专利名称：一种重组人白细胞介素21工程菌及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种重组人白细胞介素21工程菌及其制备方法，属于基因工程领域。
背景技术：
白细胞介素-21属于I类细胞因子，属于γc(共同γ链)依赖性细胞因子家族成员，与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15共用受体γ链。IL-21对各种免疫细胞都具有广泛的调节作用，能促进CD8+T、NK细胞功能的成熟，增强其细胞毒活性；促进CD4+T细胞分化及细胞因子的分泌；促进B细胞功能成熟、Ig类别转换及浆细胞的分化。IL-21通过对不同状态下免疫细胞的活化或凋亡清除的网络性调节而维持免疫细胞内环境稳态，对预防自身免疫性疾病、肿瘤形成和抗感染都发挥关键性作用，是一个有潜力的用于免疫治疗的细胞因子，值得深入地进行研究和开发，而这又是以能够大量制备白细胞介素-21为前提的。
基因工程方法生产生物药品是一种普遍采用的成熟而简便的方法，其中用基因工程菌发酵的方法又是最常采用的生产方法，它具有生产流程简单易操作、蛋白质产量高、表达量稳定、便于纯化回收等优点。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种重组人白细胞介素21工程菌及其制备方法，并对其发酵条件进行了探索。
一种构建重组人白细胞介素21工程菌的方法，步骤如下 (1)合成PCR引物上游引物为5′-GGGAATTCCATATGCAAGATCGCCACATGAT-3′；下游引物为5′-ACCGCTCGAGGGAATCTTCACTTCCGTGTGT-3′； (2)PCR扩增目的片段以重组质粒pcDNA3-IL-21为模板，通过PCR基因扩增，获得IL-21基因片段； (3)DNA测序鉴定将上述PCR扩增得到的IL-21基因片段和pMD18-T载体连接，构建重组载体pMD18-T-IL-21，将重组载体pMD18-T-IL-21转化细菌，用含氨苄霉素的培养基筛选阳性克隆，并进行DNA测序鉴定； (4)构建重组载体将pMD18-T-IL-21重组质粒与pET30a(+)载体分别用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切，回收，得到的目的片段，在T4DNA连接酶的作用连接，温度为16～25℃，时间16～20℃时，时间≥6h；20～25℃时，时间≥5min； (5)转化将重组载体pET30a(+)-IL-21转化细菌，构建重组IL-21工程菌； 所述步骤(2)的具体操作过程为以重组质粒pcDNA3-IL-21为模板，于50μl反应体系中加入MgCl2 0.1mmol、dNTP 0.01mmol、上游及下游引物各60pmol、Taq DNA聚合酶1u；PCR条件95℃5min，94℃1min，58℃1min，72℃1min，循环35次，72℃延长7min；PCR产物用1％低熔点琼脂糖电泳纯化回收。
所述步骤(3)的具体操作过程为将上述PCR扩增得到的IL-21基因片段与pMD18-T载体在连接复合物作用下于16℃连接；将重组载体pMD18-T-IL-21转化大肠杆菌DH5α，平铺于含氨苄青霉素的选择性培养基上筛选阳性克隆，进行DNA测序鉴定。
一种人白细胞介素21工程菌，是由如下步骤构建而成 (1)合成PCR引物上游引物为5′-GGGAATTCCATATGCAAGATCGCCACATGAT-3′；下游引物为5′-ACCGCTCGAGGGAATCTTCACTTCCGTGTGT-3′； (2)PCR扩增目的片段以重组质粒pcDNA3-IL-21为模板，通过PCR基因扩增，获得IL-21基因片段； (3)DNA测序鉴定将上述PCR扩增得到的IL-21基因片段和pMD18-T载体连接，构建重组载体pMD18-T-IL-21，将重组载体pMD18-T-IL-21转化细菌，用选择性培养基筛选阳性克隆，进行DNA测序鉴定； (4)构建重组载体将pMD18-T-IL-21重组质粒与pET30a(+)载体分别用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切，回收，得到的目的片段，在T4DNA连接酶的作用连接，温度为16～25℃，时间16～20℃时，时间≥6h；20～25℃时，时间≥5min； (5)转化将重组载体pET30a(+)-IL-21转化细菌，构建重组IL-21工程菌； 所述重组质粒pcDNA3-IL-21是这样构建的先采用RT-PCR技术从人外周血单个核细胞获得IL-21DNA(506bp)，然后采用常规技术将其导入质粒pcDNA3，得到重组质粒pcDNA3-IL-21。
