培养树突状杀手细胞的配方及其方法
【专利摘要】本发明提供一种培养树突状杀手细胞的配方及其方法，其中上述配方包含有效量的至少一细胞激素，且此细胞激素为介白素15号。另外，培养树突状杀手细胞的方法至少包含下列步骤：首先，取得人类血液检体的外围血单核细胞群组。接着，加入有效量上述配方以与外围血单核细胞群组混合，并静置一第一合适时间。
【专利说明】培养树突状杀手细胞的配方及其方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种培养树突状杀手细胞的配方及其方法，尤其涉及一种利用介白素15号于生物体外大量扩增树突状杀手细胞的配方及其方法。
【背景技术】
[0002]人体对外来异物具有辨识和启动一连串反应的防御机转，这防御系统就是免疫系统。免疫系统拥有不同作用的白血球及淋巴细胞、不同功能的蛋白质因子，如免疫球蛋白、介白质及细胞激素等，互相协调合作，形成人体的防御力。免疫反应依其特异性及记忆性的有无，分为先天性及后天性。先天性免疫系统包括可溶性化学因子、干扰素、补体系统、嗜中性淋巴球及巨噬细胞的吞噬作用和自然杀手细胞的毒杀作用等。后天性免疫系统包括体液免疫及细胞免疫，前者包括抗体生成系统，后者包括淋巴细胞、淋巴激素及免疫记忆系统。记忆的功能使免疫系统对已对付过的抗原，引发强而快速的次发反应，可将外来危害因子有效去除。
[0003]免疫反应对抗原会有不同反应是由于主要组织兼容复合物(MajorHistocompatibility Complex, MHC)的作用。外来抗原通常需要经过细胞处理与MHC分子结合后，才能被免疫系统所认知。因此MHC的类型与个人对特定因子的免疫力有关，是造成个体对疾病易感性的重要因素。人类的MHC又名人类白血球抗原(Human LeukocyteAntigen, HLA)。HLA可分为class 1、class II,为结构相似的醣蛋白，与抗原呈现功能有关。HLAclass I抗原表现于所有体细胞上，而class II只表现于巨噬细胞、B细胞及树突状细胞(Dendritic Cell, DC)的细胞表面上。
[0004]人体内有一种高度分化的免疫细胞，叫做抗原呈现细胞(Antigen PresentingCells, APC)。抗原呈现细胞的功能是摄取、加工、处理外源性抗原并将加工后抗原呈现给T淋巴细胞，诱导T淋巴细胞进行增殖进而分化成效应细胞，产生免疫反应，以辨识并抵抗感染甚至癌症细胞。树突细胞(Dendritic cells, DCs)是目前所知的人体内功能最强大的抗原呈现细胞，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC的最大特点是能够显著刺激初始T细胞进行增殖，而其他的抗原呈现细胞，如巨噬细胞、B细胞仅能刺激已活化的或记忆性T细胞。因此DC是机体免疫反应的始动者,在免疫反应的诱导中具有独特的地位。
[0005]另外，自然杀手细胞(Natural Killer cell, NK cell)也是一种在免疫反应中占有重要地位的细胞，其起源于淋巴前驱细胞，占人类血液中淋巴球的5~10%。NK细胞表面缺乏专一性的抗原受体，负责非专一性防御，可以胞杀肿瘤细胞和被病毒感染细胞。NK细胞表面虽然没有抗原专一性受体，但其表面有许多其他的膜蛋白接受来自目标细胞的刺激，以调节NK细胞的活性，这些膜蛋白大致可分为“抑制性受体”和“活化性受体”。当NK细胞与细胞接触后，获得活化性受体的讯息，若与正常细胞接触，则正常细胞表面的第一型MHC分子与抑制性受体结合，传递了 “抑制” NK细胞活性的讯息，故NK细胞不会被活化，以避免杀死正常细胞。若正常细胞被病毒感染或转为肿瘤细胞后，第一型MHC分子的表现常会发生异常，因此当NK细胞接触不正常细胞时，便无法获得抑制性受体的讯息，于是NK细胞便活化进行胞杀作用。也就是说，只有“活化”讯息存在，且“抑制”的讯息异常或不存在时，NK细胞才会进行胞杀作用。
