左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立的制作方法
【专利摘要】左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，主要步骤如下：1.对志贺菌进行左氧氟沙星等12种抗生素药敏试验，挑选出敏感株做诱导实验；2.测左氧氟沙星对诱导株原代MIC0；3.将单菌落至左氧氟沙星细菌液体培养基中培养；4.取步骤3中菌液至左氧氟沙星细菌液体培养基中传一代，取菌液至左氧氟沙星液体培养基中传两代，药物浓度达到敏感与中介临界值前依次将左氧氟沙星浓度倍增培养细菌，当药物浓度达到敏感与耐药临界值后依次将左氧氟沙星浓度递增培养；当诱导抗菌药物浓度达到2、4、8μg/ml时，菌株在该浓度中诱导培养两天，生长良好的单菌落诱导培养得到志贺菌诱导耐药谱型，对该诱导耐药谱型的菌株进行基因突变分析。
【专利说明】左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及体外构建喹诺酮耐药志贺菌模型的方法，具体涉及喹诺酮类诱导多组志贺菌耐药模型建立的方法。
【背景技术】
[0002]细菌耐药性的出现和蔓延在很大程度上是对抗感染治疗的挑战，以志贺菌为例，众多研究已表明志贺菌目前频繁出现耐药株，且呈耐药产生速度快、耐药范围广、耐药率高、各菌型耐药谱不同等特点，喹诺酮作为目前治疗菌痢的首选药物，上世纪80年代投入使用时志贺菌属细菌对其敏感性高达95%以上，菌痢的疗效曾一度改观。但近40年来，喹诺酮类抗生素应用广泛，且该药与其他抗菌药物一起也用于动物感染的治疗，细菌尤其是肠杆科细菌对喹诺酮类药物呈现较高的耐药性。
[0003]靶基因突变是志贺菌属细菌对喹诺酮类药物的重要分子基础，由染色体介导耐药株靶基因突变存在多态性，诱导株多重耐药性的产生可能是由于激活了它包括AcrAB在内的主动外排系统，主动外排机制和靶基因突变共同存在导致志贺菌属细菌耐哇诺酮类药物，
虽然有研究用喹诺酮类药物诱导志贺菌，但只是诱导一株志贺菌，形成单个诱导体系，所呈现的耐喹诺酮药物靶基因gyrA、parC的突变先后顺序不能排除自身随机突变的影响，且不能从一致性和统计学概率上来解释突变时序的准确性，不能说明问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是克服以上不足，提供一种左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立。
[0005]一种左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，主要方法步骤如下:
(1)用纸片琼脂扩散法对志贺菌进行头孢唑啉、头孢噻肟、氨苄西林、庆大霉素、氯霉素、四环素、复方新诺明、萘啶酸、吡哌酸、环丙沙星、诺氟沙星及左氧氟沙星12种抗生素的药敏试验，以对12种抗菌药物均敏感的为敏感株，判断细菌敏感、中度敏感或耐药，将敏感株于细菌固体培养基平板上划线培养，选取生长良好的单菌落做诱导实验；
(2)用琼脂稀释法测定左氧氟沙星(Levofloxacin,LEV)对诱导株原代的最低抑菌浓度MIC0, LEV敏感、中介、耐药标准依次为MIC ( μ g/ml) ( 2、2~8、≥8 ；
(3)从实验诱导株的细菌固体培养基平板上挑取生长良好的单菌落至至少五管左氧氟沙星浓度为1/4XMIQ的细菌液体培养基中，32°C _39°C震荡培养细菌生长至对数期0D600=0.6-1 ；
(4)取步骤(3)中一定量菌液至至少五管左氧氟沙星含量为1/4XMICtl的细菌液体培养基中再传一代，然后再取一定量菌液至左氧氟沙星浓度为1/2X MICtl的液体培养基中传两代，在药物浓度达到敏感与中介临界值前，依次将左氧氟沙星浓度倍增培养细菌，当药物浓度达到敏感与耐药临界值后依次将左氧氟沙星浓度递增培养，每次递增I μ g/ml ；(5)当诱导抗菌药物浓度达到2、4、8Pg/ml时，菌株在该浓度中诱导培养两天后，暂不诱导传代，先做至少两次无诱导剂传代培养后，再接种于含相同浓度诱导剂的细菌固体培养基平板上过夜培养，挑选生长良好的单菌落继续诱导培养，最终得到至少五组志贺菌诱导耐药谱型；对该诱导耐药谱型的菌株进行基因突变分析；
(6)在诱导传代的过程中，采用琼脂稀释法测定左氧氟沙星对实验诱导株各代的MIC，LEV敏感、中介、耐药标准依次为MIC ( μ g/ml) ( 2、2~8、≤8 ；
(7)构建左氧氟沙星诱导多组志贺菌耐药基因突变模型，以此进行诱导耐药基因突变时序分析。
