专利名称：一种利用菊芋原料糖化和发酵同步进行生产乙醇的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新的乙醇生产方法。
技术背景由于化石类资源有限且呈枯竭之势，能源短缺已是当今社会面临的一个重大问题。发 展可再生的生物质能源是解决日趋紧张的能源供应的有效途径。生物质能源是利用能源植 物或农林业有机废弃物生产出来的一种清洁能源产品，其中燃料乙醇是发展生物质能源的 首选产品。目前全球燃料乙醇年产规模近3000万吨，而我国燃料乙醇生产能力仅150万 吨左右，主要以玉米、小麦等粮食作物为原料。鉴于我国人多地少、粮食生产压力大，以 玉米、小麦等粮食作物为原料的燃料乙醇发展空间受到极大限制，难以长久支撑我国燃料 乙醇产业持续发展，因此必须走原料多元化道路。据统计原料成本占燃料乙醇生产成本的 70%_80%。因此，开发价廉、产量高、综合利用价值高的能源作物势在必行。菊芋等经济 作物成为可供选择的原料。菊芋(Jerusalem artichoke)系多年生草本植物，地下块茎型如生姜，俗称"洋姜"。 菊芋的特点是适应性和抗病能力极强，耐干旱、贫瘠和严寒，在不适宜粮食作物生长的废 弃土地(如盐碱、滩涂地)上也能良好生长，且种植简便，管理粗放，产量高(地下块茎 3-4吨/亩，地上茎杆产量也可达3吨/亩)。菊芋含糖量高，其块茎糖含量达到鲜重的11-20 o%。菊芋中的糖70-90%以菊粉(inulin)形式存在，菊粉是一种多聚果糖，每个菊粉分 子含有30-35个果糖残基，经P-2， l糖苷键脱水聚合而成，成线型排列，果糖链末端为一 个葡萄糖分子。除菊芋外，菊苣(chicory)和大丽花(dahlia)中也富含菊粉糖。因此， 菊芋作为一种果糖含量丰富的非粮型能源作物是理想的乙醇生产原料。菊芋发酵生产乙醇的关键是菊粉中的多聚果糖水解成单糖(主要为果糖)，然后被酵 母等微生物利用。水解菊粉成为单糖的酶为外切型菊粉酶(inulinase)，该酶能够从菊粉 分子的末端逐一水解单糖残基。能够分泌菊粉酶的微生物主要为真菌，包括黑曲霉 "5pergi〃"s m>er)、脆壁克鲁维酵母((A7〃yyeroffi7ces /ragi'h's )、马科斯克鲁 维酵母 (A7u，er。那ce5"鹏rxj'朋i/s) 等。日本 Kazuyoshi 0hta等 (Applied and Environmental Microbiology, 59(3) :729-733， 1993)将黑曲霉(Asper^z7J"s/7_z>er817) 与发酵性能优良的酿酒酵母(&cc力aro/^ces cereWw'se 1200)混合培养，利用来源于 菊苣和大丽花的纯菊粉发酵生产乙醇，乙醇浓度达到了 20% (v/v)。 KatarzynaSzambelan等(Biotechnology Letters 26: 845 - 848, 2004)利用分泌菊粉酶的脆壁克鲁维酵母混合，发酵菊芋粉生产乙醇，乙醇浓度分别达到9.9% (v/v)、 9.4%(v/v)。他们还试验了 先用菊粉酶水角军菊芋粉，然后禾ll用2y历oi历o"S51 ffl。Z^'7i51或5"acc力ara历yce51 cereKisiae发 酵生产乙醇，乙醇浓度分别达到9.7% (v/v) 、 9. l%(v/v)。吕跃钢等(食品与发酵工业， 29 (5) : 66-68， 2003)曾将酿酒酵母与菊粉酶共固定，利用补加了蔗糖的菊芋抽提液发 酵生产乙醇，当初始糖浓度为20% (w/v)时，发酵醪液乙醇含量可达11.98%(v/v)。上述研究中所采用的发酵菌株为酿酒酵母或Zj朋o/z7朋as M^i乃's，自身均不能产生菊 粉酶，菊粉的水解依赖于添加外源菊粉酶或者利用能够产生菊粉酶的黑曲霉、脆壁克鲁维 酵母。