[0006]近年来，同时具有上述两种DC与NK细胞功能的干扰素分泌型杀手树突细胞逐渐受到关注。干扰素分泌型杀手树突细胞可以从毒杀目标、抗原呈现到活化T细胞都由自己完成，也即干扰素分泌型杀手树突细胞找到目标后会毒杀目标，接着把碎片吞噬后呈现抗原给T细胞，并活化T细胞。然而，正如同前文述及，干扰素分泌型杀手树突细胞虽然在免疫反应中扮演了相当重要的角色，但因为干扰素分泌型杀手树突细胞在体内的量非常稀少，如此低的细胞比率及数目，需要繁琐的步骤来加以纯化，也限制了针对干扰素分泌型杀手树突细胞的进一步研究，不仅如此，目前的技术仅能从老鼠的脾脏、淋巴结或骨髓中分离出干扰素分泌型杀手树突细胞，使得要实际将其应用于研究或临床上都面临了不小的瓶颈。
【发明内容】
[0007]有鉴于此，发明人经过长年的努力以及无数次的试验，已成功筛选出了人类体内同时具有毒杀及抗原呈现功能的细胞，并定义该细胞为树突状杀手细胞(DendriticKiller Cell，DKC)，又称为毒杀型树突细胞(cytoDC)或干扰素分泌型杀手树突细胞(IKDC)。然而，从发明人实验的结果严格说来，树突状杀手细胞在人类周边淋巴细胞中所占的比率低于0.01%。请参考图1至图2B,图1显示健康者与癌症患者在外围血中树突状杀手细胞含量百分比对照图，图2A显示本发明一实施例中藉流式细胞仪分析癌症患者外围血的结果，图2B显示本发明一实施例中藉流式细胞仪分析健康者外围血的结果。如图1所示，在癌症患者的外围血中树突状杀手细胞(DKC)的含量百分比明显低于健康者。另外，如图2A所示，请见右上角处，癌症患者所提供的外围血中树突状杀手细胞群组10内细胞的含量只有百分之0.0367，而如图2B所示，同样请见右上角处，在健康者所提供的外围血中树突状杀手细胞群组10内细胞的含 量为百分之0.436，明显高于癌症患者。
[0008]因此，发明人进一步地研发出培养此种树突状杀手细胞的配方及其培养方法，运用本发明所提供的方法能使外围血中微量的树突状杀手细胞扩增至200至400倍，将使树突状杀手细胞在癌症免疫疗法的研究及应用上具有重大性的突破。
[0009]承上所述，本发明提供一种培养树突状杀手细胞的配方，包含有效量的至少一细胞激素，且上述细胞激素为介白素15号。
[0010]在本发明的一实施例中，本发明所提供的配方更包含有效量的另一细胞激素，且上述另一细胞激素为介白素12号。较佳地，介白素15号的浓度大于Ing/mL。更进一步,介白素15号的浓度为10ng/mL,介白素12号的浓度为0.5_20ng/mL。利用本发明所提供之配法可将人类血液检体中的树突状杀手细胞的数量扩增200至400倍。较佳地，其中人类血液检体选择自于一癌症病患的外围血。
[0011]本发明的另一目的在于提供一种培养树突状杀手细胞的方法，该方法至少包含下列步骤。首先，取得人类血液检体的外围血单核细胞群组。接着，加入有效量的该配方以与外围血单核细胞群组混合，其中上述配方包含有效量的至少一细胞激素，且上述细胞激素为介白素15号。最后，静置一第一合适时间。
[0012]在本发明的一实施例中，其中上述配方更包含有效量的另一细胞激素，且上述另一细胞激素为介白素12号。较佳地，介白素15号的浓度大于Ing/mL,更进一步,介白素15号的浓度为10ng/mL。介白素12号的浓度为0.5_20ng/mL。[0013]在本发明的一实施例中，其中于上述静置第一合适时间后，更包含下列步骤:首先，收集未附着的细胞，该些细胞经处理后得到一第一沈淀物。接着，利用上述配方回溶第一沈淀物。最后，静置一第二合适时间。
[0014]在本发明的一实施例中，其中于静置第一合适时间或上述静置第二合适时间的步骤后，更包含下列步骤:分离出一树突状杀手细胞群组。其中上述分离出的树突状杀手细胞群组内的细胞数量为人类血液检体中筛选出的树突状杀手细胞数量的200至400倍。而上述分离出树突状杀手细胞群组的步骤系藉由一流式细胞检测技术或相关技艺的替代技术来完成。
[0015]在本发明的一实施例中，其中上述取得人类血液检体的外围血单核细胞群组的步骤中，包含下列步骤。首先，收集该人类血液检体，并以同体积磷酸缓冲液两倍稀释人类血液检体。接着，自人类血液检体中分离出外围血单核细胞群组，并去除外围血单核细胞群组中的T细胞与B细胞。最后，调整外围血单核细胞群组的浓度至IO6细胞/毫升。
