一种利用dna熔解温度分析水稻香味基因的功能标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用DNA熔解温度分析水稻香味基因的功能标记及其应用，属于生物【技术领域】。本发明根据水稻香味基因fgr与正常的等位基因BAD2在编码区第7外显子的序列差异设计香味基因功能标记BAD2-E7。利用该标记进行两轮PCR扩增，第一轮PCR以基因组DNA为模板，利用外侧引物扩增；第二轮PCR以稀释的第一轮PCR扩增产物为模板，利用内侧引物扩增。利用仪器检测第二轮PCR扩增产物DNA熔解温度，通过熔解温度高低区分fgr和BAD2序列差异，从而判别水稻材料的基因型（香味或非香味）。
【专利说明】—种利用DNA熔解温度分析水稻香味基因的功能标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体地涉及一种利用DNA熔解温度分析水稻香味基因的功能标记及其应用。
【背景技术】
[0002]水稻是我国重要的农作物，香味是高品质稻米的一个重要特性，香型稻米的价格比非香型稻米的价格高，其育种工作得到了广泛重视。选择是香型稻米育种中最重要环节之一。传统的香稻育种选择方法，是通过表现型间接对香味基因型进行选择，这种方法存在周期长、效率低、准确性较差等缺点。最有效的选择，应是直接对香味基因型进行选择，DNA分子标记的出现为这种 直接选择提供了可能。
[0003]绝大多数香稻品种的香味性状主要受位于第8染色体上的一对隐性基因fgr控制。Bradbury等研究认为，是编码甜菜醛脱氢酶2的基因似似在第七外显子发生8个碱基缺失和3处碱基变异，导致转录提前终止而使得BAD2酶丧失功能，进而使其的作用底物2-乙酰-1-卩比咯啉(2-acetyl-l-pyrroline, 2AP)的代谢途径中断，香味物质2AP不断积累，致使水稻的叶片和籽粒产生香味。针对该功能变异位点，基于凝胶电泳的功能标记GRFM04已被开发并用于香型水稻种质的鉴定。
[0004]成本低、简便实用、重复性好的共显性标记，是有效开展香稻分子辅助选择育种的重要基础。传统凝胶电泳的分辨率有限，无法满足广泛存在的SNP或Indel检测需求；此外，传统的凝胶电泳操作费时、具有一定毒性，要实现大批量分离群体的标记检测难度较大。因此，继续开发新型功能型分子标记，是水稻分子育种进步的必然需求。
[0005]DNA序列的差异会导致DNA熔解温度的不同，如果能利用DNA熔解温度检测基因型，将可避免凝胶电泳的缺陷，实现批量化、自动化、全封闭的基因型检测。利用DNA熔解温度判别基因型在人类疾病的研究中已有报道，但是，该技术涉及环节较多、需详尽的前期优化工作，目前在水稻上系统开展此技术研究的报道较少，这在一定程度上限制了其在水稻育种中的广泛应用。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题克服目前传统水稻香味基因检测技术的缺陷，提供了一种利用DNA熔解温度分析水稻香味基因的功能标记。
[0007]本发明的另一个目的是提供一种利用DNA熔解温度分析水稻香味基因的功能标记的应用。
[0008]本发明的目的通过以下技术方案予以实现:
一种水稻香味基因功能标记BAD2-E7，所述BAD2-E7由一对内侧引物BAD2_E7-1n_F/BAD2-E7-1n-R 和一对外侧引物 BAD2-E7-out-F/BAD2-E7_out-R 组成，BAD2-E7-1n_F、BAD2-E7-1n-R、BAD2-E7-out_F 和 BAD2-E7_out-R 引物序列如 SEQ ID NOl?4 所示。[0009]一种如上所述水稻香味基因功能标记BAD2-E7的应用，所述应用为用于区分香型水稻和非香型水稻。
[0010]一种区分香型水稻和非香型水稻的方法，包括以下步骤:
51.以待测水稻基因组DNA为模版，利用权利要求1所述的外侧引物BAD2-E7-out-F/ BAD2-E7-out-R 进行 PCR 扩增；
52.将步骤SIPCR扩增的产物稀释，以之为模版，利用权利要求1所述的内侧引物 BAD2-E7-1n-F/BAD2-E7-in-R 进行 PCR 扩增；
53.检测步骤S2扩增所获的DNA的熔解温度，如果待测DNA的熔解温度在79-79.6°C 之间，待测水稻为非香型水稻；如果待测DNA的熔解温度在77.3-77.9°C之间，待测水稻为香型水稻。
[0011]本发明通过研究发现水稻香味基因的熔解温度为77.6°C，正常的等位基因 BAD2的熔解温度为79.3°C，水稻香味基因fgr的熔解温度比正常的等位基因似似的熔解温度低了 1.7°C，所以，通过熔解温度就可以区分和似似序列差异，从而判别水稻材料的基因型(香味或非香味)。如果待测水稻的DNA的熔解温度在79-79.6°C之间，可判断待测水稻为非香型水稻，如果待测DNA的熔解温度在77.3-77.9°C之间，可判断待测水稻为香型水稻。
