专利名称：一种鉴定水稻香味的方法及与香味性状共分离的分子标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴定水稻香味的方法及与香味性状共分离的分子标记， 属分子遗传学领域，专用于水稻香味品种的选育与遗传研究，并可用于克隆 香味基因。
技术背景香味是水稻重要的食味品质性状。许多优良的水稻品种具有令人愉快的 香气，备受消费者的欢迎，世界上每个水稻生产国或地区均有香稻种植。目前对香味的测定方法主要有咀嚼籽粒法、氢氧化钾法、高效液相色谱 法，前两种方法是通过嗅觉来进行的，咀嚼籽粒法大批量鉴定时会对舌头和 鼻子造成影响，氢氧化钾法对香味的释放也有一定的局限性，鉴定不准。高 效液相色谱为香味的测定提供了客观的方法，但该方法需要大批的样品量，而且费时(Jin et a7. ， 2003)。在香稻选育方面，利用分子标记辅助选择可以准确、简单、快速地选育 香稻。许多研究者对香味基因的遗传分析和定位进行了研究，并为香稻育种 提供了一些有用的分子标记，但是目前所利用的分子标记距离较远，对香味 不能准确鉴定。到目前为止，大部分研究表明稻米香味是受一个隐性单基因控制的。Ahn "a丄(1992)利用一对近等基因系Lemont和香Lemont，香Lemont的香味基 因来自供体Della，以有香味分离的F3群体为材料，通过RFLP分析表明，香味 基因与位于第8染色体上的RG28连锁，遗传距离为4.5cM。李欣等(1995)以籼型及粳型标记基因系为材料，分别与武进香籼、武进香粳杂交，以碱浸法 测定双亲和F,、 F2、及部分F3组合的叶香，结果表明香味基因与位于第8染色体上的标记基因r-凍现连锁，估算两者的重组值约为38. 03% ±3.8496。 Jin W a丄(1995)用CT9993/KDML105的F2分离群体为材料，找到一个RAPD引物，这 个引物只在非香群体中扩增到1.5kb片段，并表现与香味性状紧密连锁，用该 引物对两亲本、F2分离群体单株和其它不同品种进行分析，进一步证明了这种 多态的可靠性。Lorieux " s丄(1996)以DH群体为材料，利用RFLP、 RAPD、 STS和同工酶标记及气相色谱测定AcPy的浓度，证实了AcPy是香味的主要成 分，且香味基因与RG28相连锁，距离为5.8cM,同时鉴定出2个QTL， 一个位于 第4染色体，另一个位于第12染色体。Garland " a丄(2000)根据RG28在一对香稻与非香稻品种之间的多态性区域发展了一个微卫星标记 SCU-RICE-SSR-1 ，并选择附近区域的4个SSR标记对24个香稻和非香品种进行 标记的多态信息量分析，研究表明，SCU-RICE-SSR-1、 RM42和RM223可以用来 区别不同品种中的香味基因的复等位基因。Jin " a, (2003)找到了一个 与香味基因连锁的SNP标记RSP04,用RSP04对50个单株构成的F2分离群体进行 基因型分析，发现RSP04与香味基因之间有两个重组株，RSP04与香味基因相 距2cM;用RSP04对另外一个163个单株构成的F2分离群体进行基因型分析，发 现RSP04与香味基因之间有6个重组株，RSP04与香味基因相距约2cM。 Dong " a丄(2001)对三个日本当地香稻品种的三体遗传分析表明，这三个香稻品种 的香味是由一个隐性基因控制的，均属等位基因，位于第8染色体上。Siddiq "W. (1986)对一个印度品种进行三体遗传分析，发现有两个隐性香味基 因，分别位于第5和第9染色体。Chen等(2006)把香味基因座定位在一个69kb 的区间内。施军琼(2004)利用单片段代换系对香味基因进行了初步定位， 在两个分离群体中香味基因均与RM223共分离，在以Basmati 385为供体的分 离群体中，香味基因距两侧标记RM515和RM284分别为2.7cM和3.3cM，在以美 国茉莉香为供体的分离群体中，香味基因距两侧标记RM515和RM210分别为 2.9cM和11.8cM。利用分子标记对水稻香味基因的分子标记辅助选择的技术国内外均有报道，但迄今为止，关于水稻香味基因共分离的标记还未见报道，利用TPS溶液 鉴定香味性状也是第一次报道。