[0016]在本发明的一实施例中，其中上述去除外围血单核细胞群组中的T细胞与B细胞的步骤藉由一流式细胞检测技术来完成，且其步骤为:检测外围血单核细胞群组中的B细胞表面标记与T细胞表面标记的表现。然后，去除B细胞表面标记与T细胞表面标记呈现阳性者。
[0017]在本发明的一实施例中，其中上述去除外围血单核细胞群组中的T细胞与B细胞的步骤藉由一磁珠分选技术来完成，且其步骤为:首先，加入接有生物素的抗体与外围血单核细胞群组反应。接着，加入披覆有抗生物素的磁珠，并使其通过具有磁场的一含铁管柱。较佳地，上述接有生物素的抗体包含ant1-⑶3与ant1-⑶19。
[0018]在本发明的一实施例中，其中人类血液检体为全血。
[0019]在本发明的一实施例中，其中上述自人类血液检体中分离出外围血单核细胞群组的步骤藉由流式细胞检测技术或Ficol1-Paque密度梯度离心技术来完成。
[0020]在本发明的一实施例中，其中上述收集人类血液检体的步骤来自一癌症患者。较佳地，上述癌症患者所患的癌症可来自鳞状细胞癌、原位性与小叶性乳癌、肝癌、鼻咽癌、肺癌、骨癌、胰脏癌、皮肤癌、头部或颈部癌症、皮肤或是眼内的恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、结肠癌、乳癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、何杰金氏症、非何杰金氏症、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织癌、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、孩童硬肿瘤、淋巴癌、膀胱癌、肾脏或输尿管癌、肾脏细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管新生、脊轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、脑垂体腺瘤、卡波希氏瘤、表皮样癌和这些癌症的任何组合及其散播或转移形式所组成的群组。
[0021]由下文的说明，可更进一步了解本发明的特征及其优点，阅读时请参考图3至图6。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1显示健康者与癌症患者在外围血中DKC含量百分比对照图；
[0023]图2A显示本发明一实施例中藉流式细胞仪分析癌症患者外围血的结果；[0024]图2B显示本发明一实施例中藉流式细胞仪分析健康者外围血的结果；
[0025]图3显示本发明一实施例的培养树突状杀手细胞的方法流程图；
[0026]图4显示本发明一实施例的培养树突状杀手细胞的方法流程图；
[0027]图5A至图显示本发明一实施例中分别加入培养基、介白素12号、介白素15号与介白素15号搭配介白素12号以培养树突状杀手细胞至第三天的结果；
[0028]图6A至图6C显示本发明一实施例中藉流式细胞仪检测树突状杀手细胞在培养前、培养第三天与培养第七天的结果；以及
[0029]图7显示树突状杀手细胞培养天数及细胞数量的结果。
[0030]附图标记说明
[0031]SlOO~S107 培养树突状杀手细胞的步骤
[0032]S1001~S1005培养树突状杀手细胞的步骤
[0033]10树突状杀手细胞
[0034]20自然杀手细胞
【具体实施方式】
[0035]名词定义
[0036]除非有其他定义， 所有在此所用的技术及科学词汇，如同作为本发明所属【技术领域】中具有该领域技术人员一般性地了解具有相同意义。在此指称的所有专利、申请案、公开申请案及其他应用，以及基因库登录号都完整以参考文献被整合起来。若本章节提出的定义与其他专利、申请案、公开申请案及其他在此引用的参考文献所提出的定义相反或不一致，以本章节提出的定义为主。
[0037]如本发明所使用，术语“树突状杀手细胞(DKC)”指同时具有细胞毒杀及抗原呈现功能的细胞。
[0038]如本发明所使用，符号“ + ”指细胞表面标记有表现于细胞表面，如利用流式细胞仪测得细胞表面标记量大于阴性控制组的表现量。
