalResearch-Asia,1994年9月1-3日于马来西亚槟城举行，AOCSPress(1995))、酶、聚酮化合物(Cane等人(1998)Science282:63画68)及所有其它描述于Gutcho(1983)ChemicalsbyFermentation,NoyesDataCorporation,ISBN:0818805086及其中所指出参考文献中的化学物质。特别优选的生物合成产物为氨基酸，特别优选必需氨基酸，具体而言为L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-曱硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸及L-苏氨酸、L-高丝氨酸，尤其为L-赖氨酸、L-曱硫氨酸及L-苏氨酸。氨基酸例如赖氨酸、甲硫氨酸及苏氨酸在下文的每一情况下是指氨基酸的L型及D型，优选为L型，即例如L-赖氨酸、L-甲硫氨酸及L-苏氨酸。具体而言，本发明涉及通过培养与野生型相比至少一种基因的表达速率提高或受影响的基因修饰微生物来生产赖氨酸的方法，其中ch)与野生型相比，至少一种本发明的内源表达单元在樣t生物中的特异表达活性是增加的，其中所述内源表达单元调节内源基因的表达，或dh)通过本发明表达单元或者通过具有按照实施方案a)的增加的特异表达活性的表达单元来调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于表达单元而言是异源的，并且其中所述基因选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸半醛脱氬酶的核酸、编码二氨基庚二酸脱氢酶的核酸、编码二氨基庚二酸脱羧酶的核酸、编码二氬吡啶二羧酸合成酶的核酸、编码二氢吡啶二羧酸还原酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码丙糖磷酸异构酶的核酸、编码转录调节物LuxR的核酸、编码转录调节物LysRl的核酸、编码转录调节物LysR2的核酸、编码苹果酸-醌氧化还原酶的核酸、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸、编码6-磷酸葡糖酸脱氩酶的核酸、编码转酮酶的核酸、编码转醛酶的核酸、编码赖氨酸输出子的核酸、编码生物素连接酶的核酸、编码精氨酰-tRNA合成酶的核酸、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、编码果糖-l，6-二磷酸酶的核酸、编码蛋白质OpcA的核酸、编码1-磷酸果糖激酶的核酸及编码6-磷酸果糖激酶的核酸。就上述方法而言，通过本发明表达单元或者通过具有按照实施方案ch)的增加的特异表达活性的本发明表达单元对微生物中这些基因表达的调节可通过以下方式实现dhl)将一种或多种于适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的于适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或dh2)将这些基因中的一种或多种导入微生物基因组中，以便在于适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明内源表达单元控制下进行一种或多种所导入基因的表达，或dh3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。用于制备赖氨酸的上述方法的另一个优选实施方案包含基因修饰微生物，其与野生型相比还具有增加的下列活性中的至少一种，所述活性选自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸半醛脱氢酶活性、二氨基庚二酸脱氢酶活性、二氨基庚二酸脱羧酶活性、二氢吡啶二羧酸合成酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸异构酶活性、转录调节物LuxR的活性、转录调节物LysRl的活性、转录调节物LysR2的活性、苹果酸-醌氧化还原酶活性、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性、转酮酶活性、转醛酶活性、赖氨酸输出子活性、精氨酰-tRNA合成酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、果糖-l，6-二磷酸酶活性、蛋白质OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性及生物素连接酶活性。用于制备赖氨酸的上述方法的另一个特别优选的实施方案包含基因修饰^L生物，其与野生型相比还具有降^f氐的下列活性中的至少一种，所述活性选自苏氨酸脱水酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸石克化氢解酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、高丝氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、苏氨酸输出子活性、苏氨酸排出蛋白质活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性及苏氨酸合酶活性。可通过(但不是必需)具有启动子活性的本发明核酸和/或本发明表达单元引起上述这些额外增加或降低活性中的至少一种。本发明进一步涉及通过培养与野生型相比至少一种基因的表达速率已提高或受影响的基因修饰微生物来生产曱硫氨酸的方法，其中ch)与野生型相比，至少一种本发明的内源表达单元在微生物中的特异表达活性是增加的，其中所述内源表达单元可调节内源基因的表达，或dh)通过本发明表达单元或者通过具有按照实施方案a)的增加的特异表达活性的本发明表达单元来调节微生物中基因的表达，其中所迷基因相对于表达单元而言是异源的，并且其中所述基因选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸半醛脱氩酶的核酸、编码高丝氨酸脱氢酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码丙糖磷酸异构酶的核酸、编码高丝氨酸O-乙酰转移酶的核酸、编码胱硫醚y合酶的核酸、编码胱硫醚P裂合酶的核酸、编码丝氨酸幾曱基转移酶的核酸、编码O-乙酰高丝氨酸疏化氢解酶的核酸、编码亚曱基四氬叶酸还原酶的核酸、编码磷酸丝氨酸氨基转移酶的核酸、编码磷酸丝氨酸磷酸酶的核酸、编码丝氨酸乙酰转移酶的核酸、编码半胱氨酸合酶I的核酸、编码半胱氨酸合酶II的核酸、编码辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶的核酸、编码非辅酶B12依赖型甲疏氨酸合酶的核酸、编码硫酸腺苷酰转移酶的核酸、编码磷酸腺苦磷酰^L酸还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白NADPH-还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白的核酸、编码硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077的核酸、编码硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248的核酸、编码硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247的核酸、编码RXA0655调节物的核酸及编码RXN2910调节物的核酸。就上述方法而言，通过本发明表达单元或者通过具有按照实施方案ch)的增加的特异表达活性的本发明表达单元对微生物中这些基因表达的调节可通过以下方式实现dhl)将一种或多种于适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的于适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明表达单元控制下进行这些内源基因中一种或多种基因的表达，或dh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在于适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明内源表达单元控制下进行一种或多种所导入基因的表达，或dh3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。用于制备甲硫氨酸的上述方法的另一个优选实施方案包含基因修饰微生物，其与野生型相比另外还具有增加的下列活性中的至少一种，所述活性选自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸半醛脱氢酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸异构酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、胱硫醚Y合酶活性、胱硫醚P裂合酶活性、丝氨酸羟甲基转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、亚曱基四氢叶酸还原酶活性、磷酸丝氨酸氨基转移酶活性、磷酸丝氨酸磷酸酶活性、丝氨酸乙酰转移酶活性、半胱氨酸合酶I活性、半胱氨酸合酶II活性、辅酶B12依赖型曱硫氨酸合酶活性、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、硫酸腺苷酰转移酶活性、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶活性、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶活性、铁氧还蛋白NADPH-还原酶活性、铁氧还蛋白活性、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077的活性、疏酸盐还原作用的蛋白质RXA248的活性、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247的活性、RXA655调节物的活性及RXN2910调节物的活性上述用于制备曱硫氨酸的方法的另一个特别优选的实施方案包含基因修饰孩t生物，其与野生型相比另外还具有降低的下列活性中的至少一种，所述活性选自高丝氨酸激酶活性、苏氨酸脱水酶活性、苏氨酸合酶活性、内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氢吡啶二羧酸合酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性及二氨基吡啶曱酸脱羧酶活性。元引起上述这些另外增加或降低的活性中的至少一种。本发明进一步涉及通过培养与野生型相比至少一种基因的表达速率已提高或影响的基因修饰微生物来制备苏氨酸的方法，其中ch)与野生型相比，至少一种本发明的内源表达单元在^:生物中的特异表达活性是增加的，其中所述内源表达单元调节内源基因的表达，或dh)通过本发明表达单元或者通过具有按照实施方案a)的增加的特异表达活性的本发明表达单元来调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于表达单元而言是异源的，并且其中所述基因选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸半醛脱氬酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码丙糖磷酸异构酶的核酸、编码高丝氨酸激酶的核酸、编码苏氨酸合酶的核酸、编码苏氨酸输出子载体的核酸、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸、编码转醛酶的核酸、编码转酮酶的核酸、编码芊果酸-醌氧化还原酶的核酸、编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的核酸、编码赖氨酸输出子的核酸、编码生物素连接酶的核酸、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、编码苏氨酸排出蛋白质的核酸、编码果糖-l，6-二磷酸酶的核酸、编码OpcA蛋白质的核酸、编码l-磷酸果糖激酶的核酸、编码6-磷酸果糖激酶的核酸及编码高丝氨酸脱氢酶的核酸。就上述方法而言，通过本发明表达单元或者通过具有按照实施方案ch)通过以下方式实现dhl)将一种或多种于适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明表达单元导入微生物基因组中，以《吏在所导入的于适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明表达单元控制下进行这些内源基因中的一种或多种基因的表达，或dh2)将这些基因中的一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在于适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明内源表达单元控制下进行一种或多种所导入基因的表达，或dh3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸.用于制备苏氨酸的上述方法的另一个优选实施方案包含基因修饰微生物，其与野生型相比另外还具有增加的下列活性中的至少一种，所述活性选自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸半醛脱氢酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸异构酶活性、苏氨酸合酶活性、苏氨酸输出子载体活性、转醛酶活性、转酮酶活性、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、苹果酸-醌氧化还原酶活性、高丝氨蟓激酶活性、生物素连接酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、苏氨酸排出蛋白质活性、蛋白质OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性及高丝氨酸脱氢酶活性。用于制备苏氨酸的上述方法的另一个特别优选的实施方案包含基因修饰孩i生物，其与野生型相比另外还具有降低的下列活性中的至少一种，所述活性选自苏氨酸脱水酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、丝氨酸羟曱基转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、内消旋二氨基庚二酸D-脱氲酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氬吡啶二羧酸合成酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性、赖氨酸输出子活性、乙酰乳酸合酶活性、乙酮醇-酸还原异构酶活性、支链氨基转移酶活性、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、二羟基-酸脱水酶活性及二氨基吡啶曱酸脱羧酶活性。可通过(但不是必需)具有启动子活性的本发明的核酸和/或本发明表达单元引起上述这些另外增加或降低的活性中的至少一种。术语蛋白质的"活性，，在酶的情况下是指相应蛋白质的酶活性，在其它蛋白质的情况下，如结构蛋白或转运蛋白的情况下其是指蛋白质的生理活性。酶通常能将底物转化为产物，或催化此转化步骤。因此，酶的"活性"是指在特定时间内由酶转化的底物的量，或所形成的产物的量。因此，当与野生型相比活性增加时，则与野生型相比在特定时间内由酶所转化的底物的量或所形成的产物的量增加。对于前文和后文所述的所有活性，"活性"增加优选达到"野生型活性"的至少5%、优选至少20%、进一步优选至少50%、进一步优选至少100%、更优选至少300%、甚至更优选至少500%、特别优选至少600%。因此，当与野生型相比活性降低时，则与野生型相比在特定时间内由酶转化的底物的量或形成的产物的量降低。降低的活性优选是指微生物中此酶功能性会基于多种细胞生物学机制而部分或基本上完全抑制或阻断。活性的降低包含酶数量的减少，直至酶基本上完全缺乏(即检测不到相应活性或缺乏酶的免疫学可检测性)。与野生型相比，微生物中活性优选降低至少5%,进一步优选至少20%，进一步优选至少50%，进一步优选100%。具体而言，"降低"也是指相应活性的完全丧失。通过已知方法如酶分析法测定基因修饰微生物及野生型中特定酶的活性，并且由此测定酶活性的增加或降低。例如，丙酮酸羧化酶是指显示将丙酮酸转化为草酰乙酸的酶活性的蛋白质。因此，丙酮酸羧化酶活性是指在特定时间内由丙酮酸羧化酶蛋白转化的丙酮酸的量或形成的草酰乙酸的量。因此，当与野生型相比丙酮酸羧化酶活性增加时，则与野生型相比在特定时间内由丙酮酸羧化酶蛋白质转化的丙酮酸的量或形成的草酰乙酸的量增加。1/5%、进一步优选至少20%、进一步优选至少50%、进一步优选至少100%、更优选至少300%、甚至更优选至少500%、具体而言至少600%。此外，例如烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性是指烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的酶活性。烯醇丙酮酸磷酸羧激酶是指显示将草酰乙酸转化为磷酸烯醇丙酮酸的酶活性的蛋白质。因此，烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性是指在特定时间内由烯醇丙酮酸磷酸羧激酶蛋白转化的草酰乙酸的量或形成的磷酸烯醇丙酮酸的量。因此，当与野生型相比烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性降低时，则与野生型相比在特定时间内由烯醇丙酮酸磷酸羧激酶蛋白质转化的草酰乙酸的量或形成的磷酸烯醇丙酮酸的量降低。烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性的降低包含烯醇丙酮酸磷酸羧激酶数量的减少，直至烯醇丙酮酸磷酸羧激酶基本上完全缺乏(即检测不到烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性或者缺乏烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的免疫学可检测性)。与野生型相比，烯醇丙酮酸砩酸羧激酶活性优选降低至少5%、进一步优选至少20%、进一步优选至少50%、进一步优选100%。具体而言，"降低"也指烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性的完全丧失。可以多种方式额外地增加活性，例如通过在表达及蛋白质水平上关闭抑制调节机制或通过与野生型相比增加编码上述蛋白质的核酸的基因表达。同样地，与野生型相比增加编码上述蛋白质的核酸的基因表达可以多种方式进行，例如通过激活物J秀导该基因，或者如上所述通过增加启动子活性或增加表达活性或通过将一个或多个基因拷贝导入^t生物中。增加编码蛋白质的核酸的基因表达也指根据本发明操纵微生物固有内源蛋白质的表达。如上所述，这可以通过例如改变启动子和/或基因的表达单元序列来实现。例如，可通过缺失或插入DNA序列来进行这种导致基因表达速率提高的改变。如上所述，可以通过施加外源刺激改变内源蛋白质的表达。这可通过特定生理条件，即应用外源物质进行。本领域的技术人员可借助其它不同方法(单独或组合)实现基因表达的增加。因此，例如可增加适当基因的拷贝数，或将启动子及调节区或位于结构基因上游的核糖体结合位点突变。另外，可通过诱导性启动子在发酵生产过程中增加表达。延长mRNA寿命的方法同样可改善表达。通过防止酶蛋白降解同样也可增强酶活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或在染色体中整合并扩增。备选地，也可通过改变培养基的组成及培养物处理实现相关基因的过表达。本领域的技术人员可尤其在Martin等人(Biotechnology5，137-146(1987))、Guerrero等人(Gene138，35-41(1994))、Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology6，428-430(1988))、Eikmanns等人(Gene102，93-98(1991))、欧洲专利第0472869号、美国专利第4，601，893号、Schwarzer和Piihler(Biotechnology9，84-87(1991))、Reinscheid等人(AppliedandEnvironmentalMicrobiology60，126-132(1994))、LaBarre等人(Jou腦lofBacteriology175,1001-1007(1993))、专利申请WO96/15246、Malumbres等人(Gene134，15-24(1993))、日本公开说明书JP-A-10-229891、Jensen和Hammer(BiotechnologyandBioengineering58，191-195(1998》、Makrides(MicrobiologicalReviews60:512-538(1996))及众所周知的遗传与分子生物学教科书中发现对此的指导。此外，除了基因的表达或增强以外，消除有害副反应对生物合成产物，尤其是L-赖氨酸、L-甲硫氨酸及L-苏氛酸的生产是有利的(Nakayama:"BreedingofAminoAcidProducingMicroorganisms"，在OverproductionofMicrobialProducts,Krumphanzl,Sikyta，Vanek(编者)，AcademicPress,London,英国，1982)。在一个优选实施方案中，通过将至少一种编码相应蛋白质的核酸导入微生物中使编码上述蛋白质之一的核酸的基因表达增加。核酸导入可在染色体上或染色体外进行，即通过染色体上拷贝数的增加和/或在宿主微生物中复制的质粒上的一个拷贝基因。核酸的导入(例如以包含核酸的表达盒形式)优选在染色体上进行，具体而言通过上述SacB方法进行。原则上，为了该目的可以使用编码上述蛋白质之一的任何基因。以真核来源的包含内含子的基因组核酸序列为例，若宿主微生物不能够表达相应蛋白质或者不会使其表W目应蛋白质，则优选使用已经加工过的核酸序列，例如相应cDNA。相应基因的实例列于表1及表2中。通过以下方法中的至少一种优选降低^L生物中的上述活性导入至少一种用于诱导共抑制的有义核糖核酸序列或者确保其表达的表达盒；导入至少一种针对相应基因、RNA或蛋白质的DNA结合因子或蛋白质结合因子或者确保其表达的表达盒；导入至少一种引起RNA降解的病毒核酸序列或者确保其表达的表达盒，导入至少一种引起基因功能丧失的构建体，其中在所述构建体中通过例如在基因中产生插入、缺失、倒置或突变而产生终止密码子和使阅读框移位。可能且优选的是通过同源重组靶向插入至目的靶基因中或者通过导入针对耙基因的序列特异性核酸酶产生敲除突变体；导入具有降低启动子活性的启动子或者具有降低表达活性的表达单元。本领域的技术人员认识到，在本发明的范畴内还可使用其它方法来降低其活性或功能。例如，导入蛋白质的显性失活变体或确保其表达的表达盒也是有利的。此外，这些方法中的每一个均可能引起蛋白质数量、mRNA数量和/或蛋白质活性降低。也可以想到这些方法的组合使用。其它方法对本领域技术人员而言是已知的，其包含阻止或抑制蛋白质加工、蛋白质或其mRNA的转运、抑制核糖体附着、抑制RNA剪接、诱导降解RNA的酶和/或抑制翻译延伸或终止。在用于生产生物合成产物的本发明方法中，优选在培养基因修饰微生物的步骤之后从微生物和/或发酵培养基中分离生物合成产物。这些步骤可同时进行和/或优选在培养步骤之后进行。可用分批法(分批培养)或者补料分批或重复补料分批法中培养本发明基因修饰微生物，以连续或间断生产生物合成产物，特别是L-赖氨酸、L-甲碌u氨酸及L-苏氨酸。在Chmiel(Bioprozefitechnik1.EinfiihnmgindieBioverfahrenstechnik(GustavFischerVerlag，Stuttgart,1991))的教科书或Storhas(BioreaktorenundperiphereEinrichtungen(ViewegVerlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))的教科书中找到已知培养方法概述。待使用的培养基必须以适当地方式满足各个菌林的要求。在美国微生物学会的"ManualofMethodsforGeneralBacteriology"(WashingtonD.C"美国，1981)手册中描述了用于多种微生物的培养基。根据本发明，这些可使用的培养基通常包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或痕量元素。优选的碳源为糖例如单糖、二糖或多糖。良好碳源的实例为葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。也可经诸如糖蜜的复杂化合物或糖精制的其它副产物将糖置于培养基中。添加多种碳源的混合物也是有益的。其它可能的碳源为油及脂肪，例如大豆油、葵花子油、花生油及椰子脂肪；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸或亚油酸；醇，例如甘油、曱醇或乙醇以及有机酸，例如乙酸或乳酸。氮源通常为有机或无机氮化合物或含有这些化合物的材料。氮源的实例包括氨气或诸如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵的铵盐、硝酸盐、尿素、氨基酸或诸如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏及其它物质的复合氮源。氮源可单独使用或作为混合物使用。可存在于培养基中的无机盐化合物包含钩、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜及铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。为了产生精细化学品，尤其是曱硫氨酸，可能使用无机化合物例如硫酸盐、亚石克酸盐、连二亚^Sl酸盐、四硫酸盐、硫代石克酸盐、减^化物作为减^源，但是也可使用有机硫化合物例如硫醇及硫醇类作为疏源可以使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氩二钾或相应的含钠盐作为磷源。可将螯合剂加入培养基以便保持溶液中的金属离子。特别适宜的螯合剂包括二羟基酚类如儿茶酚或原儿茶酸以及有机酸如柠檬酸。根据本发明，所使用的发酵培养基通常还包含诸如维生素或生长促进剂的其它生长因子，其包括例如生物素、核黄素、硫胺、叶酸、烟酸、泛酸及吡喷醇。生长因子及盐常常来自培养基的复杂成分例如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。也可将适宜前体添加至培养基中。培养基中化合物的精确组成很大程度上视具体实验而定，并且将对于每一具体情况单独确定。