[0012]不同品种的香型水稻都含有水稻香味基因/gr，不同品种的香型水稻的fgr基因序列的相似度在99.5%以上，所以，只要是是香型水稻，无论是什么品种，通过BAD2-E7标记扩增的DNA序列的熔解温度都会在77.6°C左右范围，这个范围前后不会超过0.3°C。
[0013]优选地，步骤S2所述的稀释为稀释15-20倍。
[0014]优选地，步骤SI所述PCR反应体系为:
2 X Power Taq PCR MasterMix 母液 5 U L ；
外侧引物(10 U mol/L)各 0.3 u L ；
基因组DNA0.5 u L ；
双蒸水补足10 ii L ;
PCR 扩增程序为 95°C，5min; 95°C , 20s; 57°C , 20s; 72°C , 10s; 25 个循环； 72 °C，5min。
[0015]优选地，步骤SI所述PCR反应体系为:
2X Power Taq PCR MasterMix 母液4 U L ；
内侧引物(10 u mol/L)各 0.3 UL ；
20 X EvaGreen 染料0.5 u L ；
稀释过的第一轮PCR产物0.5 UL ；
双蒸水补足10 ii L ;
PCR 扩增程序为 95°C，2min; 95°C , 20s; 59°C , 20s; 72°C , 10s;共 25 个循环； 72 °C , 5min; 95 °C , 2min ；25°C , 2min。
[0016]优选地，步骤S3所述的熔解温度曲线为6(T95°C的熔解曲线。
[0017]优选地，步骤S3所述的对比，熔解温度曲线为75°C-82°C的熔解曲线。
[0018]比现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
1.提供的检测方法简单，比原来的通过基因测序或凝胶电泳的方法来确定基因型更加的简便、快捷；此外，此方法不接触有毒试剂，对操作人员的健康有利。
[0019]2.本发明提供的功能标记通过两次PCR扩增目的片段，显著提高了目的片段产物的特异性，使结果的判读更加准确。
[0020]3.本发明所提供的方法，检测准确率高，可用于大规模的筛选目标基因。
[0021]说明书附图
图1.功能标记BAD2-E7的引物所在基因组位置及扩增片段和Zfer基因的功能变异位点分别以星号(*)标识。
[0022]图2.利用BAD2-E7雛BAD2、fgr及其杂合型的DNA扩增片段熔解温度。
图3.利用BAD2-E7扩增产物的电泳结果；M.DNA ladder ；1-2 BAD2(日本晴);3-4 fgr(Basmati370) ;5-6 杂合型(日本晴+Basmati370)。
【具体实施方式】
[0023]下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0024]实施例1
S1.香稻品种Basmati370、非香稻品种日本晴基因组DNA的提取。
[0025]具体方法:
511.取少量水稻插秧后一月幼叶置于液氮冷冻的2.0 mL灭菌离心管中搅拌至粉末状，加1000 μ L 2 X CTAB-DNA提取(质量分数(W/V)为2%的CTAB，pH8.0 ;质量分数(W/V)为1%的PVP ；100 mmol/L Tris-HCl，ρΗ8.0 ；1.4 mol/L NaCl ；20 mmol/L EDTA，pH8.0 ;体积分数(V/V )为0.2%的巯基乙醇)；
512.置于65°C恒温水浴锅中每隔10 min摇动一次，30-45 min后取出；
513.冷却2min后加1000 μ L氯仿-异戊醇(体积比24:1 )，上下剧烈充分摇动，使两者混合均匀；
514.10000 rpm离心10 min,轻取上清至1.5 ml灭菌新离心管中，加入600 μ L预冷异丙醇上下轻摇均匀；
515._20°C放置30 min使DNA沉淀；10000 rpm离心6 min,立即倒掉上清倒立离心管于纸巾上；
516.1 min后直立离心管，加入800 μ L 70%乙醇和3 M NaAc (体积比9:1),轻摇使DNA悬浮放置30 min ；
517.10000 rpm离心6 min,立即倒掉上清加入800 μ L 70%乙醇将DNA再次漂洗30
min ；
518.10000 rpm 离心 3 min，通风橱内烘干；加入 100-200 μ LlXTB Buffer (10 mMTris-HCl, ρΗ8.0 ；1 mM EDTA, ρΗ8.0)溶解，4 °C保存备用。
[0026]S2.香稻品种Basmati370、非香稻品种日本晴香味鉴定方法。