[0006]上述左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，所述的细菌固体培养基为LB固体培养基，所述的细菌液体培养基为LB液体培养基。
[0007]上述左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，步骤(3)中震荡培养温度为37°C。
[0008]上述左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，步骤(3)中震荡培养细菌生长至0D600=0.9。
[0009]上述左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，步骤(4)中取步骤
(3)中一定量菌液至N管左氧氟沙星含量为1/4X MIC0的LB液体培养基中，使终浓度为5X105CFU/ml。
[0010]上述左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，最终7组志贺菌诱导传代61代。
[0011]上述左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，通过多组基因突变的分析，寻找喹诺酮药物靶基因突变时序的规律，利用这个模型确定在LEV诱导作用下喹诺酮药物靶基因位点突变时序，推断在人体或自然环境中志贺菌在外界LEV压力下喹诺酮药物靶基因位点突变时序，具体为:
(I)采用gyrA基因PCR-RFLP分析和parC基因PCR-RFLP-SSCP分析的方法对通过LEV筛选出的诱导株进行检测:
I)聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)扩增 gyrA 和 parC 基因
①模板DNA制备:煮沸法提取模板DNA:取增菌6小时到达对数生长期的LB增菌肉汤Iml于1.5ml的Eppendorf管中，10000转/分离心I分,弃上清,加三蒸水100 μ I,在震荡器上混匀煮沸10分钟，稍离心，则上清液即为PCR模板DNA，将提好的DNA标号后置_20°C保存备用。
[0012]②引物及引物设计
扩增目的基因片段所需引物参考福氏2a志贺菌株301 gyrA和parC基因公布序列，运用Primer5软件自行设计:
gyrA基因引物:gyrA基因全长2628bp, QRDR区域在第166-410位点。gyrA基因上游引物Al位于gyrA基因第24-43位碱基，下游引物A2位于gyrA基因第652-671位，PCR扩增片段位于 gyrA 基因 24-671 位，产物 648bp:A1:5’ -TAC ACC GGT CAA CAT TAA GG-3，，A2:5’ -TTA ATG ATT GCC GCC GTC GG-3’ ；
parC基因引物:parC基因全长2259bp，QRDR区域在第175-411位点。parC基因上游引物Cl位于parC基因第88-108位碱基，下游引物C2与parC基因第538-556位碱基互补，PCR扩增片段位于parC基因第88-556位点，产物469bp:C1:5，-GCG TTG CCG TTTATT GGT GAT-3’， C2:5’ -GCA GGT TAT GCG GTG GAA T-3’ ；
③PCR扩增方案
【权利要求】
1.左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，其特征在于，主要方法步骤如下: 用纸片琼脂扩散法对志贺菌进行头孢唑啉、头孢噻肟、氨苄西林、庆大霉素、氯霉素、四环素、复方新诺明、萘啶酸、吡哌酸、环丙沙星、诺氟沙星及左氧氟沙星12种抗生素的药敏试验，以对12种抗菌药物均敏感的为敏感株，判断细菌敏感、中度敏感或耐药，将敏感株于细菌固体培养基平板上划线培养，选取生长良好的单菌落做诱导实验； 用琼脂稀释法测定左氧氟沙星对诱导株原代的最低抑菌浓度MICtl，左氧氟沙星敏感、中介、耐药标准依次为MIC ( μ g/ml)≤2、2~8、≥8 ; 从实验诱导株的细菌固体培养基平板上挑取生长良好的单菌落至至少五管左氧氟沙星浓度为1/4XMIQ的细菌液体培养基中，32°C~39 °C震荡培养细菌生长至对数期0D600=0.6~I ； 取步骤(3)中一定量菌液至至少五管左氧氟沙星含量为1/4X MIC0的细菌液体培养基中再传一代，然后再取一定量菌液至左氧氟沙星浓度为1/2X