[0039]如本发明所使用，符号指细胞表面标记没有表现于细胞表面，如利用流式细胞仪测得细胞表面标记量等于阴性控制组的表现量。
[0040]上述细胞表面标记的表现量，使用的流式细胞仪测量结果，但本发明不以此为限，若他人采相关技艺的替代技术，执行与本发明精神相同的利用，均为本发明的专利范围中。
[0041]如本发明所使用，术语“介白素”指一组细胞因子，可以由多种细胞产生，人体免疫系统的功能在很大程度上依赖于介白素。
[0042]实施例
[0043]为了更好地理解本发明的特点以及所能达到的效果，现结合附图对本发明的较佳实施例进行详细说明。
[0044]虽然下文详述本发明多个实施例之配方及培养方法，但应了解本发明可提供许多可在多种具体背景下实施的实用发明概念。本文所述的具体实施例仅制备及使用本发明的具体方式的例示性说明且并不界定本发明的范围。下文将定义若干术语以便于理解本发明。本文所定义的术语具有熟习与本发明相关领域的该领域技术人员通常理解的含义。例如“一(a、an)”及“该(the)”等术语非欲仅指单数实体，而是包括可使用具体实例说明的一般类别。本文术语用以阐述本发明的具体实施例，但除申请专利范围所概述之外，其用法并不界定本发明。
[0045]首先，事先说明的是，如前文所述发明人经过长年的努力以及无数次的试验，已成功筛选出了人类体内同时具有毒杀及抗原呈现功能的细胞，并定义该细胞为树突状杀手细胞(DKC)，即具有包含有细胞表面标记为HLA-GXD14TD19XD3TD56+HLA-DR+的细胞。另外，本发明所提供的培养树突状杀手细胞的方法于生物体之外进行(ex vivo)。
[0046]再者，本发明所采用的人类血液检体来自一癌症患者的外围血，且此癌症患者所患的癌症可选择自鳞状细胞癌、原位性与小叶性乳癌、肝癌、鼻咽癌、肺癌、骨癌、胰脏癌、皮肤癌、头部或颈部癌症、皮肤或是眼内的恶性黑色素瘤、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、结肠癌、乳癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、何杰金氏症、非何杰金氏症、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织癌、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、孩童硬肿瘤、淋巴癌、膀胱癌、肾脏或输尿管癌、肾脏细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管新生、脊轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、脑垂体腺瘤、卡波希氏瘤、表皮样癌和这些癌症的任何组合及其散播或转移形式所组成的群组。
[0047]另外，本发明所揭示的培养方法中的多个分离或筛选步骤均藉由一流式细胞检测技术(即流式细胞仪)来完成，并适合使用各一或多种流式细胞仪来利用不同群组的细胞拥有不同的细胞表面标记物区分筛选出目标细胞群组。流式细胞仪能够以远远超过相关技艺任何其他单细胞分析技术的速度实施单细胞分析，相比于使用其他替代技术能够较快速地分析统计学上有意义的数量的细胞，但本发明并不欲以此为限。较佳地，在一个实施例中，使用带有该领域技术人员的任一适宜试样制备自动装置或液体处理器的流式细胞仪。另外，使用单路雷射流式细胞仪或多路雷射流式细胞仪来实施分析步骤均可，本发明并不欲以此为限。较佳地，大量荧光染料及偶联化学品的研发及优化使得能够将例如免疫球蛋白及小分子等各种配体偶联至荧光染料。具有介于光谱的紫外至红光区范围内的发射线的雷射能够激发该等荧光染料。因此，可使用诸多光谱学上不同的试剂来标记细胞以利用基于荧光的测试方法(如本发明所使用的流式细胞仪)进行研究。该等试剂已为熟习此项技术者所熟知。在一个实施例中，在分析步骤期间使用一或多种荧光染料。在一些实施例中，在细胞对药物组合物的效应的分析中使用一或多种染色剂。至于检测后的数据分析方法非本发明所欲探讨的主题，在此不再赘述。