所述连接复合物pMD18-T载体，购自于宝生物工程(大连)有限公司，TaKaRa CodeD101A。
本发明具有的有益效果主要表现在(1)本工程菌虽然是IPTG诱导的，但是其表达对温度非常敏感，其最佳诱导表达的温度为42℃，在37℃基本不表达。而对于以pET30a(+)为载体的重组质粒基因工程菌其发酵温度通常为37℃或者更低，这为工程菌发酵条件的探索提供了有益的启示；(2)表达的重组人IL-21是以高纯度的包涵体形式存在，可有效避免细胞水解酶对蛋白质的破坏，有利于目的蛋白质的保护和分离；(3)目的蛋白质含6×His tag结构，便于蛋白质的纯化；(4)目的蛋白表达量高，以现有的蛋白质复性方法，能够得到具有生物学活性的蛋白质，生产成本低。
图1为重组载体pET30a(+)-IL-21的构建图谱； 图2为pMD18-T-IL-21重组克隆载体的双酶切电泳分析图； 其中，1.人IL-21基因的PCR产物；2.pMD18-T-IL-21双切后得到的pMD18-T和IL-21两个片段；3.标准DNA分子量1Kb DNA ladder。
图3为pET30a(+)-IL-21重组克隆载体的双酶切电泳分析图； 其中，4.人IL-21基因PCR产物；5.标准DNA分子量1Kb DNA ladder；6.pET30a(+)-IL-21双切后得到的两个片段。
图4为实施例3中的SDS-PAGE电泳分析图； 其中，7.诱导0h；8.诱导4h；9.洗涤后包涵体；10.20mM咪唑缓冲液洗脱掉的杂蛋白；11.纯化得到的rhIL-21；M.标准蛋白质Mark。
图5为实施例3中的Western-blot鉴定图； 其中，12.诱导4h时工程菌总蛋白；13.低分子量蛋白质Mark。
图6为rhIL-21协同IL-2对NK92的促增殖效应图； 其中，横坐标表示不同浓度的rhIL-21，单位为ng/ml；纵坐标表示培养48h后不同药物浓度下NK细胞数，单位为104/ml。
具体实施例方式 实施例构建一种重组人白细胞介素21的工程菌，步骤如下 (1)合成PCR引物上游引物为5′-GGGAATTCCATATGCAAGATCGCCACATGAT-3′，外设NdeI酶切位点并包含起始密码子ATG； 下游引物为5′-ACCGCTCGAGGGAATCTTCACTTCCGTGTGT-3′，外设XhoI酶切位点。引物由博尚生物技术有限公司合成和纯化。
(2)PCR扩增目的片段以重组质粒pcDNA3-IL-21为模板，于50μl反应体系中加入MgCl2 0.1mmol、dNTP 0.01mmol、上游及下游引物各60pmol、Taq DNA聚合酶1u；PCR条件为95℃5min，94℃1min，58℃1min，72℃1min，循环35次，72℃延长7min；PCR产物用1％低熔点琼脂糖电泳纯化回收。
(3)DNA测序鉴定将上述PCR扩增得到的IL-21基因片段与pMD18-T载体在连接复合物pMD18-T vector(购自于宝生物工程(大连)有限公司，TaKaRa CodeD101A)作用下于16℃连接；将重组载体pMD18-T-IL-21转化大肠杆菌DH5α，平铺于含Amp抗生素的选择性培养基上筛选阳性克隆，进行DNA测序鉴定。
(4)构建重组载体将pMD18-T-IL-21重组质粒与pET30a(+)载体分别用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切，回收，得到的目的片段，在T4DNA连接酶的作用下16℃过夜(约10小时)连接，如图1所示。
(5)转化将重组载体pET30a(+)-IL-21转化到BL21大肠杆菌先取连接复合物加入到200μlBL21感受态细胞中混匀，冰浴30分钟；然后于42℃热休克90秒，再转到冰浴中2分钟；再加LB培养基800μl，于37度摇床120转/分钟，45分钟；最后把菌液平铺于含卡那霉素的平板上，晾干倒置于37℃孵育箱，12小时后观察有无单克隆菌株出现，若有，即为转化成功的工程菌。
实验例1对构建的pMD18-T-IL-21重组克隆载体进行双酶切电泳分析和DNA序列检测，结构如图2所示，由图可知，IL-21基因片段有效地连接到pMD-18T载体中了。
实验例2将重组载体pET30a(+)-IL-21转化入DH5α大肠杆菌，在含卡那霉素的选择性培养基上筛选阳性重组子，对阳性重组克隆载体做双酶切电泳分析，并进行DNA测序鉴定，电泳分析如图3所示。由图可知，IL-21DNA已准确地插入pET30a(+)表达载体酶切位点NdeI和XhoI之间；DNA测序表明无基因突变。