对培养基进行优化的信息可从教科书"AppliedMicrobiol.Physiology,APracticalApproach"(编者P.M.Rhodes,P.F.Stanbury，IRLPress(1997)第53-73页，ISBN0199635773)得到。也可从商品供应商购买生长培养基，例如Standardl(Merck)或BHI(脑心浸出液，DIFCO)。将所有培养基成分通过加热(1.5巴和121。C下20分钟)或无菌过滤灭菌。可将成分一起灭菌或视需要分开灭菌。所有培养基成分可在培养开始即存在或任选连续或分批加入。培养基的温度通常在15。C与45。C之间，优选在25。C与40。C，且在实验过程中保持恒定或变化。培养基的pH值应处于5至8.5的范围内，优选为约7.0。在培养期间可通过添加诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水的碱性化合物或诸如磷酸或硫酸的酸性化合物来控制培养用的pH值。可通过使用例如脂肪酸聚二乙醇酯的防泡剂来控制泡沫产生。通过向培养基中添加具有选择作用的适宜物质，例如抗生素来维持质粒的稳定性。通过向培养基中导入氧或含氧气体混合物(例如环境空气)来维持需氧条件。培养物的温度通常为20。C至45。C。培养持续进行到目的产物的形成达到最大量。通常在10小时至160小时内达到此目标。以此方式得到的发酵肉汤的干物质含量通常为7.5至25%(以重量计)。此外，至少在发酵末期，但是具体是在超过发酵时间的至少30%的时候进行糖限制发酵也是有利的。这意味着在这段时间内发酵培养基中可利用的糖浓度保持在0至3g/l或是降低的。根据所要生物合成产物及生物合成的副产物的物理/化学特性，以本身已知的方式从发酵肉汤和/或微生物中分离生物合成产物。例如，可接着进一步处理发酵肉汤。视需要而定，可用分离方法例如离心、过滤、倾析或这些方法的组合从发酵肉汤中全部或部分移除生物量或将其全部保留于其中。接着用已知方法浓缩发酵肉汤，例如借助于旋转蒸发器、薄膜蒸发器、降膜式蒸发器通过逆渗透或通过纳米过滤。然后通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾造粒或其它方法处理该浓缩的发酵肉汤。然而，也可能进一步纯化生物合成产物，尤其为L-赖氨酸、L-曱硫氨酸及L-苏氨酸。为了该目的，在除去生物量之后，使用适宜树脂对含有产物的肉汤进行层析，其中目的产物或杂质全部或部分地滞留于层析树脂上。若需要，则可使用相同或不同层析树脂重复进行这些层析步骤。本领域的技术人员精通适宜层析树脂的选择及其最有效的使用。纯化的产物可通过过滤或超滤来浓缩且贮存于产物稳定性最大的温度下。生物合成产物可以有多种形式，例如其盐或酯的形式。可用现有技术确定所分离的化合物及纯度。这些现有技术包含高效液相层析法(HPLC)、光语法、染色法、薄层层析法、NIRS、酶测定法或微生物测定。这些分析方法总结于Patek等人(1994)Appl.Environ.Microbiol.60:133-140;Malakhova等人(1996)Biotekhnologiya1127画32以及Schmidt等人(1998)BioprocessEngineer.19:67-70;Ulmann'sEncyclopediaofIndustrialChemistry(1996)第A27巻，VCH:Weinheim,第89-卯页、第521-540页、第540-547页、第559-566页、575-581页及第581-587页；Michal，G(1999)BiochemicalPathways:AnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology,JohnWileyandSons;Fallon，A.等人(1987)ApplicationsofHPLCinBiochemistry,在LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology，第17巻中。实施方案现通过以下非限定性实施例更详细地描述本发明实施例l:载体pCLiK5MCS的制备首先，通过聚合酶链式反应(PCR)使用寡核苷酸引物SEQIDNO:5和SEQIDNO:6扩增栽体pBR322的氨节青霉素抗性基因及复制起点。SEQIDNO:5:5，-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3'SEQIDNO:6:5-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTCG-3'寡核苷酸引物SEQIDNO:5除了包含与pBR322互补的序列之外，还沿5，-3，方向含有限制性内切核酸酶Smal、BamHI、NheI及AscI的酶切位点，寡核苦酸引物SEQIDNO:6除了包含与pBR322互补的序列之夕卜,还沿5，-3，方向含有限制性内切核酸酶Xbal、Xhol、NotI及DraI的酶切位点。通过例如Innis等人(PCRProtocols.AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress(1990))的标准方法，用PfuTurbo聚合酶(Stratagene，LaJolla，美国)进行PCR反应。使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(AmershamPharmacia,Freiburg)按照产品说明书将所得到的约2.1kb大小的DNA片段纯化。使用快速DNA连接试剂盒(RocheDiagnostics,Mannheim)按照产品说明书将DNA片段的平末端连接在一起，且通过如Sambrook等人(MolecularCloning.ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态的大肠杆菌(E.coli)XL-lBlue(Stratagene，LaJolla，美国)中。通过涂布在含有氨苄青霉素(50ng/ml)的LB琼脂(Lennox，1955，Virology,1:190)上来筛选含有质粒的细胞。使用Qiaprep离心式小量制备试剂盒(Qiagen，Hilden)按照产品说明书分离每个克隆的质粒DNA，并通过限制酶切消化来检查。以此方式得到的质粒称为pCLiKl。以作为PCR反应模板的质粒pWLTl(Liebl等人，1992)起始，使用寡核苷酸引物SEQIDNO:7与SEQIDNO:8扩增卡那霉素抗性盒。SEQIDNO:7:5，画GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3'SEQIDNO:8:5-GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3，寡核苷酸引物SEQIDNO:7除了包舍与pWLTl互补的序列之外，还沿5，-3，方向含有限制性内切核酸酶Xbal、Smal、BamHI、Nhel的酶切位点，寡核苦酸引物SEQIDNO:8除了包含与pWLTl互补的序列之外，还沿5，-3，方向含有限制性内切核酸酶AscI及NheI的酶切位点。通过例如Innis等人(PCRProtocols.AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress(1990))的标准方法，用PfuTurbo聚合酶(Stratagene，LaJolla，美国)进行PCR反应。使用GFX顶PCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(AmershamPharmacia,Freiburg)按照产品说明书将所得到的约1.3kb大小的DNA片段纯化。按照产品说明书用限制性内切核酸酶XbaI及AscI(NewEnglandBiolabs，Beverly,美国)切割DNA片段，且随后使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(AmershamPharmacia,Freiburg)再次纯化。同样地，按照产品说明书用限制性内切核酸酶XbaI及AscI切割载体pCLiKl，并用碱性磷酸酶(I(RocheDiagnostics,Mannheim))去砩酸化。在0.8%琼脂糖凝胶中电泳之后，使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(AmershamPharmacia,Freiburg)并按照产品说明书分离线性化载体(约2.1kb)。使用快速DNA连接试剂盒(RocheDiagnostics,Mannheim)并按照产品说明书将此载体片段与切割的PCR片段连接，并通过如Sambrook等人(MolecularCloning.ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态大肠杆菌XL-lBlue(Stratagene，LaJolla，美国)中。通过涂布在含有氨节青霉素(50ng/ml)和卡那霉素(20^g/ml)的LB琼脂(Lennox，1955，Virology,l:l卯)上来筛选含有质粒的细胞。使用Qiaprep离心式小量制备试剂盒(Qiagen，Hilden)并按照产品说明书分离每个克隆的质粒DNA,并通过限制酶切消化来检查。以此方式得到的质粒称为pCLiK2。用限制性内切核酸酶DraI(NewEnglandBiolabs，Beverly,美国)切割载体pCLiK2。在0.8。/。琼脂糖凝胶中电泳之后，使用GFX报PCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(AmershamPharmacia,Freiburg)并按照产品说明书分离约2.3kb大小的载体片段。使用快速DNA连接试剂盒(RocheDiagnostics,Mannheim)并按照产品说明书将该载体片段重新连接，并通过如Sambrook等人(MolecularCloning.ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态大肠杆菌XL-lBlue(Stratagene，LaJolla，美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20Hg/ml)的LB琼脂(Lennox，1955，Virology,l:l卯)上来筛选含有质粒的细胞。使用Qiaprep离心式小量制备试剂盒(Qiagen,Hilden)按照产品说明书分离每个克隆的质粒DNA，并通过限制酶切消化来检查。以此方式得到的质粒称为pCLiK3。以作为PCR^应模板的质粒pWLQ2(Liebl等人，1992)起始，使用寡核苦酸引物SEQIDNO:9和SEQIDNO:10扩增pHM1519复制起点。SEQIDNO:9:5，-GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3'SEQIDNO:10:5，-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC陽3，寡核苷酸引物SEQIDNO:9和SEQIDNO:10除了含有与pWLQ2互补的序列之外，还含有限制性内切核酸酶NotI的酶切位点。通过例如Iimis等人(PCRProtocols.AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress(1990))的标准方法，用PfuTurbo聚合酶(Stratagene，LaJolla，美国)进行PCR反应。使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(AmershamPharmacia,Freiburg)按照产品说明书将所得到的约2.7kb大小的DNA片段纯化。按照产品说明书用限制性内切核酸酶NotI(NewEnglandBiolabs，Beverly,美国)切割DNA片段，并用GFX，PCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(AmershamPharmacia,Freiburg)再次纯化。同样地，按照产品说明书用限制性内切核酸酶Notl切割载体pCLiK3，并用碱性磷酸酶(I(RocheDiagnostics,Mannheim))去磷酸化。在0.8%琼脂糖凝胶中电泳之后，用GFXPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(AmershamPharmacia,Freiburg)按照产品说明书分离线性化的载体(约2.3kb)。使用快速DNA连接试剂盒(RocheDiagnostics,Mannheim)按照产品说明书将此载体片段与切割的PCR片段连接，并通过如Sambrook等人(MolecularCloning.ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态大肠杆菌XL-lBlue(Stratagene，LaJolla，美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20照/ml)的LB琼脂(Lennox,1955，Virology,1:190)上来筛选含有质粒的细胞。使用Qiaprep离心式小量制备试剂盒(Qiagen，Hilden)按照产品说明书分离每个克隆的质粒DNA，并通过限制酶切消化来检查。以此方式得到的质粒称为pCLiK5。为了以多克隆位点(MCS)延长pCLiK5，于95。C下将两条合成的、基本上互补的寡核苷酸SEQIDNO:ll与SEQIDNO:12—起加热并緩慢冷却，使其结合得到双链DNA片段，所述寡核苷酸含有限制性内切核酸酶SwaI、Xhol、Aatl、Apal、Asp718、Mlul、聽I、Spel、EcoRV、Sall、Clal、BamHI、XbaI及SmaI的酶切位点。