专利名称：：一种生物细胞冷冻抗冻剂的制作方法
技术领域：
：本发明属于超低温生物学领域，涉及一种将生物组织材料进行超低温冷冻保存，解冻后，仍能保持其生物学活性的技术，具体涉及一种生物细胞冷冻抗冻剂；还涉及细胞冷冻抗冻剂的制备方法及其在哺乳动物体细胞、卵母细胞、早期胚胎及器官组织冷冻保存中的应用；特别在各种哺乳动物精液的冷冻保存中的应用。技术背景动物器官组织或者细胞经过特殊处理，保存在超低温中，抑制了其代谢活动，使其在相对静止的状态下保存下来。一旦升温又能复苏而不失去生命活动能力。复苏过程较为公认的理论是冷冻解冻过程中，在冷冻保护剂保护的作用下，阻止了细胞内水分的冰晶化，而直接形成玻璃化或是从玻璃化直接变为液态，越过了冰晶化。冰晶化是在降温过程中，水分子重新按几何图形排列形成结晶体(冰晶)。首先，细胞外水分形成冰晶，使胞外水分子迅速减少，细胞内水分子被迫通过半透膜扩散到细胞外，从而造成细胞脱水，原生质变干，使电解质浓度增高，酸碱度失去平衡，造成不可逆的化学损伤；其次冰晶还细胞内部产生，破坏细胞结构，引起细胞死亡。另一方面细胞外水分结成冰晶后，体积增大，冰晶块增大、移动，对细胞产生机械性的物理损伤，使细胞原生质表层破坏而失去保护作用。也就是说结晶形成的越大，对细胞的危害就会越大。玻璃化是在超低温下，水分子保持原来无序的排列，呈现微粒结晶且坚实均匀的纯粹玻璃样结构(即玻璃化冻结)。细胞在玻璃化冻结状态下，不会出现原生质脱水等现象，使细胞结构受到保护，解冻后的细胞仍能恢复活力。冰晶化和玻璃化形成的条件冰晶化是在0-60。C低温(冰晶化温度)区域内，缓慢降温的条件下形成的。玻璃化是在-60-250r超低温(玻璃化温度)区域内，快速越过冰晶化阶段后形成的，但玻璃化是可逆的、不稳定的，当缓慢升温再次经过冰晶化温度区域时，玻璃化又会转变为冰晶化。因此，在细胞冷冻过程中，如何使细胞快速越冰晶化进入玻璃化，是冷冻成败的关键。目前多采用的方法是在细胞稀释液中加入抗冻剂，快速冷冻、解冻，使细胞在冷冻解冻过程中迅速越过细胞致死危险温区(-15-60°C)，降低冰晶的形成，使细胞得以存活。目前所采用的抗冻物质有甘油、2—甲基亚砜、丙二醇等，它们对防止冰晶形成有着重要的作用。甘油等亲水性很强，可以在水结晶的过程中限制和干扰水分子晶.格排列，防止水形成结晶；又可使水处于过冷状态，降低水形成结晶的温度，縮短细胞穿越冰晶温度区的时间。但甘油等在常温下对细胞具有一定的毒害作用，造成细胞内蛋白质的变性。目前为了解决这一问题，科研工作者进行了大量的尝试，但是冷冻后细胞的存活率仍不理想。有关海带多糖作为生物材料抗冻保护剂的研究国内外至今未见报道。
发明内容针对目前哺乳动物胚胎、精子、细胞及器官组织冷冻后存活率低的问题，本发明的目的在于提供一种制备方法简单、成本低而且冷冻保藏效果好的生物细胞冷冻抗冻剂。实现上述发明目的技术方案是一种生物细胞冷冻抗冻剂，该lOOml细胞冷冻抗冻剂由下列原料组成海带多糖0.025~0.3g、葡萄糖2.0~3.5g、柠檬酸钠0.5L5g、蒸馏水6080ml、白蛋白10~20ml、甘油518ml、青霉素515万单位。本发明的优选配方该100ml细胞冷冻抗冻剂由下列原料组成海带多糖0.050.2g、葡萄糖2.04~2.23g、柠檬酸钠0.95~1.04g、蒸馏水65.00~71.12ml、白蛋白1718.6ml、甘油715ml、青霉素8.5~9.3万单位。本发明的最佳配方该100ml细胞冷冻抗冻剂由下列原料组成海带多糖0.1g、葡萄糖2.16g、柠檬酸钠1.008g、蒸馏水72ml、白蛋白18ml、甘油10ml、青霉素IO万单位。