实验例3参照文献郑瑞，许晓群，张彩等.重组人白细胞介素21表达条件的探讨[J].中国生化药物杂志，2007，28(5)294-296中的发酵条件，进行发酵挑取单克隆工程菌接种于10ml含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养液，37℃活化培养。取活化后菌液接种到新的含卡那霉素的LB培养液中，37℃培养至A600nm＝1±0.1时，按工程菌与新鲜LB培养基以1∶1.5的接种比例接种至工程菌的浓度为A600nm＝0.4时，直接加终浓度为1mM的IPTG，于42℃恒温水浴箱诱导发酵。
收集诱导后4h的工程菌液，超声波破菌，分别将全菌、超声破碎后的离心沉淀和上清进行SDS-PAGE电泳分析(如图4所示)，并对全菌蛋白进行Western-blot鉴定如图5所示(人IL-21抗体购自深圳晶美生物工程有限公司，产品号ab5978)。电泳后，凝胶经激光扫描并采用Kodark Digital Science 1D分析软件对IL-21表达量和蛋白分子量进行分析，rhIL-21表达量＝(目的蛋白质条带的扫描密度/工程菌所有蛋白质条带的扫描密度)×100％＝(659542÷20 60170)×100％＝32.01％，SDS-PAGE表明目的蛋白质表达量占菌体总蛋白质的32％，western-blot显示有一条与IL-21单克隆抗体(ab5978)结合的约15-17kD分子量的蛋白质电泳带。
实验例4提取纯化rhIL-21步骤为 (1)参照文献郑瑞，许晓群，张彩等.重组人白细胞介素21表达条件的探讨[J].中国生化药物杂志，2007，28(5)294-296中的条件，进行发酵挑取单克隆工程菌接种于10ml含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养液，37℃活化培养。取活化后菌液接种到新的含卡那霉素的LB培养液中，37℃培养至A600nm＝1±0.1时，按工程菌与新鲜LB培养基以1∶1.5的接种比例接种至工程菌的浓度为A600nm＝0.4时，直接加终浓度为1mM的IPTG，于42℃恒温水浴箱诱导发酵。
(2)收集诱导4h的工程菌液500ml，3000rpm×10min离心后用40ml Buffer A(100mMNaH2PO4、10mM Tris、1mM EDTA、40mM β-巯基乙醇、5％甘油、pH 8.0)重悬，用超声破菌仪破菌，12000g离心30min，离心，收集包涵体。用Buffer B(100mM NaH2PO4、10mM Tris、1M尿素、1mM EDTA、2％Trixton-100、40mM β-巯基乙醇、pH8.0)洗涤包涵体沉淀，12000g离心30min离心获得包涵体。
(3)包涵体用100ml Buffer C(100mM NaH2PO4、10mM Tris、8M尿素、40mM β-巯基乙醇、pH 8.0)悬起置4℃冰箱6h以上，12000g离心30min，弃沉淀。溶解上清移至透析袋内，依次于500ml Buffer D(100mM NaH2PO4、10mM Tris、2M尿素、0.01％SDS、40mM β-巯基乙醇、pH 8.0)、500ml Buffer E(100mM NaH2PO4、10mM Tris、0.01％SDS、40mM β-巯基乙醇、pH 8.0)、500ml Buffer F(100mM NaH2PO4、10mM Tris、pH 8.0)透析液中4℃透析8h，12000g离心30min取上清，得到复性后蛋白质。
(4)根据Ni-NTA Sepharose纯化试剂盒说明书对含6×His tag的目的蛋白质进行纯化。将复性后的rhIL-21加到Ni-NTA亲和层析柱，用20mM咪唑洗脱掉大部分杂蛋白质后，用250mM咪唑洗脱目的蛋白质，能获得纯度达95％以上rhIL-21，用考马斯亮蓝G-250染色法测蛋白质浓度，结果为平均每500ml工程菌最终可以得到8～10mg纯化的rhIL-21。
实验例5rhIL-21的活性检测(rhIL-21由实验例4制得) 以10u/ml的IL-2和不同浓度梯度的rhIL-21培养NK92细胞，48h后细胞计数，以rhIL-21浓度为横坐标，细胞数量为纵坐标做图，如图6所示，由图可知，rhIL-21在终浓度为275～5500ng/ml时对NK92细胞有不同程度的协同增殖作用，但最高浓度组rhIL-21对NK92细胞的促增殖作用反而比其他浓度组降低，这可能是因为在复性过程中使用了SDS，而高浓度rhIL-21组中SDS含量也是最高的，rhIL-21对NK92细胞的促增殖作用一部分被SDS所抵消，低药物浓度组中SDS对NK92细胞生长的影响很小，所以rhIL-21的促增殖作用能充分的表现出来，且呈现出rhIL-21剂量依赖性的增殖特点。