SEQIDNO:ll:5，國TCGAATTTAAATCTCGAGAGGCCTGACGTCGGGCCCGGTACCACGCGTCATATGACTAGTTCGGACCTAGGGATATCGTCGACATCGATGCTCTTCTGCGTTAATTAACAATTGGGATCCTCTAGACCCGGGATTTAAAT-3，SEQIDNO:12:5，隱GATCATTTAAATCCCGGGTCTAGAGGATCCCAATTGTTAATTAACGCAGAAGAGCATCGATGTCGACGATATCCCTAGGTCCGAACTAGTCATATGACGCGTGGTACCGGGCCCGACGTCAGGCCTCTCGAGATTTAAAT画3，按照产品说明书用限制性内切核酸酶XhoI及BamHI(NewEnglandBiolabs，Beverly,美国)切割载体pCLiK5，并用碱性磷酸酶(I(RocheDiagnostics,Mannheim))去磷酸化。在0.8%琼脂糖凝胶中电泳之后，用GFXPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(AmershamPharmacia,Freiburg)按照产品说明书分离线性化的载体(约5.0kb)。使用快速DNA连接试剂盒(RocheDiagnostics,Mannheim)按照产品说明书将此载体片段与合成的双链DNA片段连接，并通过如Sambrook等人(MolecularCloning.ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态大肠杆茵XL-lBlue(Stratagene，LaJolla，美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20jng/ml)的LB琼脂(Lennox,1955，Virology,1:190)上来筛选含有质粒的细胞。使用Qiaprep离心式小量制备试剂盒(Qiagen，Hilden)按照产品说明书分离每个克隆的质粒DNA，并通过限制酶切消化来检查。以此方式得到的质粒称为pCLiK5MCS。如Sanger等人(1977yProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA74:5463-5467的描述开展测序反应。使用ABIprism377(PEAppliedBiosystems，Weiterstadt)将测序反应分离和测定。将得到的质粒pCLiK5MCS列于SEQIDNO:13。实施例2:质粒PmetAmetA的制备如Tauch等人(1995)PIasmid33:168-179或Eikmaims等人(1994)Microbiology140:1817-1828所述，从谷氨酸棒杆菌ATCC13032制备染色体DNA。使用寡核苦酸引物SEQIDNO:14及SEQIDNO:15、作为模板的染色体DNA及PfuTurbo聚合酶(来自Stratagene)，通过如Innis等人(1990)PCRProtocols.AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress描述的标准方法以聚合酶链式反应(PCR)扩增包括5，非编码区的metA基因。SEQIDNO:14:5'-GCGCGGTACCTAGACTCACCCCAGTGCT-3'SEQIDNO:15:5，-CTCTACTAGTTTAGATGTAGAACTCGATGT-3'使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(AmershamPharmacia,Freiburg)按照产品说明书将所得到的约1.3kb大小的DNA片段纯化。接着用限制酶Asp718和Spel(RocheDiagnostics,Mannheim)切割该DNA片段，并用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒纯化。用限制酶Asp718和Spel切割载体pClik5MCSSEQIDNO:13，电泳分离之后，使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒分离5kb大小的片段。使用快速DNA连接试剂盒(RocheDiagnostics,Mannheim)按照产品说明书将载体片段与PCR片段连接在一起，并通过如Sambrook等人(MolecularCloning.ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,(!989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态大肠杆菌XL-lBlue(Stratagene，LaJolla，美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20照/ml)的LB琼脂(Lennox，1955，Virology,1:190)上来篩选含有质粒的细胞。以Qiagen的方法并使用来自Qiagen的材料制备质粒DNA。如Sanger等人(1977)ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA74:5463-5467的描述进行测序反应。^f吏用ABIprism377(PEAppliedBiosystems，Weiterstadt)将测序反应分离并测定。将得到的质粒pCLiK5MCSPmetAmetA列于SEQIDNO:16。实施例3:质粒pCLiK5MCSPEF-TUmetA的制备如Tauch等人(1995)Plasmid33:168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology140:1817-1828所述，从谷氨酸棒杆菌ATCC13032制备染色体DNA。使用寡核苷酸引物SEQIDNO:17与SEQIDNO:18、作为模板的染色体DNA及PfuTurbo聚合酶(来自Stratagene)，通过例如Iimis等人(1990)PCRProtocols.AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress的标准方法以聚合酶链式反应(PCR)扩增超氧化物歧化酶的5，非编码区(启动子区)(Psod)的约200bp的DNA片段。SEQID隐17:5，-GAGACTCGAGGGCCGTTACCCTGCGAATG-3，SE(JID隐18:5画CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATTGTATGTCCTCCTGGAC-3，使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(AmershamPharmacia,Freiburg)按照产品说明书将所得到的DNA片段纯化。以作为PCR义应模板的质粒PmetAmetASEQIDNO:16起始，使用寡核苷酸引物SEQIDNO:19和SEQIDNO:20扩增一部分metA。SE(JIDNO:19:5-CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3，SEQIDNO:20:5-CTGGGTACATTGCGGCCC-3"使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒按照产品说明书将所得到的约470bp的DNA片段纯化。在另一个PCR^应中，将以上得到的两个片段一起用作模板。由于序列与寡核苷酸引物SEQIDNO:18—起引入并且与metA同源，因此在PCR反应中两个片段彼此连接，且通过所用的聚合酶延伸得到连续的DNA链。通过仅在第二个循环开始时向反应混合物中加入所用的SEQIDNO:17和SEQIDNO:20寡核苷酸引物将标准方法改进。使用GFXPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒按照产品说明书将约675bp的扩增DNA片段纯化。接着，用限制酶Xhol及NcoI(RocheDiagnostics,Mannheim)切割该DNA片段并用凝胶电泳分离。随后，使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(AmershamPharmacia,Freiburg)从琼脂糖中纯化约620bp大小的DNA片段。用限制酶NcoI和SpeI(RocheDiagnostics,Maimheim)切割质粒PmetAmetASEQIDNO:16。在通过凝股电泳分离之后，使用GFXTMPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒从琼脂糖中纯化约0.7kb大小的metA片段。用限制酶Xhol和SpeI(RocheDiagnostics,Mannheim)切割载体pClik5MCSSEQIDNO:13，并在通过电泳分离之后，使用GFXtmPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒分离5kb大小的片段。使用快速DNA连接试剂盒(RocheDiagnostics,Mannheim)按照产品说明书将载体片段与PCR片段及metA片段连接在一起，并通过如Sambrook等人(MolecuIarCloning.ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,(1989))描述的标准方法将连接混合物转化进入感受态大肠杆菌XL-lBlue(Stratagene,LaJolla，美国)中。通过涂布在含有卡那霉素(20lng/ml)的LB琼脂(Lennox，1955，Virology,1:190)上来筛选含有质粒的细胞。以Qiagen的方法并使用来自Qiagen的材料制备质粒DNA。如Sanger等人(1977)ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA74:5463-5467的描述进行测序反应。使用ABIprism377(PEAppliedBiosystems，Weiterstadt)将测序反应分离并测定。将得到的质粒pCLiK5MCSPEF-TUmetA列于SEQIDNO:21。实施例4:MetA活性以(Liebl等人(1989)FEMSMicrobiologyLetters53:299-303)描述的方法，用质粒pClik5MCS、pCli固CSPmetAmetA、pCLiK5MCSPEF-TUmetA中的每一种转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌林。将转化混合物涂布在另外含有20mg/l卡那霉素的CM平板上来筛选含有质粒的细胞。挑取并分离所得到的卡那霉素抗性克隆。在30。C下将含有这些质粒构建体之一的谷氨酸棒杆菌菌林在MMA培养基(40g/l蔗糖、20g/1(NH4)2S04、Ig/1KH2P04、Ig/1K2HP04、0.25g/1MgS04x7H20、54gAces、1mlCaCl2(10g/l)、lml原儿茶酸(300mg/10ml)、1ml痕量元素溶液(lOg/1FeS04x7H20、10g/1MnS04xH20、2g/1ZnS04x7H20、0.2g/1CuS04、0.02g/1NiCl2x6H20)、100^g/l维生素B,2、0.3mg/l硫胺、lmM亮氨酸、1mg/l吡,醛HCl、1ml生物素(lOOmg/l)，pH7.0)中培养过夜。将细胞于4。C下离心，接着用冷的Tris-HCl緩冲液(0.1。/。，pH8.0)洗涤两次。重新离心之后，将细胞溶解在冷的Tris-HCl緩冲液(0.1。/。，pH8.0)中，并调节至OD6。o为160。为了使细胞破裂，将lml此细胞悬浮液转移至来自Hybaid的2mlRibolyser管中，且以6.0的旋转设定值在Hybaid的Ribolyser中裂解三次，每次30秒。通过在Eppendorf离心机中于4。C下15,000转/分离心30分钟4吏裂解物澄清，且将上清液转移至新的Eppendorf杯中。如Bradford，M.M.(1976)Anal.Biochem.72:248-254中所述，测定蛋白质的含量。如下进行metA酶活性测定。1ml反应混合物含有100mM磷酸钾緩冲液(pH7.5)、5mMMgCl2、100inM乙酰辅酶A、5mML-高丝氨酸、500^VIDTNB(EUman，s试剂)和细胞提取物。加入各个蛋白质裂解物开始测定，并于室温下孵育。然后于412nm处记录动力学10分钟。结果示于表la。<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>ATCC13032pCliK5MCSPEF-TUmetA98.4通过使用异源表达单元可以相当大地提高MetA活性。实施例5:质粒pCISlysC的构建在菌林构建的第一步骤中，在谷氨酸棒杆菌ATCC13032中进行lysC野生型基因的等位基因交换。在该种状况下，在lysC基因中进行核苷酸交换以便在所得到的蛋白质中位置311上的氨基酸Thr被lie替换。从作为PCR反应模板的来自ATCC13032的染色体DNA起始，按照产品说明书借助于Pfu-TurboPCR系统(StratageneUSA)并使用寡核苷酸引物SEQIDNO:22和SEQIDNO:23扩增lysC。如Tauch等人(1995)Plasmid33:168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology140:1817-1828所述从谷氨酸棒杆菌ATCC13032制备染色体DNA。在扩增片段的5，端为Sail限制性位点且其3'端为Mlul限制性位点。