[0048]后续，将以图3与图4进一步详细说明本发明所提供的培养树突状杀手细胞的方法。其中，图3与图4均显示本发明一实施例的培养树突状杀手细胞的方法流程图。
[0049]首先，如图3所示，先取得人类血液检体的外围血单核细胞群组S100。接着，加入有效量的一配方以与外围血单核细胞群组混合S101。其中，上述用以培养树突状杀手细胞的配方包含有效量的至少一细胞激素，且上述细胞激素为介白素15号。最后，静置一第一合适时间S102。
[0050]在本发明的一实施例中，上述配方更包含有效量的另一细胞激素，且上述另一细胞激素所使用的是介白素12号。较佳地，介白素15号的浓度大于Ing/mL。更进一步，介白素15号的浓度为10ng/mL,介白素12号的浓度为0.5_20ng/mL。
[0051]较佳地，上述第一合适时间指将介白素15号与外围血单核细胞群组均置入培养基后放置一段时间使其开始进行细胞扩增。在本发明的一实施例中，第一合适时间为培养后的第三到第七天。
[0052]在静置第一合适时间后，收集未附着的细胞S103。接着，依序经由离心与静置沈淀等步骤处理该些细胞以得到一第一沈淀物S104。随后利用上述配方(即介白素15号与介白素12号)回溶第一沈淀物S105。
[0053]最后，将回溶的第一沈淀物静置一第二合适时间S106。在经过第二合适时间之后，便可分离出一树突状杀手细胞群组S107。较佳地，第二合适时间为第一合适时间后开始培养第二合适时间的第三至第四天。较佳地，上述步骤S107藉由一流式细胞检测技术完成，但本发明并不欲以任一方法为限。另外，上述步骤S107也可于步骤S102静置一第一合适时间后执行。
[0054]然而，必须说明的是，上述第一合适时间或第二合适时间均为一较佳实验手段，但本发明并不欲以此为限。也就是说，本发明也可于培养后第四天进行步骤S103~S106，然后于培养后第十天进行步骤S107。再者，于步骤S106之后，可再重复进行步骤S103~S105，也即再次收集未附着的细胞，并处理该些细胞以获得一第二沈淀物，随后以本发明所提供的配方回溶第二沈淀物后静置一第三合适时间，重复上述步骤即可将树突状杀手细胞放大至所需数量。
[0055]请参考图4，上述步骤SlOO更包含下列步骤:首先，收集人类血液检体S1001，并以两倍磷酸缓冲液稀释人类血液检体S1002。接着，自人类血液检体中分离出外围血单核细胞群组S1003，并去除外围血单核细胞群组中的T细胞与B细胞S1004。最后，调整外围血单核细胞群组的浓度至106细胞/毫升S1005。较佳地，上述人类血液检体为全血。另外，步骤S1003藉由流式细胞检测技术或Ficol1-Paque密度梯度离心技术来完成。
[0056]进一步说明的是，`上述步骤S1004可藉由一流式细胞检测技术或一磁珠分选技术来完成。以流式细胞检测技术为例，步骤S1004包含下列步骤:首先，检测外围血单核细胞群组中的B细胞表面标记与T细胞表面标记的表现。如前面名词定义所述，B细胞表面标记指会表现于B细胞的细胞表面标记，如CD19等，而T细胞表面标记指会表现于T细胞的细胞表面标记，如CD3等。因此，后续步骤将进一步去除B细胞表面标记与T细胞表面标记呈现阳性者，也即剩下即为细胞表面标记具有⑶3_与⑶19_表现的细胞。
[0057]若以磁珠分选技术为例来说明，则步骤S1004包含下列步骤:首先，加入接有生物素的抗体与外围血单核细胞群组反应。接着，加入披覆有抗生物素的磁珠，并使其通过具有磁场的一含铁管柱。此时，T细胞与B细胞因被抗体与磁珠抓住，通过管柱时会被磁场吸住而留在管柱内，因而获得去除T细胞与B细胞的外围血单核细胞群组。较佳地，上述接有生物素的抗体包含ant1-⑶3与ant1-⑶19。
[0058]据此，本发明所提供的培养树突状杀手细胞的配方包含细胞激素，且此处所指的细胞激素可为单独使用有效量的介白素15号，或同时使用有效量的介白素15号与介白素12号，本发明并不欲以任一实施例为限。至于，配方中所使用的介白素15号与介白素12号的浓度与培养方法均已描述如前文，在此不再赘述。
