一种批量提取水稻胚乳dna的方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，公开了一种批量提取水稻胚乳DNA的方法。该方法包括如下步骤：S1.从水稻种子中切取胚乳；S2.将胚乳投入PCR板（T1板）孔中；S3.T1板每孔加入碱液，放入PCR仪中进行加热；S4.取出T1板，每孔投入钨合金珠及1×DNA抽提液；S5.将T1板重新置于PCR仪中进行加热；S6.取出T1板，振动；S7.将T1板放入离心机进行离心；S8.取出T1板，将上清液转移至另一PCR板（T3板）中，T3板每孔中预先加入双蒸水；S9.将T3板置于冰箱中保存。该方法快速、操作简单，可实现水稻胚乳DNA的批量提取。
【专利说明】一种批量提取水稻胚乳DNA的方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及生物【技术领域】，更具体地，涉及一种批量提取水稻胚乳DNA的方法。
【背景技术】
[0003]水稻是我国重要的粮食作物，高产、优质、多抗水稻新品种的培育是提升我国粮食安全的重要环节。随着分子标记的出现，利用分子标记辅助选择提高新品种培育效率已得到了广泛应用。
[0004]水稻DNA的制备是进行分子标记辅助选择的前提，在提取时应根据不同研究需要，保证其结构的相对完整性；尽量排除其他大分子成分如蛋白质、多糖等的污染。以水稻叶片为材料，利用CTAB进行DNA提取，是目前广泛应用的方法，该方法DNA提取量较多、纯度也较高，可满足大部分分子生物学研究要求。但该方法有机试剂处理次数过多、耗时长、 成本高。前人已经研究了部分DNA提取的简化方法，如简化的CTAB法、TritonX-1OO法、 NaOH提取法等，但这些方法都存在各种缺点(如效率低、有毒试剂使用等)，无法满足大批量群体的DNA抽提工作。此外，一般的DNA抽提以叶片为材料，必然受到水稻生长季节的限制， 特别是在需筛选目的基因型单株移栽时，其时间的要求更加紧迫。如能利用水稻胚乳提取 DNA，可将基因型鉴定工作提早一个世代，对于育种工作的安排更加有利。
[0005]目前，利用水稻籽粒提取DNA的研究已有报道，但已有的研究操作步骤繁琐、不能进行批量化提取；此外，现有的籽粒提取DNA是破坏性的方法，籽粒被完全破坏，无法继续种植。因此，有必要探讨一种批量化的水稻胚乳DNA提取方法，使其更好的应用于水稻育种。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的 技术问题是，为了克服现有技术中水稻DNA提取技术的上述不足，提供一种批量提取水稻胚乳DNA的方法。
[0007]本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以解决:
一种批量提取水稻胚乳DNA的方法，包括如下步骤:
51.从水稻种子中切取胚乳；
52.将胚乳投入PCR板孔中，所述的PCR板命名为Tl板；
53.Tl板每孔加入50?150 u L碱液，放入PCR仪中进行加热；
54.取出Tl板，每孔投入钨合金珠及150-250 u L I XDNA抽提液；
55.将Tl板重新置于PCR仪中进行加热；
56.取出Tl板，振动3?4min ；
57.将Tl板放入离心机进行离心；
58.取出Tl板，将上清液转移至另一PCR板中，PCR板命名为T3板，T3板每孔中预先加入5(Tl50 u L双蒸水；
S9.将T3板置于冰箱中保存；
S4中IXDNA抽提液的组成为pH9.5的Tris、EDTA, KCl，它们的摩尔比为 5?15:0.5?1.5:50?150。
[0008]该方法提取快速、不使用有毒的提取试剂，而且利用水稻胚乳提取DNA，可将基因型鉴定工作提早一个世代，对于育种工作的安排更加有利。
[0009]作为一种优选方案，SI中所述从水稻种子中切取胚乳是指从每粒水稻种子切取 1/3的胚乳。
[0010]作为一种优选方案，S2中每个PCR板孔中投入5?8mg胚乳。
[0011]作为一种优选方案，S2中所述的碱液为I mol/ L NaOH溶液；加入量为100 u L。
[0012]作为一种优选方案，S3中的PCR条件为99 V 15 min。
[0013]作为一种优选方案，S4中I XDNA抽提液的每孔用量为180yL ;Tris、EDTA和KCl 的摩尔比为10:1:100 ;钨合金珠每孔加入I粒。
[0014]作为一种优选方案，S5中的PCR条件为99 °C，3 min。
[0015]作为一种优选方案，S7中以5000 rpm离心I min。
[0016]作为一种优选方案，所述的Tl板和T3板为96孔板。
[0017]作为一种优选方案，S8中使用96针复制器转移上清液。