[0027]具体方法:将2g左右供试材料的绿叶剪成碎片，放入小锥形瓶中，在每个瓶中加IOmL 17g/L的氢氧化钾溶液,立即盖上瓶盖,置于室温下1Omin,然后逐一打开瓶盖,立即用鼻嗅之，鉴别香味。[0028]S3.香稻品种Basmati370、非香稻品种日本晴香味基因标记BAD2-E7开发及扩增。
[0029]S31.比较Basmati370、日本晴BAD2基因第7外显子序列差异，设计涵盖差异位点的功能标记BAD2-E7(图1)。相比日本晴该区段，Basmati370在第七外显子发生8个碱基缺失和3处碱基变异，导致该区段DNA熔解温度比日本晴降低了 1.5°C。所述的BAD2-E7由一对内侧引物 BAD2-E7-1n-F/BAD2-E7-1n-R 和一对外侧引物 BAD2-E7-out-F/BAD2-E7_out-R 组成，引物序列如下:
BAD2-E7-out-F 引物序列(5，-3’ ) TACCAGGACTTGTTTGGAGCTT,如 SEQ ID NO:1 所示； BAD2-E7-out-R 引物序列(5，-3’ ) AAACCTTAACCATAGGAGCAGC,如 SEQ ID NO:2 所示；。
[0030]BAD2-E7-1n-F 引物序列(5，_3’)TGTTAGGTTGCAITTACTGGGAGT，如 SEQ ID NO:3 所示；BAD2-E7-1n-R 引物序列(5，-3，)CAAACCTTAACCATAGGAGCAGC，如 SEQ ID NO:4 所示。
[0031]利用功能标记BAD2-E7进行两轮PCR扩增，第一轮PCR以基因组DNA为模板，利用 BAD2-E7-out-F/BAD2-E7-out-R引物扩增;第二轮PCR以稀释的第一轮PCR扩增产物为模板，利用 BAD2-E7-1n-F/BAD2-E7-1n-R 引物扩增。
[0032]第一轮PCR:反应体系依次加入2 X Power Taq PCR MasterMix母液(百泰克,北京) 5 yL、外侧引物(10 iimol/L)各0.3 y L以及0.5 U L基因组DNA，最后以双蒸水补足10 U L0 在 GeneAmp 9700 型 PCR 仪(Applied Biosystems, USA)上进行 PCR 扩增,扩增程序为 95°C, 5min; 25 X (95°C , 20s; 57°C , 20s; 72°C , 10s) ; 72°C , 5min。反应完成后，向PCR管加入200 u L双蒸水，以稀释第一轮PCR产物(约20倍)。
[0033]第二轮PCR:反应体系依次加入2 X Power Taq PCR MasterMix母液(百泰克，北京) 4 UL、内部引物(10 iimol/L)各 0.3 u L,0.5 y L 20XEvaGre en 染料(Biotium, USA)、 以及0.5 UL稀释过的第一轮PCR产物，最后以双蒸水补足10 yL。PCR扩增程序为95°C， 2min; 25 X (95°C , 20s; 59°C , 20s; 72°C , 10s) ; 72°C , 5min; 95°C , 2min ；25°C , 2min。
[0034]S4.功能标记BAD2-E7扩增产物DNA熔解温度检测方法。
[0035]第二轮扩增产物分 别全部转移至带裙边、白底不透明的96孔板，加入20 u L矿物油(SIGMA’USA),离心(1000 rpm, I min)以消除气泡。将待测的检测板放入LightScanner 96 (Idaho Technology, USA)分析系统,读取60°C-95°C的熔解曲线。所采集的原始数据用 LightScanner Call IT 软件(Idaho Technology,USA)进行分析，选用 Small Amplicon 模式进行自动化分析，结果见图2，从图2可知，水稻香味基因fgr的熔解温度为77.6°C，正常的等位基因似似的熔解温度为79.3°C，水稻香味基因的熔解温度比正常的等位基因似似的熔解温度低了 1.7°C，所以，通过熔解温度就可以区分和似似序列差异，从而判别水稻材料的基因型(香味或非香味)。如果待测水稻的DNA的熔解温度在79-79.6°C之间， 可判断待测水稻为非香型水稻，如果待测DNA的熔解温度在77.3-77.9°C之间，可判断待测水稻为香型水稻。
[0036]不同品种 的香型水稻都含有水稻香味基因/gr，不同品种的香型水稻的fgr基因序列的相似度在99.5%以上，所以，只要是是香型水稻，无论是什么品种，通过BAD2-E7标记扩增的DNA序列的熔解温度都会在77.6°C左右范围，这个范围前后不会超过0.3°C。
[0037]S5.功能标记BAD2-E7扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法。