[0059]然而，必须说明的是，在一较佳实施例中，上述配方虽更可包含介白素12号，但仅包含有介白素15号的配方已可达到良好的培养效果，不仅如此，此配方一定要具有介白素15号，加入介白素12号是可更进一步加强其放大培养效果。而仅单独使用介白素12号却无法达到放大培养树突状杀手细胞的效果。请参考图5A至图5D，图5A至图分别显示加入培养基(对照组)、介白素12号、介白素15号与介白素15号搭配介白素12号，培养树突状杀手细胞至第三天的结果。其中，加入培养基培养为阴性控制的对照组。
[0060]接着请参照图5A至第图中最右边直条方块内的树突状杀手细胞10的细胞数量，对照组加入培养基(图5A)所培养树突状杀手细胞的细胞数量只增加了 0.9% ;单独加入浓度50ng/mL的介白素12号(图5B)，所培养树突状杀手细胞的细胞数量只增加2.1% ；而单独加入浓度10ng/mL的介白素15号(第五C图)，所培养树突状杀手细胞的细胞数量增加24% ;又，加入浓度10ng/mL的介白素15号搭配1.8ng/mL的介白素12号(图OT),所培养树突状杀手细胞的细胞数量增加28.2%。由实验结果可以清楚得知，单独加入介白素15号对树突状杀手细胞的培养即可达到良好的效果，据此，本发明所提供的配方及方法并不欲受限于使用同时包含有介白素15号与介白素12号的配方；而单独加入介白素12号并无法达到放大效果；介白素15号搭配介白素12号同时使用可进一步增强放大培养树突状杀手细胞的成效。
[0061]另外，介白素15号较佳地浓度为10ng/mL，但在发明人的实验中，介白素15号的浓度大于Ing/mL即可有放大培养树突状杀手细胞的效果，而较佳地介白素12号浓度介于
0.5_20ng/mL 之间。
[0062]接着，将藉由图6A至图6C以及图7来说明经由本发明所提供的配方与方法而大量制备树突状杀手细胞的实验结果。首先，图6A至图6C显示本发明一实施例中藉流式细胞仪检测树突状杀手细胞在培养前、培养第三天与培养第七天的结果。如图6A所示，可看出在培养前同时具有自然杀手细胞表面标记(CD56+)与树突细胞表面标记(HLA-DR+)的细胞数量很少，而图6A图中央 如纺锤状的细胞群20，为带有CD56但不具HLA-DR的自然杀手细胞。
[0063]如图6B与图6C所示，随着培养天数增加，细胞群20会增生并往右上角移动，也就是转变成同时具有自然杀手细胞表面标记(CD56+)与树突细胞表面标记(HLA-DR+)的树突状杀手细胞(DKC) 10。足以说明，本发明提供的培养配方及方法可以放大树突状杀手细胞，不只原本的树突状杀手细胞会增生更可趋化自然杀手细胞转变成树突状杀手细胞。
[0064]接着，请参考图7，图7显示DKC培养天数及细胞数量的结果。如图所示，随着培养天数增加，树突状杀手细胞的数量也有显著的成长。在培养后的第7天，其细胞数量可放大200至400倍。也就是说，上述在体外经由本发明所提供的配方及方法所培养的树突状杀手细胞群，其数量为人类血液检体中筛选出的树突状杀手细胞数量的200至400倍。
[0065]综上所述，本发明欲培养的标的物“树突状杀手细胞”是一种同时拥有自然杀手细胞与树突细胞功能的细胞，在人体内的量非常稀少，但其于免疫反应中扮演重要的角色。经由本发明所提供的配方及方法可在体外从人类外围血中将微量的树突状杀手细胞放大200至400倍。况且，本发明中所使用的人类外围血来自于癌症患者，如图1所示，癌症患者的外围血中树突状杀手细胞的含量更少，也就是说本发明的技术即使树突状杀手细胞是微量中的微量也可以放大，加速树突状杀手细胞的研究及应用。
[0066]以上所述实施例只用于说明本发明的技术思想及特点，其目的是使本领域技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，但不应该以此限定本发明专利的范围，所属领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围之内，相对上述实施例进行等同变化和改进，都应该属于本发明所保 护的技术范围。
【权利要求】
1.一种培养树突状杀手细胞的配方，其特征在于，包含有效量的至少一细胞激素，且该细胞激素为介白素15号。