克隆之前，以该两种限制性酶消化所扩增的片段并使用GFXPCR、DNA及凝胶条带纯化试剂盒(AmershamPharmacia,Freiburg)纯化。SEQIDNO:22:5，隱GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC-3"SEQIDNO:23:5，隱CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3"通过Sail和Mlul限制性位点将所得的多核普酸克隆至下文中称为pCIS的pCLIK5MCS整合型SacB(SEQIDNO:24)并转化进入大肠杆菌XL-lblue中。通过涂布于含有卡那霉素(20ng/ml)的LB琼脂(Lennox，1955，Virology,1:190)上对含有质粒的细胞进行篩选。分离质粒且通过测序来证实预期核苷酸序列。通过多种方法并使用来自Qiagen的材料制备质粒DNA。如Sanger等人(1977)ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA74:5463-5467所述进行测序反应。使用ABIprism377(PEAppliedBiosystems，Weiterstadt)对测序反应进行分离和测定。将所得到的质粒pCISlysC列为SEQIDNO:25。实施例6:来自谷氨酸棒杆菌的lysC基因诱变使用Quickchange试剂盒(来自Stratagene/美国)按照产品说明书将来自谷氨酸棒杆菌的lysC基因进行定向诱变。在质粒pCISlysC(SEQIDNO:25)中进行诱变。为了通过Quickchange方法(Stratagene)由thr311交换成311ile，合成以下寡核苦酸引物SEQIDNO:26:5，-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG-3'SEQIDNO:27:5，-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG画3'这些寡核苷酸引物在Quickchange反应中的使用导致在lysC基因SEQIDNO:28中932位上核脊酸的交换(由C交换成T)。在转化进入大肠杆菌XLl-blue中并制备质粒之后，通过测序反应证实了lysC基因中发生氨基酸交换Thr311Ile。所得到的质粒命名为pCISlysCthr311ile并列于SEQIDNO:29。如Liebl等人(1989)FEMSMicrobiologyLetters53:299-303所述，通过电穿孔将质粒pCISlysC仇r311ile转化入谷氨酸棒杆菌ATCC13032中。对该方案的修-改描述于DE10046870中。使用如Sambrook等人(1989)，Molecularcloning.ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor中所述的标准方法，通过Southern印迹及杂交来检查各个转化体lysC基因座上的染色体排列。此举确保转化体已通过同源重组在lysC基因座上整合了所转化的质粒。此类菌落在不含抗生素的培养基中生长过夜之后，将细胞涂布于蔗糖CM琼脂培养基(10g/l蛋白胨、5g/l牛肉膏、5g/1酵母提取物、2.5g/1NaCl、2g/l尿素、1%葡萄糖、10%蔗糖,pH6.8)上并于30。C下培养24小时由于载体pCISlysCthr311ile中所存在的sacB基因将蔗糖转化为有毒产物，因此能够生长的菌落仅仅为通过野生型lysC基因与所突变lysCthr311ile基因之间的第二个同源重组步骤而缺失sacB基因的那些菌落。在同源重组过程中，或者是野生型基因或者是突变的基因与sacB基因一起缺失。SacB基因与野生型基因的缺失导致产生突变的转化体。挑取生长菌落并研究其卡那霉素敏感性表型。缺失SacB基因的菌落必须同时显示出卡那霉素敏感性生长行为。在摇瓶中研究此类卡那霉素敏感性克隆的赖氨酸生产力(见实施例6)。培养未经处理的谷氨酸棒杆菌ATCC13032以用于对照。选择与对照组相比赖氨酸生产提高的菌落，分离染色体DNA，通过PCR反应扩增lysC基因的相应区并测序。将具有增加的赖氨酸合成特性且在lysC的932位上具有所证实突变的该克隆称作ATCC13032lysC实施例7:用于借助于异源表达单元Peftu(SEQ.ID.2)使lysC基因过表达整合型质粒的制备定义以下寡核苷酸用于扩增编码延伸因子Tu的基因的启动子。SEQID30:CK352:5，-CGCCAATTGTGGCCGTTACCCTGCGAATG-3'SEQID31:CK353:5-TTCTGTACGACCAGGGCCACTGTATGTCCTCCTGGACTTC-3"引物与来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA—起用于PCR反应。使用该方法可以扩增对应于约200bp预期大小的DNA片段。定义以下寡核苷酸用于扩增编码天冬氨酸激酶的基因。SEQID32:CK354:5，-GAAGTCCAGGAGGACATACAGTGGCCCTGGTCGTACAGAA画3'SEQID33:CK355:5，-CATGCCCGGGACAGCAGCAAGTTCCAGCAT-3'引物与来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032lysC"31"的染色体DNA—起用于PCR反应。使用该方法可以扩增对应于约620bp预期大小的DNA片段。引物CK354和CK353含有重叠序列并且在5，端彼此同源。将以上所得的PCR产物用作另外PCR的模板，在该PCR中使用引物CK352和CK355。使用该方法可以扩增对应于约820bp预期大小的DNA片段。用限制性酶Munl和Smal切割该Peftu/lysC"^融合体。定义以下寡核苷酸用于扩增IysC基因的5，区SEQID34:CK356:5，-CGCGACGTCCGTCCCAAAACGATCATGAT-3，SEQID35:CK357:5，-CGCCAATTGCTTTGTGCACCTTTCGATCT誦3，引物与来自谷氨酸棒杆菌的染色体DNA—起用于PCR反应。使用该方法可以扩增对应于约600bp预期大小的DNA片段。用限制性酶AatII及Muni消化此DNA片段。随后，将此片段与消化的Peftii/lysC"51"融合体克隆入先前经限制性酶Aatll及Smal消化的载体pCIS中。将所得到的载体称作pCISPeftulysC"""(SEQID36)。至此步骤为止，所有克隆均在大肠杆菌XL-1Blue(来自Stratagene,Amsterdam,荷兰)中进行。如Liebl等人(1989)FEMSMicrobiologyLetters53:299-303所述，接着使用转化质粒pCISPeftulysC"""与质粒pTcl5AcglM—起转化大肠杆菌Mn522(来自Stratagene,Amsterdam,荷兰)。根据谷氨酸棒杆菌的甲基化型式，质粒pTcl5AcglM使得DNA能够被甲基化(DE10046870)。此步骤使得可以用整合型质粒pCISPeftulysC"""对谷氨酸棒杆菌进行电穿孔。电穿孔及随后在含有卡那霉素(25將/ml)的CM平板上进行的选择导致产生多个转结合子。为了选择第二个重组事件(其将导致载体与lysC启动子及lysC基因一起被切除)，将这些转结合子于不含卡那霉素的CM培养基中培养过夜并接着涂布于具有10%蔗糖的CM平板上进行选择。存在于栽体pCIS上的saeB基因编码果聚糖蔗糖转移酶并且导致在蔗糖上生长的细菌的果聚糖合成。由于果聚糖对谷氨酸棒杆菌是有毒性的，因此只有那些通过笫二次重组步骤丟失整合型质粒的谷氨酸棒杆菌细胞才能在含蔗糖培养基上生长(J3ger等人，JournalofBacteriology174(1992)5462-5466)。检查150个抗蔗糖克隆的卡那霉素敏感性。证明所测试克隆中的56个克隆不仅对蔗糖具有抗性并且还是卡那霉素敏感性的。使用聚合酶链式反应(PCR)检查是否也发生了以Peftu启动子对天然启动子的置换。对于该分析，从起始菌株和20个克隆分离染色体DNA。为了该目的，用牙签将个别克隆从琼脂平板中挑出并悬浮于100^111120中，于95。C下煮沸10分钟。将所得溶液中的10jil在PCR中用作模板。所用引物为与Peftu启动子及lysC基因同源的寡核苷酸。所选择PCR条件如下95'C预变性5分钟；95°C变性30秒；55。C杂交30秒；72。C扩增2分钟；30个循环；72。C最终延伸5分钟。在具有初始菌抹DNA的混合物中，由于寡核苷酸的选择而不可能产生PCR产物。只有其中第二次重组实现由Peftu对天然启动子(PlysC)置换的克隆出现预期552bp大小的条带。在所测试的20个克隆中总共有3个为阳性。实施例8:天冬氨酸激酶(lysC)测定法在3(TC下将包含带有天然启动子的lysC^基因的染色体拷贝或PeftulysC"""构建体的染色体拷贝的谷氨酸棒杆菌林于CM培养基(10g/l蛋白胨、5g/1牛肉膏、5g/1酵母提取物、2.5g/1NaCl、2g/l尿素、1%葡萄糖，pH6.8)中培养直至OD卿为8。将细胞于4'C下旋转离心，然后用冷的Tris-HCl緩沖液(0.1。/。，pH8.0)将细胞洗涤两次。重新离心之后，将细胞溶解于冷的Tris-HCl緩冲液(0.1。/。，pH8.0)中并调整至OD鋼为160。为了使细胞破裂，将1ml该细胞悬浮液转移至来自Hybaid的2mlRibolyser管中，以6.0的旋转设定值在来自Hybaid的Ribolyser中裂解三次，每次30秒。通过在4'C下以15,000转/分于Eppendorf离心机中离心30分钟使裂解物澄清，将上清液转移至新的Eppendorf杯中.如Bradford,M.M.(1976)Anal.1Biochem.72:248-254中所述测定蛋白质含量。天冬氨酸激酶的酶活性测定如下。在30。C下，将lml反应混合物(含有100mMTris-HCl(pH8.0)、10mMMgCl2、600mM羟胺HC1(用10NKOH调至pH7.0)、4mMATP、200mM天冬氨酸盐(钠盐))与额外1mlH20孵育10分钟，通过加入个别蛋白质裂解物开始分析并且在30。C下孵育30分钟。通过向反应混合物中加入1ml终止溶液(10%氯化铁、3.3%三氯乙酸、0.7NNaCl)以终止反应。离心步骤之后，测量上清液的ODs40。在该状况下，l单位相当于每分钟每mg蛋白质形成lnmol天冬氨酸异羟结果示于表2a。表2a<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>可以通过将PeftulysC"""构建体整合入染色体中使天冬氨酸激酶活性增力口2.5倍。实施例9:赖氨酸生产为了研究PeftnlysC"""构建体对赖氨酸生产的作用，在30。C下将菌林ATCC13032、ATCC13032lysC^或ATCC13032PeftulysC"^于CM平板(10.0g/1D-葡萄糖、2.5g/1NaCl、2.0g/l尿素、10.0g/1细菌用胰蛋白胨(Difco)、5.0g/1酵母提取物(Difco)、5.0g/1牛肉膏(Difco)、22.0g/1琼脂(Difco)，经高压灭菌(121t:下20分钟))上培养2天。接着将细胞从平板上刮下并悬浮于盐水中。就主要培养物而言，将10ml培养基I及0.5g经高压灭菌的CaC03(RiedeldeHaen)置于100mlErlenmeyer烧瓶中，用细胞悬浮液接种直至OD咖为1.5，在InforsAJ118(来自Infors，Bottmingen，瑞士)型摇床上于220转/分培养39小时。然后确定分泌至培养基中的赖氨酸浓度。培养基I:40g/1蔗糖60g/1糖蜜(以100。/。糖含量计算)10g/1(NH4)2S。40.4g/1MgS04.7H200.6g/1KH2P040.3mg/1疏胺'HCl1mg/1生物素(来自1mg/ml储存溶液，该储存溶液已通过过滤除菌并用NH4OH调整至pH8.0)2mg/1FeS042mg/1MnS04用NEUOH调整至pH7.8，高压灭菌(121。C,20分钟)。此外，加入维生素Bu(羟钴胺素，SigmaChemicals)储存溶液(200Hg/ml，通过过滤除菌)直至维生素Bu终浓度为100pg/l。在Agilent1100系列LC系统HPLC上通过Agilent高压液相层析测定氨基酸浓度。用邻苯二甲醛进行柱前衍生化作用允许对所形成的氨基酸进行定量，并且在HypersilAA柱(Agilent)上将氨基酸混合物分级分离。研究结果示于表3a。