[0018]作为一种优选方案，S9中`所述的保存是指置于_20°C冰箱中保存。
[0019]本发明与现有技术相比具有以下优点:
I)本方法以水稻籽粒1/3胚乳为DNA抽提材料，而通常的DNA抽提以叶片为材料，本方法在时间安排上更加灵活。
[0020]2)本方法以水稻籽粒1/3胚乳，剩余的籽粒部分(胚乳和胚)仍然保留可以继续种植，而通常的水稻籽粒DNA抽提以整个籽粒为材料，提取DNA后无法种植。
[0021]3)本方法 I XDNA 抽提液配方如下:IOmM Tris (pH9.5), ImM EDTA，100 mM KCl ； 不含有毒的酚-氯仿等试剂，对于操作人员更加安全。
[0022]4)本方法利用用96针复制器实现DNA的批量转移，一次可以转移96个样品，每样品约0.5 y L，耗时3飞秒；而通常的DNA转移利用多道移液器进行，需多次更换移液吸头， 转移96个样品所需时间较长。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为水稻籽粒胚乳切取位置。
[0024]图2为利用本方法提取的5个水稻样本胚乳DNA电泳图；图2中:M为DNA ladder; I为R173; 2为日本晴；3为籼小占；4为航恢7号；5为粤晶丝苗2号。
[0025]图3为利用CTAB提取的5个水稻样本胚乳DNA电泳图；图3中:M为DNA ladder; I为R173; 2为日本晴；3为籼小占；4为航恢7号；5为粤晶丝苗2号。
【具体实施方式】
[0026]以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。[0027]实施例1利用本方法提取水稻品种为R173、日本晴、籼小占、航恢7号、粤晶丝苗 2 号 DNA0
[0028]具体方法为:
S1.取带稃壳水稻种子96粒，剥去稃壳，用刀片切取1/3胚乳(约5-8mg) ；S2.所切取的胚乳投入96孔PCR板(Tl板)孔中，对应的剩余籽粒部分(胚
乳和胚)投入另一 96孔PCR板(T2板)孔中，Tl与T2板所投样片的孔编号一一对应；
53.用多通道移液器在Tl板每孔加入100UL I mol/ L NaOH溶液，放入PCR仪，99 V 15 min，T2板放入4°C冰箱备用；
54.Tl板取出，每孔投入I粒钨合金珠，并用多通道移液器吸取180 ii L I XDNA抽提液置入每孔，盖好硅胶盖；
55.将Tl板重新置于PCR仪中，99V，3 min ；
56.取出Tl板，接触涡旋器振动3-4min，直至所有孔的组织较彻底地被破碎；S7.T1板放入离心机，用吊篮转子5000 rpm离心I min ；
58.取出Tl板，用96针复制器沾取上清液(含DNA)至另一96孔PCR板(T3板)中，T3 板每孔中预先加入100 u L双蒸水；
59.取出T3板，置于_20°C冰箱中保存。
[0029]对比例I利用CTAB法提取水稻品种为R173、日本晴、籼小占、航恢7号、粤晶丝苗 2 号 DNA0
[0030]具体方法:
S1.取少量水稻插秧后一月幼叶置于液氮冷冻的2.0 mL灭菌离心管中搅拌至粉末状， 加1000 u L2XCTAB-DNA提取液(质量分数W/V 2%的CTAB，pH8.0 ;质量分数W/V 1%的PVP ； 100 mmol/L Tris-HCl, pH8.0 ；1.4 mol/L NaCl ;20 mmol/L EDTA，pH8.0 ;体积分数 V/V
0.2%的巯基乙醇)； S2.置于65 °C恒温水浴锅中每隔10 min摇动一次，30?45 min 后取出；
53.冷却2min后加1000 U L氯仿-异戊醇(体积比24:1)，上下剧烈充分摇动，使两者混合均匀；
54.10000 rpm离心10 min,轻取上清至1.5 ml灭菌新离心管中，加入600 UL预冷异丙醇上下轻摇均匀；
55._20°C放置 30 min 使 DNA 沉淀；
56.10000 rpm离心6 min,立即倒掉上清倒立离心管于纸巾上；
57.1 min后直立离心管，加入800 u L 70%乙醇和3 M NaAc (体积比9:1)，轻摇使DNA 悬浮放置30 min ；
58.10000 rpm离心6 min,立即倒掉上清加入800 u L 70%乙醇将DNA再次漂洗30
min ；
59.10000 rpm离心3 min,通风樹内烘干；
S10.加入 100-200 u LlXTB Buffer (10 mM Tris-HCl, pH8.0；lmM EDTA, pH8.0)溶
解，4 °C保存备用。
[0031]实施例2实施例1与对比例I两种方法提取的DNA浓度及纯度测定。