二十世纪八十年代初，加拿大一家实验室曾对能够分泌菊粉酶的克鲁维酵母(主要 为马科斯克鲁维酵母，A7"j^er，/ces历arw'朋"s)直接利用菊芋原料发酵生产乙醇进行 了研究(Duvnjak Z. et al， Biotechnology Letters 3(10) :589-594， 1981; Argyrio Margaritis et al， Biotechnology Letters, 3(10) :595-599, 1981; Argyrio Margaritis et al， Applied and Environmental Microbiology, 45(2) :723-725， 1983)。所用的发 酵原料为高温灭菌的菊芋汁，但直接采用菊芋原汁发酵时，由于初始糖浓度限制，发酵产 物乙醇浓度不超过7。/。(v/v)。当原料菊芋汁经蒸发浓縮糖浓度达到25% (w/v)，并添加O. 05% Tween 80, 0. 01%油酸(oleic acid) ， 0.01%玉米浆(corn steep liquor)时，乙醇浓度 可以达到12.9。/。(v/v)，虽然乙醇参数较好，但工艺并不适于工业化应用。本发明中所采用的菌株为鹰嘴豆克鲁维酵母Y179和以鹰嘴豆克鲁维酵母Y179为宿主细胞所构建的基因工程菌，这些菌株自身具有高分泌表达菊粉酶并直接利用菊芋原料发酵 生产乙醇的能力。本发明所采用的工艺路线与已报道的明显不同在于(1)种子培养基为 菊芋汁或菊芋粉培养基，不添加任何辅助成分；(2)发酵培养基为菊芋粉，或菊芋汁直接 添加菊芋粉，不添加任何辅助营养成分，总糖浓度大于20% (w/v)，而且无需高温灭菌， 产物乙醇浓度高，达到12% (v/v)以上。具有工艺简单方便，适于工业化生产应用的特 点。发明内容本发明的目的在于提供一种利用菊芋原料生产乙醇的简便方法，实现糖化与发酵同步 进行。本发明提出的生产乙醇的方法具体步骤如下(1)原料准备用新鲜菊芋榨取菊芋计，调整菊芋计的总糖浓度至4%-18% (W/V); 用新鲜菊芋粉碎制取全菊芋粉。具体操作如下新鲜菊芋清洗干净、晾干， 一部分菊芋用榨汁机榨取菊芋汁，测定菊芋汁总糖浓度， 调整总糖浓度至4%-18% (w/v)。取一部分洁净的鲜菊芋切成片状，将菊芋片置于阳光下 晒干，或者将菊芋片放入4(TC-8(rC烘箱中烘干。将干燥后的菊芋片粉碎，20目-80目筛子 过筛，细粉保留，粗粉继续粉碎过筛，合并细粉，得到全菊芋粉，密封干燥保存备用。(2) 菌种活化取-80。C冻存的克鲁维酵母菌株划线接种于YEPD固体培养基上，在 25"C-37'C培养箱中培养12小时以上，YEPD固体培养基组成为酵母抽提物10 g/L，蛋 白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，经高温灭菌。取一环YEPD固体培养基上的菌 种接入YEPD液体培养基中25'C-37。C摇床活化培养12小时-20小时，YEPD液体培养基 组成为酵母抽提物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，经高温灭菌。(3) 种子液准备用全菊芋粉或者菊芋汁配制种子培养液，不添加任何辅助营养成分， 糖浓度为4%-18% (w/v)，经高温灭菌。将活化的克鲁维酵母按0.5%-5% (v/v)量接入种 子培养液中，25'C-37'C摇床培养12小时-60小时，作为后续发酵的种子液。(4) 发酵采用三种发酵方式。第一、二种为一次投料方式，第三种为补料方式。 第一种，在糖浓度为4%-18% (w/v)菊芋汁中添加全菊芋粉配制发酵培养基，调节总糖浓 度达到20%-30% (w/v)，按照5%-20% (v/v)量接入种子液，在28'C-42。C厌氧条件下搅 拌培养24小时-144小时，结束发酵，醪液送去蒸馏。第二种，直接用水溶解全菊芋粉， 搅拌均匀，调节总糖浓度达到20%-30% (w/v)，按照5%-20% (v/v)量接入种子液，在 28。C-42。C厌氧条件下搅拌培养24小时-144小时，结束发酵，醪液送去蒸馏。第三种，用 水溶解全菊芋粉，搅拌均匀，调节总糖浓度达到5%-20% (w/v)，按照5%-20% (v/v)量 接入种子液，在28'C-42'C厌氧条件下搅拌培养12小时以上，补加全菊芋粉，搅拌均匀， 所添加的全菊芋粉与初始使用的全菊芋粉总糖浓度之和达到20%-30% (w/v)，继续在28 。C-42。