本说明书未详述之处均为本领域技术人员所掌握和熟知，不再赘述。
权利要求
1.一种构建重组人白细胞介素21工程菌的方法，其特征在于步骤如下
(1)合成PCR引物上游引物为5′-GGGAATTCCATATGCAAGATCGCCACATGAT-3′；下游引物为5′-ACCGCTCGAGGGAATCTTCACTTCCGTGTGT-3′；
(2)PCR扩增目的片段以重组质粒pcDNA3-IL-21为模板，通过PCR基因扩增，获得IL-21基因片段；
(3)DNA测序鉴定将上述PCR扩增得到的IL-21基因片段和pMD18-T载体连接，构建重组载体pMD18-T-IL-21，将重组载体pMD18-T-IL-21转化细菌，用选择性培养基筛选阳性克隆，进行DNA测序鉴定；
(4)构建重组载体将pMD18-T-IL-21重组质粒与pET30a(+)载体分别用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切，回收，得到的目的片段，在T4DNA连接酶的作用下连接，温度为16～25℃，时间16～20℃时，≥6h；20～25℃时，≥5min；
(5)转化将重组载体pET30a(+)-IL-21转化细菌，构建重组IL-21工程菌。
2.根据权利要求1所述的一种构建重组人白细胞介素21工程菌的方法，其特征在于所述步骤(2)的具体操作过程为以重组质粒pcDNA3-IL-21为模板，于50μl反应体系中加入MgCl2 0.1mmol、dNTP 0.01mmol、上游及下游引物各60pmol、Taq DNA聚合酶1u；PCR条件95℃5min，94℃1min，58℃1min，72℃1min，循环35次，72℃延长7min；PCR产物用1％低熔点琼脂糖电泳纯化回收。
3.根据权利要求1所述的一种构建重组人白细胞介素21工程菌的方法，其特征在于所述步骤(3)的具体操作过程为将上述PCR扩增得到的IL-21基因片段与pMD18-T载体在连接复合物作用下于16℃连接；将重组载体pMD18-T-IL-2I转化大肠杆菌DH5α，平铺于含氨苄青霉素的选择性培养基上筛选阳性克隆，进行DNA测序鉴定。
4.一种人白细胞介素21工程菌，其特征在于是由如下步骤构建而成
(1)合成PCR引物上游引物为5′-GGGAATTCCATATGCAAGATCGCCACATGAT-3′；下游引物为5′-ACCGCTCGAGGGAATCTTCACTTCCGTGTGT-3′；
(2)PCR扩增目的片段以重组质粒pcDNA3-IL-21为模板，通过PCR基因扩增，获得IL-21基因片段；
(3)DNA测序鉴定将上述PCR扩增得到的IL-21基因片段和pMD18-T载体连接，构建重组载体pMD18-T-IL-21，将重组载体pMD18-T-IL-21转化细菌，用选择性培养基筛选阳性克隆，进行DNA测序鉴定；
(4)构建重组载体将pMD18-T-IL-21重组质粒与pET30a(+)载体分别用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切，回收，得到的目的片段，在T4DNA连接酶的作用下连接，温度为16～25℃，时间16～20℃时，时间≥6h；20～25℃时，时间≥5min；
(5)转化将重组载体pET30a(+)-IL-21转化细菌，构建重组IL-21工程菌。
全文摘要
本发明公开了一种重组人白细胞介素21工程菌极其构建方法，构建步骤为先通过PCR扩增获得目的片段，然后经DNA测序鉴定后，使目的片段与pET30a(+)载体连接，然后转化细菌，即获得工程菌。本发明的工程菌的最佳发酵诱导温度为42℃，较普通菌高，为工程菌发酵条件的探索提供了有益的启示和科学研究价值；表达的IL-21是以高纯度的包涵体形式存在，可有效避免细胞水解酶对蛋白质的破坏，表达的目的蛋白质含6个His tag结构，便于纯化出高纯度的重组蛋白质。
文档编号C12R1/19GK101240276SQ20081001517
公开日2008年8月13日 申请日期2008年3月18日 优先权日2008年3月18日
发明者许晓群, 王郡甫, 瑞 郑, 彩 张, 张建华, 刘金生 申请人:山东省医学科学院基础医学研究所