MICtl的液体培养基中传两代，在药物浓度达到敏感与中介临界值前，依次将左氧氟沙星浓度倍增培养细菌，当药物浓度达到敏感与耐药临界值后依次将左氧氟沙星浓度递增培养，每次递增I μ g/ml ； 当诱导抗菌药物浓度达到2、4、8Pg/ml时，菌株在该浓度中诱导培养两天后，暂不诱导传代，先做至少两次无诱导剂传代培养后，再接种于含相同浓度诱导剂的细菌固体培养基平板上过夜培养，挑选生长良好的单菌落继续诱导培养，最终得到至少五组志贺菌诱导耐药谱型，对该诱导耐药谱型的菌株进行基因突变分析； 在诱导传代的过程中，采用琼脂稀释法测定左氧氟沙星对实验诱导株各代的MIC，左氧氟沙星敏感、中介、耐药标准依次为MIC ( μ g/ml) ≤2、2~8、≥8 ； 构建左氧氟沙星诱导多组志贺菌耐药基因突变模型，以此进行诱导耐药基因突变时序分析。
2.如权利要求1所述的左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，特征在于:所述的细菌固体培养基为LB固体培养基，所述的细菌液体培养基为LB液体培养基。
3.如权利要求1所述的左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，特征在于:步骤(3)中震荡培养温度为37°C。
4.如权利要求1所述的左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，特征在于:步骤(3)中震荡培养细菌生长至0D600=0.9。
5.如权利要求1所述的左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，特征在于:步骤(4)中取步骤(3)中一定量菌液至N管左氧氟沙星含量为1/4X MIC0的LB液体培养基中，使终浓度为5 X 105CFU/ml。
6.如权利要求1所述的左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，特征在于:最终7组志贺菌诱导传代61代。
7.如权利要求1所述的左氧氟沙星诱导志贺菌耐药基因突变时序模型的建立，其特征在于:通过多组基因突变的分析，寻找喹诺酮药物靶基因突变时序的规律，利用这个模型确定在LEV诱导作用下喹诺酮药物靶基因位点突变时序，推断在人体或自然环境中志贺菌在外界LEV压力下喹诺酮药物靶基因位点突变时序，具体为: (I)采用gyrA基因PCR-RFLP分析和parC基因PCR-RFLP-SSCP分析的方法对通过LEV筛选出的诱导株进行检测； 1)聚合酶链式反应扩增gyrA和parC基因: ①模板DNA制备:煮沸法提取模板DNA:取增菌6小时到达对数生长期的LB增菌肉汤Iml于1.5ml的Eppendorf管中，10000转/分离心I分,弃上清,加三蒸水100 μ I,在震荡器上混匀煮沸10分钟，稍离心，则上清液即为PCR模板DNA，将提好的DNA标号后置_20°C保存备用； ②引物及引物设计:扩增目的基因片段所需引物参考福氏2a志贺菌株301gyrA和parC基因公布序列,运用Primer5软件自行设计: gyrA基因引物:gyrA基因全长2628bp，喹诺酮耐药决定区(QRDR)在第166-410位点；gyrA基因上游引物Al位于gyrA基因第24-43位,下游引物A2位于gyrA基因第652-671位，PCR扩增片段位于gyrA基因24-671位，产物648bp:
Al:5，-TAC ACC GGT CAA CAT TAA GG-3，，
A2:5’ -TTA ATG ATT GCC GCC GTC GG-3’， parC基因引物:parC基因全长2259bp，QRDR区域在第175-411位点；parC基因上游引物Cl位于parC基因第88-108位碱基，下游引物C2与parC基因第538-556位碱基互补，PCR扩增片段位于parC基因第88-556位点，产物469bp:
Cl:5’ -GCG TTG CCG TTT ATT GGT GAT-3’，
C2:5’ -GCA GGT TAT GCG GTG GAA T-3’， ③PCR扩增方案` 表1 gyrA和parC基因PCR扩增体系(50 μ I)
【文档编号】C12N1/20GK103756993SQ201310239279
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年6月18日 优先权日:2013年6月18日
【发明者】段广才, 王颖芳, 杨海燕, 宋春花, 马楠, 张卫东 申请人:郑州大学