本发明的中所述的白蛋白为牛血清白蛋白或人血清白蛋白。本发明的中所述的海带多糖是经由天然海带(LaminarianponicaAresch.)浸提，浓縮，除蛋白，透析除杂，醇沉等步骤提取的粗多糖。本发明还有一个目的是提供上述生物细胞冷冻抗冻剂的制备方法，包括下列步骤1)称取各原料海带多糖、葡萄糖、柠檬酸钠、蒸馏水、白蛋白、甘油、青霉素，备用；2)将葡萄糖和柠檬酸钠水溶液配置成基础液；3)将基础液与白蛋白混合均匀后添加青霉素配制成I液4)在I液里添加甘油配制成II液；5)在n液中加入海带多糖混合均匀；6)再将pH值调为67.5，然后进行过滤灭菌，冷却至室温，放入25°C冰箱中备用。本发明还有一个目的是提供上述生物细胞冷冻抗冻剂在冷冻保藏哺乳动物的精子、卵母细胞、体细胞、器官中的应用。与现有技术相比，本发明生物细胞冷冻抗冻剂具有以下优点1)本发明首次将海带多糖添加到冷冻基础液中，进行细胞、精液、器官组织的冷冻保存，均获得了良好的效果，细胞解冻后的存活率大大提高，尤其解决了猪精液冷冻解冻后存活率低的世界性难题，该发明进一步拓展了超低温生物学的研究范围，为超低温保护材料提供了新的途径。2)本发明生物细胞冷冻抗冻剂的制备方法简单。3)本发明生物细胞冷冻抗冻剂的生产成本低，对所冷冻材料没有任何毒副作用。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步说明实施例1提取的粗多糖方法本发明的中所述的海带多糖是经由天然海带(LaminarianponicaAresch.)浸提，浓縮，除蛋白，透析除杂，醇沉等步骤提取的粗多糖。具体步骤海带洗净、烘干、粉碎，称重后添加25倍的蒸馏水，加热到90°C，浸提5h。用布氏漏斗真空抽滤，得到浸提液。利用旋转式蒸发仪将浸提液浓縮5倍。然后在浓縮液中加入l/3体积的氯仿戊醇(4:1)，震荡30min，4000rpm离心30min，收集上清液，重复45次。后用透析袋除杂。用4倍体积的95%乙醇，在4。C沉淀24h后，4000rpm离心，取沉淀物干燥，粉碎。实施例2用电子分析天平称取2.16g葡萄糖和1.008g柠檬酸钠，将其溶于72ml蒸馏水中，用磁力搅拌器搅拌均匀配制成基础液；在基础液中加入18ml白蛋白混匀，添加IO万IU青霉素配制成I液；在I液添加lOml甘油配制成II液；在II液中添加海带多糖使海带多糖的浓度为0.025g/100ml，调pH值为6.21，然后进行过滤灭菌，冷却至室温，放入4X:冰箱中备用。实施例3该100ml细胞冷冻抗冻剂由下列原料组成海带多糖0.05g、葡萄糖2.16g、柠檬酸钠1.008g、蒸馏水78ml、白蛋白15ml、甘油7ml、青霉素8万单位。实施例4该100ml细胞冷冻抗冻剂由下列原料组成海带多糖0.1g、葡萄糖2.5g、柠檬酸钠1.114g、蒸馏水73ml、白蛋白20ml、甘油9ml、青霉素12万单位。实施例5该100ml细胞冷冻抗冻剂由下列原料组成海带多糖0.15g、葡萄糖2.9g、柠檬酸钠1.308g、蒸馏水70ml、白蛋白19ml、甘油llml、青霉素9万单位。实施例6该100ml细胞冷冻抗冻剂由下列原料组成海带多糖0.138g、葡萄糖2.88g、柠檬酸钠1.5g、蒸馏水75ml、白蛋白20ml、甘油5ml、青霉素11万单位。实施例7该100ml细胞冷冻抗冻剂由下列原料组成海带多糖0.3g、葡萄糖2.57g、柠檬酸钠1.06g、蒸馏水73ml、白蛋白20ml、甘油7ml、青霉素15万单位。