我国香稻资源丰富，从不同的水稻品种中发掘、鉴定和定位香味基因， 找到鉴定香味性状准确可靠的方法，克服目前咀嚼法、KOH法和仪器分析法鉴 定香味中不准的缺点，建立共分离的香味基因分子标记，并利用与香味基因 共分离的分子标记进行辅助育种，判断香味基因是以杂合和纯合存在，能准 确地选择在香味基因座上纯合和杂合的具有优异性状单株，而且能够有目标 地将香味基因在实验室选择得到，大大提高选择的效率。 发明内容本发明的目的是克服现有鉴定水稻香味的方法的不足之处，而提供一种 鉴定水稻香味的方法，以及为分子标记进行辅助育种提供一种与香味性状共 分离的分子标记，提高选育效率。本发明该种鉴定水稻香味的方法如下(1) 在分蘖期取水稻单株上部l-2片幼叶，保存于-8(TC冰箱中备用；(2) 取2-4cm长的水稻叶片放入1.5ml离心管中，放入液氮，研碎，加 TPS溶液900 u 1， 75。C水浴20分钟；其中TPS溶液为lOOraM Tris-HCl (pH8. 0)， 10mM EDTA(pH8.0)， 1M KC1;(3) 打开盖，用鼻闻，即可判定香味的有无。 本发明所提供的与香味性状共分离的分子标记，是由 特异性PCR引物LOl上游端自5， 一3，的核苷酸序列为CCTTTGTGGTATTCCGTTGTT 下游端自5， 一3'的核苷酸序列为GTGTGCACTGGTCACTGTTTT 或特异性PCR引物L02上游端自5， 一3，的核苷酸序列为ATGTTTTAGTGTTTTTTCAGGCT 下游端自5， 一3'的核苷酸序列为CCAGACATMATAATGGCATCTT经PCR扩增水稻基因组DNA得到的。其中引物L01在香粳9407中扩增出 280bp的特异片段，在IRBB60中扩增出271bp的特异片段。引物L02在香粳 9407中扩增出210bp的特异片段，在IRBB60中扩增出200bp的特异片段。利用本发明提供的鉴定水稻香味的方法对曲阜香稻、明水香稻、香粳9407 (均为公知公用品种，国家种子库均有保存，可对外提供)分别和水稻品种 IRBB60 (公知公用品种，国家种子库均有保存，可对外提供)杂交的F2分离 群体进行香味性状鉴定。在分蘖期取水稻单株上部1-2片幼叶，保存于-8(TC 冰箱中备用。取2-4cm长的水稻叶片放入1.5ml离心管中，放入液氮，研碎， 加TPS溶液900ul， 75。C水浴20分钟。打开盖，用鼻闻，可准确判定香味的 有无。TPS溶液配方lOOmM Tris-HCl (pH8. 0) ， 10mM EDTA(pH8. 0) ， 1M KC1。此外本发明人设计出了 2对特异性的PCR引物，它能对水稻苗期香味性 状进行标记鉴定，检测是否具有香味基因/《r，其检测的准确性高，操作简单。 由于曲阜香稻、明水香稻、香粳9407是普遍应用的杂交品种的亲本，因此该 分子标记还具有检测是否具有香味性状的普遍意义，可以作为其他以香稻品 种作为亲本育种材料的检测工具。本发明该种鉴定水稻香味的方法及与香味性状共分离的分子标记，具有 以下优点(1) 利用本发明鉴定水稻香味的方法(TPS法)鉴定水稻香味，简单易 行，准确方便。利用KOH法不能准确判定香味性状的单株，利用TPS法可准 确判定。(2) 标记稳定，不受环境影响。通过本发明设计的特异性PCR引物，2007 年在不同生育期取样，用这两标记进行检测，标记表现稳定，不受环境影响。(3) 辅助育种选择目标明确，节约成本。通过PCR标记的扩增，可以判 定香味基因是以纯合或杂合状态基因型存在的单株，加快香味性状分子标记 辅助育种，大大提高选择的效率。
图1:标记L01对香粳9407X IRBB60杂交的F2代分子标记辅助选择电泳图谱M为Marker, Pl，香粳9407; P2， IRBB60; 1-20， &分离单株。图2 :标记L02对香粳9407 XIRBB60杂交的F2代分子标记辅助选择电泳图谱M为Marker, Pl，香粳9407; P2， IRBB60; 1-20， &分离单株。
具体实施方式