C厌氧条件下搅拌培养，发酵总时间24小时-144小时，发酵结束后醪液送去蒸馏。步骤2菌种活化中的克鲁维酵母菌株可以为鹰嘴豆克鲁维酵母Y179或以鹰嘴豆克鲁 维酵母Y179为宿主细胞所构建的工程菌。步骤4发酵中无论菊芋汁混合全菊芋粉配制的发酵培养基，还是单独由全菊芋粉配制 的发酵培养基，均不用添加任何辅助营养物质。本发明具有如下特点① 种子培养基和发酵培养基成分均由菊芋汁、全菊芋粉配制而成，不需添加任何辅 助营养物质；② 发酵培养基不必预先糖化处理，实现糖化与发酵同步进行，从而降低了发酵成本。③ 发酵可以在28-42'C区间进行。④间歇式发酵方式，发酵原料菊芋汁、全菊芋粉入罐后不必高温灭菌，可直接接入种 子液进入发酵周期。
图1:鹰嘴豆克鲁维酵母Y179在250 ml三角瓶中以菊芋汁和全菊芋粉混合物为原料 分别于3(TC、 37"C发酵生产乙醇时醪液中乙醇浓度变化曲线图。图2:鹰嘴豆克鲁维酵母Y179在250 ml三角瓶中以菊芋汁和全菊芋粉混合物为原料 分别于3(TC、 37。C发酵生产乙醇时醪液上清中总糖变化曲线图。图3:鹰嘴豆克鲁维酵母Y179在5 L发酵罐中以全菊芋粉为原料3(TC发酵生产乙醇 时醪液中乙醇浓度变化曲线图。图4:鹰嘴豆克鲁维酵母Y179在5 L发酵罐中以全菊芋粉为原料30。C发酵生产乙醇时 醪液上清中总糖变化曲线图。
具体实施方式
实施例1① 原料处理新鲜菊芋5千克用水清洗干净，取2500克鲜菊芋用榨汁机榨取菊芋汁 液，采用酸解法测定总糖，调整总糖浓度至10% (w/v)，经115'C灭菌20分钟后，备用。 取2500克鲜菊芋切片，菊芋片放入70'C烘箱中烘干，干菊芋片经粉碎机粉碎后，40目筛 子过筛，收集细粉，粗粉继续粉碎、过筛，采用酸解法测定40目全菊芋粉总糖含量，所 有40目全菊芋粉装瓶密封保存备用。② 菌种活化取-8(TC冻存的鹰嘴豆克鲁维酵母Y179菌株在YEPD固体培养基上划 线，于30。C培养箱中培养16小时，YEPD固体培养基组成为酵母抽提物10g/L，蛋白 胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，经高温灭菌。取一环YEPD固体培养基上的菌种 接入装有3 ml YEPD液体培养基的10 ml试管中，于30°C 250 rpm的摇床中活化培养18 小时，YEPD液体培养基组成为酵母抽提物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，经 高温灭菌。③ 种子液准备取0.1ml经上述活化的鹰嘴豆克鲁维酵母Y179细胞培养液接入装有 10ml菊芋汁培养基的50ml三角瓶中，培养基总糖浓度为10。％ (w/v)，于30°C 250 rpm的 摇床中培养36小时，作为发酵的种子液。④ 发酵准备两只250ml三角瓶，在每只三角瓶中装入50ml总糖浓度为10% (w/v) 菊芋汁和8克全菊芋粉，搅拌均匀，然后各接入步骤③中准备的5ml种子液， 一只三角瓶 置于30°C摇床中，另一只三角瓶置于37°C摇床中，两只三角瓶经250 rpm转速培养8 小时后停止摇动，继续静置发酵48小时，3(TC摇床中发酵醪液乙醇浓度达到12% (v/v)、清液残糖浓度小于0.5% (w/v)， 37。C摇床中发酵醪液乙醇浓度达到10% (v/v)、清液残糖 浓度小于1% (w/v)。 实施例2① 原料处理新鲜菊芋10千克用水清洗干净，切片，菊芋片置7(TC烘箱中烘干，干 菊芋片经粉碎机粉碎后，40目筛子过筛，收集细粉，粗粉继续粉碎、过筛，合并所有40 目全菊芋粉，采用酸解法测定全菊芋粉总糖含量后，全菊芋粉装瓶密封保存备用。称取约 16克全菊芋粉倒入1000 ml三角瓶中，加入250 ml水，搅拌均匀，总糖含量约5% (w/v)， 高温灭菌，作为种子培养基备用。② 菌种活化取-80。C冻存的鹰嘴豆克鲁维酵母Y179菌株在YEPD固体培养基上划 线，于30'C培养箱中培养16小时，YEPD固体培养基组成为酵母抽提物10g/L，蛋白 胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，高温灭菌。