[0038]具体方法:扩增产物经8.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(电泳缓冲液I X TBE，电压110 V，时间2.5 h)，通过0.1% AgNO3染色，利用BIORAD凝胶成像系统观察、拍照及读带。
[0039]实施例2:利用BAD2-E7检测水稻香味基因型。
[0040]1.供试材料:本实验所研究材料为香稻品种Basmati370、非香稻品种日本晴。
[0041]2.2份供试材料香味鉴定:香味鉴定方法同实施例1所述。
[0042]3.结果表明，Basmati370叶片表现出香味，日本晴叶片无香味。
[0043]4.2份供试材料DNA提取，PCR扩增分析:DNA提取和PCR扩增方法同实施例1所述。
[0044]5.功能标记BAD2-E7扩增产物DNA熔解温度检测:熔解温度检测方法同实施例1所述。
[0045]结果表明，Basmati370扩增产物DNA熔解温度为TL 6°C，说明Basmati370含有香味基因/#，所以可以判定Basmati370为香型水稻；日本晴扩增产物DNA熔解温度为79.3°C，日本晴为野生型基因似似，可以判定日本晴为非香型水稻，以上结果表明利用功能标记BAD2-E7可以区分香与非香的水稻品种，准确率达100%。
[0046]6.功能 标记BAD2-E7扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳:聚丙烯酰胺凝胶检测方法同实施例1所述。结果表明，Basmati370较日本晴的扩增产物缺少数个碱基，与预期结果完全一致(图3)。说明所熔解温度检测与常规凝胶电泳结果一致，可代替凝胶电泳检测香味基因型，提闻检测效率。
【权利要求】
1.一种水稻香味基因功能标记BAD2-E7，其特征在于，所述BAD2-E7由一对内侧引物 BAD2-E7-1n-F/BAD2-E7-1n-R 和一对外侧弓丨物 BAD2-E7-out-F/BAD2-E7_out-R 组成， BAD2-E7-1n-F、BAD2-E7-1n-R、BAD2-E7-out-F 和 BAD2-E7_out-R 引物序列如 SEQ ID NOl?4所示。
2.—种权利要求1所述水稻香味基因功能标记BAD2-E7的应用，其特征在于，所述应用为用于区分香型水稻和非香型水稻。
3.—种区分香型水稻和非香型水稻的方法，其特征在于，包括以下步骤:51.以待测水稻基因组DNA为模版，利用权利要求1所述的外侧引物BAD2-E7-out-F/ BAD2-E7-out-R 进行 PCR 扩增；52.将步骤SIPCR扩增的产物稀释，以之为模版，利用权利要求1所述的内侧引物 BAD2-E7-1n-F/BAD2-E7-1n-R 进行 PCR 扩增；53.检测步骤S2扩增所获的DNA的熔解温度，如果待测DNA的熔解温度在79?79.6°C 之间，待测水稻为非香型水稻，如果待测DNA的熔解温度在77.3-77.9°C之间，待测水稻为香型水稻。
4.根据权利要求3所述区分香型水稻和非香型水稻的方法，其特征在于，步骤S2所述的稀释为稀释15?20倍。
5.根据权利要求3所述区分香型水稻和非香型水稻的方法，其特征在于，步骤SI所述 PCR反应体系为:2 X Power Taq PCR MasterMix 母液 5 U L ；外侧引物(10 U mol/L)各 0.3 u L ；基因组DNA0.5 u L ；双蒸水补足10 ii L ;PCR 扩增程序为 95°C，5min; 95°C , 20s; 57°C , 20s; 72°C , 10s; 25 个循环； 72 °C，5min。
6.根据权利要求3所述·区分香型水稻和非香型水稻的方法，其特征在于，步骤SI所述 PCR反应体系为:2 X Power Taq PCR MasterMix 母液4 U L ；内侧引物(10 u mol/L)各 0.3 UL ；20 X EvaGreen 染料0.5 u L ；稀释过的第一轮PCR产物0.5 UL ；双蒸水补足10 ii L ;PCR 扩增程序为 95°C，2min; 95°C , 20s; 59°C , 20s; 72°C , 10s;共 25 个循环； 72 °C , 5min; 95 °C , 2min ；25°C , 2min。
7.根据权利要求3所述区分香型水稻和非香型水稻的方法，其特征在于，步骤S3所述的熔解温度曲线为6(T95°C的熔解曲线。
8.根据权利要求3所述区分香型水稻和非香型水稻的方法，其特征在于，步骤S3所述的对比，熔解温度曲线为75?82°C的熔解曲线。
【文档编号】C12Q1/68GK103436530SQ201310238700
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年6月17日 优先权日:2013年6月17日
【发明者】郭涛, 罗文龙, 陈志强, 王慧, 黄翠红, 刘永柱, 张建国 申请人:华南农业大学