2.根据权利要求1所述的配方，其特征在于，该介白素15号的浓度大于Ing/mL。
3.根据权利要求1所述的配方，其特征在于，该介白素15号的浓度为10ng/mL。
4.根据权利要求1所述的配方，其特征在于，该配方更包含有效量的另一细胞激素，且该另一细胞激素为介白素12号。
5.根据权利要求4所述的配方，其特征在于，该介白素12号的浓度介于0.5-20ng/ml。
6.根据权利要求1所述的配方，其特征在于，该配方可将人类血液检体中的树突状杀手细胞的数量扩增200至400倍。
7.根据权利要求6所述的配方，其特征在于，该人类血液检体选择自一癌症病患的外围血。
8.一种培养树突状杀手细胞的方法，其特征在于，至少包含下列步骤: 取得血液检体中的外围血单核细胞群组； 加入有效量的该配方以与该外围血单核细胞群组混合，其中该配方包含有效量的至少一细胞激素，且该细胞激素为介白素15号；以及 静置一第一合适时间。
9.根据权利要求8所`述的方法，其特征在于，该配方更包含有效量的另一细胞激素，且该另一细胞激素为介白素12号。
10.根据权利要求9所述的配方，其特征在于，该介白素15号的浓度为10ng/mL，该介白素12号的浓度介于0.5-20ng/mL。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，于该静置该第一合适时间后，更包含下列步骤: 收集未附着的细胞； 处理该些细胞以得到一第一沈淀物； 利用该配方回溶该第一沈淀物；以及 静置一第二合适时间。
12.根据权利要求8或11所述的方法，其特征在于，于该静置该第一合适时间或该静置该第二合适时间的步骤后，更包含下列步骤:分离出一树突状杀手细胞群组。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，该分离出的该树突状杀手细胞群组内的细胞数量为人类血液检体中筛选出的树突状杀手细胞数量的200至400倍。
14.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，该取得该人类血液检体的该外围血单核细胞群组的步骤中，包含下列步骤: 提供该人类血液检体； 自该人类血液检体中分离出该外围血单核细胞群组；及 去除该外围血单核细胞群组中的T细胞与B细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，该人类血液检体来自于一癌症患者。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，该癌症患者所患的癌症可选择自于鳞状细胞癌、原位性与小叶性乳癌、肝癌、鼻咽癌、肺癌、骨癌、胰脏癌、皮肤癌、头部或颈部癌症、皮肤或是眼内的恶性黑色素瘤、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、结肠癌、乳癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、何杰金氏症、非何杰金氏症、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织癌、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、孩童硬肿瘤、淋巴癌、膀胱癌、肾脏或输尿管癌、肾脏细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管新生、脊轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、脑垂体腺瘤、卡波希氏瘤、表皮样癌和这些癌症的任何组合及其散播或转移形式所组成的 群组。
【文档编号】C12N5/0783GK103525764SQ201310238976
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年6月17日 优先权日:2012年7月5日
【发明者】李建谋 申请人:富禾生医股份有限公司