[0032]具体方法:1) UV-240紫外分光光度计开机预热IOmin ；2)用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室的S池架上，关上盖板；3)设定狭缝后校零；4)将标准样品和待测样品适当稀释(DNA5 μ I或RNA4y I用TE缓冲液稀释至1000 μ I)后，记录编号和稀释度；5)把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板；6)设定紫外光波长，分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值；7)计算待测样品的浓度与纯度，DNA样品的浓度(μ g/μ I):0D260X稀释倍数X 50/1000，RNA样品的浓度(μ g/μ I):0D260X 稀释倍数 X40/1000。
[0033]实施例3利用凝胶电泳检测实施例1和对比例I所提取的DNA 具体方法:制备1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，观察结果并照相保存。
[0034]对比两种方法提取的DNA浓度及纯度。本方法提取的DNA可以达到CTAB法DNA量的一半左右，CTAB法提取的DNA浓度在74(Tll00ng/ μ L之间，本方法提取的DNA浓度在30(T480ng/ μ L。CTAB法提取的DNA的0D260/0D280在1.8?2.0之间，说明质量完好；本方法提取DNA法提取的DNA的0D260/0D280在1.8?2.0之间。电泳结果表明两种方法提取的DNA均可应用于下一步研究。在耗时方面，以提取水稻96个样为例，本方法需要30分钟，而CTAB法需要3个小时左右。说明本方法可大大提闻DNA抽提效率,并可满足下一步研究需求。`
【权利要求】
1.一种批量提取水稻胚乳DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤:S1.从水稻种子中切取胚乳；S2.将胚乳投入PCR板孔中，所述的PCR板命名为Tl板；S3.Tl板每孔加入50-150 u L碱液，放入PCR仪中进行加热；S4.取出Tl板，每孔投入钨合金珠及150 250 u L I XDNA抽提液；S5.将Tl板重新置于PCR仪中进行加热；S6.取出Tl板，振动3-4min ；S7.将Tl板放入离心机进行离心；S8.取出Tl板，将上清液转移至另一PCR板中，PCR板命名为T3板，T3 板每孔中预先加入5(Tl50 V- L双蒸水；S9.将T3板置于冰箱中保存；S4中IXDNA抽提液的组成为pH9.5的Tris、EDTA, KCl，它们的摩尔比为 5-15:0.5-1.5:50-150。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，SI中所述从水稻种子中切取胚乳是指从每粒水稻种子切取1/3的胚乳。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中每个PCR板孔中投入 5-8mg胚乳。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中所述的碱液为Imol/ L NaOH溶液；加入量为100 u L0
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S3中的PCR条件为99V 15 min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S4中IXDNA抽提液的每孔用量为180 u L5Tris、EDTA和KCl的摩尔比为10:1:100 ;钨合金珠每孔加入I粒。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S5中的PCR条件为99V，3 min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S7中以5000rpm离心I min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Tl板和T3板为96 孔板。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S8中使用96针复制器转移上清液。
【文档编号】C12N15/10GK103436524SQ201310238655
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年6月17日 优先权日:2013年6月17日
【发明者】郭涛, 罗文龙, 陈志强, 王慧, 陈海英, 刘永柱, 张建国 申请人:华南农业大学