试验例1以猪精液冷冻保存进行说明。(一)冷冻保存液的配制冷冻保存液按照实施例配置，以常用的冷冻保存液TCG为对照组，进行比较说明。(二)荧光染液的配制称取0.002g罗丹明123溶于lmlDMSO，0.45)im滤膜过滤后，避光贮存；称取0.0002gPI溶于10mlPBS中，0.45pm滤膜过滤后，一20。C避光贮存；增光剂，甘油:PBS(9:1);封片采用无色指甲油。(三)精液的采集与预处理用手握法采精，选择中段浓度精液经4层纱布过滤，除去胶状物后，用生物显微镜于37"C下进行常规品质检查。选择无异味，色泽乳白色，形态正常，活率在0.7以上密度的精液供试。将质量合格的精液保存在3235'C的水浴中平衡6080min，使精子与精清充分接触，然后经800r/min离心10min,弃掉精清。(四)精液冷冻1.采集新鲜的猪精液在高速离心机中以17°C、800g/min的速度离心IO分钟，弃上清，得到白色沉淀。将得到的沉淀用基础液等温稀释后轻轻摇匀，并置于17。C恒温下平衡3小时。将平衡的溶液用离心机以17°C、800g/min的速度离心10分钟，加稀释I液至2mL，轻轻摇匀后置于5"C下平衡2小时，然后加入稀释II液轻轻摇匀置于5。C下再平衡2小时。2.装管，进行冷冻，具体步骤如下首先置于程序冷冻仪中缓慢降温，开始设定的温度为5°C，然后以2°C/min的速度缓慢降温到-5。C。然后投(五)解冻与活率鉴定1.用镊子将冷冻管迅速取出，放入37t:恒温水浴锅内解冻。2.将解冻后的细管精液，用等温的基础液稀释调整密度至36X106个精子/ml。先取等温的100u1HEPES/BSA缓冲液置于预温的1.5mlE卯endorf离心管中，然后加入lul罗丹明123贮存液和lylPI贮存液，避光孵育10min，最后加入50u1精液，在37°C、黑暗潮湿的环境孵育30min。取10u1精子悬液于载玻片上，加少量增光剂，混匀后盖上盖玻片，荧光显微镜(400X)下观察。死精子在波长488nm紫外光激发下头部核区发红色荧光。活精子和有活性线粒体的精子头部不发光，而尾巴线粒体部分(中段)有亮绿色荧光。(六)评定结果每组每次至少数200个精子，重复5次以上，求平均值。结果见表1。从表中可以看出本发明中最佳配方的冷冻保存液可使精子冻后活率达5.0以上。试验例2，以大鼠胰腺细胞冷冻保存进行说明。(一)一般传代细胞，用胰蛋白酶将贴壁细胞消化，制成细胞悬浮液。加含有牛血清的保护液EMDM，阻止消化。(二)将上述细胞悬浮液离心5min(1200rpm/min)，然后弃掉上清夜，添加冷冻保护液液(配置方法参照实施例l，2，3)，形成悬浮液。并以90。Z牛血清和10X固S0常规冷冻液作为对照组。(三)装管(方法同试验例l(四))，装管后，平衡1520min，再将细管放入冷冻仪；按照冷冻仪程序冷冻，以2"C/min的速度从5.9'C降温到-5.5。C，平衡510min，再以0.20.6。C/min的速率下降至-40-50。C，在平衡5min后投入液氮保存。(四)评定结果每组每次至少数100个细胞，重复5次以上，求平均值。结果见表l。从表中可以看出本发明中最佳配方的冷冻保存液可使大鼠胰腺细胞冻后存活率达42%。试验例3以牛卵母细胞冷冻保存进行说明。(一)从废弃的卵巢中获得卵母细胞，反复清洗，干净后，移入冷冻保护液中平衡1020min。以75%DMEM、15%小牛血清和10%DMSO的冷冻液做为对照组。