取一环YEPD固体培养基上的菌种接 入装有3 ml YEPD液体培养基的10 ml试管中，于30°C 250 rpm的摇床中活化培养18小 时，YEPD液体培养基组成为酵母抽提物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，经高 温灭菌。③ 种子液准备取2.5 ml经上述活化的鹰嘴豆克鲁维酵母Y179接种于步骤1中准备 的250 ml种子培养基中，于3(TC 250 rpm转速的摇床中培养24小时，作为发酵的种子液。 发酵在5 L发酵罐中加入800克全菊芋粉和2500 ml水，150rpm转速搅拌均匀 后，85'C蒸煮20分钟(同时150rpm搅拌)，待罐体冷却后，加入250ml种子液，300 rpm 转速搅拌，在不通气的条件下，3(TC发酵培养144小时，每隔12小时取样分析醪液中乙 醇和残糖浓度。发酵醪液乙醇浓度达到12% (v/v)，清液残糖浓度为0.35% (w/v)，糖醇 转化效率达到86%。
权利要求
1. 一种利用菊芋原料糖化与发酵同步进行生产乙醇的方法，其特征在于具体步骤如下(1)原料准备用新鲜菊芋榨取菊芋计，调整菊芋计的总糖浓度至4％-18％(W/V)；用新鲜菊芋粉碎抽取金菊芋粉；(2)菌种活化取-80℃冻存的克鲁维酵母菌株划线接种于YEPD固体培养基上，在25℃-37℃培养箱中培养12小时以上，YEPD固体培养基组成为酵母抽提物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，经高温灭菌；取一环YEPD固体培养基上的菌种接入YEPD液体培养基中25℃-37℃摇床活化培养12小时-20小时，YEPD液体培养基组成为酵母抽提物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，经高温灭菌；(3)种子液准备用全菊芋粉或者菊芋汁配制种子培养液，糖浓度为4％-18％(w/v)，经高温灭菌；将活化的克鲁维酵母按0.5％-5％(v/v)量接入种子培养液中，25℃-37℃摇床培养12小时-60小时，作为后续发酵的种子液；(4)发酵采用如下三种发酵方式之一种第一种，在糖浓度为4％-18％(w/v)菊芋汁中添加全菊芋粉配制发酵培养基，调节总糖浓度达到20％-30％(w/v)，按照5％-20％(v/v)量接入种子液，在28℃-42℃厌氧条件下搅拌培养24小时-144小时，结束发酵，醪液送去蒸馏；第二种，直接用水溶解全菊芋粉，搅拌均匀，调节总糖浓度达到20％-30％(w/v)，按照5％-20％(v/v)量接入种子液，在28℃-42℃厌氧条件下搅拌培养24小时-144小时，结束发酵，醪液送去蒸馏；第三种，用水溶解全菊芋粉，搅拌均匀，调节总糖浓度达到5％-20％(w/v)，按照5％-20％(v/v)量接入种子液，在28℃-42℃厌氧条件下搅拌培养12小时以上，补加全菊芋粉，搅拌均匀，所添加的全菊芋粉与初始使用的全菊芋粉总糖浓度之和达到20％-30％(w/v)，继续在28℃-42℃厌氧条件下搅拌培养，发酵总时间24小时-144小时，发酵结束后醪液送去蒸馏。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体为一种利用菊芋原料生产乙醇的方法。该方法包括，原料处理鲜菊芋清洗干净，榨汁，或切片，烘干，磨粉；种子液制备克鲁维酵母在以菊芋粉或菊芋汁为完全组分的种子培养液中培养；发酵全菊芋汁或全菊芋粉配制的培养基中接入种子液，厌氧发酵生产乙醇，最后蒸馏获得乙醇。本发明中种子培养基和发酵培养基成分均为菊芋汁或菊芋粉，不需添加任何辅助成分，而且发酵培养基中的菊芋原料不需预先糖化处理，利用种子液中克鲁维酵母所分泌产生的菊粉酶直接水解糖化菊芋原料中的多聚果糖，并同时进行发酵，产物乙醇浓度达到12％(v/v)。本发明方法简单，实现糖化与发酵同步进行，降低了生产成本。
文档编号C12R1/645GK101265485SQ20081003711
公开日2008年9月17日 申请日期2008年5月8日 优先权日2008年5月8日
发明者静 俞, 刘建平, 李育阳, 江佳稀 申请人:复旦大学