表3a<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>序列表〈110>巴斯福股份公司(BASFAktiengesellschaft)<120>PEF-TU表达单元〈130〉PF55183/Mec〈140〉20030320<141>〈160〉42<210〉1<211〉186〈212〉D，<213〉谷氨酸棒杆菌(Corynebacteri咖glutamicum)<220〉〈223〉EFTIARXA01284X启动子<400〉1ggccgttaccctgcgaatgtccacagggtagctggtagtttgaaaatcaacgccgttgcc60cttaggattcagtaactggcacattttgtaatgcgctagatctgtgtgctcagtcttcca120ggctgcttatcacagtgaaagcaaaaccaattcgtggctgcgaaagtcgtagccaccacg180aagtcc186<210>2<211〉199<212〉DNA<213〉谷氨酸棒杆菌〈220〉<223>EFTIARXA0128A全部<400>2ggccgttaccctgcgaatgtccacagggtagctggtagtttgaaaatcaacgccgttgcc60cttaggattcagtaactggcacattttgtaatgcgctagatctgtgtgctcagtcttcca120ggctgcttatcacagtgaaagcaaaaccaattcgtggctgcgaaagtcgtagccaccacg180aagtccaggaggacataca199〈210〉3<211〉1365<212〉腿<213>谷氨酸棒杆菌〈220〉〈223〉RXA00077<400〉3atgaatgstg3g犯t3ttcaaagctccaactatxagccattcccgagttttgacgattgg60aaacagatcgaggtgtcgctcttagatgtcatcgaatcctcacgccatttttctgatttg120ctgatcgttctgcgttagatgctgcgctagEiagagctgcc180gcagttgataccaatgccatag犯ggaatcttccaaactgatcgcggttttacccataca240gttgcaacgc鄉taggggcttgggagc已acaaatggcgatgaaaggcaaacatgttaag300cctgcgtttgacgatactctsgaaggctttgagtatgttctcgatgcagtaactggtaga360actccaatctctcagca^tggattaga^tttgcacgccgtcattctgcggagccaagaa420agccacgaggtttttacagccgttggagtcc犯犯tcaggcgcttcagaaaggcgagtat480aaaactcagccaaatagtccacagcgctcagatggatctgtacstgcatacgccccagtt540g犯gatactcctgctgaaatggctagatttatttcagaacttgaatctaaggaattctta600gcagccg卿agctgcctatgcccactatgctttxgtatgtattcatcct660tttgcagatggg犯tgg3Cgagttgcacgagccttggctagtgtttttctatacaaagat720cctgg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sCysMetGlyPheGluArgGin250LeuHisThrAsn265ThrGlyValThr280AsnGlyAlaThr295lieArgHislieSerValValAsp330AlaGlyGly235LysAspAsnThrGlu315TyrAlaThr220GluAlaLeuGlyArg300SerThrAla205190GinAspProGluGlylieHisValAsp285SerGinAspSer270MetLeuGlyAla255SerLeuValSerlielie240GlyAspArgMetValHisGinLeu320ThrAlaThr335<210>39<211>6<212>■<213>谷氨酸棒杆菌<220>〈223〉POTENTIELLE—-10-区—1<400>39tagttt6<210>40<211>6<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><223>POTENTIELLE—-10-区—2<400>40taggat6<210〉41<211>6〈212>腿<213>谷氨酸棒杆菌<220><223〉POTENTIELLE_-10-区—3〈400>41tgcgct<210>42<211>7〈212〉DNA〈213〉谷氨酸棒杆菌<220>〈223>RIBOSOMALE〈400〉42aggagga权利要求1.一种具有启动子活性的核酸在基因转录中的用途，所述核酸包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通过核苷酸替代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.1衍生并且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C)在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.1杂交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段。2.—种表达单元在基因表达中的用途，所述表达单元包含根据权利要求l所述的具有启动子活性的核酸以及额外的功能性连接的核酸序列，其中所述核酸序列确保核糖核酸的翻译。3.根据权利要求2所迷的用途，其中所述表达单元包含E)核酸序列SEQ.ID.N0.2，或F)通过核苷酸替代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.2衍生并且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.2具有至少90。/。同一性的序列，或G)在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.N0.2杂交的核酸序列，或H)E)、F)或G)序列的功能等效片段。4.根据权利要求3所述的用途，其中所述表达单元由核酸序列SEQ.ID.NO.2组成。5.—种具有启动子活性的核酸，其包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通过核苷酸替代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.l衍生并且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.l具有至少90。/。同一性的序列，或C)在严格条件下与核酸序歹'jSEQ.ID.NO.l杂交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段，其前提条件是排除包含序列SEQ.ID.NO.l的核酸。6.—种表达单元，其包含根据权利要求5所述的具有启动子活性的核酸以及额外的功能性连接的核酸序列，其中所述核酸序列确保核糖核酸的翻译。7.根据权利要求6所述的表达单元，其包含E)核酸序列SEQ.ID.N0.2，或F)通过核苷酸替代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.2衍生并且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.2具有至少90%同一性的序列，或G)在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.N0.2杂交的核酸序列，或H)E)、F)或G)序列的功能等效片段，其前提条件是排除包含序列SEQ.ID.N0.2的核酸。8.—种与野生型相比，改变或影响微生物中基因转录速率的方法，其通过以下方式实现a)与野生型相比，改变根据权利要求l所述的具有启动子活性的内源核酸在孩i生物中的特异启动子活性，所述内源核酸调节内源基因的转录，或b)通过根据权利要求l所述的具有启动子活性的核酸，或者通过具有根据实施方案a)所述改变的特异启动子活性的权利要求l所述具有启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录，其中所述基因相对于所述具有启动子活性的核酸而言是异源的。9.根据权利要求8所述的方法，其中通过根据权利要求l所述的具有启动子活性的核酸或者通过具有根据实施方案a)所述改变的特异启动子活性以下方式实现bl)将一种或多种根据权利要求l所述的具有启动子活性、于适当条件下具有改变的特异启动子活性的核酸导入微生物基因組中，以便在所导入的根据权利要求1所述的具有启动子活性、于适当条件下具有改变的特异启动子活性的核酸控制下进行一种或多种内源基因的转录，或b2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在根据权利要求l所述的具有启动子活性、于适当条件下具有改变的特异启动子活性的内源核酸控制下进行一种或多种所导入基因的转录，或b3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含根据权利要求1所述的具有启动子活性、于适当条件下具有改变的特异启动子活性的核酸以及功能性连接的一种或多种待转录核酸。10.根据权利要求8或9所述的方法，其中与野生型相比，为了提高或影响微生物中基因的转录速率，ah)与野生型相比，根据权利要求l所述的具有启动子活性的内源核酸在微生物中的特异启动子活性是增加的，所述内源核酸调节内源基因的转录，或bh)通过根据权利要求l所述的具有启动子活性的核酸，或者通过具有根据实施方案a)所述增加的特异启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录，其中所述基因相对于所述具有启动子活性的核酸而言是异源的。11.根据权利要求10所述的方法，其中通过根据权利要求l所述的具有启动子活性的核酸或者通过具有根据实施方案a)所述增加的特异启动子通过以下方式实现bhl)将一种或多种根据权利要求l所述的具有启动子活性、于适当条件下具有增加的特异启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在所导入的根据权利要求1所述的具有启动子活性、于适当条件下具有增加的特异启动子活性的核酸控制下进行一种或多种内源基因的转录，或bh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在根据权利要求l所述的具有启动子活性、于适当条件下具有增加的特异启动子活性的内源核酸控制下进行一种或多种所导入基因的转录，或bh3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含根椐权利要求1所述的具有启动子活性、于适当条件下具有增加的特异启动子活性的核酸以及功能性连接的一种或多种待转录核酸。12.根据权利要求8或9所述的方法，其中与野生型相比，为了降低微生物中基因的转录速率，ar)与野生型相比，根据权利要求l所述的具有启动子活性的内源核酸在微生物中的特异启动子活性是降低的，所述内源核酸调节内源基因的转录，或br)将具有根据实施方案a)所述的降低的特异启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在所述导入的具有降低的启动子活性的核酸控制下进行内源基因的转录。13.—种与野生型相比，改变或影响微生物中基因表达速率的方法，其通过以下方法实现c)与野生型相比，改变根据权利要求2或3所述的内源表达单元在微生物中的特异表达活性，所述内源表达单元调节内源基因的表达，或d)通过根据权利要求2或3所述的表达单元，或者通过具有根据实施方案c)所述改变的特异表达活性的权利要求2或3所述表达单元来调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于所述表达单元而言是异源的。14.根据权利要求13所述的方法，其中通过根据权利要求2或3所述的表达单元，或者通过具有根据实施方案a)所述改变的特异表达活性的权利dl)将一种或多种于适当条件下具有改变的特异表达活性的根据权利要求2或3所述的表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或d2)将一种或多种基因导入微生物基因組中，以便在于适当条件下具行一种或多种所导入基因的表达，或^^、，、；'、，.、，d3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。15.根据权利要求13或14所述的方法，其中与野生型相比，为了提高或影响微生物中基因的表达速率，ch)与野生型相比，根据权利要求2或3所述的内源表达单元在微生物中的特异表达活性是增加的，所述内源表达单元调节所述内源基因的表达，或dh)通过根据权利要求2或3所述的表达单元，或者通过具有根据实施方案a)所述增加的特异表达活性的权利要求2或3所述表达单元来调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于所述表达单元而言是异源的。16.根据权利要求15所述的方法，其中通过根据权利要求2或3所述的表达单元，或者通过具有根据实施方案a)所迷增加的特异表达活性的权利dhl)将一种或多种于适当条件下具有增加的特异表达活性的根据权利要求2或3所述的表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的于适当条件下具有增加的特异表达活性的表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或dh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在于适当条件下具有增加的特异表达活性的根据权利要求2或3所述的内源表达单元控制下进行一种或多种所导入基因的表达，或dh3)将一种或多种核酸构建体导入^t生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有增加的特异表达活性的根据权利要求2或3所述的表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。17.根据权利要求13或14所述的方法，其中与野生型相比，为了降低微生物中基因的表达速率，cr)与野生型相比，根据权利要求2或3所述的内源表达单元在微生物中的特异表达活性是降低的，其中所述内源表达单元调节所述内源基因的表达，或dr)将根据实施方案cr)所述具有降低的特异表达活性的表达单元导入微生物基因组中，以便在所述导入的具有降低的表达活性的表达单元控制下进行内源基因的表达。18.