1、 F2群体的创建和表型鉴定2005年利用曲阜香稻、明水香稻、香粳9407分别与IRBB60杂交，年底 F,种子送海南岛三亚加代，自交产生F2种子。2006年将F2分离群体播种于山 东省水稻研究所实验农场，5月1号播种，6月20号插秧，单株插植。插秧 20天抽提F2分离群体的单株DNA，并利用本发明鉴定水稻香味的方法(TPS 法)鉴定水稻单株的香味性状，分有香味和无香味两种表型，每个分离群体 种植3000株，共9000株。2、 F2分离群体的分子标记分析(1) 用CTAB法提取曲阜香稻/IRBB60、明水香稻/IRBB60、香粳 9407/IRBB60杂交的&各单株DNA。(2) SSR分析参照Panaudetal. (1996)的方法。20^1 PCR反应体系为: 模板DNA10ng/nl， 0. 15^11 lOmMdNTPs， 1. 5个单位的7^酶，2 |al 10XPCR buf f er (含MgCl2) ， 1. 5 pl的2 uM正向和反向引物，反应体积20^1。 PCR 反应程序为DNA94。C预变性5min，然后94°C变性1 min， 55'C退火lmin， 72。C延伸lmin，最后72。C延伸5min。在PTC-200PCR仪上进行扩增，扩增产 物在6%聚丙烯酰胺胶上进行分离电泳，银染参照李文涛等(2002)的方法进行 显色观察，记录实验结果。(3) 水稻香味基因已经被定位在水稻第8染色体RM1109和PSM465 之间(Chenetal. 2006， Fen， 2005)。在此基础上，利用RM1109和PSM465对三个组合F2分离群体的9000个单株进行扩增，在两个标记之间共筛选到106 个交换株，利用本发明鉴定水稻香味的方法(TPS法)鉴定水稻交换株的香味。 同时根据所在区域日本晴和9311的基因组序列，利用Primer Premier Version 5设计PCR引物对LOl (上游端自5， 一3'的核苷酸序列为 CCTTTGTGGTATTCCGTTGTT ， 下游端自 5， 一3， 的核苷酸序列为 GTGTGCACTGGTCACTGTTTT)和L02 (上游端自5， 一3,的核苷酸序列为 ATGTTTTAGTGTTTTTTCAGGCT ， 下游端自 5， 一3， 的核苷酸序列为 CCAGACATMATAATGGCATCTT)，进行扩增。结果表明在曲阜香稻、明水香稻、 香粳9407和IRBB60之间LOl和L02表现多态性，其中在香粳9407和IRBB60 的扩增结果如附图l， 2所示。通过分析交换株的基因型与香味表型，没有发 现这两标记与香味基因/《r出现交换，表现共分离。因此L01和L02两标记 可用于筛选香稻品种。
权利要求
1、一种鉴定水稻香味的方法，其特征在于，步骤如下(1)在分蘖期取水稻单株上部1-2片幼叶，保存于-80℃冰箱中备用；(2)取2-4cm长的水稻叶片放入1.5ml离心管中，放入液氮，研碎，加TPS溶液900μl，75℃水浴20分钟；其中TPS溶液为100mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)，1M KCl；(3)打开盖，用鼻闻，即可判定香味的有无。
2、 一种与香味性状共分离的分子标记，其特征在于，是由 特异性PCR引物LOl上游端自5， 一3，的核苷酸序列为CCTTTGTGGTATTCCGTTGTT 下游端自5' —3'的核苷酸序列为GTGTGCACTGGTCACTGTTTT 或特异性PCR引物L02上游端自5， 一3，的核苷酸序列为ATGTTTTAGTGTTTTTTCAGGCT 下游端自5' —3'的核苷酸序列为CCAGACATAAATAATGGCATCTT 经PCR扩增水稻基因组DNA得到的。
3、 根据权利要求1、 2所述的一种鉴定水稻香味的方法及与香味性状共 分离的分子标记，其特征在于，二者可联合用于水稻香味品种的选育与遗传 研究，并可用于克隆香味基因。
全文摘要
本发明涉及一种鉴定水稻香味的方法及与香味性状共分离的分子标记，属分子遗传学领域。在分蘖期取水稻单株上部1-2片幼叶，保存于-80℃冰箱中备用。取2-4cm长的水稻叶片放入1.5ml离心管中，放入液氮，研碎，加TPS溶液900μl，75℃水浴20分钟。打开盖，用鼻闻，可准确判定香味的有无。用特异性PCR引物LO1或LO2经PCR扩增即可得到该分子标记。本发明专用于水稻香味品种的选育与遗传研究，并可用于克隆香味基因。
文档编号C12Q1/68GK101260430SQ20081001526
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月18日 优先权日2008年4月18日
发明者姚方印, 姜明松, 张晓东, 李广贤, 李润芳, 王文英 申请人:山东省水稻研究所