(二)按照试验例2(三)的方法进行冷冻。(三)解冻后进行培养，统计活率，每组每次至少数100个卵母细胞，重复3次以上，求平均值，结果见表l。从表中可以看出本发明中最佳配方的冷冻保存液使牛卵母细胞细胞冻后存活率达到44%。试验例4以猪胚胎冷冻保存进行说明。(一)将体外受精的猪胚胎按照试验例3方法进行冷冻。以75%的DMEM、15%的小牛血清和10%DMSO的冷冻液做为对照组。(二)解冻后统计活率，每组每次至少数50个胚胎细胞，重复3次以上，求平均值，结果见表l。从表中可以看出，本发明中最佳配方的冷冻保存液使猪胚胎冻后活率达到52%。表1试验例结果一览表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>权利要求1、一种生物细胞冷冻抗冻剂，其特征在于该100ml细胞冷冻抗冻剂由下列原料组成海带多糖0.025～0.3g、葡萄糖2.0～3.5g、柠檬酸钠0.5～1.5g、蒸馏水60～80ml、白蛋白10～20ml、甘油5～18ml、青霉素5～15万单位。2、根据权利要求1所述的生物细胞冷冻抗冻剂，该100ml细胞冷冻抗冻剂由下列原料组成海带多糖0.05~0.2g、葡萄糖2.042.23g、柠檬酸钠0.951.04g、蒸馏水65.007U2ml、白蛋白1718.6ml、甘油715ml、青霉素8.59.3万单位。3、根据权利要求1所述的生物细胞冷冻抗冻剂，该100ml细胞冷冻抗冻剂由下列原料组成海带多糖O.lg、葡萄糖2.16g、柠檬酸钠1.008g、蒸馏水72ml、白蛋白18ml、甘油10ml、青霉素10万单位。4、根据权利要求l、2或3所述的生物细胞冷冻抗冻剂，其特征在于所述的白蛋白为牛血清白蛋白或人血清白蛋白。5、根据权利要求K2或3所述的生物细胞冷冻抗冻剂，其特征在于所述的海带多糖是经由天然海带(LaminarianponicaAresch.)浸提，浓縮，除蛋白，透析除杂，醇沉等步骤提取的粗多糖。6、制备权利要求1所述的生物细胞冷冻抗冻剂的方法，其特征在于，包括下列步骤1)称取各原料海带多糖、葡萄糖、柠檬酸钠、蒸馏水、白蛋白、甘油、青霉素，备用；2)将葡萄糖和柠檬酸钠水溶液配置成基础液；3)将基础液与白蛋白混合均匀后添加青霉素配制成I液；4)在I液里添加甘油配制成II液；5)在II液中加入海带多糖混合均匀；6)再将pH值调为67.5，然后进行过滤灭菌，冷却至室温，放入25°C冰箱中备用。7、权利要求1所述的生物细胞冷冻抗冻剂在冷冻保藏哺乳动物的精子、卵母细胞、体细胞、器官中的应用。全文摘要本发明公开了一种生物细胞冷冻抗冻剂，该100ml细胞冷冻抗冻剂由下列原料组成海带多糖0.025～0.3g、葡萄糖2.0～3.5g、柠檬酸钠0.5～1.5g、蒸馏水60～80ml、白蛋白10～20ml、甘油5～18ml、青霉素5～15万单位。其制备方法是将葡萄糖、柠檬酸钠溶于蒸馏水中配制成基础液；在加入白蛋白混合均匀后添加青霉素配制成I液；在I液里添加甘油配制成II液；在II液中加入海带多糖混合均匀；再调pH值为6～7.5，然后进行过滤灭菌，冷却至室温，放入2～5℃冰箱中备用。该细胞冷冻保护液适用于哺乳动精液、体细胞、卵母细胞、早期胚胎及器官组织冷冻保存，特别适用于各种哺乳精液冷冻保存。文档编号C12N5/06GK101220346SQ20081001749公开日2008年7月16日申请日期2008年2月3日优先权日2008年2月3日发明者婷张,张树山,李青旺,江中良,胡建宏申请人:西北农林科技大学