根据权利要求8-17中任一项所述的方法，其中所述基因选自编码生蛋白与非生蛋白氨基酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码核苷酸与核苷生物合成途径的蛋白质的核酸、编码有机酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码脂类与脂肪酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码二元醇生物合成途径的蛋白质的核酸、编码糖类生物合成途径的蛋白质的核酸、编码芳香化合物生物合成途径的蛋白质的核酸、编码维生素生物合成途径的蛋白质的核酸、编码辅因子生物合成途径的蛋白质的核酸及编码酶生物合成途径的蛋白质的核酸，其中所述基因还任选包含其它调节元件。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述来自氨基酸生物合成途径的蛋白质选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氬酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸异构酶、转录调节物LuxR、转录调节物LysRl、转录调节物LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮酶、转.醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱疏醚Y合酶、胱硫醚P裂合酶、丝氨酸羟曱基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、苏氨酸输出子载体、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出子、生物素连接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、辅酶B12依赖型曱硫氨酸合酶、非辅酶B12依赖型曱硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节物、RXN2910调节物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸排出蛋白、丝氨酸羟甲基转移酶、果糖-l，6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247、蛋白质OpcA、l-磷酸杲糖激酶及6-磷酸果糖激酶。20.—种表达盒，其包含a)至少一种根据权利要求2或3所述的表达单元，及b)至少一种其它待表达核酸，及c)于适当条件下的的其它遗传控制元件，其中至少一种表达单元与其它待表达核酸序列功能性连接在一起，且所述其它待表达核酸序列相对于所述表达单元二元是异源的。21.根据权利要求20所述的表达盒，其中所述其它待表达核酸序列选自编码生蛋白与非生蛋白氨基酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码核苷酸与核苷生物合成途径的蛋白质的核酸、编码有机酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码脂类与脂肪酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码二元醇生物合成途径的蛋白质的核酸、编码糖类生物合成途径的蛋白质的核酸、编码芳香化合物生物合成途径的蛋白质的核酸、编码维生素生物合成途径的蛋白质的核酸、编码辅因子生物合成途径的蛋白质的核酸及编码酶生物合成途径的蛋白质的核酸。22.根据权利要求21所述的表达盒，其中所述来自氨基酸生物合成途径的蛋白质选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氪酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸异构酶、转录调节物LuxR、转录调节物LysRl、转录调节物LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氩酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱硫醚Y合酶、胱硫醚P裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚曱基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、苏氨酸输出子载体、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出子、生物素连接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、非辅酶B12依赖型甲疏氨酸合酶、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节物、RXN2910调节物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸排出蛋白、丝氨酸鞋甲基转移酶、果糖-l，6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077、疏酸盐还原作用的蛋白质RXA248、石克酸盐还原作用的蛋白质RXA247、蛋白质OpcA、l-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。23.—种表达载体，其包含根据权利要求20至22中任一项所迷的表达盒。24.—种基因修饰微生物，其中所述基因修饰导致与野生型相比，改变或影响至少一种基因的转录速率，并取决于a)改变微生物中至少一种根据权利要求l所述的具有启动子活性的内源核酸的特异启动子活性，所述内源核酸调节至少一种内源基因的转录，或b)通过根据权利要求l所述的具有启动子活性的核酸，或者通过具有根据实施方案a)所述改变的特异启动子活性的权利要求l所述具有启动子活性的核酸来调节微生物中基因转录，其中所述基因相对于所述具有启动子活性的核酸而言是异源的。25.根据权利要求24所述的基因修饰微生物，其中通过根据权利要求l所述的具有启动子活性的核酸，或者通过具有根据实施方案a)所述改变的转录的调节通过以下方式实现bl)将一种或多种根据权利要求l所述的具有启动子活性、于适当条件下具有改变的特异启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在所导入的根据权利要求1所述的具有启动子活性、于适当条件下具有改变的特异启动子活性的核酸控制下进行一种或多种内源基因的转录，或b2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在根据权利要求l所述的具有启动子活性、于适当条件下具有改变的特异启动子活性的内源核酸控制下进行一种或多种所导入基因的转录，或b3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含根据权利要求1所迷的具有启动子活性、于适当条件下具有改变的特异启动子活性的核酸以及功能性连接的一种或多种待转录核酸。26.根据权利要求24或25所述的基因修饰微生物，其与野生型相比，至少一种基因具有提高或影响的转录速率，其中ah)与野生型相比，根据权利要求l所述的具有启动子活性的内源核酸在微生物中的特异启动子活性是增加的，其中所述内源核酸调节内源基因的转录，或bh)通过根据权利要求l所述的具有启动子活性的核酸，或者通过具有根据实施方案ah)所述增加的特异启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录，其中所述基因相对于所述具有启动子活性的核酸而言是异源的。27.根据权利要求26所述的基因修饰微生物，其中通过根据权利要求l所述的具有启动子活性的核酸，或者通过具有根据实施方案a)所述增加的转录的调节通过以下方式实现bhl)将一种或多种根据权利要求l所述的具有启动子活性、于适当条件下具有增加的特异启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在所导入的具有启动子活性、于适当条件下具有增加的特异启动子活性的核酸控制下进行一种或多种内源基因的转录，或bh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在根据权利要求l所述的具有启动子活性、于适当条件下具有增加的特异启动子活性的内源核酸控制下进行一种或多种所导入基因的转录，或bh3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含根据权利要求1所述的具有启动子活性、于适当条件下具有增加的特异启动子活性的核酸以及功能性连接的一种或多种待转录核酸。28.根据权利要求24或25所述的基因修饰微生物，其与野生型相比，至少一种基因具有降低的转录速率，其中ar)与野生型相比，至少一种根据权利要求l所述的具有启动子活性的内源核酸在微生物中的特异启动子活性是降低的，其中所述内源核酸调节至少一种内源基因的转录，或br)将一种或多种具有根据实施方案a)所述的降低的启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在所述导入的具有降低的启动子活性的核酸控制下进行至少一种内源基因的转录。29.—种基因修饰微生物，其中所述基因修饰导致与野生型相比，改变或影响至少一种基因的表达速率，并取决于c)与野生型相比，改变根据权利要求2或3所述的至少一种内源表达单元在微生物中的特异表达活性，其中所述内源表达单元调节至少一种内源基因的表达，或d)通过根据权利要求2或3所述的表达单元，或者通过具有根据实施方案a)所述改变的特异表达活性的权利要求2或3所述表达单元来调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于所述表达单元而言是异源的。30.根据权利要求29所述的基因修饰微生物，其中通过根据权利要求2或3所述的表达单元，或者通过具有根据实施方案a)所述改变的特异表达式实现dl)将一种或多种于适当条件下具有改变的特异表达活性的根据权利要求2或3所述表达单元导入微生物基因组中，以便在所述导入的于适当进行一种或多种内源基因的表达，或d2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在所述于适当条件进行一种或多种所导入基因的表达，或d3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于及功能性连接的一种或多种待表达核酸。31.根据权利要求29或30所述的基因修饰微生物，其与野生型相比，至少一种基因具有提高或影响的表达速率，其中ch)与野生型相比，根据权利要求2或3所述的至少一种内源表达单元在微生物中的特异表达活性是增加的，其中所述内源表达单元调节内源基因的表达，或dh)通过根据权利要求2或3所述的表达单元，或者通过具有根据实施方案a)所述增加的特异表达活性的权利要求2或3所述表达单元来调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于所述表达单元而言是异源的。32.根据权利要求31的基因修饰微生物，其中通过根据权利要求2或3所述的表达单元，或者通过具有根据实施方案a)所述增加的特异表达活性现dhl)将一种或多种于适当条件下具有增加的特异表达活性的根据权利要求2或3所述表达单元导入微生物基因組中，以便在所导入的于适当条件下具有增加的特异表达活性的根据权利要求2或3所述表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或dh2)将一种或多种基因导入微生物基因組中，以便在于适当条件下具有增加的特异表达活性的根据权利要求2或3所述内源表达单元控制下进行一种或多种所导入基因的表达，或dh3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所迷核酸构建体包含于适当条件下具有增加的特异表达活性的根据权利要求2或3所述表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。33.根据权利要求29或30所述的基因修饰微生物，其与野生型相比，至少一种基因具有降低的表达速率，其中cr)与野生型相比，根据权利要求2或3所述的至少一种内源表达单元在微生物中的特异表达活性是降低的，其中所述内源表达单元调节至少一种内源基因的表达，或dr)将一种或多种具有降低的表达活性的根据权利要求2或3所述表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的具有降低的表达活性的权利要求2或3所述表达单元控制下进行至少一种基因的表达。34.—种基因修饰微生物，其包含根据权利要求2或3所述的表达单元以及功能性连接的待表达基因，其中所述基因相对于所述表达单元而言是35.根据权利要求34所述的基因修饰微生物，其包含根据权利要求20至22中任一项所述的表达盒。36.根据权利要求24-35中任一项所述的基因修饰微生物，其中所述码核苷酸与核苷生物合成途径的蛋白质的核酸、编码有机酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码脂类与脂肪酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码二元醇生物合成途径的蛋白质的核酸、编码糖类生物合成途径的蛋白质的核酸、编码芳香化合物生物合成途径的蛋白质的核酸、编码维生素生物合成途径的蛋白质的核酸、编码辅因子生物合成途径的蛋白质的核酸及编码酶生物合成途径的蛋白质的核酸，其中所述基因还任选包含其它调节元件。37.根据权利要求36所述的基因修饰微生物，其中所述来自氨基酸生物合成途径的蛋白质选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸异构酶、转录调节物LuxR、转录调节物LysRl、转录调节物LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱硫醚Y合酶、胱硫醚P裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、苏氨酸输出子载体、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出子、生物素连接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、非辅酶B12依赖型曱硫氨酸合酶、硫酸腺普酰转移酶亚基1和2、磷酸腺苦-磷酰碌u酸还原酶、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节物、RXN2910调节物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸排出蛋白、丝氨酸羟曱基转移酶、果糖-l，6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247、蛋白质OpcA、l-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。38.—种通过培养根据权利要求24-37中任一项所述的基因修饰微生物来制备生物合成产物的方法。39.—种通过培养根据权利要求24、25、31或32中任一项所述的基因修饰微生物来制备赖氨酸的方法，其中所述基因选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸、编码二氨基庚二酸脱氢酶的核酸、编码二氨基庚二酸脱羧酶的核酸、编码二氢吡啶二羧酸合成酶的核酸、编码二氢吡啶二羧酸还原酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码丙糖磷酸异构酶的核酸、编码转录调节物LuxR的核酸、编码转录调节物LysRl的核酸、编码转录调节物LysR2的核酸、编码苹果酸-醌氧化还原酶的核酸、编码葡萄糖-6-磷酸脱氩酶的核酸、编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的核酸、编码转酮酶的核酸、编码转醛酶的核酸、编码赖氨酸输出子的核酸、编码生物素连接酶的核酸、编码精氨酰-tRNA合成酶的核酸、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、编码杲糖-l，6-二磷酸酶的核酸、编码蛋白质OpcA的核酸、编码l-磷酸果糖激酶的核酸及编码6-磷酸果糖激酶的核酸。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述基因修饰微生物与野生型相比，额外具有增加的下列活性中的至少一种，所述活性选自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸半醛脱氢酶活性、二氨基庚二酸脱氢酶活性、二氨基庚二酸脱羧酶活性、二氩吡啶二羧酸合成酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氩酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸异构酶活性、转录调节物LuxR的活性、转录调节物LysRl的活性、转录调节物LysR2的活性、苹果酸-醌氧化还原酶活性、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性、转酮酶活性、转醛酶活性、赖氨酸输出子活性、精氨酰-tRNA合成酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、果糖-l，6-二磷酸酶活性、蛋白质OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性及生物素连接酶活性。41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述基因修饰微生物与野生型相比，额外具有降低的下列活性中的至少一种，所述活性选自苏氨酸脱水酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、O-乙酰-高丝氨酸硫化氢解酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、高丝氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、苏氨酸输出子活性、苏氨酸排出蛋白活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性及苏氨酸合酶活性。42.—种通过培养根据权利要求24、25、31或32中任一项所述的基因修饰微生物来制备甲硫氨酸的方法，其中所述基因选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸、编码高丝氨酸脱氢酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码丙糖磷酸异构酶的核酸、编码高丝氨酸O-乙酰转移酶的核酸、编码胱硫醚Y合酶的核酸、编码胱硫醚P裂合酶的核酸、编码丝氨酸幾曱基转移酶的核酸、编码O-乙酰高丝氨酸疏化氢解酶的核酸、编码亚甲基四氢叶酸还原酶的核酸、编码磷酸丝氨酸氨基转移酶的核酸、编码磷酸丝氨酸磷酸酶的核酸、编码丝氨酸乙酰转移酶的核酸、编码半胱氨酸合酶I的核酸、编码半胱氨酸合酶II的核酸、编码辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶的核酸、编码非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶的核酸、编码硫酸腺苷酰转移酶的核酸、编码磷酸腺苷磷酰疏酸还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白NADPH-还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白的核酸、编码硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077的核酸、编码硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248的核酸、编码硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247的核酸、编码RXA0655调节物的核酸及编码RXN2910调节物的核酸。43.根据权利要求42所述的方法，其中所述基因修饰微生物与野生型相比，额外具有增加的下列活性中的至少一种，所述活性选自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸半醛脱氬酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸异构酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、胱硫醚Y合酶活性、胱硫醚P裂合酶活性、丝氨酸羟曱基转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、亚甲基四氢叶酸还原酶活性、磷酸丝氨酸氨基转移酶活性、磷酸丝氨酸磷酸酶活性、丝氨酸乙酰转移酶活性、半胱氨酸合酶I活性、半胱氨酸合酶II活性、辅酶B12依赖型曱硫氨酸合酶活性、非辅酶B12依赖型曱硫氨酸合酶活性、硫酸腺苷酰转移酶活性、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶活性、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶活性、铁氧还蛋白NADPH-还原酶活性、铁氧还蛋白活性、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077的活性、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248的活性、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247的活性、RXA655调节物的活性及RXN2910调节物的活性。44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述基因修饰微生物与野生型相比，额外具有降低的下列活性中的至少一种，所述活性选自高丝氨酸激酶活性、苏氨酸脱水酶活性、苏氨酸合酶活性、内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氢吡咬二羧酸合酶活性、二氢吡咬二羧酸还原酶活性及二氨基吡啶曱酸脱羧酶活性。45.—种通过培养根据权利要求24、25、31或32中任一项所述的基因修饰微生物来制备苏氨酸的方法，其中所述基因选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码丙糖磷酸异构酶的核酸、编码高丝氨酸激酶的核酸、编码苏氨酸合酶的核酸、编码苏氨酸输出子载体的核酸、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸、编码转醛酶的核酸、编码转酮酶的核酸、编码苹果酸-醌氧化还原酶的核酸、编码6-磷酸葡糖酸脱氩酶的核酸、编码赖氨酸输出子的核酸、编码生物素连接酶的核酸、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、编码苏氨酸排出蛋白的核酸、编码果糖-l，6-二磷酸酶的核酸、编码OpcA蛋白质的核酸、编码l-磷酸果糖激酶的核酸、编码6-磷酸果糖激酶的核酸及编码高丝氨酸脱氢酶的核酸。46.根据权利要求45所述的方法，其中所述基因修饰微生物与野生型相比，额外具有增加的下列活性中的至少一种，所述活性选自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸半趁脱氩酶活性、甘油醛-3-彿酸脱氩酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸异构酶活性、苏氨酸合酶活性、苏氨酸输出子载体活性、转醛酶活性、转酮酶活性、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、苹果酸-醌氧化还原酶活性、高丝氨酸激酶活性、生物素连接酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、苏氨酸排出蛋白活性、蛋白质OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性、果糖-l，6-二磷酸酶活性、6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性及高丝氨酸脱氢酶活性。47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述基因修饰微生物与野生型相比，额外具有降低的下列活性中的至少一种，所述活性选自苏氨酸脱水酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、丝氨酸羟甲基转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氲吡啶二羧酸合成酶活性、二氩吡啶二羧酸还原酶活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性、赖氨酸输出子活性、乙酰乳酸合酶活性、乙酮醇-酸还原异构酶活性、支链氨基转移酶活性、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、二羟基-酸脱水酶活性及二氨基吡啶甲酸脱羧酶活性。48.根据权利要求38-47中任一项所述的方法，其中所述生物合成产物是在培养步骤后和/或培养步骤期间中从培养基中分离的并且在适当条件下是从培养基中纯化的。49.核,列SEQ.ID.NO.42的用途，其用作能使基因在棒杆菌属(Corynebacterium)或短杆菌属(Brevibacterium)纟田菌中表达的表达单元中的核糖体结合位点。50.核酸序列SEQ.ID.N0.39、40或41的用途，其用作能使基因在棒杆菌属或短杆菌属细菌中表达的表达单元中的-10区。51.—种能使基因在棒杆菌属或短杆菌属细菌中表达的表达单元，其包含核酸序列SEQ.ID.NO.42。52.根据权利要求51所述的表达单元，其中所述核酸序列SEQ.ID.NO.42用作核糖体结合位点。53.—种能使基因在棒杆菌属或短杆菌属细菌中表达的表达单元，其包含核酸序列SEQ.ID.NO.39、40或41中的至少一种。54.才艮据权利要求53所述的表达单元，其中所述核酸序列SEQ.ID.NO.39、40或41用作-10区。全文摘要本发明涉及用于调节基因转录和表达的核酸序列的用途、新启动子及其表达单元、用于改变或影响基因转录速率和/或表达速率的方法、包含该表达单元的表达盒、具有改变的或受影响的转录速率和/或表达速率的基因修饰微生物及通过培养该基因修饰微生物来制备生物合成产物的方法。文档编号C12N1/00GK101255419SQ20081000895公开日2008年9月3日申请日期2004年12月15日优先权日2003年12月18日发明者B·克勒格尔,C·克洛普罗格,H·施罗德,O·策尔德尔,S·哈夫纳申请人:巴斯福股份公司